CN118615216A - 鹅绒委陵菜的发酵方法、发酵液及其在化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鹅绒委陵菜的发酵方法、发酵液及其在化妆品中的应用，属于生物发酵技术领域。本发明提供的鹅绒委陵菜的发酵方法，将鹅绒委陵菜块茎磨粉过筛后，以1％‑3％w/v的添加量将筛下粉末添加至培养基后灭菌，以8％‑12％v/v的接种量将菌种接种至灭菌液中进行发酵，灭菌后过滤即得鹅绒委陵菜发酵液。采用本发明提供的发酵方法制备得到的鹅绒委陵菜发酵液的委陵菜酸含量显著提升。并且具有较好的抗炎、抗氧化、保湿、抗皱紧致和抑菌效果，是一种具有良好应用前景的化妆品原料。

Description

鹅绒委陵菜的发酵方法、发酵液及其在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及鹅绒委陵菜的发酵方法、发酵液及其在化妆品中的应用。

背景技术

鹅绒委陵菜，学名Potentilla anserina，别名蕨麻、人参果、长寿果、老鸦爪等。鹅绒委陵菜为蔷薇科多年生草本植物，其块根含有多糖、琥珀酸、三萜类化合物、多酚、黄烷醇、类黄酮、三萜类化合物和其他活性物质，使得鹅绒委陵菜清热解毒，凉血止痢的功效。另外鹅绒委陵菜含有维生素及镁、锌、钾、钙元素，具有较高的医疗和营养价值，有着健胃补脾、生津止渴、益气补血的功能，而鹅绒委陵菜开花时的全草，还可用来收敛止血，止咳利痰，也作滋补。

鹅绒委陵菜作为我国特有的、具有良好药用价值的植物，受到越来越多的研究者的关注。Chen等人^[1]研究鹅绒委陵菜的药理作用，发现其在保护肝脏损伤、抗氧化、抗缺氧、增强免疫功能、抗炎和抗肿瘤等方面发挥保护作用。也有少数研究发现鹅绒委陵菜可改善心血管疾病，保护受损的心肌组织。Zhang等人^[2]在研究者发现，鹅绒委陵菜预处理可有效减轻小鼠急性心肌缺血再灌注损伤，维持心脏正常功能，进而发挥对心脏的保护作用。另有研究证明，鹅绒委陵菜乙醇提取物能显著抑制急性心肌缺血再灌注所致的心肌细胞凋亡，并抑制caspase3，caspase9 mRNA水平及蛋白水平的表达。Choi H等人^[3]发现，鹅绒委陵菜可以解决因戴口罩引起的皮肤问题，包括增强水分，加强皮肤屏障和缓解瘙痒。

鹅绒委陵菜作为一种药食两用植物，有较高的营养价值和医疗、保健功能，资源丰富，开发利用潜力巨大，但其相关产品较少，抗氧化类发酵产品稀缺，目前使用菌种发酵鹅绒委陵菜产品的工艺较少，且多进行糖化反应，以促进鹅绒委陵菜有效成分的提取，但会使制备工艺繁琐，且糖化反应不易控制。因此，亟需提供一种简单便捷且具有高抗氧化活性的蕨类发酵产品。

Morikawa T,Ninomiya K,Imura K,et al.Hepatoprotective triterpenes fromtraditional Tibetan medicine Potentilla anserina[J].Phytochemistry,2014,102:169-181.

李灵芝，张丽，龚海英，等.蕨麻乙醇提取物抗缺氧及抗氧化机制研究[J].中国食品卫生杂志，2005，17(4):306.

Choi H,Ha JH,Kang HC,et.al.The Protective Effects of MoisturizerContaining Potentilla anserina Extract in the Topical Treatment of SkinDamage Caused by Masks[J].Int J Mol Sci.2023Sep 19；24(18):14294.

发明内容

基于现有技术中存在的问题和不足，本发明旨在提供一种鹅绒委陵菜的发酵方法、发酵液及其在化妆品中的应用。本发明提供的鹅绒委陵菜的发酵方法，将鹅绒委陵菜块茎磨粉过筛后，以1％-3％w/v的添加量将筛下粉末添加至培养基后灭菌，以8％-12％v/v的接种量将菌种接种至灭菌液中进行发酵，灭菌后过滤即得鹅绒委陵菜发酵液。采用本发明提供的发酵方法制备得到的鹅绒委陵菜发酵液的委陵菜酸含量显著提升。并且具有较好的抗炎、抗氧化和抑菌效果，是一种具有良好应用前景的化妆品原料。

本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种鹅绒委陵菜的发酵方法，所述的发酵方法包括如下步骤：

S1、将鹅绒委陵菜块茎磨粉、过筛，取筛下粉末；

S2、将筛下粉末添加至培养基中，灭菌后得灭菌液；

S3、将菌种接种至步骤S2所述的灭菌液中，发酵后，灭菌过滤即得鹅绒委陵菜发酵液。

具体地，步骤S1中所述的过筛为过60-80目筛。

优选地，步骤S1中所述的过筛为过80目筛。

具体地，步骤S2中所述的筛下粉末的添加量为1％-3％w/v。

优选地，步骤S2中所述的筛下粉末的添加量为2％w/v。

具体地，步骤S2中所述的培养基中包括无水葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母粉中的一种或多种。

进一步具体地，步骤S2中所述的培养基中包括赤灵芝基础培养基、紫灵芝基础培养基、蛹虫草基础培养基、蝉花虫草基础培养基、酿酒酵母基础培养基、双歧杆菌基础培养基。

优选地，所述的赤灵芝基础培养基的制备方法为称取3.5g无水葡萄糖、0.5g蛋白胨、0.25g酵母粉、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min即得赤灵芝基础培养基。

优选地，所述的紫灵芝基础培养基的制备方法为3.5g可溶性淀粉、0.5g蛋白胨、0.75g酵母粉、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min即得紫灵芝基础培养基。

优选地，所述的蛹虫草基础培养基的制备方法为称取2.0g无水葡萄糖、3.0g蛋白胨、0.75g酵母粉、0.05g硫酸镁、0.005g磷酸二氢钾、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min即得蛹虫草基础培养基。

优选地，所述的蝉花虫草基础培养基的制备方法为称取3.5g无水葡萄糖、0.5g蛋白胨、0.25g酵母粉、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min，即得蝉花基础培养基

优选地，所述的酿酒酵母基础培养基的制备方法为称取1.0g无水葡萄糖、1.0g蛋白胨、0.5g酵母粉、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min，即得酿酒酵母基础培养基。

优选地，所述的双歧杆菌基础培养基的制备方法为称取2.0g无水葡萄糖、1.0g蛋白胨、0.75g酵母粉、0.01g可溶性淀粉、0.5g氯化钠、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min，即得双歧杆菌基础培养基。

具体地，步骤S3中所述的菌种的接种量为8％-12％v/v。

优选地，步骤S3中所述的菌种的接种量为10％v/v。

具体地，步骤S3中所述的菌种包括但不限于赤灵芝菌种、紫灵芝菌种、蛹虫草菌种、蝉花虫草菌种、酿酒酵母菌种或双歧杆菌菌种。

优选地，所述的赤灵芝菌种的菌种编号为CICC-14042。

优选地，所述的紫灵芝菌种的菌种编号为CICC-51332。

优选地，所述的蛹虫草菌种的菌种编号为CICC-14013。

优选地，所述的蝉花虫草菌种的菌种编号为CICC-81169。

优选地，所述的酿酒酵母菌的菌种编号为CGMCC 2.3880。

优选地，所述的双歧杆菌菌种的菌种编号为CICC-6068。

进一步优选地，步骤S3中所述的菌种为酿酒酵母菌种，编号为CGMCC 2.3880。

具体地，所述的赤灵芝菌种、紫灵芝菌种、蛹虫草菌种、蝉花虫草菌种的OD600≥1。

具体地，所述的酿酒酵母菌和双歧杆菌菌种的浓度为10⁸-10⁹CFU/mL。

优选地，所述的酿酒酵母菌和双歧杆菌菌种的浓度为10⁸CFU/mL。

具体地，步骤S3中所述的发酵的温度为25-30℃，发酵时间为96-120h。

优选地，步骤S3中所述的发酵的温度为25℃，发酵时间为96h。

优选地，步骤S3中所述的灭菌为121℃整体灭菌20min。

优选地，步骤S3中所述的过滤为经0.45μm滤板过滤。

本发明的有益效果为：

1、本发明采用发酵法对鹅绒委陵菜进行发酵炮制，与单一提取液对比，其发酵产物的委陵菜酸含量显著提升。

2、采用本发明提供的方法制备得到的发酵液鹅绒委陵菜发酵液的抗氧化、抗炎、抑菌作用显著。DPPH自由基清除率达到91.43±3.39％，COX-2环氧化酶抑制率达到87.36±0.16％。对痤疮丙酸杆菌抑制率达到94.11±1.67％，金黄色葡萄球菌抑制率达到58.93±0.56，具有显著抑菌功效。

附图说明

图1为委陵菜酸标准品检测图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

基础实验例1基础培养基的制备

1、赤灵芝基础培养基：称取3.5g无水葡萄糖、0.5g蛋白胨、0.25g酵母粉、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min即得赤灵芝基础培养基。

2、紫灵芝基础培养基：称取3.5g可溶性淀粉、0.5g蛋白胨、0.75g酵母粉、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min即得紫灵芝基础培养基。

3、蛹虫草基础培养基：称取2.0g无水葡萄糖、3.0g蛋白胨、0.75g酵母粉、0.05g硫酸镁、0.005g磷酸二氢钾、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min即得蛹虫草基础培养基。

4、蝉花虫草基础培养基：称取3.5g无水葡萄糖、0.5g蛋白胨、0.25g酵母粉、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min，即得蝉花基础培养基。

5、酿酒酵母基础培养基：称取1.0g无水葡萄糖、1.0g蛋白胨、0.5g酵母粉、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min，即得酿酒酵母基础培养基。

6、双歧杆菌基础培养基：称取2.0g无水葡萄糖、1.0g蛋白胨、0.75g酵母粉、0.01g可溶性淀粉、0.5g氯化钠、100mL纯水于250mL锥形瓶中，进行121℃高温灭菌20min，即得双歧杆菌基础培养基。

基础实验例2菌种的培养

1、赤灵芝菌种：购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC-14042。

2、紫灵芝菌种：购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC-51332。

3、蛹虫草菌种：购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC-14013。

4、蝉花虫草菌种：购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC-81169。

5、酿酒酵母菌种：购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC 2.3880。

6、双歧杆菌菌种：购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC-6068。

实施例1

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎(蕨麻，又名人参果)，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量，将其添加入赤灵芝基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种10％的赤灵芝菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

实施例2

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量，将其添加入紫灵芝基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种10％的紫灵芝菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

实施例3

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量，将其添加入蛹虫草基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种10％的蛹虫草菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

实施例4

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量，将其添加入蝉花虫草基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种10％的蝉花虫草菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

实施例5

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量，将其添加入酿酒酵母基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种10％浓度为10⁸CFU/mL的酿酒酵母菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

实施例6

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量，将其添加入双歧杆菌基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种10％浓度为10⁸CFU/mL的双歧杆菌菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

对比例1

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量加热回流法，提取210min，经中速定性滤纸过滤，得鹅绒委陵菜提取液。

对比例2

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，10％添加量，将其添加入酿酒酵母基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种1.5％浓度为10⁸CFU/mL的酿酒酵母菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

对比例3

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，10％添加量，将其添加入酿酒酵母基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种10％浓度为10⁸CFU/mL的酿酒酵母菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

对比例4

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量，将其添加入酿酒酵母基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种1.5％浓度为10⁸CFU/mL的酿酒酵母菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

对比例5

筛选颗粒饱满，无霉变、无明显变质现象的鹅绒委陵菜块茎，经粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下部分，2％添加量，将其添加入酿酒酵母基础培养基中，121℃高温灭菌20min后放至常温，接种15％浓度为10⁸CFU/mL的酿酒酵母菌种，发酵温度25℃，基础培养条件下培养96h，发酵结束后，121℃整体灭菌20min，经0.45μm滤板过滤，得鹅绒委陵菜发酵液。

实验例1高效液相色谱法测定委陵菜酸含量

通过高效液相色谱法，对实施例1-6、对比例2-5制备得到的鹅绒委陵菜发酵液、对比例1制备得到的鹅绒委陵菜提取液中的委陵菜酸含量进行检测。高效液相色谱法条件如下：

采用安捷伦1260色谱仪，色谱柱采用ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm,5μm)；柱流量为：0.8mL/min，柱温为：35℃；波长为：210nm，进样量为：10μL。流动相A为：0.2％乙酸水；流动相B为：乙腈；流动相A与流动相B的梯度见表1。委陵菜酸的出峰时间为24.121分钟，见图1。

表1流动相A与流动相B的梯度

时间min	A％	B％
			0	95	5
5	95	5
			30	70	30
50	60	40
			60	50	50
70	50	50
			80	40	60
90	30	70
			100	30	70

表2委陵菜酸含量(mg/mL)

样品名称	委陵菜酸含量(mg/mL)
		实施例1	0.2146
实施例2	0.2225
		实施例3	0.1722
实施例4	0.1764
		实施例5	0.3814
实施例6	0.2075
		对比例1	0.0826
对比例2	0.1238
		对比例3	0.1494
对比例4	0.1357
		对比例5	0.1559

测定结果见表2，与对比例1相比，实施例1-6制备得到的鹅绒委陵菜发酵液中委陵菜酸含量均有显著提高，表明本发明提供的发酵工艺可以显著提升鹅绒委陵菜原料委陵菜酸含量，且实施例5提升效果最佳，较对比例相比，委陵菜酸含量提升至4.6倍，可达0.3814mg/mL。

实验例2DPPH自由基清除试验

1、DPPH乙醇溶液的配置

称取20mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，DPPH浓度配制为2×10^-4mol/L；0-4℃下避光保存，现配现用，4h内有效。(阳性对照选用维生素C)。

2、待测液的配置

取实施例1-6制备得到的鹅绒委陵菜发酵液和对比例1制备得到的鹅绒委陵菜提取液，用纯水配制得0.25mg/ml、0.5mg/mL、0.1mg/mL、2mg/mL浓度的待测溶液。

3、实验步骤

按表3加入各试剂：

1)取1mL的待测液与1mL的2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A管)；

2)取1mL的无水乙醇与1mL的2×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(B管)；

3)取1mL的无水乙醇与1mL的待测液混匀(C管)；

表3试剂配比表

编号	DPPH溶液	无水乙醇	待测液	总体积
					A	1mL	——	1mL	2mL
B	1mL	1mL	——	2mL
					C	——	1mL	1mL	2mL

4)避光反应30min后，在517nm下测A、B、C管吸光度值；

5)DPPH自由基抑制率计算公式：DPPH抑制率(％)＝(B+C-A)/B

4、DPPH自由基抑制率检测结果

测试结果见表4，与对比例1相比，实施例1-6制备得到的蕨麻发酵液DPPH自由基清除率均有显著提高，表明本发明提供的发酵工艺可以显著提升鹅绒委陵菜原料抗氧化作用，且实施例5在10％浓度下的DPPH抑制作用最显著，DPPH自由基清除率达到91.43±3.39％，具有显著抗氧化功效。

表4DPPH自由基清除

样品	1％	3％	5％	10％
					实施例1	34.06±4.10％	53.06±0.85％	61.97±0.73％	79.55±4.99％
实施例2	45.63±4.18％	55.97±3.47％	64.04±0.17％	87.49±0.92％
					实施例3	25.97±2.75％	42.08±0.89％	70.44±0.09％	81.86±2.54％
实施例4	38.30±5.18％	43.68±2.84％	52.17±2.41％	70.52±1.36％
					实施例5	52.28±3.89％	63.56±3.40％	77.10±3.96％	91.43±3.39％
实施例6	49.35±3.18％	56.37±3.97％	62.22±3.31％	88.27±0.95％
					对比例1	15.07±2.80％	16.79±4.11％	19.17±1.12％	30.06±6.55％

实验例3COX-2环氧化酶活性抑制作用验证

用COX-2试剂盒测试不同样品对COX-2的抑制率，具体操作根据厂家提供的使用说明：

1、配制样品培养基：将样品用DMSO稀释至待测浓度(100μg/mL)。

2、试剂配制：

(1)融解除rhCOX-2以外的其它所有试剂至室温，略离心使溶液沉淀至管底，再混匀备用。COX-2Probe、COX-2Cofactor(50X)和COX-2Substrate(50X)配制在DMSO中，可37℃水浴0.5-2min促进融解。使用完毕后宜立即-20℃避光保存。

(2)COX-2Cofactor工作液的配制：按照每个样品需要5微升COX-2Cofactor工作液的比例配制适量的COX-2Cofactor工作液。取适量的COX-2Cofactor(50X)，按照1:49的比例用COX-2Assay Buffer稀释。例如4微升COX-2Cofactor(50X)加入196微升COX-2AssayBuffer配制成200微升COX-2Cofactor工作液。配制好的COX-2Cofactor工作液可4℃存放，仅限当日使用。

(3)COX-2工作液的配制：按照每个样品需5微升COX-2工作液的比例配制适量的COX-2工作液。取适量的rhCOX-2(25X)，按照1:24的比例用COX-2Assay Buffer稀释。例如8微升rhCOX-2(25X)加入192微升COX-2Assay Buffer配制成200微升COX-2工作液。配制好的COX-2工作液可在冰浴上暂时保存，1小时内酶活性基本稳定。注：所有涉及COX-2的操作应在冰上进行。

(4)COX-2Substrate工作液的配制：按照每个样品需5微升COX-2Substrate工作液的比例配制适量的COX-2Substrate工作液。取适量的COX-2Substrate(50X)，加入等体积的Substrate Buffer，充分涡旋混匀，该混合物再按照1:24的比例用Milli-Q级纯水或重蒸水稀释，充分涡旋混匀。例如20微升COX-2Substrate(50X)加入20微升Substrate Buffer，涡旋混匀后，再加入960微升Milli-Q级纯水或重蒸水，再充分涡旋混匀，最终获得1毫升COX-2Substrate工作液。配制好的COX-2Substrate工作液可在冰浴上暂时保存，1小时内较为稳定。注：COX-2Substrate工作液也可在样品检测时37℃孵育10分钟的过程中配制。

(5)阳性抑制剂Celecoxib溶液的配制：本试剂盒提供的阳性对照抑制剂Celecoxib浓度为100μM，配制在DMSO中，可以根据需要使用与待测抑制剂一样的溶剂稀释成所需浓度或浓度梯度。通常Celecoxib的IC50约为10nM-100nM。

3、样品检测：

(1)参考表5，使用96孔黑板设置对照孔和样品孔，并按照下表依次加入样品和各溶液。加入待测样品后，混匀，37℃孵育10分钟。

表5试剂配比表

注：*样品溶剂是指配制和稀释待测抑制剂所用的溶剂。

(2)各孔加入COX-2Probe 5微升。

(3)各孔快速加入COX-2Substrate工作液5微升，混匀。注：加入COX-2Substrate工作液后反应即会开始，如果孔数较多，可以在低温操作或使用排枪操作以减小各孔间加入COX-2Substrate工作液的时间差而导致的误差，混匀也可以在培养板振荡器上进行。

(4)37℃避光孵育5分钟后进行荧光测定。激发波长为560nm，发射波长为590nm。当荧光读数偏低时，也可适当延长孵育时间至10-20分钟。

4、计算：

(1)计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照、RFU100％酶活性对照、RFU阳性抑制剂对照和RFU样品。RFU，Relative Fluorescence Unit。

(2)计算每个样品的抑制百分率。计算公式如下：

抑制率(％)＝(RFU100％酶活性对照-RFU样品)/(RFU100％酶活性对照-RFU空白对照)×100％。

5、COX-2抑制率检测结果

结果显示(表6-表7)，与对比例1相比比，实施例1-6制备得到的鹅绒委陵菜发酵液COX-2环氧化酶抑制率均有显著提高，表明发酵工艺可以显著提升鹅绒委陵菜原料抗氧化作用，且实施例5在10％浓度下的COX-2抑制作用最显著，其COX-2环氧化酶抑制率达到87.36±0.16％，具有显著抗炎功效。

表6浓度为0.5％实施例1-6与对比例1对COX-2的抑制率

	COX-2抑制率(％)	SD(％)
			实施例1	35.82	0.03
实施例2	39.33	0.01
			实施例3	38.96	0.2
实施例4	32.53	0.12
			实施例5	53.66	0.06
实施例6	49.97	0.07
			对比例1	17.79	0.05

表7浓度为1.0％实施例1-6与对比例1对COX-2的抑制率

实验例4对痤疮丙酸杆菌的抑制作用

1、痤疮丙酸杆菌的培养

将培养基与痤疮丙酸杆菌摇匀，直至底部无白色菌块沉淀。使用无菌注射器吸管将200μL-800μL菌液移进新的培养基中，37℃于生化培养箱中静置培养。培养4-5天后，再进行传代。

2、微量肉汤法测试样品的抑菌活性

(1)制备新鲜培养基

将厌氧瓶中的无菌疱肉培养基转入无菌50mL离心管中。在25℃3500rpm的条件下，将无菌疱肉培养基离心10min。取上清液置于另一无菌50mL离心管中备用。

对于样品用将新鲜培养基各样品稀释成100μL/mL(10％)、70μL/mL(7％)、50μL/mL(5％)、30μL/mL(3％)、10μL/mL(1％)。

(2)痤疮丙酸杆菌的提取

将培养基与痤疮丙酸杆菌轻轻摇匀，转移至无菌50mL离心管。在25℃

1000rpm的条件下，离心30s，将上清液转移至无菌50mL离心管，在25℃

3500rpm的条件下，离心10min。

(3)菌液浓度的测定

打开酶标仪，波长设置600nm。从菌液中取400μL置于1.5mL无菌离心管。从装有400μL菌液的1.5mL离心管取出200μL菌液置于普通96孔板。在600nm下测量菌液的OD600值。若OD600值>0.5时，用无菌PBS进行稀释。

(可从2倍、4倍、6倍、8倍进行探索)当OD值等于0.5时，可进行下一步实验。

(4)菌液的稀释

计算所需菌悬液的体积。将菌悬液(OD600＝0.5)用新鲜培养基稀释160倍。

(5)铺板

无菌96孔培养板中，试验孔中每孔加入100μL稀释的菌悬液，再加入100μL不同浓度的样品，100μL不同浓度的样品+100μL疱肉培养基作为对照组，以不加P.acnes的200μL疱肉培养基作为空白对照，100μL稀释的菌悬液

+100μL疱肉培养基作为阴性对照，以100μL稀释的菌悬液+100μL，200μg/mL青霉素钠做阳性对照，各做3个复孔。

撕开厌氧产气袋置于2.5L厌氧罐中，再将无菌96孔培养板置于2.5L厌氧罐。培养24h后，在600nm处，测其吸光度。

(6)铺完板后放入厌氧罐在培养箱培养24小时后测在600nm下的OD值。

(7)痤疮丙酸杆菌抑制率：

实施例1-6与对比例1对痤疮丙酸杆菌的抑制率(％)结果见表8。

表8对痤疮丙酸杆菌的抑制率

样品浓度	1％	3％	5％	10％
					实施例1	42.03±1.17％	60.69±1.62％	64.38±2.34％	75.02±3.87％
实施例2	30.48±0.06％	62.63±0.82％	73.34±2.15％	84.07±0.82％
					实施例3	42.71±2.20％	59.18±4.27％	74.68±3.86％	82.21±1.67％
实施例4	39.07±6.56％	65.39±2.91％	68.99±4.27％	76.77±4.34％
					实施例5	45.60±5.11％	71.24±3.50％	81.68±3.44％	94.11±1.67％
实施例6	43.35±3.67％	62.36±2.12％	77.49±2.20％	81.86±1.58％
					对比例1	12.03±4.08％	20.69±2.27％	34.38±1.55％	55.02±4.33％

结果显示，与对比例1相比，实施例1-6制备得到的鹅绒委陵菜发酵液对痤疮丙酸杆菌抑制率均有显著提高，表明发酵工艺可以显著提升鹅绒委陵菜原料的有害菌活性抑制作用，且实施例5在10％浓度下的有害菌活性抑制作用最显著，其痤疮丙酸杆菌抑制率达到94.11±1.67％。

实验例5金黄色葡萄球菌抑制作用

1、金黄色葡萄球菌的培养

将培养基与金黄色葡萄球菌摇匀，直至底部无白色菌块沉淀。使用无菌吸管将200μL-800μL菌液移进新的培养基中，37℃于生化培养箱中静置培养。培养4-5天后，再进行传代。

2、微量肉汤法测试样品的抑菌活性

(1)制备新鲜培养基

将无菌培养基转入无菌50mL离心管中。在25℃3500rpm的条件下，将无菌培养基离心10min。取上清液置于另一无菌50mL离心管中备用。

对于样品用将新鲜培养基各样品稀释成100μL/mL(10％)，50μL/mL(5％)，10μL/mL(1％)。

(2)金黄色葡萄球菌的提取

将培养基与金黄色葡萄球菌轻轻摇匀，转移至无菌50mL离心管。在25℃1000rpm的条件下，离心30s，将上清液转移至无菌50mL离心管，在25℃

3500rpm的条件下，离心10min。

(3)菌液浓度的测定

打开酶标仪，波长设置600nm。从菌液中取400μL置于1.5mL无菌离心管。从装有400μL菌液的1.5mL离心管取出200μL菌液置于普通96孔板。在600nm下测量菌液的OD600值。若OD600值>0.5时，用无菌PBS进行稀释。

(可从2倍、4倍、6倍、8倍进行探索)当OD值等于0.5时，可进行下一步实验。

(4)菌液的稀释

计算所需菌悬液的体积。将菌悬液(OD600＝0.5)用新鲜培养基稀释3000倍。

(5)铺板

无菌96孔培养板中，试验孔中每孔加入100μL稀释的菌悬液，再加入100μL不同浓度的样品，100μL不同浓度的样品+100μL LB培养基作为对照组，以不加P.acnes的200μL LB肉汤培养基作为空白对照，100μL稀释的菌悬液+100μL LB肉汤培养基作为阴性对照，以100μL稀释的菌悬液+100μL，200μg/mL青霉素钠做阳性对照，各做3个复孔。

将无菌96孔培养板置于37℃培养箱中。培养12h后，在600nm处，测其吸光度。

(6)铺完板后放入培养箱培养12小时后测在600nm下的OD值。

(7)金黄色葡萄球菌抑制率：

实施例1-6与对比例1对金黄色葡萄球菌的抑制率结果见表9。

表9对金黄色葡萄球菌的抑制率

样品浓度	1％	3％	5％	10％
					实施例1	5.89±0.38％	10.07±2.44％	24.10±0.79％	30.16±3.75％
实施例2	3.88±1.44％	11.36±1.62％	19.57±2.73％	26.72±0.80％
					实施例3	13.08±3.93％	21.20±2.04％	25.64±3.45％	26.54±3.87％
实施例4	12.85±2.98％	19.57±1.74％	24.79±9.13％	32.59±1.26％
					实施例5	21.50±2.05％	29.26±1.20％	36.85±1.52％	58.93±0.56％
实施例6	21.71±0.93％	27.16±1.96％	35.44±2.05％	48.58±0.92％
					对比例1	0.24±2.91％	10.98±1.29％	18.72±2.61％	24.08±6.78％

结果显示，与对比例1相比，实施例1-6制备得到的鹅绒委陵菜发酵液对金黄色葡萄球菌抑制率均有显著提高，表明发酵工艺可以显著提升鹅绒委陵菜原料的有害菌活性抑制作用，且实施例5在10％浓度下的有害菌活性抑制作用最显著，其金黄色葡萄球菌抑制率达到58.93±0.56％。

实验例6保湿作用

6.1初始数据采集

在测试环境中安静等待20-30min，使MPA-10对皮肤角质层水分含量进行测试。测试区域为前臂内侧，每个测试区测试3次取平均值，记为T0。

6.2涂抹受试物

(1)测试期间受试者按照划分区域分别在前臂内侧和面部一次性涂抹含5％测试样品的基础凝胶配方，测试期间受试者在受试区不使用其它任何化妆品。基础凝胶配方具体内容见下表10：

表10基础凝胶配方

(2)测试周期为2h，在测试周期内，受试者禁止进食、饮水、打闹等引起皮肤水分强烈变化的活动。

6.3不同时间段的数据采集

在产品使用前、1h、2h后，对前臂内侧测试区域皮肤角质层水分含量进行测试，试验结果记为T0、T2、T4、每个测试区域测试3次取平均值。实施例1-6与对比例1对皮肤角质层水分含量改善结果见表11。

表11皮肤角质层水分含量改善结果

结果显示，与对比例1相比，实施例1-6制备得到的鹅绒委陵菜发酵液对皮肤角质层水分含量均有显著提高，表明发酵工艺可以显著提升鹅绒委陵菜原料补水保湿作用，且实施例5在10％浓度下的保湿补水效果最显著，4小时后，其皮肤角质层水分含量提升52.66％

实验例7弹性蛋白酶抑制作用(抗皱紧致)

1、Tris-HCl溶液的配制：配制2mmol/L的Tris-HCl溶液，用1mol/L和0.1mol/L的NaOH溶液调节pH＝8.0。使用后4℃低温保存。

2、弹性蛋白酶溶液配制：用2mmol/L的Tris-HCl溶液配制浓度为1U/mL的弹性蛋白酶溶液。使用后若有剩余，-20℃保存。

3、底物溶液的配制：用2mmol/L的Tris-HCl溶液配置0.5mg/mL的底物溶液。使用后若有剩余，-4℃保存。

4、待测液的配制：

(1)取实施例1-6制备得到的鹅绒委陵菜发酵液和对比例1制备得到的鹅绒委陵菜提取液样品，使用2mmol/L的Tris-HCl溶液溶解配制成10％的待测溶液。

(2)取油溶性样品，用DMSO溶解后，加入到2mmol/L的Tris-HCl溶液配置成2％的DMSO溶液。

5、实验步骤：

在96孔板中，按表12加入各试剂。

(1)A：20μL弹性蛋白酶溶液+10μL待测液+40μL底物溶液+80μLTris-HCl溶液

(2)B：20μL弹性蛋白酶溶液+10μL待测液+120μLTris-HCl溶液

(3)C：20μL弹性蛋白酶溶液+90μLTris-HCl溶液+40μL底物溶液

表12试剂配比表

编号	弹性蛋白酶溶液	待测液	2mmol/LTris-HCl	底物溶液	总体积
						A	20μL	10μL	80μL	40μL	150μL
B	20μL	10μL	120μL	—	150μL
						C	20μL	—	90μL	40μL	150μL

先加入弹性蛋白酶溶液和待测液(或Tris-HCl溶液)孵育15min后，再加入底物溶液和缓冲液孵育50min，在410nm处测定吸光度值。

弹性蛋白酶抑制率计算公式：抑制率(％)＝100×[1-(A-B)/C]

实施例1-6与对比例1对弹性蛋白酶抑制率结果见表13。

表13对弹性蛋白酶抑制率(％)

样品名称	浓度	抑制率(％)
			实施例1	10％	52.35±2.6
实施例2	10％	71.24±3.08
			实施例3	10％	34.63±0.66
实施例4	10％	30.11±0.13
			实施例5	10％	75.39±2.95
实施例6	10％	40.44±0.30
			对比例1	10％	19.87±0.32
芦丁	2mmol/L	65.26±4.21

结果显示，与对比例1相比，实施例1-6制备得到的鹅绒委陵菜发酵液对弹性蛋白酶的抑制率均有显著提高，表明发酵工艺可以显著提升鹅绒委陵菜原料抗皱紧致作用，且实施例5在10％浓度下的弹性蛋白酶抑制作用最显著，其弹性蛋白酶抑制率达到75.39±2.95％。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。

Claims (10)

1.一种鹅绒委陵菜的发酵方法，其特征在于，所述的发酵方法包括如下步骤：

S1、将鹅绒委陵菜块茎磨粉、过筛，取筛下粉末；

S2、将筛下粉末添加至培养基中，灭菌后得灭菌液；

S3、将菌种接种至步骤S2所述的灭菌液中，发酵后，灭菌过滤即得鹅绒委陵菜发酵液；

步骤S2中所述的筛下粉末的添加量为1％-3％w/v；

步骤S3中所述的菌种的接种量为8％-12％v/v。

2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤S2中所述的筛下粉末的添加量为2％w/v。

3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤S3中所述的菌种的接种量为10％v/v。

4.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，步骤S3中所述的菌种包括赤灵芝菌种、紫灵芝菌种、蛹虫草菌种、蝉花虫草菌种、酿酒酵母菌种或双歧杆菌菌种。

5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤S2中所述的培养基中包括无水葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母粉中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤S3中所述的发酵的温度为25-30℃，发酵时间为96-120h。

7.权利要求1-6任一项所述的发酵方法制备得到的鹅绒委陵菜发酵液。

8.权利要求7所述的鹅绒委陵菜发酵液在制备化妆品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的化妆品具有抗炎、抗氧化或抑菌功效。

10.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品包含权利要求7所述的鹅绒委陵菜发酵液。