CN1187774A - 中枢神经系统轴突外延调节剂,以及包含和使用该调节剂的组合物,细胞和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在体内促进哺乳动物中枢神经系统中神经生长的方法,该方法通过施用一种能抑制在胶质细胞和髓鞘中发现的抑制分子信号的神经细胞粘附分子,以促进神经生长。同样还涉及活性片段、同源物、衍生物、模拟物、类似物、分泌细胞和其可溶性分子,以及其抗体、DNA分子、载体和能表达它们的转化细胞。本发明也包括在分化的星形细胞及来源于它的细胞和组织中表达一种神经粘附分子的转基因小鼠品系。神经粘附分子的表达增强来源于这些转基因小鼠的中枢神经系统组织的轴突外延(outgrowth)。本发明还涉及增强中枢神经系统神经元的神经元外延,增强记忆和增加突触效能的方法。也涉及检测调节神经粘附分子作用的药物的方法,和适用于上述方法的检测系统。

Description

中枢神经系统轴突外延调节剂，以及包含 和使用该调节剂的组合物，细胞和方法

发明背景发明领域

本发明通常涉及中枢神经系统中的神经生长的调节，尤其是涉及用于促进中枢神经系统神经生长的方法和有关的制剂，构建物和组合物。具体地说，本发明涉及使用细胞粘附分子，优选的是如L1的神经细胞粘附分子以促进和改善上述神经生长。相关现有技术的描述

神经元延伸轴突的能力在发育期间建立神经元联系中具有头等重要性。在再生因损伤被毁的重新建立的联系中也需要这种能力。

在所有动物物种的中枢和外周神经系统的发育过程中，轴突大量地伸长(Cajal(1928)神经系统的退化和再生，牛津大学出版社，伦敦)这种现象涉及轴突和树突。然而，在成体中，中枢神经系统中轴突和树对突的再生，随着进化过程而日益丧失。

在外周神经系统中，遭受损伤后，所有脊椎动物种类的轴突能再生(Cajal(1928)；Martini(1994)神经细胞学杂志23：1-28)。然而，在哺乳动物中，损伤后的轴突再生局限于轴突萌发。然而，神经元外延的再生在较低等脊椎动物种类中可能存在(Stuermer等，(1992)神经生物学杂志，23：537-550)。相反，在中枢神经系统中，如果不是所有的高等和低等脊椎动物成体的神经元那么也是大多数具有轴突再生的可能性。(Aguayo(1985)“在哺乳动物成体中枢神经系统中来自损伤神经元的轴突再生”。在：突触可塑性(Cotman.C.W.ed.)纽约，TheGuilford出版社，pp457-484)。

胶质细胞是控制轴突再生的明确的决定因素。一般来说，哺乳动物胶质细胞允许发育过程中中枢神经系统轴突再生(Silver等(1982)比较神经病学杂志210：10-29，Miller等(1985)发育生物学111：35-41，Pollerberg等，(1985)细胞生物学杂志101：1921-1929)，以及成体外周神经系统轴突再生(Fawcett等，(1990)神经科学年评13：43-60)。因此，依据遭受损伤的情况，成体哺乳动物外周神经系统的胶质细胞在一定程度上能恢复它们早期的促进轴突外延的潜能，以使它们促进再生(Kalderon(1988)神经科学研究杂志21：501-512；kliot等“诱导背根纤维再生成成熟哺乳动物的脊髓”在：神经再生的目前问题，纽约，pp311-328；Carlstedt等，(1989)脑研究通报22：93-102)。某些低等脊椎动物的中枢神经系统的胶质细胞仍允许成年期的轴突再生(Stuermer等，(1992)神经生物学杂志23：537-550)。相反，成体哺乳动物的中枢神经系统的胶质细胞并不有助于损伤后的轴突再生。

几种起分子信号作用并作为促进和或抑制轴突生长基础的识别分子已被鉴别出来(Martini(1996))。在轴突外延促进识别分子中，神经细胞粘附分子L1在介导轴突外延中起重要的作用(Schachner(1990)神经科学讨论会2：497-507)。依赖于L1的轴突外延由嗜同性相互作用所介导。L1能增强表达L1的轴突细胞和施旺氏细胞以及被L1转染的成纤维细胞中的轴突生长(Bixby等。(1982)美国国家科学院院报，84：2555-2559；Chang等，(1987)细胞生物学杂志104：355-362；Lagenaur等(1987)美国国家科学院院报84：7753-7757；Serlheimer等(1988)细胞生物学杂志107：341-351；Kadaron等(1990a)细胞生物学杂志110：193-208；Williams等(1992)细胞生物学杂志119：883-892)。切除或压碎成年小鼠的外周神经后显著地增强L1的表达(Nieke等(1985)分化30：141-151；Martini等，(1994a)神经胶质10：70-74)。二天内L1积聚在神经元和施旺氏细胞之之间的接触位点，主要集中在施旺氏细胞表面而不是在神经元上(Martini等(1994a)。此外，L1的嗜同结合能力通过与神经细胞粘附分子N-CAM的分子连接而被加强，结果使结合通过嗜同辅助作用而发生(Kadmon等(1990a)；Kadmon等(1990b)细胞生物学杂志110：209-218和110：193-208；Horstkorte等(1993)细胞生物学杂志121：1409-1421)。除了其促轴突外延的特性外，L1还参与细胞粘附(Rathjen等(1984)EMBO J.3：1-10；Kadmon等(1990b)细胞生物学杂志，110：209-218；Appel等(1993)神经科学杂志，13：4764-4775)，粒细胞迁移(Lindner等(1983)自然305：427-430)和轴突髓鞘形成(Wood等(1990)神经科学杂志10：3635-3645)。

L1由6个免疫球蛋白样的结构域和5个纤连蛋白III型同源重复构成。L1起信号转导物作用，在导致胞内信使分子稳定的基态水平变化的一系列复杂事件中，其识别过程为第一步。后者的变化包括肌醇磷酸、Ca²⁺、pH和环核苷酸(Schuch等(1990)神经元3：13-20；vonBohlen und Hallbach等(1992)欧洲神经科学杂志，4：896-909；Doherty等(1992)神经生物学趋势评论2：595-601)以及蛋白激酶如蛋白激酶C和pp60^c-src的活性变化(Schuch等(1990)神经元3：13-20；Atashi等(1992)神经元8：831-842)。L1还和酪蛋白H型激酶和另一个磷酸化L1的未鉴定的激酶有关(Sadoul等(1989)神经化学杂志328：251-254)。L1介导的轴突外延对L型Ca²⁺通道的阻断作用和百日咳毒素敏感。这些发现表明Ca²⁺和G蛋白在L1介导的轴突外延中的重要作用(Williams等(1992)细胞生物学杂志119：883-892)。L1也存在于培养物中的增殖未成熟的星形细胞中，这些细胞的轴突外延比分化的L1免疫反应阴性的星形细胞的轴突外延被更好地促进(Saad等(1991)细胞生物学杂志115：473-484)。然而，发现在体内，在从胚胎期第13天一直到成年期检测的任何发育阶段，星形细胞均表达L1(Bartsch等(1989)比较神经病学杂志284：451-462；和未发表的资料)。

假如L1有促使轴突外延的能力，那么研究是否L1和L1所归属的免疫球蛋白超家族的其它成员的星形细胞表达可能抑制被报道存在于成熟中枢神经系统的胶质细胞和髓鞘上潜在的抑制性分子信号是恰当的(Schachner等，发育神经生物学展望；印刷中：Schwab等(1993)神经科学年述16：565-595)。这特别与开发治疗由中枢神经系统神经组织畸形或损伤引起的衰弱的有效对策有关，它正是本发明所针对的目标发明概述

根据本发明，公开了用于调节神经生长的制剂和相应的方法，尤其是可在中枢神经系统(CNS)的腔隙(compartment)中促进这种生长，更具体地说是在有髓神经组织中。本发明的制剂能在通常认为抑制已知的轴突外延(outgrowth)因子的生长促进刺激物的环境中显著地促使上述神经生长。具体来说，这种抑制环境包括存在于中枢神经系统胶质细胞和髓鞘上的抑制性分子信号。

本发明的制剂广泛选自一组细胞粘附分子，较优选的是神经细胞粘附分子。最优选的是本发明的制剂选自一组属于免疫球蛋白超家族的分子，特别是那些介导非钙依赖的神经细胞粘附的成员，其中L1，N-CAM和髓鞘相关糖蛋白为其中的特别成员。可能也影响中枢神经系统神经生长的其他细胞粘附分子包括层粘连蛋白、纤连蛋白、N-钙粘着蛋白，BSP-2(小鼠N-CAM)、D-2、224-1A6-A1，L1-CAM、NILE、Nr-CAM、TAG-1(轴突蛋白-1)、Ng-CAM和F3/F11。

在本发明的另一方面，本发明的制剂属于一种在本文被称为神经识别分子L1家族的新家族。这个家族包括L1、NgCAM、神经束蛋白、果蝇神经胶质蛋白、蓑L1.1和L1.2及其他成员。这组制剂全部表现为以L1为特征的Ig样结构域和FN样重复，在这方面的连系中，显示为显著的共线性，包括HNK-1糖结构的高度N-糖苷化连接的糖类以及一种包含180kD主带及165和125kD较小带的蛋白片段带型。

本发明的制剂也包括其中能调节中枢神经系统中轴突生长的细胞粘附分子和同族分子片段，它的衍生物和模拟物。尤其是，这些制剂包括含有为细胞外基质分子所特有的结构基元的分子，尤其为纤连蛋白III型同源重复和免疫球蛋白样结构域。优选的是，这些结构基元包括结构上与纤连蛋白III型同源重复1-2和免疫球蛋白样结构域I-II，III-IV和V-VI相似的那些基元。

本发明涉及促进和增强体内神经再生的方法，以及相应的遗传构建物，如质粒、载体、转基因等，以及药用组合物，所有这些都可用于实现上述方法的目的。更具体地说，本发明的制剂可制备成载体或质粒，如通过基因治疗技术导入位于中枢神经系统中需要再生位点的神经细胞中，引起本发明的制剂表达，因而促进必需的神经生长。另一策略考虑在一组合物中配制一种或多种适宜制剂，通过非肠道给药可同样直接导入到中枢神经系统位点。至于某些制剂如L1已表明能嗜同结合，施用这样的组合物可起到抑制而不是促进神经生长的目的。这种效果在不需要或无控制的生长可能发生或正在发生的特殊情况下也许是所希望要的，因此本发明也涉及这种用途。

因此，这些制剂参与嗜同结合的能力将拮抗剂提供给包括其抗体的能用作激动剂的试剂，因而参与促进神经生长和再生。因此，本发明涉及用于本文提出的治疗目的的，适宜的构建物和含为制剂抗体的组合物的制备。而且，正如在本文以后说明的那样，根据本发明，例如L1的抗体可用作药物发现检测或相同的检测的一部分，以鉴别可能具有活性和可用于诊断和治疗的其它制剂。尤其是，如本文后面所说明的，根据CHL1的分离和鉴定，L1的类似物，如多克隆抗体的抗体可用于鉴别L1CAM家族的其它成员，因此本发明涉及应用上述抗体分离的这些CAM成员。本发明还涉及诊断应用，例如，通过检测和测定本发明一种或多种制剂的存在量和活性，可望估测中枢神经系统神经生长潜在的或真正的发展。同样地，如本文后面所述，本发明还涉及包括药物发现分析的分析方法，该分析方法能利用本发明制剂的活性调节中枢神经系统神经生长。例如可通过含本发明的制剂的分析方法检测用于中枢神经系统神经生长调节的前景药物，或连同此方法一起开发的细胞系或者培养物可用作测定系统。

简言之，本发明还涉及在分化的星形细胞和胶质细胞以及来源于此的细胞和组织中表达神经粘附分子的转基因小鼠品系。尤其，神经粘附分子是L1。星形胶质细胞的L1表达增强来自这些转基因小鼠的中枢神经系统组织的轴突外延。

还如所讨论的，本发明涉及增强中枢神经系统神经元的神经外延的方法，增强记忆的方法以及长期强化作用的稳定和其它相似的有用方法测定的增加突触效能的方法。还涉及检测药物方法和调节神经粘附分子的效应其它调节方法，和适用于上述方法的测定系统。

相应地，本发明的一个主要目的是提供一种转基因的哺乳动物，其胶质细胞表达一种外源的神经粘附分子。

本发明的进一步的目的是提供含转基因哺乳动物胶质细胞的细胞培养物。

而本发明的另一目的是提供一种细胞培养系统，该系统含转基因哺乳动损伤或未损伤的视神经或者神经系统的其它部分。

本发明的进一步的目的是提供一种增强中枢神经系统神经元的神经元外延的方法、该方法包括在胶质细胞培养系统上培养神经元。

本发明的进一步的目的是提供一种增强中枢神经系统神经元的神经生长的方法，该方法包括在放置在细胞培养系统中的神经系统的视神经或其它部分上培养神经元。

本发明的进一步的目的是提供一种增强中枢神经系统神经元的神经元生长的方法，该方法包括通过植入细胞来分泌神经粘附分子。

本发明的另一目的是提供一种增强记忆的方法，该方法包括需要增强记忆时，给哺乳动物大脑施用对增强哺乳动物记忆有效的量的胶质细胞培养系统的细胞。

本发明的另一目的是提供一种增强记忆的方法，该方法包括需要增强记忆时给哺乳动物大脑施用对增强哺乳动物记忆有效的量的放置在细胞培养系统中的神经系统的视神经或其它部分的细胞。

本发明的另一目的是提供一种增强记忆的方法，该方法包括在需要上述增强记忆时，给哺乳动物大脑的胶质细胞输入一种载体，该载体允许神经粘附分子在胶质细胞中表达。

本发明的另一个目的是提供一种增强记忆的方法，该方法包括通过植入细胞分泌神经粘附分子。

本发明的另一目的是提供一种在需要这种增加时增加哺乳动物中枢神经系统中突触效能的方法，该方法包括给哺乳动物的大脑施用对增加哺乳动物大脑突触效能有效的量的胶质细胞培养系统的细胞。

本发明的另一个目的是提供一种在需要这种增加时能增加哺乳动物中枢神经系统突触效能的方法，包括给哺乳动物大脑施用对增加哺乳动物大脑突触效能有效的量的放置在细胞培养系统中的神经系统的视神经或其它部分的细胞。

另一个目的是提供一种当需要这种增加时能增加哺乳动物中枢神经系统突触效能的方法，该方法包括在需要上述增强时给哺乳动物大脑的胶质细胞输入一种载体，该载体允许神经粘附分子在胶质细胞中表达。

本发明另一个目的是提供一种增加突触效能的方法，该方法包括通过植入细胞分泌神经粘附分子。

本发明的另一目的是提供一种检测药物或其它实体调节神经粘附分子活性的能力的方法，该方法包括把中枢神经系统神经元添加到胶质细胞培养系统中；再把待检测的药物加入到细胞培养系统中；测定中枢神经系统神经元的神经元外延；并相对于不加药物的对照培养物而言，使在存在药物时细胞的神经元外延水平的差异与药物调节神经粘附分子活性的能力之间的相关。

本发明的另一目的是提供一种检测药物或其它实体调节神经粘附分子活性的能力的方法，该方法包括把中枢神经系统神经元加到视神经或神经系统其它部分的细胞培养系统中；再把待检测的药物加到细胞培养系统中；然后测定中枢神经系统神经元的神经元外延；相对于不加药物的对照培养物而言，在存在药物时，细胞的神经元外延水平的差异与药物调节神经粘附分子活性的能力之间的相关性。

本发明的另一个目的是提供一种用于筛选能调节神经粘附分子产生的药物和其它制剂的检测系统，这种检测系统包括胶质细胞培养系统；和加入到的细胞培养系统的中枢神经系统神经元。

本发明的另一目的是提供一种用于筛选能调节神经粘附分子产生的药物和其它制剂的检测系统，该检测系统包括培养加入了药物或试剂的胶质细胞培养系统；将中枢神经系统神经元加入到细胞培养系统中；和检测神经元外延以确定所加药物的效果。

本发明的另一目的是提供一种用于筛选能调节神经粘附分子产生的药物和其它制剂的检测系统，该检测系统包括在加入了药物或试剂的细胞培养系统中培养视神经或神经系统的其它部分；将神经元加到细胞培养系统中；和检测神经元外延以确定所加药物的效果。

本发明的另一目的是提供一种用于筛选能调节神经粘附分子产生的药物或其它制剂的检测系统，该检测系统包括在用药物或制剂接种中枢神经系统神经元的培养物；加入可溶性的神经粘附分子；和检测神经元外延以确定所加药物的效果。

对确保为详细的描述进行研究并参考下面的附图说明，对于本领域的技术人员来说，其它目的和优点都将是显而易见的。附图简述

图1描述GFAP-L1嵌合转基因图谱。4.05kb的小鼠L1cDNA被插入到用NotI接头修饰过的GFAP基因的外显子中，在该构建物中，L1cDNA的5′的前端是SV40晚期基因剪接区(V)，接在3′之后的是SV40聚腺苷酸化信号(pA)。L1ATG的位置和聚腺苷酸化信号均已显示外显子用框表示。

图2描述来自不同转基因品系的脑RNA的RNA印迹分析。将10μg成年全脑总RNA上样至各泳道上并用鼠L1cDNA探测。曝光时间为3天。1-3泳道为来自不同转基因后代的脑(第1泳道：3426品系；第2泳道：3427品系；第3泳道：3481品系；第4泳道，非转基因对照脑)。注意转基因L1 mRNA(箭头)的水平在三个转基因品系中是不同的，品系3426水平最高，品系3427居中，品系3418最低。右边的空白显示28S和18SrRNA的位置。

图3描述用原位杂交定位来自非转基因小鼠(A、B和E)和3426品系转基因小鼠(C和D)的成年未损伤(A、C和E)和损伤(损伤后15天，B和D)的视神经的L1mRNA。在野生型动物中，L1mRNA仅在视网膜神经元细胞中检测到，而在视神经胶质细胞中没有检测到(A和B)。在转基因动物中，在视神经中可见含L1转录物的细胞(C和D)。L1阳性细胞的密度在神经无髓鞘近端部分最高。损伤后神经中L1mRNA阳性细胞的密度略有增加(比较C和D)。在视神经中，表达L1细胞的分布(C和D)与表达GFAP(E)细胞的分布相似。在图E的标尺为100μm(A-E)。

图4描述双免疫荧光显微镜法定位来自转基因(3426品系，A和B)和野生型(C)动物的非损伤(A和C)和损伤(损伤后28天，B)的视神经中的L1(A和B)和GFAP(C)。损伤后来自转基因动物的视神经的L1免疫反应性明显地增加(比较A和B)。在损伤的转基因神经中的L1免疫反应性图型与未损伤野生型神经中的GFAP免疫染色图型相似。L1阳性的无髓鞘视网膜细胞神经节轴突存在于未损伤的野生型神经(A)中，图C的标尺为50μM(A-C)。

图5描述双免疫荧光显微镜法定位来自3426品系的转基因动物(A、B和C)及野生型动物(D、E和F)的培养的星形细胞中的L1(A和D)和GFAP(B和E)。注意仅来自转基因动物的细胞表达L1，而来自野生型动物的星形细胞为L1阴性。图F的标尺为30μM(A-F)。

图6显示(A)来自转基因和野生型动物的损伤(损伤后15天)和未损伤视神经的蛋白印迹分析。将损伤(泳道1、3和5)或未损伤神经(泳道2、4和6)的25μg总蛋白上样，并用抗L1的亲和纯化的多克隆抗体检测。蛋白提取物从转基因小鼠品系3426(泳道1和2)、3427(泳道3和4)及野生型动物(泳道5和6)中制备。与非转基因的对照相比，转基因动物中的L1表达增加。随着视神经损伤后，在转基因动物中发生L1的上调作用，而在野生型动物中L1的量下降。表观分子量(kD)在左边空白栏显示。

图7描述培养在来自野生型(A和B)和转基因(C和D)动物(3426品系)的视神经冷冻切片上的小鼠小脑神经元轴突外延的实例。A和C表示未损伤的视神经，而B和D表示损伤的视神经。图D的标尺为50μM(A-D)。

图8描述和比较在来自野生型(WT)和转基因动物(品系3426、3427和3418)的非损伤(c)和损伤(l)(损伤后28天)视神经的冰冻切片上维持着的小脑神经元的轴突长度。注意在转基因动物切片上的轴突长度比在野生型动物切片上的轴突长度要长。在转基因品系中，轴突总是在损伤的神经上比在非损伤的神经上要长，而轴突长度在野生型动物的非损伤和损伤神经上没有显出明显的差别。注意在不同的转基因品系中轴突长度与L1的表达水平成正相关(也可见蛋白印迹数据)。显示了来自一个代表性和实验的平均值±平均值的标准误差(样本数超过12)

图9是没有和用抗L1(抗L1)和小鼠肝细胞膜(抗肝脏的亲和纯化的多克隆抗体预保温后，测定在野生型(WT)和转基因动物的未损伤(c)和损伤(l)视神经(损伤后28天)的冰冻切片上保持的轴突长度的图解。以在没有用任何抗体预保温的神经上的轴突长度为100％，在用抗体处理后获得的相同神经切片上的轴突长度以对此值的相对值表示。发现在转基因动物冰冻切片上的轴突长度，经L1抗体处理过的明显降低(60％)。图顶部的数字表示测定每一值用的神经总数平均值±平均值标准误差来自至少双份进行的4次独立实验。

图10描述和比较在缺乏抗体和将切片用抗L2(抗L1)和小鼠肝细胞膜(抗肝脏)亲和纯化的多克隆抗体预保温后，从野生型(WT)和转基因动物(3426品系)制备的星形细胞单层上的小鼠小脑(A)或鸡DRG(B)神经元的轴突长度。以没有用任何抗体预保温的星形细胞上的轴突长度为100％，抗体处理后获得的单层星形细胞上的轴突长度以对此值的相对值表示。在用L1抗体预保温单层星形细胞后仅在转基因星形细胞中可见轴突长度明显降低(约40％)。平均值±标准误差从双份进行的二个独立实验的至少100个神经元中得到。*表示平均值与对照(不经任何抗体处理的野生型或转基因的星形细胞)相比有显著差异(p＜0.05，Mann-Whitney U检验)。

图11表示体内视神经的轴突再生(0-2000μm)。将6-8周龄的GFAP-L1转基因小鼠和野生型小鼠眼眶内压碎处理，14天后用荧光素标记的生物素酯示踪以通过顺行标记法显示视网膜神经节细胞轴突。每点表示一只动物。

图12描述体内视神经轴突再生(0-800μm)。将6-8周龄的GFAP-L1转基因小鼠和野生型小鼠眼眶内压碎处理，14天后用荧光素标记的生物素酯示踪以通过顺行标记法显示视网膜神经节细胞轴突。每点代表一只动物。

图13显示注射鸡L1抗体到IMHV后对一次被动回避试验任务的回避百分率(记忆保留)的影响。每一点代表在对应于训练显示的时间点上接受L1抗体(抗L1)(实圆圈)或生理盐水(空方框)注射的一组鸟。所有动物均在训练后24小时测定(^*表示生理盐水和抗体组间p＜0.05，X^-)。

图14包括二个图，描述在前30分钟和后5.5小时注射Ig I-IV和FN片段对被动回避任务的记忆保留的影响。所有动物在训练后24小时测定。每组动物组以组方图表示(^*为p＜0.05，^**为p＜0.005)。

图15包括一系列图解，显示抗L1(anti L1)的抗体对大鼠海马CA1区切片中锥状神经元的LTP的影响。a，未注射抗体的对照位点在TBS前和50分钟后(箭头)记录的平均(n＝4)EPSP。b，在存在抗小鼠L1的兔多克隆抗体时，在TBS前和后50分钟(箭头)记录的平均(n＝4)EPSP(Rathjen等(1984))，c，在L1抗体(IgG部分，6.2mg/ml○)，或者抗在CHO细胞中重组表达的免疫球蛋白样区I-VI的多克隆抗体(Hynes(1992)细胞69：11-25)(抗血清含大约1mg/ml的特异性抗体，)和下列对照存在下：(1)对照LTP(没有抗体，□)，(2)存在抗小鼠肝细胞膜的多克隆抗体的IgG部分(3.5mg/ml，●)，该抗体强烈地与大鼠海马切片反应(Linder等(1983)自然305：427-430)，(3)存在兔非免疫血清，和(4)存在L1抗体，但没有用TBS诱导LTP(6.2mg/ml○；还见e、f)在TBS前后EPSP起始斜率随时间变化的过程。结果以为基线值的百分率的EPSP起始斜率的平均数±S.E.M表示，基线值在TBS(n＝5)切片前20分钟期间记录得到，切片至少来自3只动物；存在L1抗体时的LTP值与对照LTP有差异，对照LTP与抗L1的抗体组的值相比为P＜0.001，而与抗免疫球蛋白样区I-VI的抗体组相比为p＜0.01)。d，抗L1的多克隆抗体IgG部分对LTP的浓度依赖性降低(6.2mg/ml，○)；2mg/ml，●；0.6mg/rnl，▲；0.06mg/gl，□p＜0.0001)。作为对照，显示来自抗肝细胞膜的多克隆抗体的结果(3.5mg/ml，■)。e，在没有TBS时，使用抗L1的多克隆抗体前和之后60分钟(箭头)所记录到的平均(n＝4)EPSP。f，在没有TBS时，使用抗L1的多克隆抗体前和之后30分钟(箭头)所记录到的平均(n＝4)细胞内兴奋性突触后电流(EPSP)。

图16说明免疫球蛋白样结构域I-VI、多克隆NCAM抗体和寡甘露糖苷糖肽对LTP的影响。a，与对照LTP(20mM Tris/HCl，pH7.6，□)相比，在L1的免疫球蛋白(Ig)样结构域I-VI(216μg/ml，3.2mM；在20mM Tris/HCl pH7.6中，○；p＜0.01)和L1的纤连蛋白(FN)III型同源重复I-V(225μg/ml；3.8mM；在20mM Tris/HCl pH7.6，■)存在下，TBS前后EPSP起始斜率的随时间变化的过程。b，在抗NCAM的抗体(1gG部分，3.9mg/ml，▲)，抗轴突蛋白-1的抗血清(●)和如下对照存在下，TBS前后EPSP起始斜率随时间变化的过程，对照：(1)非免疫兔血清(▲)，(2)非免疫兔血清的IgG部分(3.0mg/ml，◆)，以及(3)存在NCAM抗体(3.9mg/ml，□；p＜0.06)但不用TBS诱导LTP。c.在寡甘露糖苷糖肽(O)，来自无唾液酸胎球蛋白的对照糖肽(●)(二者均为100μM)存在下及缺乏糖肽(□)时，TBS前后EPSP起始斜率随时间变化的过程。结果以换算为基线值百分率的EPSP起始斜率的平均数±S.E.M.表示，基线值在TBS(n＝5或6，切片至少来自3只动物)前20分钟记录得到。

图17图解性描述L1抗体和寡甘露糖苷糖对早已建立的LTP和MNDA受体介导的突触传递的影响。a.在L1抗体用于实验整个过程(6.2mg/ml；O)或TBS后10分钟开始使用时(6.2mg/ml；●)，TBS前后EPSP起始斜率随时间变化的过程。b.在寡甘露糖苷糖用于实验整个过程(100μM，O)或TBS后20分钟开始使用时(100μM；●)，TBS前后EPSP起始斜率随时间变化的过程。c在CNQX(30μM)存在下使用L1抗体前和后30分钟(箭头)所记录到的平均(n＝4)NMDA受体依赖的EPSP。d在CNQX(10μM)存在下使用寡甘露糖苷糖类前和后60分钟(箭头)所记录到的平均(n＝4)NMDA受体依赖的EPSP。图a和b的结果以换算为基线值百分率的EPSP起始斜率平均数±S.E.M.表示，基线值在TBS前20分钟期间记录得到(n＝5，切片至少来自3只动物)。

图18描述克隆pX#2的4.43kb cDNA插入片段的核苷酸序列和小鼠CHL1推导的氨基酸序列。最长的开放阅读框(bp296～bp3922)含以TGA终止密码子终止的1209个氨基酸。表示信号肽(氨基酸1～24)和跨膜区(1082～1104)的2个疏水区已划下线。2个箭头表示从λgt11文库分离得到的克隆311的5′和3′末端。天冬酰胺连接的糖基化的潜在位点(Hubbard和Ivatt，1981)在氨基酸序列下用实心菱形标示。免疫球蛋白(Ig)样结构域用罗马数字从I～VI标数在保守的色氨酸下。特征性的半胱氨酸用圆圈标示。FN-样重复标数为F1～F5，特征性的色氨酸(F1；缺失，F2；W732，F3；W830，F4：W936，F5；W1053)和酪氨酸/苯丙氨酸(F：Y682，F2：Y781，F3：F888，F4：Y989，F5：缺失)用方框标出。括号突出RGD和DGEA序列(分别为氨基酸残基185～187和555～558)。非翻译序列用斜体数字显示。序列数据可从EMBL/Genebank/DDBJ的登记号X94310下得到。

图19描述小鼠CHL1的结构域结构、细菌表达的蛋白片段的编码区和疏水性图。(a)图示表明从CHL1原始序列推导出的结构特征。数字用来表示在翻译起始位点开始的氨基酸序列。从I～VI的Ig样结构域用半圆表示(氨基酸数目指形成二硫键的半胱氨酸)，用框象征从1-5的FN样重复(氨基酸数目指结构域边界)。实圆圈显示潜在的N-糖基化位点。信号肽和跨膜区用划线框表示。(b)线条表示编码在大肠杆菌中产生的重组蛋白的cDNA位置。(c)推导的氨基酸序列疏水性图(Kyte和Doolittle，1982)显示具有公认的疏水信号序列和跨膜结构域(^*)的完整膜蛋白的独特特征。正值表示疏水性。横坐标所标的数字为氨基酸位置。

图20显示L1家族分子的细胞内结构域的排列。从推测的跨膜区后的第一个氨基酸残基开始的细胞内结构域序列，被排序为小鼠CHL1、小鼠L1、鸡Nr-CAM、鸡Ng-CAM、鸡神经束蛋白、果蝇神经胶质蛋白、蓑L1.2。数字指CHL1的氨基酸的位置，灰色框表示在CHL1序列中导入的缺口。在大多数序列中出现的相同氨基酸用黑框标志。三个括号(I、II和III)系指高度保守的一段序列。

图21是小鼠和大鼠不同组织的CHL1和L1mRNA的RNA印迹分析

(a)将从缺少小脑的脑(泳道1，5)，脊髓(泳道3，7)和背根神经节(泳道4，8)来的多聚(A)RNA(2μg)及来自9天龄具小脑小鼠(泳道2，8)的总RNA(10μg)用CHL1(1～4泳道)或L1(5～8泳道)核酸探针杂交。将从肾(9泳道)、脾(10泳道)、肝(11泳道)、胸腺(12泳道)来的多聚(A)^*RNA(1μg)及来自9日龄小鼠的肠(13道)和肺(14泳道)的多聚(A)^*RNA(0.5μg)用CHL1核酸探针杂交。

(b)NGF诱导(1泳道)和未诱导(2泳道)的PC12细胞、COS-1细胞(3泳道)的总RNA(20μg)及9日龄(4泳道)和6天龄大鼠(5泳道)的小脑总RNA(30μg)用CHL1核酸探针杂交。RNA在左边栏显示。

图22表示抗CHL1的多克隆抗体的特异性和CHL1在不同组织中表达。

(a)用对来自脑免疫纯化的L1(1泳道)(2μg))、N-CAM(2泳道(2μg))、MAG(3泳道(2μg))和使用CHL1抗体进行阴离子交换层析纯化的重组CHL1蛋白片段(4泳道(0.1μg)的蛋白质印迹分析。(b)从9日龄小鼠的脑(1泳道)、肝(2泳道)、肺(3泳道)、肾(4泳道)、和肠(5泳道)的粗膜去污剂的裂解物的可溶性(S)和不溶性(M)部分的蛋白印迹分析。在图(b)左边的数字指和脑(1泳道)及肝(2泳道)的CHL1免疫反应带的分子量。

分子量标准用kD为单位在左边(a)和右边(b)栏表示。

图23显示瞬时转染COS-1细胞的CHL1检测。单层培养的CHL-1转染(a)和模拟转染(c)的COS-1细胞用抗CHL1的多克隆抗体免疫染色。(b，d)分别相对应于(a，c)的相差显微图。图d标尺为30μm，从a-d。

图24描述用原位杂交分析对小鼠视网膜、视神经和小脑皮层切片中的CHL1和L1mRNA进行定位。在7日龄小鼠的视网膜中，位于神经节细胞层的神经节细胞(在a中的l)和位于内核层的无长突及水平细胞(在1中的2)可检测到L1mRNA。在视网膜中的其它类型细胞或者在视神经中的胶质细胞不含有可检测水平的L1转录物(a)。在神经节细胞和位于内核层内边(即Vitread)的少数细胞每周可检出CHL1mRNA(b)。位于视神经近侧区(即近视网膜)的胶质细胞可被CHL1反义cRNA探针强烈标记，而位于更远侧区的胶质细胞仅每周才被标记上(b)。在2周龄小鼠的小脑皮层中，在分子层的星状细胞和篮状细胞中(mol)和内粒层的高尔基细胞和粒细胞中(Igl：d)可检出L1转录物。CHL1转录物的分布图形相似，除开在分子层的较薄部分几乎见不到任何标记(b)。用CHL1正义cRNA探针杂交的切片没有被标记(7日龄的视网膜和视神经，见c)。图c标尺为100μm，a-c：图e标尺为150μm，d和e。

图25说明在星形细胞的培养物中的CHL1的免疫荧光显微镜法定位。

培养的小鼠星形细胞的双免疫标记用CHL1的多克隆抗体(a，d)和GFAP的单克隆抗体(b，e)进行，(c，f)分别对应于(a，b和d，e)的相差显微图。图C和F的标尺为20μm，分别对应于a-c和d-f。

图26是去糖基化的CHL1的蛋白质印迹分析。来自7日龄小鼠脑粗膜的去污剂的裂解物的可溶(S)和不溶(M)部分与N-糖苷酶F(N)、O-糖苷(O)、两种酶合用(N+O)或者没有酶(-)温育，然后在蛋白质印迹中和抗CHL1的抗体反应。分子量标准显示在右边空白处，单位为kD。糖基化和去糖基化的CHL1蛋白级分的分子量以kD为单位显示于下面的盆中。

图27显示来自脑组织的CHL1免疫沉淀物中MNK-1糖类的存在用CHL1的抗体将CHL1从9日龄小鼠脑的全脑组织的去污剂的裂解物中沉淀。脑裂解物(1泳道)和免疫沉淀物(2，3泳道)用SDS-PAGE分离，印迹，用抗HNK-1表位的312单克隆抗体(1，2泳道)或CHL1抗体(3泳道)温育。分子量标准在右边空白处显示，单位为kD。

图28：和L929转染体共培养时海马神经元的轴突外延

将来自大鼠第18天胚胎的海马神经元培养在亚铺满的单层的L929转染子或亲本L929细胞上。共培养11-12小时后，固定细胞，用412单克隆抗体(识别HNK-1糖的表位)或抗NCAM的多克隆抗体标记细胞。由于在这些培养物中神经元高度分叉的特点，为了总轴突长度的测定仅测定每一分叉上最长的轴突。

(A)轴突生长被CHL1促进并被抗体抑制。使用(+AB)或不使用抗重组CHL1的多克隆抗体(纯化的IgG 500μg/ml，平板接种后45分钟加入)，将神经元与CHL1转染子(CHL1)或亲本L929细胞(L929)及L1转染子共培养。显示了4-5次独立实验的平均总轴突长度。误差棒是平均数的标准误差。

(B)不同的CHL1细胞系比L1更好地促进轴突外延。神经元培养在表达程度稍有不同的两种不同的CHL1转染子(CHL1细胞系1、CHL1细胞系2)、亲本L929细胞(L929)及L1转染子(L1)上。提供了以L929细胞作对照(ctr)的百分数表示的总轴突长度。误差棒为平均数的标准误。

(C)轴突外延促进作用影响所有长度级别的轴突。提供了使用或不使用如(A)中提供的抗体处理，与CHL1转化体(CHL1细胞系1和2)及亲本L929细胞(L929)共培养的海马神经元的总轴突长度的累积频率分布图。其轴突比某一长度x更长或相等的神经元的百分率(垂直轴)以作为轴突长度x的函数(水平轴)作图。数值来自一次代表性的实验。

图29：和L929转染体共培养的小脑神经元的轴突外延

来自6-7日龄小鼠的小脑神经元在CHL1转染体(CHL1)、不表达转染CHL1的L929细胞(Mock)、亲本L929或L1转染体(L1)上培养20小时。细胞染色按已在图7所述的方法进行。

(A)CHL1促进小脑神经元的轴突外延。显示的是三次实验的总轴突长度平均数。误差棒为平均数的标准误。

(B)CHL1促进小脑神经元的轴突外延也比L1更好。以L929细胞作对照(ctr)的百分数提供总轴突长度，误差棒为平均数的标准误

(C)CHL1增加小脑神经元的轴突外延影响所有各级大小的轴突。以作为轴突长度x(水平轴)的函数，作出具有轴突比某一长度x更长或相等的神经元的百分率的总轴突长度的累积频率分布图(垂直轴)显示的数值来自一次代表性的实验。

图30：用可溶的CHL1处理的海马神经元的轴突外延

海马神经元在多聚-L-赖氨酸覆盖的盖玻片上培养12小时，培养时添加CHL1转染子(CHL1)、亲本L929细胞(L929)、或者L1转染体(L1)的粗膜制备物的上清(40μg/ml总蛋白)。轴突长度的染色和测定按已所述的方法(图7)进行。

(A)来自L929转染子的可溶CHL1促进每个细胞最长轴突和所有轴突的外延。显示了最长轴突的绝对长度和总轴突长度。数值为3次独立实验的平均数。误差棒为平均数的标准误差。

(B)可溶的CHL1促使轴突数目略有增加。将总轴突长度换算为用来自亲本L929细胞(ctr)处理的海马神经元轴突长度的百分数作图。数值为3次独立实验的平均数。误差棒为平均数的标准误差。

(C)可溶的CHL1也影响所有各级长度的轴突外延。显示的是来自一次代表性实验的总轴突长度的累积频率分布图。

图31：L929转染子的CHL1和L1蛋白的凝集反应数量分析及稳定性。

(A)S2细胞转染子的凝集反应数量分析。为检测凝集反应，CHL1-(CHL1)(ctr)和L1-(L1)转染细胞在培养基中培养18h(密度约为3×10⁶细胞/ml)，用(+ind)或不用(-ind)CuSO₄诱导转基因表达。在温育开始和结束时用血球计数器统计颗粒数。凝集反应的百分数按指数(1-N/NO×100)计算。N18和NO分别表示温育期结束或开始时的颗粒数。数值至少为4次独立实验的平均数。误差棒为标准偏差。

(B)L929转染子凝集反应的动力学。将CHL1-转染细胞(CHL1)、CHL1转染不表达的细胞(Mock)、亲本L929细胞(L929)和L1转染细胞(L1)用低浓度的胰酶-EDTA处理从组织培养物上分离，清洗，在聚苯乙烯管中37℃温育。每隔30分钟从每一样本吸取一等分试样，用血球计数器统计颗粒数。结果按图(A)所述表示。显示的数值至少为3次独立实验的平均数。线条为标准偏差。

本发明优选的实施方案详述

具体地说，本发明涉及一些在本文被称作“中枢神经系统神经生长调节剂”(CNGMs)的制剂的应用，尤其是在本文被定义为促进中枢神经系统(中枢神经系统)轴突外延的一类神经细胞粘附分子。通常，由于在胶质细胞中存在抑制性分子信号，成熟的中枢神经系统的神经元不能再生。本发明的制剂和方法能用于克服这种抑制作用并促进中枢神经系统轴突外延。

本发明的制剂包括并可选自任何能调节或促进中枢神经系统轴突外延的任何细胞粘附分子，特别是属于免疫球蛋白超家族的分子。更具体而言，这些分子选自介导非Ca²⁺依赖的神经细胞粘附的免疫球蛋白超家族的成员，包括L1、N-CAM和髓鞘相关糖蛋白。本发明也涉及具有促轴突活性的这些分子的片段、类似物、同源物、衍生物和模拟物。特别优选这些片段的结构基元和包括与纤连蛋白III型同源重复相似的结构域(特别是重复1-2)，和免疫球蛋白样结构域(尤其是结构域I-II、III-IV和V-VI)的类似物。作为本发明的制剂，尤其是L1 CAM家属的成员显示出嗜同结合作用，制剂和它们的拮抗剂，特别是它们的抗体可用作这些制剂有关的受体激动剂，因而可被以用相同的方式用在诊断和临床应用中并用于与试剂本身相同的目的。因此，L1起受体的作用，其受体可用作激动剂，以促进本文所述的轴突外延以协助特别是中枢神经系统中的神经再生。在L1的抗体能用于鉴别在本文将作制剂的神经识别分子L1CAM家属的其它成员的能力中，进一步说明了这种性能，而且本发明相应地扩展到利用上述抗体鉴别、分离和表征的分子。因此，本文下面鉴别为中枢神经系统神经生长调节剂的这类物质被认为在其成员中包括例如L1的CAMs和本文后来所述的例如CHL1的其类似物的抗体。

本发明在一个方面涉及在体内分化星形细胞中中枢神经系统神经生长调节剂(CNGMs)或神经细胞粘附因子的异位表达。已发现在上述星形细胞的单层培养物和成年小鼠视神经的非损伤和损伤的冰冻切片及还在转基因动物体内的视神经压碎实验中，这些分子增强轴突外延。增加的促轴突外延的能力与CNGM异位表达的水平成比例。这可通过对本发明不同的转基因品系表达不同的转基因编码的CNGM基础水平的比较，和视神经损伤后接着增加CNGM表达的相关性来证明。

应当理解尽管损伤和非损伤的视神经适于本发明中使用，同样地能使用神经系统的任何部分，包括脑和脊髓的各部分。

轴突外延依赖于由星形细胞的CNGM表达水平，这说明了CNGM在转基因动物中促进轴突外延而产生的特异的影响。轴突外延被多克隆CNGM抗体而不是被针对小鼠肝细胞膜的抗体所抑制进一步支持这种特异性，尤其是因为这两种抗体能很好地对转基因动物的神经元和星形细胞的细胞表面反应。

在一优选的实施方案，CNGM是L1。L1生物学效应能被L1抗体所抑制，这表明在转基因的星形细胞表面，L1以反式构型具有嗜同活性。此外，不和鸡背根神经节神经元反应的L1种特异性抗体抑制在转基因的星形细胞上的这种神经元细胞类型的轴突外延。这些发现明确地把L1确认为反式活化的活性分子并表明由一般缺乏L1表达的胶质细胞异位表达L1明显地在体外增强轴突外延。

在体内一般不表达L1的胶质细胞上转基因介导的轴突外延的增强作用显示，成年哺乳动物中枢神经系统的胶质细胞能更有助于轴突外延。因此，胶质衍生的促轴突生长的分子随成熟而丢失(Smith等(1986)比较神经病学杂志。251：23-43；Smith等(1990)发育生物学138：377-390)似乎可由识别分子的表达而被补偿，该识别分子一般在成年的哺乳动物外周神经系统的胶质细胞中高度表达(Niecke等(1985)；Bixby等(1988)细胞生物学杂志107：353-362；Seilheimer等(1988)细胞生物学杂志107：341-351)。

来自本发明转基因品系的成熟星形细胞的表型，可针对遭受损伤后施旺细胞相关的重新表达L1的能力而被修饰。由施旺细胞引起的L1表达增加可能通过损伤后自分泌机制上调神经营养素所介导(Seilheimer等(1987)EMBOJ6：1611-1616)。相似地，由培养基中的星形细胞产生的L1表达能被TGF-β和NGF上调(Saad等(1991))通过用GFAP-L1转基因产生小鼠的方法，成熟星形细胞对神经损伤的不反应性用促轴突外延的分子L1的上调作用克服。L1的表达可能特别对中枢神经系统有髓鞘神经的轴突外延有利，一般情况下有髓鞘神经含有几种抑制轴突生长的分子(Schachner等，发育神经生物学展望，印刷中；Schwab等(1995)神经科学年述16：565-595)。

本发明说明星形神经胶质细胞和少突神经胶质细胞的抑制作用至少部分地被本文定义的制剂的促轴突外延特性所克服，尤其是通过被异位表达的L1活性得以阐明。通过星形细胞表达L1也似乎能补偿由少突神经胶质细胞所致的抑制效应。因此，对允许和不允许的分子信号可能没有必要定位于相同类型细胞上以发生轴突外延。反之，上述分子信号可分布在不同的细胞类型中。L1和其它促轴突生长的分子的细胞和分子操作可能因而允许在损伤或疾病后增强成年哺乳动物中枢神经系统的再生能力。

正如前面所述，本发明涉及促进在中枢神经系统中神经生长，包括为再生因损伤或疾病而失去的结构，以及再生那些表现为不完全或未成熟形成的结构和组织所需要的生长。本发明的制剂还显示出本文后面所阐述的神经保护或神经保护作用，例如能被施用于抑制或抵抗各种病因学造成的神经退化或丢失。

本发明涉及包含或通过经基因治疗或相似的方法促进某些制剂表达，或者适当而有益地以药用组合物形式外源施用制剂来治疗损伤或患病的中枢神经系统结构来运送本发明制剂的构建物和组合物。在后一方面，尽管已确认目前已被鉴别的成员，如L1和N-CAM似乎嗜同种结合，并因而可证明用表达的方法传输更有利，但一般认为某些制剂，当以这样的方法施用时能起促生长效应。本发明期望涉及可能的途径和方案。

也应当理解本发明涉及CNGM分泌细胞在调节中枢神经系统中的神经外延、再生和神经存活中的应用，诸如某些可溶的CNGMs和其片段，其同族分子也包括在本发明之中。

因此，如果在本发明中出现时，下列术语具有下面的含义。

术语“制剂”、“中枢神经系统神经生长调节剂”、“CNGM”、“神经识别分子”、“识别因子”、“识别因子蛋白”、“神经粘附分子”和未特别列出的任何变异体可在本文互换使用，并且贯穿整个申请中被使用。权利要求涉及的蛋白质物质包括一种或多种蛋白，并涉及那些具有前述的氨基酸序列和在本文权利要求书中提出的活性全貌的蛋白。前述术语也包括上述蛋白的活性片段、同源物、衍生物、模拟物和类似物，包括与所述制剂表现相似的小分子。

因此，同样可考虑显示基本相同或改变活性的蛋白质。这些修饰可为有意设计的，例如通过定点诱变获得修饰，或者可偶然出现，例如经过在产生复合体或称之为亚单位的宿主中突变得到的那些修饰  另外，术语“中枢神经系统神经生长调节剂”“CNGM”、“神经识别因子”、“识别因子”、“识别因子蛋白”和“神经粘附分子”指包括在本文具体引述的范围之中的蛋白质及基本上同源的类似物和等同的变异体。

本文描述的氨基酸残基优选为“L”异构体形式。不过，以“D”异构体形式存在的残基能取代任何L-氨基酸残基，只要所需的免疫球蛋白结合的功能特性被多肽保持。NH₂指存在于多肽的氨基端的游离的氨基基团。COOH指存在于多肽的羧基端的游离的羧基基团。为与标准的多肽命名一致，生物化学杂志243：3552-59(1969)，氨基酸残基的缩写示于在下列对应表中

                       对应表

          符号                    氨基酸单字母         三字母Y              Tyr                 酪氨酸G              Gly                 甘氨酸F              Phe                 苯丙氨酸M              Met                 甲硫氨酸  A             Ala             丙氨酸S             Ser             丝氨酸I             Ile             异亮氨酸L             Leu             亮氨酸T             Thr             苏氨酸V             Val             缬氨酸P             Pro             脯氨酸K             Lys             赖氨酸H             His             组氨酸Q             Gin             谷氨酰胺E             Glu             谷氨酸W             Trp             色氨酸R             Arg             精氨酸D             Asp             天冬氨酸N             Asn             天冬酰胺C             Cys             半胱氨酸

应该注意的是所有的氨基酸残基序列在本文用通式表示，其左和右的方向为氨基端到羧基端的常规方向。此外，应该注意的是在氨基酸残基序列起点或终止的破折号表示接下一个或多个氨基酸残基的序列的一个肽键。提供上表以表示的三个字母和一个字母的相互关系，它们在本文可能交替出现。

“复制子”是起体内DNA复制的自主单位作用，即在其自身控制下能复制的任何遗传元件(如，质粒、染色体、病毒)。

“载体”是一个复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，另一DNA片段可粘附于载体上，以便造成附加片段的复制。

“DNA分子”系指要么以单链形式或双链螺旋存在的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合物形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，但并不限制其成为任何特别的三级形式。因此，该术语包括已发现的双链DNA、特别是线性DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒和染色体。在讨论特别的双链DNA分子结构时，在本文可根据一般常规方式，仅给出沿DNA非转录链的5′到3′方向的序列来描述序列(即，具有与mRNA同源的序列的链)。

“复制起点”系指参与DNA合成的那些DNA序列。

DNA“编码序列”是一种双链DNA序列，当置于适当的调节序列控制之下时，该序列在体内可转录和翻译成多肽。编码序列的边界由5′端(氨基)的起始密码子和3′端(羧基)的翻译终止密码子决定。编码序列可包括，但并不局限于，原核生物的序列、来自真核生物mRNA的cDNA、来自真核生物(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列以及甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′端。

转录和翻译控制序列为DNA调节序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等，它们供作在宿主细胞中表达编码序列之用。

“启动子序列”是在细胞中能结合RNA聚合酶，并启动下游(3′方向)编码序列转录的DNA调节区。为解释本发明，启动子序列在其3′端以转录起始位点为界，扩大到上游(5′方向)到包括为启动上述背景下可检测水平的转录所必需的最小数目的碱基或单元。在启动子序列中会找到一个转录起始位点(通常由核酸酶S1作图确定)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)。真核生物启动子常常，但不总是含“TATA”框和“CAT”框。除了-10和-35的共有序列外，原核生物启动子含Shine-Dalgarno序列。

“表达控制序列”是控制和调节另一DNA序列的转录和翻译的DNA序列。在细胞中当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列在转录和翻译控制序列的“控制之下”，mRNA然后翻译成由编码序列编码的蛋白。

“信号序列”可包括在编码序列前。该序列编码处多肽N端的信号肽，信号肽与宿主细胞联络以指导信号肽到细胞表面或者分泌多肽到培养基中，而该信号肽在蛋白离开细胞前被宿主细胞切除。发现信号肽与许多源于原核和真核生物的蛋白有关。

术语“寡核苷酸”，在本文用作指探针，定义为由2个或多个核苷酸，优选多个3个核苷酸组成的分子。其确切的大小依赖于许多因素，最终取决于寡核苷酸的最后功能和使用。

术语“引物”在本文系指寡核苷酸，其或者在纯化的限制性消化中自然产生，或者合成产生。当置于引物延伸产物合成的条件下，引物能起合成起点作用，它与核酸链互补。即在核苷酸、如DNA聚合酶的诱导剂和合适的温度和pH存在下，引物被诱导。引物要么是单链或双链，必需足够长以在诱导剂存在下引导所需的延伸产物合成。引物确切的长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。例如，作诊断应用时，取决于靶序列的复杂性，典型的寡核苷酸引物含15-25或更多的核苷酸，尽管它可能含较少的核苷酸。

本文所选的引物“基本上”与特定的靶DNA序列的不同链互补。这意味着引物必须有足够的互补性，能与它们各自的链杂交。因此，引物序列没有必要反映模板的确切序列。例如，非互补的核苷酸片段可与引物的5′端相连，引物序列的剩余部分与该链互补。另一方面，只要引物序列与链的序列有足够的互补性能与此杂交，由此形成合成延伸产物的模板，那么非互补的碱基或更长的序列可散置在引物中。

在此所用的术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”系指细菌的酶，每种酶在特异的核苷酸序列或其附近切割双链DNA。

当上述DNA已被导入进细胞中时，则细胞被外源或异源DNA所“转化”。转化的DNA可整合或不整合(共价连接)到组成细胞基因组的染色体DNA上。例如，在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可保持在如质粒一样的附加因子上。至于真核细胞，稳定转化的细胞是转化DNA已经整合进染色体的细胞，这样转化DNA由子代细胞通过染色体复制遗传，真核细胞建立由包括含转化DNA的子代细胞群体组成的细胞系或克隆的能力可说明了这种稳定性。“克隆”是来自单细胞或共同祖细胞，由有丝分裂形成的细胞群体。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。

当至少约75％的核苷酸与确定长度的DNA序列匹配时(优选的至少约80％，最优选的至少约90或95％)，二种DNA序列为“基本上同源”。基本同源的序列可用序列数据库已有的标准软件比较序列予以鉴别，或者如在确定为对于特别体系的严谨条件下DNA杂交实验中鉴别。确定合适的杂交条件是现有技术中的技术。如见Maniatis等，同上；DNA克隆，Vols I&II，同上；核苷酸杂交，同上。

DNA构建物的“异源”区是指未发现与自然界中的较大有联系的较大DNA分子中的可鉴别的DNA片段。因此，当异源区编码一种哺乳动物基因时，该基因通常由在来源生物的基因组中不是位于哺乳动物基因组DNA侧翼的DNA相接。异源编码序列的另一实例是自然界未发现其本身编码序列的构建物(例如，基因组的编码序列含有内含子的cDNA，或者具有与天然基因不同密码子的合成序列)。等位变异或自然发生的突变事件不产生在本文所述的DNA异源区。

“抗体”是包括抗体和其片段的任何免疫球蛋白，它能结合特异表位。术语包括多克隆抗体、单克隆抗体和嵌合抗体，最后提及的抗体进一步详述见美国专利Nos 4,816,397和4,816,567。

“抗体结合位点”是抗体分子的结构部分，由特异结合抗原的重和轻链可变和高度可变区组成。

本文以各种语法形式采用的短语“抗体分子”意指既是完整的免疫球蛋白分子又是免疫球蛋白分子的免疫学活性部分。

作为实例的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子，基本上完整的免疫球蛋白分子和含互补位免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域熟知的如Fab、Fab′、F(ab′)₂和F(v)，这些部分优选用于本文所述的治疗方法中。

通过熟知的方法对基本完整的抗体分子分别进行木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白裂解反应来制备抗体分子的Fab和F(ab′)₂部分。例如见Theofilopolous等的美国专利，号为4,342,566。Fab′抗体分子部分也已熟知，其从F(ab′)₂部分产生，接着用巯基乙醇还原连接二条重链部分的二硫键，随后用如碘乙酰胺的试剂对所得蛋白硫醇进行烷基化而来。本文优选的是含完整抗体分子的抗体。

以各种语法形式出现的短语“单克隆抗体”指的是仅有一种能和特异抗原起免疫反应的抗体结合位点的抗体。因而典型的单克隆抗体显示对任何能起免疫反应的抗原有单结合亲和性。因此，单克隆抗体可能含有许多抗体结合位点的抗体分子，每一免疫特异性针对不同的抗原，如双特异(嵌合的)单克隆抗体。

短语“药学上可接受的”系指当给人服用时，分子实体和组合物生理学上可忍受，通常不产生过敏性反应或相似的不适反应，如胃不适、头晕等。

本文所用的短语“治疗有效量”意味着足以预防，并优选降低至少约30％，较优选至少50％，最优选至少90％的临床上靶细胞群体S堋活性的明显变化，或者其它的病理学特征如血压升高，发烧或可伴其存在和活性的白细胞计数的量。

当表达控制序列控制和调节该DNA序列的转录和翻译时，DNA序列为“操作性连接”到表达控制序列上。术语“操作性连接”包括在将要被表达DNA序列前具有合适的起始信号(如，ATG)，并维持正确的阅读框以允许在表达控制序列控制之下表达DNA序列和产生由DNA序列编码的所需产物。如果操作者希望插入到重组DNA分子中的基因不含有合适的起始信号，上述的起始信号可被插在基因前。

术语“标准杂交条件”系指对杂交和洗膜二者来说，盐和温度条件基本相等，为5×SSC和65℃。

在一个方面，本发明涉及表达CNGM或神经识别分子尤其是L1，并且优选地在星形细胞中表达的转基因动物。这些动物增加中枢神经系统神经外延的能力。

本发明也包括一种检测系统，该检测系统用于筛选通过干扰或增强CNGM神经识别活性而有效地调节靶哺乳动物细胞的神经外延的潜在药物。“神经识别活性”或“神经粘附活性”意味着CNGM与另一分子结合后的任何生物学效应，包括对第二信使的胞内效应。在一个实例中，通过和对照比较，可将测试药物和活化中枢神经系统神经生长调节剂的配基一起施用到细胞样本中，或者给表达中枢神经系统神经生长调节剂的转基因动物服用，确定其对调节剂与任何化学样品或与测试药物的结合活性的影响。至少一种本发明中枢神经系统神经生长调节剂，尤其是L1，的确定的特性是参与细胞内信使稳定的基态水平的变化，包括Ca²⁺、pH和环核苷酸，以及蛋白激酶的活性变化，如蛋白激酶C、ppbo^c-src、酪蛋白II型激酶和已知磷酸化L1的另一激酶。

更重要的是能修改检测系统，鉴定要么在细胞质或者在细胞核中能与CNGMs或蛋白结合的药物或其它物质，从而抑制或增强转录活性。该检测可用于开发对特定的细胞活性，如神经生长或增加突触效能有特异的药物或者在时间和水平上增强上述活性的药物。例如，上述药物可用于调节对损伤有反应的神经生长，或者治疗其它病理学病，如治疗帕金森病、ALS、享廷顿舞蹈病和阿尔茨海默病的神经退化性疾病

在另一个具体实施方案中，本发明研究了中枢神经系统神经生长调节剂活性的激动剂和拮抗剂。特别是，抑制神经元识别CNGM和L1能力的制剂和分子能用于阻断神经生长，而上述生长是禁忌的，并如前面所述，含上述制剂的药学组合物可以直接施用于靶位点。在另一实施方案中，激动剂可能是具有L1的结构域部分，特别是纤连蛋白III型同源重复2和3的序列的多肽，或者是针对那个区的抗体。这些抗体的每一个可潜在地应用于如L1的特殊CNGM具有进行嗜同结合能力之处(即，L1能结合自身，因而L1的抗体和L1片段本身能与L1结合)。

本发明的一种诊断用途涉及在测定中应用本发明的CNGMs筛选蛋白激酶抑制剂。因为本文描述的CNGMs的活性是被磷酸化的，它们能够的也有可能被特异的磷酸酶脱磷酸化。因此，阻断特异性激酶或磷酸酶是调节这些神经识别蛋白活性的药理学干涉途径。

同样地，本发明涉及开发抗CNGMs的抗体，包括自然产生和重组制备的抗体。例如，可应用这些抗体筛选表达文库，以获得基因和编码CNGMs的基因。上述抗体可能包括由熟知的遗传技术制备的多克隆和单克隆抗体，以及双特异(嵌合)抗体、和包括其他使它们适宜于用于与它们调节神经生长能力有联系的其它诊断用途的功能抗体。

特别地，由于它们与蛋白结合的特殊能力，抗中枢神经系统神经生长调节制的抗体可被选择并包括在本发明的范围之中，因而神经生长调节剂或据信与其有因果联系的特异多肽的活性，通过应用适当标记数量的生长因子调节剂或抗体或其类似物，通过后面讨论的分析方法直接进行分析。

因而，CNGMs、它们的类似物和任何拮抗剂或对此产生的抗体能与各种诊断技术结合使用，包括免疫测定法，如应用由任一放射性物质加入所标记，用硼氢化钠还原或放射性碘化标记的CNGM抗体的放射免疫测定法。

在免疫测定中，可制备对照量的拮抗剂或相应的抗体或相似物的用一种酶，用一种特异结合配偶体和/或放射性元素标记，然后可导入细胞样品中。标记材料或其结合配偶体有机会和标本中的位点反应后，所得到的物质可用熟知的技术检测，这些技术可随附加标记的性质而改变。例如，对于上述下列蛋白材料的目的，可选择抗CNGMs的抗体并适当地运用于实例中的分析方法中。

在放射性标记，如用同位素³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I和¹⁸⁶Re的实例中，可利用目前已知的可得到的计数方法。在标记是酶的例子中，可用本领域熟知的目前应用的比色法、分光光度测定法、荧光分光光度测定法、电流测定法、或气体不定量法的任一种技术完成检测。

本发明包括一种检测系统，它可被制备为检测试剂盒的形式以定量分析神经生长调节剂的存在范围，或者鉴别可模拟或阻断它们活性的药物或其他制剂。该系统或检测试剂盒可包括按本文讨论的放射性和/或酶技术之一制备的标记级分，将标记到神经生长调节剂、它们的激动剂和/或拮抗剂一种或多种另外的免疫化学试剂上，其中至少之一是游离或固定的配基，能任意和标记级分、其标记配偶体、一种待测的级分或它们的结合配偶体结合。

在另一个实例中，本发明涉及某些治疗方法，这些方法以中枢神经系统神经生长调节剂、其(或它们的)亚基、或其活性片段，或者确定拥有同样活性的制剂或其他药物的活性为基础。第一种治疗方法和CNGM、其活性片段、类似物、同源物、衍生物或模似物的存在和活性而导致中枢神经系统神经生长的促进作用有关，并且该方法包括施用对在宿主中促进中枢神经系统发育、再生或康复有效量的一种能调节CNGM产生和/或活性的制剂，相反地，可施用针对CNGM或蛋白的药物或其他中和结合配位体来抑制或预防不需要的神经生长。而且，参与CNGMs或蛋白磷酸化或去磷酸化的特异激酶和磷酸酶的作用调节提供了一种调节基于CNGM/蛋白的活化作用，能伴有增强疗效的调节剂或蛋白活性的方法。

更具体地说，在本文一般所指的治疗方法可包括通过药用组合物的施用，治疗各种病理学的或其他细胞机能障碍和紊乱的方法，药用组合物可包括中枢神经系统神经生长调节剂或其亚单位活性的有效抑制剂或增强子，或者包括如根据本发明的另一方面制备和应用的药物筛选测定法而开发出的其他相等有效的药物。例如，针对中枢神经系统神经生长调节剂或蛋白的药物或其他结合配偶体可施用于抑制或增强结合及第二信使活性。

如上提述，本发明涉及L1CAMs的整个家族的发现，尤其是对L1的类似物名为CHL1。CHL1包括一个N端信号序列、6个免疫球蛋白(Ig)样结构域、和4.5个纤连蛋白III型(FN)样重复、一个跨膜结构域和一个C端，很可能细胞内的结构域约为100个氨基酸。CHL1在其胞外结构域中与鸡Ng-CAM最为相似(约40％氨基酸的同一性)，接着相似的顺序是小鼠L1、鸡神经束蛋白、鸡Nr-CAM、果蝇神经胶质蛋白、及蓑L1.1(分别为37～28％的氨基酸同一性)、小鼠F3、大鼠TAG-1和大鼠BIG-1(约27％氨基酸同一性)。与Ig超家族(如N-CAM、DCC、HLAR、rse)的其他成员的相似性为16～11％。细胞内结构域与小鼠和鸡的Nr-CAM，小鼠和大鼠的神经束蛋白最为相似(约50％的氨基酸同一性)，接着相似的顺序是鸡神经束蛋白和Ng-CAM、果蝇神经胶质蛋白、及蓑L1.1和L1.2(约40％氨基酸的同一性)。除了前已识别的L1家族成员中(小鼠/人L1/大鼠NILE；鸡Ng-CAM；鸡/小鼠Nr-CAM；果蝇神经胶质蛋白；蓑L1.1和L1.2；鸡/小鼠神经束蛋白/大鼠ADGP)高度全面的同源性和保守调节结构外，根据确定为2个邻近的Ig样结构域和FN样重复的之内和之间距离的保安氨基酸残基位置之间的氨基酸数目确定L1的特性标准。这些显示6个Ig样结构域中和邻近的4个FN样重复的共线性，FN样重复在L1和含这些组件的分子之间明显保守，这些组件(命名为L1家族盒)包括F3亚组(小鼠F3/鸡F11/人CNTN1；大鼠BIG-1/小鼠PANG；大鼠TAG-1/小鼠TAX-1/鸡轴突蛋白-1)的GPI连接形式。过去介绍为N-CAM样分子的结直肠癌分子(DCC)与L1家属盒一致。CHL1享有L1家族成员之中的其他结构特征是高度的N-葡糖苷连接的糖类(约为其分子量的20％，它包括HNK-1糖类结构和包括185kD的主带及100和125kD的较小片段的蛋白片段带型。至于L1家族成员之外，在神经系统和较晚发育阶段观察到CHL1的优势表达。

为更详细地说明本发明的优选实施方案提供以下实例。然而，它们绝不应认为是限制本发明的广泛范围。实施例1GFAP-L1转基因和转基因小鼠的产生

胶质纤维酸性蛋白(GFAP，Eng等，(1971)脑研究，28：351-354)在小鼠中枢神经系统发育的晚期阶段主要由星形细胞表达(Landry等(1990)神经科学研究杂志25：194-203),因此GFAP基因的调节序列用于指导转基因小鼠的成熟星形细胞的神经细胞粘附分子L1的表达。GFAP-L1转基因(图1)仅编码神经细胞粘附分子L1，因为GFAP基因做ATP已被突变，随L1编码序列3′端之后的是翻译终止和聚腺苷酸化信号(Toggs等(1994)自然367：188-193)。这个构建物用于建立转基因小鼠的三个不同的品系，命名为3418、3426和3427。

如前所述，将小鼠L1cDNA(Moos等(1988)自然334：701-703)插入到修饰过的鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的外显子1中。(Toggs等(1994)自然367：188-193)含蛋白的整个编码序列和250个3′端未翻译核苷酸的4.05kb的小鼠L1cDNA与修饰过的GFAP-L1转基因融合。

用Sfi I消化将14.5kb GFAP-L1转基因从修饰过的克隆载体中切下，接着电泳和从琼脂糖凝胶中电洗脱。纯化的DNA用T₅E0.1(5mMTris-HCl，pH7.4，0.1mM EDTA)稀释到终浓度为2μg/ml。大约2pl稀释DNA显微注射到从CB6F1雌性(超数排卵的)与C57B/6J雄性交配而来的受精卵的雄原核中。显微操作存活的卵按下列所述的方法(Hogan等(1986)小鼠胚胎的操作，冷泉港实验室，纽约)转移到假孕寄养母鼠的子宫中。实施例2DNA印迹分析

通过从尾活组织检查分离的基因组DNA的DNA印迹分析(Southern(1975)分子生物学杂志98：503-517)，分析小鼠转基因整合进小鼠的基因组中。让转基因建立者小鼠交配，按同样的方法筛选幼鼠以建立转基因品系，将10μg DNA样品用BamHI或者EcoRI和XbaI消化，接着在0.7％琼脂糖凝胶上电泳分离，在碱性条件下转移到HybondN+膜上(Amersham)。L1cDNA的3.3kb的EcoRI片段或从A1.5质粒纯化(Maxwell等(1989)生物技术7：276-280)的SV40晚期剪切和聚腺苷化位点的330 bp Hind III片段，通过随机引物法(BoehringerMannheim)用³²πα-CTP标记，以用作探针。在5×SSPE，5×Denhardt溶液，0.5％(w/v)SDS和0.1mg/ml超声的非同源DNA中，65℃下进行预杂交1小时。杂交过夜。所有DNA印迹最终严谨漂洗条件为65C下0.1×SSPE和0.1％SDS(w/v)。实施例3RNA印迹分析

用致死剂量的水合氯醛麻醉致死成年小鼠(12周龄)，取出大脑，迅速地冷冻在液氮中。通过在液氮中研磨组织分离总细胞RNA。4摩尔的硫氰酸胍加到研磨过的组织中。总RNA的分离按所述方法进行(Chomczynski等(1987)分析生物化学162：156-159；Pagliusi等AMOG神经生物学研究杂志22：113-119)。RNA的产量根据260nm的吸光值估测。将10μgRNA在1％的琼脂糖甲醛凝胶中分级分离以用于RNA印迹分析(Thomas(1980)美国国家科学院院报77：201-205)。

随机引物标记的L1cDNA探针用于同时检测内源的6kb L1mRNA(Tacke等(1987)神经科学通讯82：89-94)和转基因来源的4.2kbL1mRNA。用Image Program(NIH，研究服务分部，NIMH)对原始底片的扫描影像(Arcus扫描仪，Agta-Gavaert)进行RNA印迹的光密度分析。

来自转基因动物全脑总RNA的RNA印迹分析显示预期来自转基因mRNA(图2)的大小为(4.2kb)的L1转录物。这些转录物明显地与为6kb和源自有丝分裂后神经元的内源L1 mRNA不同。光密度法分析显示，与内源L1mRNA水平相比(定级为100％)，源自转基因L1mRNA的水平在品系3426、3427和3418中，分别为34％、13％和8％。

实施例4动物

对冷冻切片、免疫细胞化学和原位杂交实验的培养物来说，对照动物取自年龄配对的正常C57bl/6J小鼠或非转基因的同窝鼠。为了分离小脑神经元和制备星形细胞培养物，采用6天龄ICR非转基因的幼鼠。背根神经节(DRG)的神经元从8天龄鸡胚中制备。

实施例5原位杂交

为证实转基因动物星形细胞体内表达L1，用原位杂交法分析视神经。选择视神经是因为其仅含胶质细胞，没有神经细胞体。一般而言，体内的星形细胞在发育的任何阶段缺乏L1的表达(未发表的资料)。

为在新鲜冷冻脑切片的冰冻切片中检测L1mRNA，通过体外转录产生地高辛配基标记的cRNA(Dorris等(1993)组织化学99：251-262)。将编码L1细胞外部分的序列(Moos等(1988))亚克隆到pBluescript KS+(stratagene)载体中。用XhoI或XbaI线性化所得的质粒后，分别用T7和T3启动子转录L1插入片段而产生反义和有义cRNA探针。为产生GFAP cRNA探针，将编码蛋白N端的GFAP cDNA的1.2kb片段(Lewis等(1984)美国国家科学院院报81：2743-2745；由N.JCowan博士惠赠)亚克隆到pBluescript KS+载体中。通过转录所产生的质粒产生反义和有义cRNA探针，分别从T3和T7启动子用EcoRI和XhoI线性化。为改善组织穿透作用，在碱性水解的条件分级反义和有义探针，得到平均片段长度约为300个核苷酸。按别处所述的方法(Dorris等(1993)；Bartsch等，神经科学杂志，印刷中)。在从成年动物制备(12周龄)的视神经的切片上进行。

在非转基因的对照中，L1转录物仅在视网膜神经细胞中检测到，但在视神经中在损伤前(图3A)和损伤后(图3B)均未检测到。相形之下，L1 mRNA由来自转基因小鼠视神经的胶质细胞表达(图3C)。在神经远端有髓部分和近端无髓部分均可检测到L1mRNA阳性细胞。当与神经有髓远端部分比较时，杂交信号的强度在无髓近端部分更高。

用GFAP cRNA探针观察无髓区和有髓区之间阳性细胞的相似分布和标记强度的相似差异性(比较图3C和E)。不过，转基因动物视神经中L1mRNA阳性细胞的数目总是明显地比GFAP阳性细胞的数目低，有可能是由于L1cRNA探针的低敏感性。另一方面，L1mRNA的可检测水平仅可在GFAP高水平表达的星形细胞中得到。这种阈值效应可能由于设计的GFAP-L1转基因仅含2kb的GFAP 5′侧翼序列。体外研究显示，转录起始位点上游2和6kb之间的区域含有增强GFAP驱动融合基因在C6细胞中表达的序列单元(Sarid(1991)神经科学杂志28：217-228)。最后，GFAP外显子1的修饰，包括大L1cDNA的导入可能降低与GFAP mRNA比较而言的嵌合mRNA的稳定性并改变由位于修饰区上游和下游的调节GFAP序列所起的作用。

视神经损伤后，L1表达的上调作用在转基因的视神经(图3D)而未在非转基因的视神经(图3B)中观察到。表达L1的细胞数目和L1杂交信号的强度在相同的转基因品系的不同个体中相似，但不同的转基因品系有变化。与RNA印迹分析所获的结果一致(见上)，L1 mRNA阳性细胞在品系3426中最为丰富，基次为品系3427，最后为品系3418。在不同的品系中转基因表达水平的这种变异性可能与许多因素有关，尤其是位于不同的转基因整合位点两侧的邻位宿主染色质区引起的效应(Proudfoot(1986)自然322：562-565；Reik等(1987)自然328：248-251；Sapienze等(1987)自然328：251-254)。实施例6抗体

业已描述了抗小鼠L1的多克隆兔抗体的产生和在L1免疫亲和柱上的纯化(Rathjen等(1984)；Martini等(1988))及抗小鼠肝细胞膜的多克隆抗体的制备(Lindner等(1983))；Pollerberg等(1985)。抗GFAP的小鼠单克隆抗体可商业购得(Boehringer Mannheim)。

对于蛋白印迹分析，通过辣根过氧化物酶连接的羊抗小鼠或兔抗体肉眼观察多克隆和单克隆抗体(Dianova，Hamburg，德国)。对于免疫细胞化学法，使用异硫氰酸荧光素或异硫氰酸四甲基罗丹明结合的羊抗兔抗小鼠抗体检测初级抗体(Dianova)。用于原位杂交的地高辛配基标记的cRNA探针通过连接针对地高辛的Fab片段的碱性磷酸酶来肉眼观察(Boehringer Mannheim)。实施例7

神经元在冰冻切片上的维持

为了分析是否来自转基因动物的视神经比来自野生型动物的视神经更有助于轴突外延、小脑神经元被维持在损伤和对侧非损伤视神经的冰冻切片上(图7)。

6～16周龄小鼠的视神经按Bartsch等，(1989)比较神经病学杂志284：451-462所述的方法制备。简言之，用液氮把损伤和非损伤的视神经包埋和冷冻在无血清激素已知的培养基中(Fischer(1986b)神经科学通讯28：325-329)。组织切片(厚14μm)在Frigocut 270冰冻切片机上(Jung-Reichardt)纵向切出，锔在聚-L-赖氨酸包被(Sigma，0.001％在水中)的无菌玻璃盖玻片上，在一无菌的小室中空气干燥2-3小时。用培养基清洗切片5分钟后，将从六日龄ICR小鼠来的Percoll梯度纯化的小脑神经元(Keilhauer等(1985)自然316：728-730)(100μl培养基中有6×10⁴个细胞)加到每一盖片上。细胞维持在37℃，5％CO₂和95％空气的湿润环境的培养箱中。

轴突外延还在抗体存在下测定。将切片与多克隆L1抗体或抗小鼠肝细胞膜的多克隆抗体(100μg/ml，用培养液广泛透析和稀释)在37℃预温育1小时。移去抗体后，切片小心地用培养液清洗(室温下5次，每次5分钟)，然后加Percoll梯度纯化的小脑神经元。2天后，冰冻切片培养物用在PBS中4％的多聚甲醛室温固定30分钟，测定轴突的长度。为避免测定中的“边际效应”，我们没有评价位于外缘包括盖片20％的切片。用半自动的计算机影像分析程序(IBAS，Kontron，Zeiss)，测定了所有生长在这些切片上的轴突长度并算出每个神经细胞体的平均轴突长度。对每次实验和视神经(损伤或非损伤)来说，生长在转基因动物神经上的轴突平均长度和对照动物的相应值有关。用至少2只转基因动物的损伤和对侧非损伤的神经，进行了12次独立的实验。

对转基因动物来说，与非损伤的神经比较观察到在损伤的神经上轴突长度增加。相反，在野生型动物损伤和非损伤视神经的轴突长度没有明显差异(图8)。培养在来自转基因动物未损伤视神经上的神经元轴突始终比培养在来自野生型动物未损伤神经上的神经元轴突要长。当用来自品系3426的切片时，观察到轴突长度最大的增加约为300％。相似地，当和来自野生型动物的损伤神经比较时，在转基因品系损伤神经上的轴突长度增加高达400％。

转基因视神经促轴突外延的活性与L1的表达水平成正相关(图8)。表达高水平L1蛋白的品系3426的非损伤视神经比相比之下低水平表达L1的品系3427和3418(以降低顺序)的非损伤视神经，更有力地增加轴突生长。在品系3426和3427的损伤视神经上(损伤28天后)，轴突生长比在野生型动物损伤的视神经上高4倍。在损伤视神经的神经生长增加对品系3426和3427相似(尽管和品系3427比较，损伤后品系3426显示L1蛋白表达增加25％)的发现可能表明，在品系3427中L1的蛋白水平已经足以用来最大程度地诱导来自小脑神经元的轴突外延。

从野生型动物来的非损伤视神经与抗L1或小鼠肝细胞膜的多克隆抗体预温育没有明显地影响轴突长度(图9)。相反，当来自转基因品系3426的非损伤或损伤的视神经的冰冻切片和L1抗体预温育时，轴突长度降低多于50％(图9)。强烈地与视神经和小脑神经元结合的抗肝细胞膜的抗体(资料未显示)并没有显示相似的抑制效应。令人感兴趣的是，与没有先前抗体预温育来自野生型动物的受损伤视神经比较，来自野生型动物的损伤视神经与L1抗体预温育诱导增加轴突生长。在相同的条件下抗小鼠肝细胞膜的抗体没有显示明显的增加，这表明添加细胞表面反应性抗体本身并不干扰轴突外延。实施例8

神经元在星形细胞单层培养物上的维持

为了制备星形细胞单层，将来自6日龄小鼠的前脑清除各种非神经组织，按他处所述的方法解离(Schnitzer等，(1981)神经免疫学杂志1：429-456；Fischer等(1982a)神经科学通讯29：297-302；Keilhauer等(1985)。将细胞在BME培养基(Gibco)中，在聚-L-赖氨酸包被的(Sigma，0.001％在水中)细胞培养瓶中培养14～20天，该BME培养基含10％马血清和2mM谷氨酰胺。通过每次换培养基时摇晃培养瓶和以4天的间隔亚培养细胞移去污染的少突神经胶质细胞和神经元。培养14天后对GFAP免疫染色显示多于90％的细胞是星形细胞。培养14天后，细胞被胰酶消化，并在聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖片单层培养5天。然后，将来自6日龄小鼠Percoll梯度纯化的小脑神经元(Schnitzer等(1981))和来自8日龄鸡胚胎的背根神经节(DRG)(Seilheimer等(1988)细胞生物学杂志107：341-351)的神经元加到星形细胞单层上。与小脑神经元共培养6天和DRG神经元共培养12天后，共培养物用在PBS中的2％多聚甲醛固定，按实施例7所述的方法分析轴突长度。

还在源自转基因(品系3426)或非转基因对照的单层星形细胞培养物中研究了来自小鼠小脑神经元或鸡背根神经节(DRG)神经元的轴突外延(图10，表1)。             表1培养在从野生型小鼠(WT)和转基因品系3426制备的星形细胞单层上的小脑神经元和背根神经节(DRG)神经元的轴突长度

         小脑神经元     DRG神经元

WT          65±34mm      90±10mmWT+抗L1     72±30mm     105±14mmWT+抗肝脏    57+24mm     107±12mm3426        75±41mm      137+10mm3426+抗L1    45+25mm        88+8mm3426+抗肝脏  8±31mm     124±15mm

  显示了没有用任何抗体预保温或用抗L1的多克隆抗体(抗L1)或抗小鼠肝细胞膜抗体(抗肝脏)处理后在星形细胞上的轴突长度。平均值±标准偏差来自一次四份重复二次独立进行的实验的至少100个神经元。

当与使用野生型星形细胞的轴突长度比较时，在转基因星形细胞上小脑或DRG神经元的轴突长度分别高约15％或50％(表1)。抗肝细胞膜抗体不影响来自野生型或转基因动物的星形细胞单层上的轴突长度(图10，表1)。星形细胞单层与L1抗体预温育没有明显影响来自野生型动物细胞上的轴突长度。相反，它降低生长来自转基因动物细胞上的小脑神经元或DRG神经元的轴突长度约40％。在本文中值得注意的是在本研究所用的直接抗小鼠L1的多克隆抗体和来自鸡的神经元没有反应(Martini等，1994a；资料未显示)。不过，借助于免疫荧光分析，可显示这些抗体如L1抗体与自转基因动物的星形细胞及与小鼠小脑神经元一样有效地结合(资料未显示)。实施例9

免疫荧光和Aurion-GP免疫金显微术

新鲜冷冻横或纵切的野生型和转基因动物视神经或星形细胞单层的L1和GFAP免疫染色按所述方法进行(Bartsch等(1989))为了双标记法，我们首先用L1抗体(在PBS，1％BSA中，2μg/ml)4℃温育活星形细胞30分钟。用70％甲醇在-20％下渗透细胞10分钟后，细胞和GFAP抗体4℃温育30分钟。

为在冰冻切片培养实验中定量轴突长度，根据厂家的说明(Aurion，免疫金试剂和辅助习惯标记法，Wageningen，荷兰)略作修改，使用Aurion免疫R-Gent银增强染色法。简言之，培养物用4％多聚甲醛的PBS中室温固定10分钟，用50mM甘氨酸的PBS中温育10分钟，然后在封闭缓冲液(BB，0.5％BSA在PBS中)中处理15分钟。用BB洗3次，每次5分钟后，细胞和用BB稀释的L1抗体(2μg/ml)室温温育30分钟。接着，培养物用BB洗3次，每次5分钟，在室温下加用BB以1∶20稀释的第二抗体1小时。用蒸馏水洗3次后，培养物用2％戊二醛的PBS室温固定10分钟，用蒸馏水洗3次。然后室温下加入1∶1混合的增强剂和显色剂。出现反应产物后，盖片用蒸馏水洗3次，用甘油封片。

在非转基因小鼠的视神经中，L1免疫反应性局限在无髓视网膜神经节细胞轴突上(Bartsch等，(1989))。在来自转基因动物未损伤的视神经中，也发现与细胞体和放射状细胞外延有关的弱的L1免疫反应性(图4A)。在转基因的视神经中的这种L1免疫反应性强度损伤后明显增加(图4B)，并与在非损伤(图4C)或损伤(未显示)的野生型神经中找到的GFAP免疫反应性的分布相似。

在制备自6日龄转基因动物前脑的星形细胞培养物中，另外分析了L1的表达。自野生型动物的星形细胞上没有可检测到的L1免疫反应性(图5D)。相反，L1阳性细胞存在于来自转基因动物的培养物中(图5A)。如由双免疫染色所示，相同的细胞也证明对GFAP阳性(图5B和E)，表明表达L1的细胞的确是星形细胞。因为L1的免疫染色在活细胞上进行，似乎有可能在转基因动物中，L1在体内也暴露在星形细胞的细胞表面。实施例10蛋白印迹分析

为进一步定量在GFAP-L1转基因小鼠中L1的表达量，在蛋白印迹上分析来自野生型和转基因成年小鼠的非损伤和损伤(损伤后15天)视神经匀浆物的去污剂提取物(图6)。

来自8周龄动物损伤(损伤15天后)和对侧非损伤的视神经被清除不含非神经组织，然后冷冻在液氮中。应注意的是仅用神经有髓远端区，而不用L1免疫反应性的神经无髓或部分有髓近端区。在4℃用Branson B15超声器超声5分钟前，冻融神经10次。然后将组织在匀浆缓冲液中(1％Triton X-100，2M尿素，5mM苄脒，0.1mM碘乙酰胺，1mM苯甲基磺酰氟，溶在PBS中的5mM-对甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮钠)用Dounce匀浆器匀浆。匀浆物以16,000g，4℃离心15分钟变清。按Wessel等(1984)所述的方法，将上清用甲醇/氯仿处理以沉淀蛋白。测定上清液中的蛋白含量(Pierce)。在还原条件下7％板胶上SDS-PAGE后，蛋白(25μg)通过蛋白印迹用多克隆L1抗体(0.4μg/ml)分析。辣根过氧化物酶连接的二抗(2μg/ml)由ECL蛋白印迹检测试剂盒(Amersham)检测。免疫印迹的光密度分析用ImageProgram(NIH，研究服务分部，NIMH)，在原始底片的扫描影像(Arcus扫描仪，Agfa-Gavaet)进行。

免疫印迹的光密度分析说明在转基因动物未损伤视神经中的L1表达比在野生型动物未损伤视神经中高约40％和13％(分别为品系3426和3427)。与野生型动物损伤视神经比较，在损伤的转基因神经中的L1表达高310％和200％(分别为品系3426和3427)。来自野生型动物的损伤和对侧未损伤的视神经之间比较显示、L1蛋白表达在损伤侧面降低约40％。相反，当与非损伤对侧面比较时，L1的蛋白量在品系3427和3426的损伤神经中增加了约30％。对非损伤和损伤的视神经来说，在品系3426中L1的表达水平比在品系3427中分别高约35％和25％。实施例11视神经体内轴突生长

6-8周龄的老GFAP-L1转基因小鼠和野生型小鼠眼眶内压碎，14天后，用荧光素标记的生物素酯通过顺行标记法示踪标记视网膜神经节细胞轴突。结果在图11和12显示。每一个点代表1只动物。实施例12神经细胞粘附分子L1的纤连蛋白III型同源重复2和3的边界部分鉴定被为促轴突生长和信号转导的结构域

为确定涉及轴突外延的神经细胞粘附分子L1的结构域，制备抗L1的单克隆抗体并研究它们对培养物中的小脑神经元轴突外延的影响。当11个抗体被底物包被时，只有抗体557 B6同L1一样有力促进轴突生长，增加细胞内Ca²⁺水平和刺激肌醇磷酸的转换，其中抗体557.B6识别位于在纤连蛋白III型同源重复2和3之间的边界的包含氨基酸818～832的一个合成肽表示的表位。这些发现暗示轴突外延和这些第二信使的变化互相关联。上述的相关性被Ca²⁺通道拮抗剂和百日咳毒素能抑制L1和抗体557.B6所致的轴突外延所证实。这些观察首次表明结合于细胞表面L1的独特位点作为明显的信号转导结构域，增加肌醇磷酸的转换和提高胞内Ca²⁺水平，其中通过该信号转导区，识别事件似乎被汇集以触发轴突外延。实施例13在神经移植的外周神经中的L2/HNK-1免疫反应性：前运动轴突有关的施旺细胞的优先表达

在成年小鼠中，糖类表位L2/HNK-1(下文称为L2)通过髓鞘化腹根和肌肉神经的施旺细胞来表达，但很少由背根或皮肤神经的施旺细胞的髓鞘化的来表达。由于被底物包被的L2糖脂促进培养运动神经元而不是感觉神经元的外延，因而L2可通过体内再生运动轴突影响肌肉神经的优先移植。

因此，通过指导运动或感觉轴突进入8周龄小鼠股神经的肌肉和皮肤分支中来分析再生轴突对由神经移植的施旺细胞引起的L2表达的影响。来自皮肤分支的再生轴突并不导致在肌肉或皮肤神经分支中免疫细胞化学上可检测的L2表达。来自肌肉分支的轴突再生导致由皮肤分支的少数施旺细胞引起的L2弱表达，而促进由肌肉分支的许多施旺细胞引起的L2强表达。因而在它们与运动轴突接触而表达L2的能力上以前和运动轴突联系的髓鞘化施旺细胞与以前和感觉轴突联系的髓鞘化施旺细胞不同。在神经移植的关键阶段这种L2表达的上调作用可能提供运动轴突再生进入合适的肌肉通路，比那些再生进入不合适的感觉通路的轴突具有优势。实施例14L1巩固在小鸡中对被动回避任务的记忆

在一次试验被动回避任务中，如果小亮珠包有苦味的氨茴酸甲脂时，学会了抑制它们啄小亮珠的趋向性的训练数目的小鸡，导致了时间依赖的细胞和分子级联，在前脑的2个不连续区，中间内侧超纹状体腹沟(IMHV)和Lobus parolfactorius(LOP)中，重建突触前和后的要素中达到了顶点(Rose(1991)神经科学动向14：390-397)。级联涉及由增强岩藻糖掺入所证实的2种明显的糖蛋白合成波，其在训练后，在IMHV和LPO中发生变化的次数。2种波对用于回避任务的长时(即，加24小时)记忆保留是必需的，其中通过啄试验中的干珠小鸡来证实记忆遗忘，否则它们将回避以前的苦珠。

假如L1在介导细胞-细胞接触中有作用，进行本研究是为了确定L1是否是参与糖蛋白合成的任一种或二种波和学习有关的糖蛋白，及对记忆形成是否是必需的。如果真是这样，在与训练有关的适当时间施用抗L1的抗体将阻止长时记忆必需的突触重建，因此产生对任务的遗忘。相似地，如果L1分子的细胞外区域在突触重建和稳定化需要的识别和粘附过程中起作用，那么与外源分子嗜同结合的外源使用的细胞外结构域片段可能干扰这种过程。抗体和片段

按照已建立的免疫接种方法(Rathjen等(1984)进行免疫接种，通过用免疫亲和纯化的L1(Ng-CAM，8D9)免疫接种在兔中制备多克隆抗体。再用8D9单克隆抗体(Lagenaur和Lemmon(1987)美国国家科学院院报84：77533-7757)柱，使用建立的方法(Rathjen等(1984))从一日龄鸡脑中分离L1。用G蛋白琼脂糖凝胶(Pharmacia LKB)按厂家的说明，从第三次免疫接种后所获的血清中分离抗体。显示有6个免疫球蛋白样(Ig-I-VI)和5个纤连蛋白III型同源重复(FN1-5)在大肠杆菌中的重组表达的融合蛋白按Appel等(1993)所述的方法制备鸡亚细胞部分的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹

将全部来自数日龄鸡脑的脑匀浆、粗膜、可溶性部分(Burchuladze等(1990)脑研究535：131-138)和突触后密体(Murakami等(1986)神经化学杂志46：340-348)的50μg蛋白，在还原条件下的5-15％聚丙烯酰胺梯度凝胶上用SDS-PAGE(Laemmli(1970)自然227：146-148)分离，然后按(Burnette(1981)分析生物化学112：195-203)的方法将它们转移到硝酸纤维素膜上。在与用含5％脱脂奶粉，pH7.2的Tris-缓冲盐溶液以1∶000稀释的L1抗体温育过夜后，按前述方法(Scholey等(1993)神经科学55：499-509)检测免疫反应性带。训练和测验步骤

将在温箱中孵化两种性别的数日龄POss结实小鸡成对养在小圈中，按Lossner和Rose(1983)神经科学杂志41：1357：1363)所述的方法，预先训练小鸡啄小(2.5mm)白珠，然后训练啄用氨茴酸甲酯包被的较大(4mm)铬珠。啄苦味的鸟显示刻板的厌恶反应，激烈摇头，并远离该珠。训练后24小时，通过显示与训练中相同的干铬珠测验每只动物。在动物回避试验珠中显示被动回避学习能力的保留。在这种方案的每次重复试验中，训练和检测了24～36只小鸡。虽然有时在注射生理盐水的小鸡中轻微降低回避率，80％以上的训练过、未注射的小鸡在这些条件下检测时一般回避珠子。相反，用水包被的珠训练出的小鸡试验时拼命地啄干珠，它们的回避值很少是5～10％以上。所有训练和检测由一个不知道预先处理动物的实验者按常规进行。注射

L1抗体、FN1-5和Ig I-VI片段在0.9％生理盐水中透析过夜，调整浓度L1为1mg/ml和片段为250μg/ml。小鸡从每半球10μl L1抗体接受双侧颅内注射进中间内侧超纹状体腹部(IMHV)，对照动物接受相似的生理盐水注射。应用特别设计的头夹和袖式Hamilton注射器获得准确的输送IMHV(Davis等(1982)药理生物化学。行为学17：893-896)。训练或检测前接受这种不论是生理盐水还是抗体体积的注射的小鸡未显示明显的行为影响，训练中仍准确地啄珠。新孵化小鸡的大脑的胞外大体积意味着这种体积的注射可被很好耐受，并可获得没有泄漏的效果。以前的报告证实(Scholey等(1993))注射后数小时，抗体从注射点缓慢扩散。注射设置的准确性通过死后对大脑的肉眼检查进行常规检验。在实验的每次重复中，采用注射生理盐水和抗体或片段的小鸡的平衡组。在L1实验中，在与训练有关的8个时间点中的一点；训练前2小时或30分钟，或者训练后+1小时、+3小时、+4小时、+5.5小时、+8小时或+12小时用生理盐水或抗体注射小鸡组。根据以前的观察，可预见在或者训练前30分钟或者训练后5.5小时注射的鸟中，任何效果均可观察到，在这些时间点上重复的数目相应地较大(对于抗体注射分别为N＝17，28，17，19，18，21，19和18)。在-30分钟或者+5.5小时注射L1片段FN1-5和Ig I-VI，在24小时时检测保留率。由X²的统计学法比较注射生理盐水和L1抗体或L1片段的小鸡各组的保留率。结果显示在图13和14中。实施例15在长期强化中涉及L1和NCAM

用标准技术制备来自卤代烷烃麻醉雄性Wistar大鼠(180-220g)横向海马切片(400μm)。将切片放置在一个界面小室中，开始时让其室温下在高渗(320mOsm/kg)的人工脑脊液(ACSF)中恢复45分钟。然后将水浴温度升高到30C，培养基改变为压力正常的ASCF(307mOsm/kg)，其中含(用mM表示)：NaCl，1240；KCl，25；MgSO₄，2.0；CaCl₂，2.5；KH₂PO₄，1.25；NaHCO₃，26.0；葡萄糖，10；蔗糖，4；用95％O₂/5％CO₂(pH7.4)冒泡；灌流率：0.75ml/min。通过放在CA1区放射层中的弯曲铂依线(直径50μm)刺激舍弗尔并行/连合纤维。测试刺激包括每30秒持续100μs的单相脉冲，调整刺激强度以得到30％的最大EPSP幅度(没有重叠群体峰的最大EPSP)靠2根位于离每边刺激电极约300μM远的玻璃微吸管(2M NaCl，1～5MΩ)，从CA1放射层记录EPSP的值

稳定记录至少15分钟后，用改进的微注射系统(Nanoliter注射仪，WPI)将抗体或蛋白片段喷到在一个记录电极(小心调整电极在30％)附近(50～75μm)的CA1树突区上，除非另有说明，每10秒连续传送5nl直到实验结束。由于明显的原因洗去抗体后接着诱导LTP是不可能的，但在每一切片中，通过从没有使用抗体的第二电极的记录可证实是否能诱导LTP。虽然喷射微吸管的顶端没有穿过切片，当喷射开始时有时可观察到EPSP幅度的小量降低这种强度人为现象与喷射物质的性质无关。除非另有说明，将蛋白在20mM PBS pH7.4中透析，浓度系指吸管浓度。

开始微喷射后20分钟，用一爆发刺激(TBS)范式诱导LTP，该范式由间隔4秒的3串波组成；每串由100Hz 5个脉冲的10个高频率爆发及爆发由200ms所分隔组成(Reichardt等(1991)神经科学年评14：531-570)。刺激脉冲的持续时间在TBS中加倍。LTP的诱导可完全被10μMD(-)-2-氨基-5-戊酸(D-AP5；Tocris)的灌流所阻止。应用EPC-9膜片钳增强仪及“盲目的”膜片钳方法，从CA1神经元获得全细胞记录。温浴温度为30℃。用1.5mm OD硼硅酸盐玻璃拉膜片电极，其电阻为3～8MΩ。吸管既不用火光滑也不加层。电极常规地放在含(用mM)：葡糖酸钾，129；KCl，5；MgCl₂，1；CaCl₂，1；N-1-(羟乙基哌嗪)-N′-(2-乙磺酸)，5；1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)，5；Na-ATP，10和Na-GTP，0.3，用KOH调整pH为7.3的溶液中，系列电阻没有被补偿。反应以3～4个信号的平均值取样，或者打印出来作肉眼分析，或者贮存在硬盘中作进一步分析。用设计比较和对比分析的方差分析进行统计学评价；时间被认为重复测定一个水平的从属变量。按前所述产生抗L1(Rathjen等(1984))，抗Ig I-VI(Hynes等(1992))和抗肝细胞膜的抗体(Linder(等(1 983))。结果显示在图15

按所述(Hynes等(1992)的方法进行L1的Ig样区域和FNIII型同源性重复I-V在细菌中的表达和纯化。按所述(Larson等(1986)科学232：985-988；Bailey等(1992)科学256：645-649)的方法产生抗NCAM和轴突蛋白-1的抗体。从核糖核酸酶B来的寡苷露糖苷糖肽和来自脱唾液酸球蛋白(asialofetuin)的对照糖肽的制备已有描述(Larson等(1986)。结果显示在图16。

在使用抗体或糖肽前起始20分钟，应用30μM非NMDA阻断剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮分离NMDA受体介导的EPSP在每次实验结束时，可证实D(-)-2-氨基-5-膦酰基戊酸(D-AP5；30μM；Tocris)完全抑制这些反应。结果在图17显示。

实施例16L1产生神经保护效应

进行实验进一步说明L1对中枢神经系统神经组织的活性。具体地说，将小鼠中脑细胞等份试样进行平板接种，并培养在具有如下制备的培养基的4个不同的板上：第一个对照板仅用聚-L-赖氨酸包被；第二个板有用聚-L-赖氨酸和L1包被；第三个对照板用聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被；第四个板用聚-L-赖氨酸、层粘连蛋白和L1包被。所有平板接受等量细胞并培养在相同的条件下。7天后，将这些平板都进行染色以证实多巴胺的存在，然后观察。用L1包被的板显示比对照更多的生长，为200％～400％。用层粘连蛋白包被的板显示更大的轴突外延，但细胞并不比用L1包被的板多。结果说明和暗示L1产生很大的神经保护效应，因为通过生长的细胞数目测定的细胞成活率明显地比对照增加。

实施例17可溶性L1(L1-FC)在神经存活中有功能活性并且是有效的制剂

按在神经元14：57-66，1995所述的步骤以重组L1-FC融合蛋白的形式在COS细胞中制得可溶性L1。重组蛋白由蛋白A亲和层析纯化，并被用作覆盖在塑料瓶上的底物，或者作为以约1-10μg/ml加到培养基中的溶性分子。体外维持培养7天后检测来自第17天的大鼠胚胎中脑神经元的轴突外延和存活。多巴胺能神经元由免疫染色多巴胺-β-羟化酶(DBH)加以识别，并用IBAS形态测定设备定量。将加有可溶性L1-Fc的培养物维持在聚-DL-鸟氨酸(PORN)上，并将底物覆盖的L1-Fc加到在前已涂PORN的顶部(在Appel等，神经科学杂志(3：4764-4775，1993中已描述的条件下)。NCAM-Fc用作对照。表DBH-神经元在体外7天后的存活和轴突生长

	神经元数目-	轴突长度--
			底物覆盖的L1	129±20	179±40
可溶性L1	98±7	135+27
			仅PORN(对照)	14±2	37±9

平均值至少来自3次独立实验±SEM

-数量来自单位视野

--测定每个神经元所有轴突(总轴突长度)的长度(以μm表示)

神经细胞之间的识别是机能神经系统发育的一个重要的必要条件。识别分子在细胞表面表达，在那里它们介导邻近细胞之间的相互作用，如钙粘着蛋白，或者介导细胞表面和胞外基质之间的相互作用，如整联蛋白(Takeichi，1991；Ruoslathi，1988；Hynes，1992)。识别分子最重要的家族包括免疫球蛋白(Ig)样结构域。Ig样结构域反映了免疫球蛋白和细胞粘附分子的共同祖先，其中两者涉及特异的识别事件(Edelman，1970)。在神经系统中，迄今为止Ig超家族包括多于24种不同的分子。有些含Ig样结构域的分子在细胞外结构域中有许多功能；作为细胞因子和神经营养素的受体既有识别特性又有高亲和力的感受功能(Tannahill等，1995；Pulido等，1992)。Ig样结构域的三维结构与FN样重复相似(Main等，1992；Leahy等，1992)，它也是几种胞外基质分子中。如纤连蛋白、键生蛋白家族成员及其他分子的结构基元(Williams和Barclay，1988；Baron等1992；Erickson，1993)。Ig超家族的神经识别分子具有独特的短暂性的spatlel和细胞类型特异的表达类型(综述见Edelman 1988；Schachner，1991，1994；Rathjen和Josseli，1991；Rutiehauser，1993)。这个家族的识别分子在所有促细胞粘附和轴突外延部分结构性重叠。某些识别分子强烈地嗜同，即自身结合配偶体，而其他优先地嗜异，即它们与非自身配偶体结合，非自身配偶体常包括Ig超家族的其他成员或胞外基质分子(Brummendorf和Rathjen，1993，1994)。对神经识别分子单独的Ig样结构域和/或FN样重复的功能特性的目前了解显示了在识别、轴突生长和排斥中的不同的，并且重叠的功能特性(Gennarini等，1991；Frel等，1992；Taylor等，1993；Appel等，1993，1995；Pesheva等，1993；Feisenfeld等，1994；Hoim等，1995)。

在Ig超家族神经识别分子中，与神经识别分子L1有关的分子家族显示在功能和结构方面惊人的相似性。它们是有效的轴突生长促进剂，在发育过程相对晚期表达，大部分在轴突发生开始阶段表达。它们主要地由神经元表达，尽管L1家族的某些成员也存在于促轴突外延的胶质细胞上(Martini和Schachner 1986；Bixby等，1988；Seilheimer和Schachner，1988)。

在下面的实验中，鉴定和分析了L1家族的另一成员，它被命名为L1的几乎相等的同源物(CHL1)。它含有6个Ig样结构域和FN样重复，其中4个是与其他L1家族成员的FN样重复高度同源。部分FN样重复位于分子的近膜区，这是L1有关分子中最可能变化的区域。CHL1与L1家族的成员共享的其他特征是其在神经系统中数量占优势，在发育晚期表达及其高度的N-糖基化水平，包括HNK-1糖类的表达。实施例18材料和方法动物ICR小鼠和Wistar大鼠用于组织制备。抗体

直接抗重组表达CHL1(氨基酸499-1063(图18和19))和L1(氨基酸126～1981(Appel等，1993))的胞外部分的多克隆抗体，按所述的方法(Rathjen和Schachner，1984)在兔中产生。为引起抗CHL1的抗体，将200μg纯化的peplitle注射到兔子中，接着以3周间隔另外加注射100μg共4次。用硫酸铵沉淀法从血清中浓缩L1抗体(13.5mg/ml)。用单克隆大鼠抗体41 2识别HNK-1糖表位(Kruse等，1984)。抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的单克隆抗体从Boehringer(Mannhelm)得到。抗O1抗原的单克隆抗体已有描述(Sommer和Schachner，1981)。神经粘附分子的纯化

用单克隆抗体柱从成年小鼠脑粗膜部分的去污剂提取物中，免疫亲和纯化L1、N-CAM和MAG(Rathjen和Schachner，1984；Falssner等，1985；Poltorak等，1987)。cDNA文库和筛选

来自8日龄小鼠脑Poly(A)⁺RNA的λgt11文库的制备和用免疫亲和纯化的多克隆L1抗体筛选该文库，按所述的方法(Tacke等，1987)进行。为得到较长的cDNA克隆，构建了一个新的DNA文库：从6～14日龄小鼠脑中，用硫氰酸胍/酸性苯酚法(Chomezynski和Sacchi，1987)纯化RNA。用二次先后过寡(dT)纤维素柱(Sambrook等，1989)富集Poly(A)^-RNA。用cDNA合成试剂盒(Amersham)，将8微克的poly(A)⁺RNA用于寡(dT)引物双键cDNA的合成。按大小挑选cDNA，用含Sal I位点的Dra II衔接子连接到质粒pXMD1上(Kluxen等，1992)。为繁殖和扩增文库，使用大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，荷兰)。为了筛选，将各等份试样以约2×10⁴细菌/膜的密度(138cm³)直接接种在尼龙膜(BIODYNE^TM Pall)上。影印滤膜37℃温育过夜，接着，裂解细菌(0.5M NaOH；1.5M NaCl)，中和滤膜(3M NaCl；0.5MTris-HCl pH8.0)，在2×SSC中清洗，空气干燥，在80℃烤2小时。尼龙膜被预杂交，和按厂家的方案随机引物法(BoehringerMannheim)放射性标记的CHL1(来自λgt11文库)的1kb片段(HincII/KpnI)杂交，在高严谨条件下42℃洗膜，然后按别处所述的方法(Sambrook等，1989)对X光片曝光。根据标准方法(Sambrook等，1989)，通过限制作图和测序进一步表征6个阳性克隆。含4.43kbCHL1插入片段的一个克隆(pX#2)用于进一步分析。DNA测序和序列分析

通过双脱氧链终止法(Sanger等，1977)，用双链DNA作T7 DNA聚合酶(Pharmacia)的模板和合成寡核苷酸作引物，测定核苷酸序列。收集cDNA序列，用DNASTAR程序(DNASTAR，Inc，伦敦)分析。除非另有说明，氨基酸序列用Jolun Hein法排序(Hein，1990)(缺口补偿＝11，缺口长度补偿＝5，K元组＝2)。蛋白序列比较

为计算相似性指数(％)  以比较保守氨基酸残基之间的距离，几种含6个Ig样结构域和至少4个FN样重复的不同蛋白在Ig样结构域(半胱氨酸系指S-S键)和FN样重复(色氨酸和酪氨酸/苯丙氨酰)中的保守氨基酸残基被排序。确定了这些保守位置之间的氨基酸残基数目。这称为共有距离。计算距离的平均值，即L1家族成员中共有距离和标准偏差(SD)。SD值四舍五入到下一位整数。比较每种蛋白与平均距离的距离、如果该距离值与平均值±SD(＝共有距离)相等，可认作吻合。对每种单独的蛋白计算与19共有距离的吻合数(相似性指数＝吻合数/19×100)。例如，在CHL1蛋白中16个距离值与共有距离吻合，而所有指标中的3种不吻合。这致使CHL1的相似性指数为16/19或84％。实施例19细胞培养和在COS-1细胞中的CHL1和L1的表达

将克隆pX#2的4.43kb插入片段连接到Sall消化的pXMD1中(Kluxen等，1992，Kluxen和Lobbert，1991)。小鼠L1 cDNA(Moos等，1988)的亚片段(EcoRI(质粒多接头)/Pvull 4048碱基对)用T4DNA聚合酶处理并连接到pXMD1中。

在37℃，有5％CD2的增湿环境下将COS-1细胞培养在添加有10％(v/v)胎牛血清的DMEM(0.1％葡萄糖中)。DEAE-葡聚糖介导的DNA转染按所述的方法(Kluxen等，1992)作一些修改而进行，简言之，细胞以约10,000细胞/cm²接种。一天后，用DMEM(0.45％葡萄糖)洗二次，用转染液取代培养基，转染液由添加有10％(v/v)Nu-血清(Becton Dickinson，瑞士)，0.4mg/ml(w/v)DEAE葡聚糖(Pharmacia)，50μM氯喹和1.25μg/ml DNA(每10cm平皿4ml)的DMEM组成。细胞温育在37℃和5％CO₂中4小时。然后移去培养基，将细胞在含10％＝甲基亚砜(v/v)的磷酸盐缓冲液(pH7.3)中温育2分钟。用DMEM(0.45％葡萄糖)洗2次后，加添加10％(v/v)胎牛血清和20μg/ml庆大霉素的DMEM，并将细胞培养在该培养基中。24小时后，细胞在有0.01％胰蛋白酶和0.0004％EDTA的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中温育37℃5分钟后被分离，为进行免疫细胞化学，将细胞以约20,000细胞/cm³密度重新接种在包含涂有聚-L-赖氨酸玻璃盖片(直径为11mm)的24孔板中(Falcon)，并继续培养24小时为了蛋白印迹分析，将细胞重新接种在组织培养平皿上，并继续培养48小时。

将PC12细胞培养在涂有胶原的组织培养平皿中的含10％(v/v)胎牛血清和5％(v/v)马血清的DMEM中。为了用神经生长因子(NGF)诱导细胞，在约50％铺满时从单层移去培养基，代之以添加100ng/ml7s-NGF(Sigma，瑞士)的减少血清含量(5％马血清)的培养基。培养2天后，细胞用0.1％胰蛋白酶和0.04％EDTA温育后分离，收集细胞，进行RNA提取

星形细胞原代培养根据McCarthy和De Vellis(1980)修改过的方法(Guenard等1994)制备，并在体外培养1～2周后用于免疫染色。少突神经细胞的原代培养按Laeng等(1994)所述的方法制备，体外培养12天。实施例20反义RNA的产生

将克隆pX#2的4.43kb插入片段连接到Sall消化的pBSII SK(Stratagene)，接着缺失(ApaI载体)/AvrII(3330碱基对(图18))片段以获得编码蛋白胞外部分的CHL1的cDNA片段(见图18和19)通过T4 DNA聚合酶处理L1 cDNA(Moos等，1988)的EcoRI(质粒多接头)/EcoNI(3304碱基对)片段的连接制备相似的L1构建体并将其连接到SmaI消化的pBSIISK-上。质粒用Xbal消化，按所述方法(Melton等，1984)用T7RNA聚合酶用于合成³²P标志的反义RNA。RNA印迹分析

用Oligotex^TM直接mRNA法(QIAGEN Inc，Dusseldorf，德国)按厂家说明，从新生和9日龄小鼠的不同组织中制备聚(A)^-mRNA。聚(A)^-mRNA和RNA标志(RNA梯带，GIBCO/BRL)在0.8％甲醛/琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在20×SSC中毛细管转移法(Southern，1975)转移到Hybond-N膜上(Amersham)。紫外交联后(UV-Stratalinker1800，Stratagene，La Jolla，CA)，用亚甲基蓝法(Sambrook等，1989)核实转移和转移到膜上的RNA量。65℃预杂交2小时后，在杂交缓冲液中(5×SSC，2.5×Denhart溶液，50mM Na₂PO₄(pH6.5)，0.1％SDS，1mM EDTA，2μg/ml鲑精DNA，50％甲酰胺)，用特异于CHL1和L1³²P标记的反义RNA探针65℃杂交滤膜过夜。然后滤膜在0.1×SSC中65℃洗3次，0.1％SDS洗1小时，对X光片曝光。实施例21在大肠杆菌中重组CHL1蛋白的表达和纯化

编码第6个Ig样结构域(IgVl)和FN样重复1.45(见图18和19b)的CHL1(Mscl；1791个碱基对(起源于来自CHL1克隆的λgt11的载体克隆位点和5′端)和BsmA1；3494个碱基对)的1.7kb cDNA片段亚克隆到pET载体的唯一的BamHI限制位点上(Studier和Moffatt，1986)质粒的正确序列由测序证实。用这种质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)。重组蛋白的表达和用阴离子交换层析纯化按Appel等(1993)的方法进行。SDS-PAGE和考马斯染色显示一条预期分子量(70kD)的主带，其含量至少为总蛋白的80％(未显示)。组织级分

通过将组织在40mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，5mM EGTA，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1％Triton X-100中匀浆，在不断搅动下4℃维持3小时而制备全组织的去污剂裂解物。可溶部分通过100,000g离心从不溶物质中分离。

为制备去污剂裂解物的膜级分，组织在1mM NaHCO₂(pH7.9)，0.2mM CaCl₂，0.2mM MgCl₂，1mM亚精胺，5μg/ml aprotinin，10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂，1mM PMSF和0.5碘乙酰胺中4℃匀浆。然后分离膜和可溶级分，膜沉淀重新悬浮于溶解缓冲液中(20mM Tris-HCl(pH7.9)，0.15MNaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，0.5％Trton X-100，5μg/ml Aprotinin，10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂，1mM PMSF和0.5mM碘乙酰胺)。

瞬时转染的COS-1细胞用HBSS洗二次，在含1mM EDTA的HBSS中37℃温育10分钟。然后用火光滑的Pasteur吸管分离细胞，200g，4C离心10分钟收集细胞。细胞在20mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM碘乙酰胺，1mM PMSF和1％MP-40中裂解，上清通过离心(13000g)变清。蛋白测定按Bradford(1976)所述的方法进行。蛋白印迹分析

将蛋白用在还原条件下，在8％或10％平板胶中的SDS-PAGE(Laemmil，1970)分离，并根据Faissner等(1985)的方法转移到硝酸纤维素滤膜上(0.45μM，BA85；Schleicher&Schuell，Dassel，德国)用于免疫检测，其中使用CHL1抗血清(稀释1∶500，对ECL为1∶10000)、L1多克隆抗体(稀释1∶1000，对ECL为1∶15000)、或单克隆抗体412(稀释1∶1000，对ECL为1∶1000)碱性磷酸酶偶联的第二抗兔或抗大鼠的IgG。按照厂家的说明使用ECL蛋白印迹检测试剂(Amersham)和X-光片检测通过增强化学发光(ECL)法，或者用BCIP和NBT作显色底物来检测结合抗体。实施例22酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定(ELISA)除蛋白以100ng/ml浓度包被外，按Husmann等(1992)所述的方法进行。所用的CHL1抗血清有几种稀释度，为1∶250～1∶2×10₆之间。CHL1的去糖基化

来自7日龄小鼠的脑组织匀浆(200μl，蛋白浓度6mg/ml)的去污剂裂解物通过离心分离成可溶性级分和不溶性物质(见组织级分)，然后按厂家的说明(Boehringer Mannheim，德国)用0.5单位的N-糖苷酶F或2.5单位的O-糖苷酶，或这些浓度的二种酶温育。裂解物由SDS-PAGE在10％胶上分离。蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上，用抗重组CHL1蛋白片段的CHL1抗血清(1∶500稀释)温育(见图18)免疫沉淀

来自9天龄小鼠脑组织匀浆(300μl，蛋白浓度5mg/ml)去污剂裂解物的可溶级分(见组织级分)在5ml含1％NP40和30μl G琼脂糖(Pharmacia/LKB)的缓冲液中(20mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA)，和10μlCHL1抗血清或抗L1的多克隆抗体5℃温育过夜。用含0.1％NP40，0.05％SDS的缓冲液，然后20mM Tris-HCl(pH7.4)相续清洗后，琼脂糖珠在5x样品缓冲液(250mM Tris-HCl(pH6.6)，10％SDS，50％甘油，0.5％溴酚蓝、25％B-巯基乙醇)中煮10分钟，上清用SDS-PAGE在10％胶中分离。应用蛋白印迹分析，将蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上并用抗L1的多克隆抗体、CHL1抗血清、或单克隆抗体412检测。间接免疫荧光

为进行细胞表面染色(Schmtzer和Schachner，1981)，植在盖片上的CHL1和模拟(仅载体)转染的COS-1细胞在含10％胎牛血清、10mM Hepes(pH7.3)和0 02％NaN₃的DMEM中，与第一抗体(CHL1抗血清(1∶100稀释)或L1多克隆抗体(1∶200稀释)室温下温育30分钟，然后和第二抗体温育。免疫染色后，细胞用4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(pH7.3)中的固定，放在含2.5％碘化钾的Moviol(Hoechst)中。为进行星形细胞和少突神经胶质细胞的双免疫荧光染色，按用于转染COS-1细胞所述的方法温育针对细胞表面抗原的第一抗体。随后，用甲醇-20℃渗透细胞后，将细胞与抗细胞间抗原的第一抗体一起温育。实施例23原位杂交

为产生地高辛标记的来自CHL1和L1相应部分相同大小的反义cRNA探针，使用用于RNA印迹分析的相同构建体。有义探针从在相反方向有插入片段的相似构建体产生。使用T7 RNA聚合酶产生并接着碱处理以获得250个核苷酸的平均长度片段来制备所有cDNA探针。原位杂交按所述的方法进行(Bartsch等，1992，Dorries等，1994)。结果和讨论CHL1 cDNA的鉴别

用抗来自脑免疫纯化L1的多克隆抗体(Tacke等，1987)筛选编码细胞粘附分子L1的cDNA克隆的λgt11表达文库，鉴别出克隆311。它含有与L1同源的部分cDNA(根据Lipman和Pearson(1985)为34.1％)和一个编码704个氨基酸包括细胞质部分的2112个碱基对(bp)的开放阅读框。为分离全长的cDNA克隆，该克隆的DNA片段用于筛选不同的cDNA文库。分离到6个单独的克隆。2个克隆含42和4.4kb的插入片段，包括L1几乎相等同源物(CHL1)的整个编码区。进一步研究了含4.4kb插入片段的克隆。DNA和推导的氨基酸序列及结构特征

4.4kb的插入片段编码295bp的5′非翻译区、3627bp的开放阅读框、和518bp的3′非翻译区(图18)。虽然3′端有一寡(A)序列，该序列上游清晰的共有聚腺苷酸化信号缺失。AUG起始密码子(296位，图18)的侧翼序列与翻译起始的理想共有序列并不相一致(Kozak，1987)。不过，基于二个证据，这种AUG当作翻译起始密码子。在所有3个阅读框中的终止密码子位于它的上游之前，接在它之后的是具有预期在残基24或25之后具有裂解位点的潜在信号序列(根据von Heijen的算法(1986)，分别为8.65和4.0分)(图18)。

翻译开放阅读框产生预测分子量为134.9kD的1209个氨基酸的蛋白，表现为膜内在糖蛋白的特性。推定的胞外结构域由1081个氨基酸组成，具有18个潜在的N-糖基化位点(图18和19a)和60个以上潜在的O-糖基化共有位点(未显示)(Pisano等，1993)，根据Kyte和Doolittle(1982)的亲水性分析判断，接着是23个氨基酸的跨膜结构域(图19c)。该结构域的两侧，其N端为一极性残基，其C端为-碱性氨基酸，与终止转移信号一致(图18)。胞内区域由105氨基酸残基组成。

胞外区含有2个为L1家族特征的重复结构域的主要结构基元：与Ig样结构域有同源性的685个氨基酸的一段序列和与FN样重复有同源性的472个氨基酸的一段序列(图1和2a)。全部6个Ig样结构域含有位于47～54氨基酸处，互相分离的半胱氨酸残基的特定对(图19)在每个结构域(DXGXYCXAXN)中，位于与第二个半胱氨酸残基周围保守氨基酸的C₂型簇相连的β链B末端的保守脯氨酸(第6个Ig样结构域除外)把Ig样结构域分配到C₂群上(Williams和Barclay，1988)。在Ig样结构域和跨膜区之间是与纤连蛋白中与FN样重复同源的4个结构域(Kornblihtt等，1985)。大约100个氨基酸的这些结构域的每一个，分别在N和C端区中、含高度保守的色氨酸(除第一个FN样重复例外)和酪氨酸/苯丙氨酸残基。有趣的是，第5个FN样重复，与L1家族的其他成员相反，仅有一个基本的半个FN样重复(图18)。是否这种一半的FN样重复表示几种可供选择的剪接形式之一仍有待于用除RNA印迹分析之外的方法确定，其中剪接形式的一种包含完全的FN样重复。在本文值得注意的是通过6个单独分离的克隆的限制分析未发现可变剪接的迹象(未显示)。对Nr-CAM/BRAVO观察第5个FN样结构域的可变剪接，从其中分离了缺乏第5个FN样重复的cDNA同I型(Grumet等1991；Kayyem等，1992)。在鸡神经束蛋白中缺少第5个FN样结构域(Volkmer等，1992)也极有可能由于可变剪接，因为其大鼠同源物，锚蛋白结合糖蛋白(ABGP)(Davis等，1993)含有第5FN样结构域。因而，CHL1增加了L1家族的一项新结构特征，仅表达4个半FN样重复(图19)。

CHL1的另一结构特征是在第二个Ig样结构域存在RGD序列(氨基酸185-187)(图18)。这个三肽原初鉴别为纤连蛋白第十III型结构域中的一个细胞附着位点(Pierschbacher和Rusolathi，1984)，并对整联蛋白的结合起作用(综述见Rusolathi和Pierschbacher，1987)FN样重复的三维结构分析显示RGD基元位于β链F和G之间(Main等，1992)。这种基元在L1家族的其他成员中也发现。在鸡Ng-CAM(Burgoon等，1991)和该种同源物鸡神经束蛋白及大鼠ABGP的第三FN样重复中，RGD序列在β链F和G之间的相同位置被发现。RGD基元也在L1中找到(在L1小鼠和大鼠(NILE)中有2个，在人L1中有1个(Moos等，1988；Hlavin和Lemmon，1991；Prince等，1991)。所有L1RGO序列在第六Ig样结构域中找到，但是比在纤连蛋白的FN样组件中的RGDs处在不同的氨基酸环境。至于在L1中，在CHL1中的三肽位于第二Ig样结构域的β链E上。目前仍不清楚这些蛋白中的RGD序列是否具有功能活性。在这方面值得注意的是在第二个FN样结构域中含RGD基元的F3/F11家族(Brummendorf和Rathjen，1993，1994)的一个成员TAG-1(Furley等，1990)所诱导的轴突延伸依赖于B、整联蛋白和L1(Felsenfeld等，1994)。这种观察提出在TAG-1的第二FN样重复和β₁整联蛋白之间有直接实际的相互作用的可能性。

在第6Ig样结构域的β链C中，CHL1也含DGEA序列(氨基酸555～558)(图18)。这种序列没有在L1家族的其他成员中找到DGEA序列也和含这种基元的I型胶原的α₂β₁整联蛋白识别有关(Staatz等，1991)CHL1和Ig超家族的其他识别分子的结构相似性

CHL1的氨基酸序列和翻译的EMBL基因序列数据库比较表明，CHL1与109个氨基酸的长序列有87.2％相同，与以前在人脑中鉴别的93个氨基酸长的序列有79.6％的相同(登记号HS2431和HSXT02610(Adams等，1992，1993))。因而，在人类中似乎存在高度保守的CHL1分子。从翻译的EMBL基因序列数据库中取如下序列和CHL1比较，这些序列是小鼠、人类和大鼠的L1/NILE、鸡Ng-CAM、鸡Nr-CAM、蓑L1.1(Tongiorgi等，1995)、鸡神经束蛋白/大鼠ABGP、果蝇神经胶质蛋白(Bieber等，1989)，小鼠F3/鸡F1/人类CNTN1(Gennarini等，1989；Ranscht，1988；Brummendorf等，1989；Berglund和Ranscht，1994)、大鼠TAG-1/鸡轴突蛋白-1/人类TAX-1(Furley等，1990；Hasler等，1993；Tsiotra等，1993)和大鼠BIG-1/大鼠PANG(Yoshihara等，1994；Connelly等，1994)的序列。比较显示在如下的表1中。表1：CHL1和其他L1相关分子的胞外部分的序列相似性比较

	CHL1(m)	L1(m)	ngCAM(c)	NrCAM(c)	神经束蛋白(c)	L1.1(z)	神经胶质蛋白(d)	F3(m)	TAG-1	BIG-1(r)
											L1(m)	37
NgCAM(c)	39	37
											NrCAM(c)	33	43	35
神经束蛋白(c)	36	36	47	33
											L1.1(zf)	28	28	30	26	30
神经胶质蛋白(d)	33	36	36	34	34	28
											F3(m)	27	28	27	26	27	26	24
TAG-1(r)	27	27	26	25	25	25	24	51
											BIG-1(r)	27	29	27	27	25	27	24	44	43
DCC(h)	14	14	14	15	14	16	14	16	15	15
											Axl(m)	11	12	11	12	12	11	11	13	12	11
HLAR(h)	15	15	13	14	13	14	11	13	14	14
											NCAM(m)	16	15	17	16	15	16	15	15	15	15

L1家族成员的胞外区互相比较，和其他分子及与Ig超家族的其他神经细胞粘附分子的比较。数值表示按Hein(1990)的方法排序后的氨基酸同一性的百分率。物种在括号中显示：c＝鸡、d＝果蝇、h＝人类、m＝小鼠、r＝大鼠，zf＝蓑鲉。表2：L1相关分子的胞内部分序列相似性的比较

	CHL1(m)	L1(m，r，b)	NrCAM(m)	NrCAM(c)	NgCAM(c)	ABGp(r)	神经束蛋白(m)	神经束蛋白(c)	神经胶质蛋白(d)	L1.1(zf)	L12(zf)
												L1(m，r，b)	57
NrCAM(m)	64	55
												NrCAM(c)	62	56	99
NgCAM(c)	43	61	41	43
												ABGP(r)	59	54	64	64	38
神经束蛋白(m)	62	56	64	65	43	100
												神经束蛋白(c)	54	58	58	60	40	87	16
神经胶质蛋白(d)	39	34	41	40	34	40	43	37
												L1.1(zf)	43	61	46	45	50	45	48	47	36
L1.2(zf)	36	54	39	38	37	37	40	39	22	44
												DCC(h)	14	12	15	13	18	12	13	12	11	12	9
成束蛋白III(d)	21	17	20	18	19	16	20	17	15	17	15
												MAOp72(f)	8	10	11	11	10	10	10	11	11	10	8
NCAM180(m)	7	7	7	7	13	5	5	5	5	13	9
												Po(m)	11	6	12	13	6	15	15	15	28	7	3

L1家族成员(包括种同源分子)的胞内区互相比较，和Ig超家族的其他神经细胞粘附分子的比较。数值表示根据Hein(1990)的方法排序后氨基酸一致性的百分率。物种显示在括号中：c＝鸡、d＝果蝇、h＝人类、m＝小鼠、r＝大鼠，及zf＝蓑鲉。小鼠、大鼠和人类的L1是相同的。小鼠NrCAM和神经束蛋白分别是91个和86个氨基酸残基的部分序列。表3：L1家族成员和含C2结构域的Ig超家族的其他成员之间的结构关系

CAMs	Ig1	1-2	Ig2	2-3	Ig3	3-4	Ig4	4-5	Ig5	5-6	Ig6
												L1	56	44	51	55	41	42	50	44	49	42	52
CHL1	52	44	51	58	41	42	49	44	49	42	55
												NrCAM	51	44	51	55	46	42	49	44	49	42	49
NrCAM	55	44	51	55	48	42	50	44	49	42	49
												ABGP	7	44	51	56	48	42	50	44	49	42	49
L1.1	7	45	51	56	48	42	50	44	49	40	53
												神经胶质蛋白	52	44	65°	48°	49	43	50	45	47	42	52
TAG-1	50	44	52	54	45	42	47	45	41	42	57
												BIG-1	50	44	52	53	48	42	47	45	41	42	56
F3	49	44	51	52	47	42	39°	45	48	42	59
												平均值	52	44	51	55	48	42	49	44	49	42	53
SD	2.5	0.3	0.7	1.7	1.2	0.3	1.3	0.6	0.7	0.6	3.6
												DCC	56	44	51	49	49	42	41
HLAR	53	49	51	46	45
												DC	53	43	50
NCAM	55	43	50	46	53	42	56	41	53
												MAG	52	39	58	44	44	42	45	40	56
神经肌肉蛋白	55	45	63	48	54	47	51	45	46	45	72
												纤连蛋白(III)

表3：L1家族成员和含C2结构域的Ig超家族的其他成员之间的结构关系(续)

CAMn	Ig6-FN1	FN1	FN1·FN2	FN2	FN2-FN3	FN3	FN3-FN4	FN4	相似性指数
										L1	44	50	50	49	49	51	47	51	84％
CHL1	41	7	7	49	49	58	41	53	84％
										NgCAM	40	50	50	57°	49	77°	7	7	74％
NrCAM	51°	50	50	50	49	58	41	52	95％
										ABOP	56°	50	50	50	49	58	41	51	95％
L1.1	41	50	50	50	49	62	47	52	74％
										神经胶质蛋白	40	50	50	52	51	53	7	54	64％
TAO-1	41	53	50	53	49	51	41	7	74％
										BIO-1	41	53	50	53	49	52	41	47	14％
F3	41	53	50	53	49	48°	41	47	43％
										平均值	41	51	50	51	49	56	41	51
SD	1.2	1.4	0.0	1.7	0.6	3.l	0.5	2.6
										DCC		49	50	46	49	51	51	51	50％
HLAR		46	49	50	41	46	49	53	42％
												49	48	49					33％
NCAM		35	56	41					25％
										MAO									11％
神经肌肉蛋白									13％
										纤连蛋白(III)		45	42	46	41	44	47	44	14％

本表显示Ig样结构域中保守氨基酸之间(涉及S-S键的半胱氨酸Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5和Ig6)，FN样重复(第二个β-链的色氨酸和第6个β-链的酪氨酸/苯丙氨酸FN1、FN2、FN3和FN6)，和这些结构域之间(1-2、2-3、3-4、4-5、和5-6；FN1-FN2、FN2-FN3、和FN3-FN4)的残基数目。第6Ig样结构域的第二个半胱氨酸的保守氨基酸和第1FN样重复的第一个色氨酸之间的距离(Ig6-FN1)反映Ig样结构域和FN样重复之间的距离。表明了L1相关分子的各个距离的平均值和标准差(SD)。给出的DCC、HLAR、rse、NCAM、MAG、神经肌肉蛋白和纤连蛋白(III)作为对照。相似性指数在右边栏给出。？＝没有保守性氨基酸*＝没有用于平均值和SD计算。

CHL1与鸡Ng-CAM(在胞外结构域氨基酸的一致性为37％、表1)和小鼠Nr-CAM(在胞内结构域氨基酸的一致性为64％，表2)极为相似。然而一致性的程度，尤其在胞外部分，不足以认为这些蛋白是物种同源物。最近，小鼠Nr-CAM的部分cDNA克隆(Moscoso和Scanes，1995)已被鉴别出来。小鼠Nr-CAM几乎与鸡Nr-CAM一致(99％)(见表2)。因此，CHL1不可能是小鼠中的Nr-CAM同源物。CHL1是在小鼠中已有L1、Nr-CAM、神经束蛋白(Moscoso和Sanes，1995)的L1家族的第4个成员，并且CHL1在人类中具有高度保守的物种同源物(Adams等，1992，1993)。

考虑到鸡和小鼠Nr-CAM和鸡和小鼠神经束蛋白的胞内序列的相似性(分别为99％和87％，表2)，小鼠L1和鸡Ng-CAM几乎不可能是种同源物，因为它们仅显示其胞内结构域1％的一致性(表2)然而，可望Ng-CAM可成为小鼠中具有高度保守的胞内结构域的L1家族的第5个成员。有趣的是，小鼠L1和鸡Ng-CAM的嗜异相互作用促进轴突外延(Lemmon等，1989)，这暗示L1家族的成员可相互作用。

除了L1家族成员的全部结构的相似性外(表1和表3)，在细胞质区域能鉴别出极为高度保守的区域(图20)。这种惊人的同源性对迄今为止已鉴别的所有物种中含胞内结构域的L1家族成员：L1、CHL1、Nr-CAM、Ng-CAM、神经束蛋白、神经胶质蛋白、和蓑L1.1是明显的，对蓑L1.2(Tongiorgi等，1995)和小鼠Nr-CAM和神经束蛋白(Moscoso和Sanes，1995)的部分序列也明显(表2)在这个区域的二段序列中，接近和部分在跨质膜片段中的一段与位于C末端(图20I，III)的另一段几乎相同。另一段在L1、Ng-CAM、Nr-CAM、神经束蛋白、L1.1和L1.2，但不在CHL1中保守的氨基酸序列(表2)含有由可变剪接起源，仅在神经元中表达的RSLE基元(在图3中，II)(Grumet等，1991；Miura等，1991；Volkmer等，1992)。因为在这些蛋白之间胞内区极为高度保守，所有L1家族的成员可用于相同的信号转导通路以活化轴突延伸。已经表明ABGP、L1和Nr-CAM的细胞质区域能和针对细胞骨架支架的与锚蛋白连系的细胞识别相互作用(Davis等，1993，Davis和Bennett，1994)。实施例24在胞外结构域中的为L1家族成员分类的所必需的结构的鉴别

为进一步研究L1家族成员身份的一般标准，我们调查研究了Ig超家族几个成员中的Ig样结构域中高度保守的氨基酸的位置(半胱氨酸系指S-S键)和FN样重复(色氨酸，酪氨酸/苯丙氨酸)(表3)。含6个Ig样区域和至少4个FN样重复的分子(L1家族和连接GPIF3/F11亚组(Brummendorf和Rathien，1993))显示分隔这些保守氨基酸的非常稳定的氨基酸数目。考虑5个不同的距离参数：

1)分隔形成每个Ig样区域的半胱氨酸(S-S)键的保守半胱氨酸的氨基酸数目(表3，Ig1、Ig2、Ig4、Ig5和Ig6栏)；

2)在-Ig样结构域的第二个半胱氨酸和下一个Ig样结构域的第一个半胱氨酸之间，反映2个邻近Ig样结构域之间距离的氨基酸数目(表3，1-2、2-3、3-4、4-5和5-6栏)；

3)在第6个Ig样结构域的最后一个保守的半胱氨酸和第一个FN样重复的保守色氨酸之间，反映Ig样结构域组件和FN样重复组件之间距离的氨基酸数目(表3，IgG-FN1栏)；

4)在每个单独的FN样重复的保守色氨酸、酪氨酸/苯丙氨酸之间的氨基酸数目(表3，FN1、FN2、FN3和FN4栏)；

5)在一FM样重复的酪氨酸/苯丙氨酸和下一个FN样重复的色氨酸之间，反映2个邻近的FN样重复之间距离的氨基酸数目(表3，FN1-FN2、FN2-FN3和FN3-FN4栏)。

为获得比较L1样分子的高度严格条件，为了计算平均距离和标准差，我们没有考虑极有可能由于可变剪接而明显偏离平均数的少数数值(神经胶质蛋白：Ig2，2-3；Nr-CAM和ABGP：Ig6-FN1；F3：Ig4、FN3：Ng-CAM；FN2，FN3(表3，用^*标记))。因为第1和第6个Ig样区域的S-S键之间的氨基酸数目(Ig1，标准差(SD)：3：Ig6；SD＝4)和FN样3和4重复的保守色氨酸、酪氨酸/苯丙氨酸之间的氨基酸数目(FN3：SD＝4；FN4：SD＝3)稍有可能变化，但所有其他距离参数对不同的分子来说仍明显地稳定(FN1-FN2：SD＝0；FN2和2-3：SD＝2(表3))。基于这些标准，我们计算了与表3列出的平均值有关的几种Ig样分子的相似指数(见材料和方法)。对于L1、CHL1、Ng-CAM、Nr-Cam、ABGP、L1.1、TAG-1和BIG-1，得到的相似指数为74-95％(表3)。对果蝇的神经胶质蛋白，确定的值略低(66％)，这极有可能反映了脊椎动物和昆虫之间的进化距离。F3和其种同源物缺少保守性，特别是在它们的Ig样结构域中，但是仍显示63％的相似性指数。构成强烈保守共线性(如在第一FN样重复末端的FxVxAxNxxG(8x)S(4x)TxxAxPxxxP或第三FN样重复的最后2个β链之间的NxxGxGPxs(未显示)的某些保守氨基酸序列支持F3属于L1家族的观点。有趣的是，在邻近结构域(Ig样结构域或FN样重复)之间的氨基酸数目在这些分子中甚至更保守，表示各个结构域之间的距离是重要的结构特征，即对神经识别分子行使功能是关键的(表3，1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、FN1-FN2、FN2-FN3和FN3-FN4栏)。因而，这种顺序(共线性)和间隔的保守性可用于更一般地解释L1家族成员的胞外结构域。应用刚确定的标准，这些成员含在N端6个Ig样区域接着4个FN样重复的组件。我们将这一结构特征称为L1家族盒。

因此，L1家族的所有成员享有L1家族盒的独特特征，并另有具有高度保守氨基酸。这些结果提示这些分子来源自一个含L1家族盒的共同祖先L1样的分子，这个分子可能通过基因复制而散布其潜在的功能，以适应在更复杂的神经系统中细胞相互作用多样化的进化需求。因而一般的L1家族可以再分为“经典的”L1家族成员(L1、CHL1、Ng-CAM、Nr-CAM、神经束蛋白、神经胶质蛋白、L1.1)和F3/F11亚组(F3/F11/CNTN1、BIG-1/PANG、和TAG-1/轴突蛋白-1/TAX-1)“经典的”L1家族成员含一个可变的第5FN样重复、一个跨膜结构域和一个高度保守的胞内结构域。F3/F11亚组的共同特征是由GPI连接到膜上，迄今为止未鉴别出可变的第5FN样重复。两个亚组的细胞外结构域含L1家族盒。

Ig超家族的其他成员，如N-CAM(Cunninham等，1987，Barthels等，1987)、MAG(Arquint等，1987；Lai等，1987；Salzor等，1987)，神经肌肉蛋白(Kanla等，1993)、和rse(Mark等，1994)或含Ig结构域和/或FN样重复的纤连蛋白(Kornblihtt等，1985)，显示明显不同的距离参数，说明它们互相之间及与L1家族的成员之间的更少关系(表3)。有趣的是，按照距离参数(相似指数分别为42％和50％)，人白细胞共同相关抗原基因(HLAR)(Strell等，1988)和在结直肠癌中缺失的肿瘤抑制基因产物(DCC)(Fearon等，1990)与L1家族紧密相关。检查保守氨基酸显示，尽管DCC似乎缺少第5和第6个Ig样结构域，按Fearon等(1990)和Pierceall等(1994)的以前建议，DCC确实与L1家族比与N-CAM更紧密相关。最近研究显示DCC主要在大脑中表达，在其细胞表面表达蛋白的DCC转染成纤维细胞的底物上，大鼠PC12细胞的轴突外延被促进(Pierceall等，1994)。虽然HLAR也显示相对高的相似指数，其与L1家族的关系并明显。实施例25CHL1mRNA和蛋白的组织分布

为了研究在神经系统中是否CHL1与L1家族的其他成员共同具有优势表达，我们在mRNA和蛋白水平分析3在各种组织中CHL1的表达。在RNA印迹分析中，CHL1核酸探针和约8kb占优势的mRNA带杂交(图21)，该带明显地比用L1探针(约6kb)(Tacke等，1987)检测的mRNA大小要大。较小和较弱的RNA带(图21a，泳道3)极有可能是由于和核糖体RNA互相杂交。8kbRNA在小脑、脑负小脑和脊髓中检出，却未在背根神经节(DRG)中检出(图21a)。相反，L1核酸探针与来自DRG的RNA显示有强杂交信号(图21a)。CHL1mRNA也可在9日龄大鼠小脑和6日龄大鼠脊髓中检出，但不可在用和不用NFG培养的大鼠PC12细胞中或在COS-1细胞中检出(图21b)在所有分析的其他组织(胸腺、肺、肝、肠、脾和肾中)，没有杂交信号可检测到(图21a)。

为鉴别CHL1蛋白，产生了抗细菌表达的CHL1蛋白片段的抗体除开与其他已知的L1家族成员高度同源区如跨膜区或胞内区外，将表示第6Ig样结构域和第4FN样重复部分的1.7kbcDNA片段(图18和19b)克隆到pET表达载体中。得到的蛋白片段被表示为通过阴离子交换层析纯化的，SDS-PAGE后用考马斯蓝染色而检测的70kD，蛋白印迹分析(图22a)和E LISA(未显示)显示来自2只兔的抗血清与CHL1蛋白片段反应，但不和纯化的L1、N-CAM或MAG反应。可观察到与CHL1肽共纯化的细菌蛋白或CHL1片段的降解产物的某些反应(图22a，泳道4)。

为进一步检测抗体的特异性和确定它们是否识别表达CHL1的天然细胞表面，用抗体检测了瞬时转染的COS-1细胞，免疫细胞化学显示CHL1在转染CHL1细胞中的细胞表面表达，但不在用载体模拟转染的细胞中表达(图23)。这些结果也说明推定的信号序列是有功能的，而且开放阅读框是正确的。

尽管第1个CHL1cDNA克隆通过用免疫亲和纯化的抗来自脑L1的多克隆抗体进行筛选从表达文库分离得到，未观察到抗重组表达的L1Ig样结构域的抗体的不同制备物与转染CHL1细胞的反应(未显示)。直接抗分子胞外部分的CHL1抗体(图19)也没有和转染L1的的细胞反应(未显示)。因此有可能用于筛选表达文库的L1多克隆抗体与CHL1和L1之间最同源的CHL1C端胞内部分反应。

用CHL1的抗血清鉴别几种组织中的免疫反应性蛋白(来自9日龄小鼠的脑、肝、肺、肾和肠，图23b)。将在0.5％Triton X-100中的粗膜级分、可溶和不可溶级分用蛋白印迹法分析。抗L1的多克隆抗体用作对照。CHL1抗体识别在脑膜不可溶和可溶级分中的185、165和125kD的三条不同带。185kD带仅在可溶级分中微弱地可检测到，而125kD.带在不可溶级分中不明显(图23b，泳道1和2)，表示185kD带可能是CHL1的膜结合形式，而125和165kD形式可能是蛋白酶解片段。转染CHL1的COS细胞和全脑组织的蛋白印迹分析后观察到相似的免疫反应带型(未显示)。相似的带型也在L1(Faissner等，1985：Sadoul等，1988)、Ng-CAM(Grumet等，1984)和NrCAM(Kayyem等，1992)的实验中观察到。不过、在第三FN样结构域中蛋白裂解的双碱基共有序列(L1：“SKR”：Ng-CAM“SRR”：Nr-CAM：“SRR”：Nr-CAM：“SRRSKR”)在CHL1中不存在。像L1家族的其他成员一样，发现CHK1仅在发育较晚期阶段表达。用蛋白印迹分析，它不能在15天前胚胎的脑中检测到(未显示)。在全肝组织的去污剂可溶级分中检测出一条50kD的免疫反应带。这条带极有可能是由于CHL1的抗体与CHL1相关蛋白的某种交叉反应性，因为用RNA印迹分析未见到肝中有CHL1特异的mRNA(图22a)。CHL1免疫反应性也不能在所测试的其他组织中检测到(图23b)。

在中枢神经系统中，L1家族的成员主要由神经元表达。因此，我们感兴趣的是CHL1是否和L1共同拥有这种表达类型。进行原位杂交实验以鉴别在出生后幼小小鼠的视网膜、视神经和小脑皮层中合成CHL1和L1的细胞。在7日龄小鼠的视网膜中，L1(图24a)和CHL1mRNA(图24b)由神经节细胞表达。另外L1转录物也能在位于内核层中的无长突细胞和水平细胞中检测到(图24a)。相反，CHL1 mRNA仅在位于中间核层的内(即；ritread)边缘的少数细胞中偶尔能检测到(图24b)。在视神经中的胶质细胞不含有可检测的L1转录物水平(图24a)。明显相反的是，CHL1mRNA强烈地由位于视神经近端(即近视网膜)区的胶质细胞表达(图24b)，CHL1的低水平表达在位于该神经更远端区的胶质细胞中可见(图24b)。

第二周龄小鼠的小脑皮层中，L1mRNA可在位于分子层中的星形细胞和篮状细胞中以及位于内粒层中的高尔基细胞和粒细胞中检测到(图24d)。当切片和CHL1反义cRNA探针杂交时，相同的细胞类型被标记(图24e)，除开位于分子层中间部分的细胞难以检测到CHL1转录物(比较图24d和e)。作为阴性对照，切片和相应的有义cRNA探针杂交、没有标记的细胞可检测到(对视网膜和视神经，用CHL1有义cRNA探针杂交，见图24c)。为了说明体外的胶质细胞是否表达CHL1，从出生后幼小的小鼠或大鼠前脑制备纯化的星形细胞或少突神经胶质细胞的培养物。使用特异地检测在转染COS-1细胞的细胞表面上的CHL1相同的多克隆CHL1抗体。分别用抗GFAP的抗体或抗O1抗原的抗体鉴别星形细胞和少突神经胶质细胞。星形细胞培养物含一些被多克隆CHL1(图25a，b)和单克隆GFAP(图25b，e)抗体双标记的细胞。然而，分析少突神经胶质细胞培养物，显示没有CHL1和O1抗原的共定位，说明成熟的少突神经胶质细胞在体外不表达可检测的CHL1水平。联合观察表明CHL1和L1显示重叠，但也有不同的表达类型。最引人注目的是，CHL1而不是L1在体内由神经系统的某些胶质细胞表达，这提示L1家族的不同成员行使不同的功能。对CHL1糖蛋白的糖基化分析和HNK-1糖类的检测

由于CHL1观察到的分子量(185kD)比计算分子量(134.9kD)大得多，分析了糖类对分子量的作用和糖类修饰的类型。来自7日龄小鼠的粗脑膜的去污剂可溶和不可溶级分进行酶促去糖基化。N-糖苷酶F(PNGasoF)处理后，所有CHL1免疫反应蛋白的分子量降低(图26)185kD带移到150kD，165kD带移到135kD，及125kD带移到110kD用一种已知裂解连接半乳糖β(1-3)N-乙酰半乳糖胺二糖的丝氨酸和苏氨酸的酶(Glasgow等，1977)β-糖苷糖处理导致略为增加迁移率：185kD和165kD带分别移到约180和160kD，而125kD带没有移动。这些观察表示大多数糖类分子量是由于N-连接的糖类。用二种酶一起处理(图26)引起比用单酶处理见到的更大迁移，从185到145kD，提示并不是所有糖基化位点，最有可能O-糖基化位点被单独的O-糖苷酶所裂解。结果显示CHL1含有大约其分子量的30％为N-糖苷连接的糖类。

几种神经细胞粘附分子带有HNK-1糖类，如L1(Kruse等，1984)、TAG-1(Dodd等，1988)、Nr-CAM(Grumet等，1991)、F3(Gennarini等，1989)，N-CAM(Kruse等，1984)、髓鞘相关蛋白MAG(McGarry等1983；Kruse等，1984)和P_o(Bollenson和Schachner，1987)。因此，我们分析CHL1是否带有HNK-1糖类。用CHL1抗体从9日龄小鼠全脑组织的去污剂裂解物中免疫沉淀CHL1。作为对照，用多克隆抗体从相同的脑提取物中相似的方法免疫沉淀L1。用直接抗HNK-1糖类的单克隆抗体412的蛋白印迹分析显示，两种免疫沉淀物含有被单克隆抗体412所识别的预期为CHL1(图27)或L1(未显示)的分子量的带。因为像L1家族的其他成员一样，HNK-1糖类涉及细胞与细胞的粘附和结合层粘连蛋白(Keilhauer等，1985；Kunemund等，1988；Hall等，1993，1995)，CHL1可能通过HNK-1糖类与层粘连蛋白相互作用。结论

以上实验把CHL1加入为神经识别分子L1家族的另一成员，神经识别分子L1家族在上述不同的物种如人类、大鼠、小鼠、鸡、蓑和果蝇中发现，因而构成系统发育保守的分子家族，其全部成员在发育晚期由神经元和神经元的亚组开始的轴突形式中表达。存在许多L1相关分子的事实表明结构上相似而功能上极有可能为不同的促轴突生长的分子的自然需要，也表明作为可能决定轴突寻找目标的精细调节的一级分子的L1家族的进化。

下列按字母顺序列出的参考文献，涉及实施例18-25。

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尽管本文针对各种特异的材料，方法和实例描述和说明了本发明，应该理解本发明不局限于为此目的所选择的材料的特定的材料组合和方法。本领域技术人员理解的这些细节的各种改变均可被包含在内。

Claims (41)

1.一种在体内促进哺乳动物中枢神经系统神经生长的方法，包括给所述哺乳动物施用一种促神经生长量的制剂，所述制剂包括一种能抑制在胶质细胞和髓磷脂中发现的抑制分子信号物和促进所述的神经生长的神经细胞粘附分子，其活性片段、其同源物、其衍生物、其模拟物、其拮抗剂、其抗体、其类似物、其分泌细胞及其可溶分子。

2.权利要求1的方法，其中所述的制剂是来源于介导Ca²⁺非依赖的神经细胞粘附的免疫球蛋白超家族的成员。

3.权利要求1的方法，其中所述的制剂是来源于包含与纤连蛋白III型同源重复和免疫球蛋白样结构域相似的结构基元的分子。

4.权利要求3的方法，其中所述的结构基元是结构上上纤连蛋白III型同源重复1-2和免疫球蛋白样结构域I-II，III-IV和V-VI相似。

5.权利要求2的方法，其中所述的制剂选自L1、N-CAM和髓磷脂相关糖蛋白。

6.权利要求2的方法，其中所述的制剂选自层粘连蛋白、纤连蛋白、N-钙粘着蛋白、BSP-2(小鼠N-CAM)、D-2、224-1A6-A1、L1-CAM、NILE、Nr-CAM、TAG-1(轴突蛋白-1)、Ng-CAM和F3/F11。

7.一种用于权利要求1-6任一项的方法中的重组DNA分子，包括和表达控制序列相连的制剂，或其活性片段、同源物、衍生物、模拟物或类似物。

8.一种包括权利要求7的重组DNA分子的载体。

9.一种含权利要求8的载体的转化宿主。

10.一种抗权利要求1-6任一项的制剂的抗体。

11.权利要求10的抗体，包括一种多克隆抗体。

12.权利要求10的抗体，包括一种单克隆抗体。

13.一种调节哺乳动物中枢神经系统中神经生长的方法，包括给所述的哺乳动物施用调节神经生长量的权利要求10的抗体，或其活性片段、同源物、衍生物、类似物、模拟物、分泌细胞或可溶性分子

14.用于在哺乳动物中枢神经系统中调节神经生长的药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1的制剂、其激动剂、其拮抗剂、其片段、其同源物、其衍生物、模拟物、类似物、其分泌细胞和可溶性分子，和药学上可接受的载体。

15.一种转基因哺乳动物，包括表达外源神经粘附分子的胶质细胞。

16.权利要求15的转基因哺乳动物，其中胶质细胞是星形细胞。

17.权利要求15的转基因哺乳动物，其中神经粘附分子是L1。

18.一种包括权利要求15-17之一的转基因哺乳动物的胶质细胞的细胞培养物。

19.一种包括来自权利要求15-17之一的转基因哺乳动物中枢神经系统的组织的细胞培养系统。

20.一种增强中枢神经系统神经元的神经外延的方法，包括在权利要求18的细胞培养系统中培养所述的神经元。

21.一种增强中枢神经系统神经元的神经外延的方法、包括在权利要求19的细胞培养系统中培养所述的神经元。

22.一种增强记忆的方法，包括在需要上述增强时给哺乳动物脑施用增强哺乳动物记忆有效量的权利要求18的细胞培养系统的细胞。

23.一种增强记忆的方法，包括在需要上述增强时给哺乳动物脑施用增强哺乳动物记忆有效量的权利要求19的细胞培养系统的细胞

24.一种增强记忆的方法，包括在需要上述增强时给哺乳动物脑的胶质细胞输送一种载体，该载体允许在所述的胶质细胞中表达一种神经粘附分子。

25.权利要求24的方法，其中神经粘附分子是L1。

26.一种在哺乳动物中枢神经系统需要上述增加时增加突触效能的方法，包括给哺乳动物的脑施用在哺乳动物脑中增加突触效能有效量的权利要求18的细胞培养系统的细胞。

27.一种在哺乳动物中枢神经系统需要上述增加时增加突触效能的方法，包括给哺乳动物的脑施用在哺乳动物脑中增加突触效能有效的，权利要求19的细胞培养系统的细胞。

28.一种在哺乳动物中枢神经系统需要上述增加时增加突触效能的方法，包括给哺乳动物脑的胶质细胞在需要上述增强时输送一种载体，该载体允许在所述的胶质细胞中表达一种神经粘附分子。

29.权利要求26的方法，其中突触效能的增加由长期强化作用的稳定来证实。

30.权利要求27的方法，其中突触效能的增加由长期强化作用的稳定来证实。

31.权利要求28的方法，其中突触效能的增加由长期强化作用的稳定来证实。

32.一种检测药物或其他实体调节神经粘附分子活性的能力的方法，包括：

a.将中枢神经系统神经元添加到权利要求18的细胞培养系统中；

b.将待测药物添加到细胞培养系统中；

c.测定中枢神经系统神经元的神经元外延；及

d.使在药物存在时相对于未添加药物的对照培养物细胞神经元外延水平的差异与该药物调节神经粘附分子活性的能力相关联。

33.一种检测药物或其他实体调节神经粘附分子活性的能力的方法，该方法包括：

a.将中枢神经系统神经元添加到权利要求19的细胞培养系统中：

b.将待测药物添加到细胞培养系统中；

c.测定中枢神经系统神经元的神经元外延；及

d.使在药物存在时相对于未添加药物的对照培养物细胞神经元外延水平的差异与该药物调节神经粘附分子活性的能力相关联。

34.权利要求32的方法，其中神经粘附分子是L1。

35.权利要求33的方法，其中神经粘附分子是L1。

36.一种筛选能调节神经粘附分子产生的药物和其他制剂的检测系统，包括：

a.培养用药物或制剂接种的权利要求18的细胞培养系统；

b.将中枢神经系统神经元添加到a)步的细胞培养系统中；

c.检测神经元外延以确定其药物的效应。

37.一种筛选能调节神经粘附分子产生的药物和其他制剂的检测系统，包括：

a.培养用药物或制剂接种的权利要求18的细胞培养系统；

b.将中枢神经系统神经元添加到a)步的细胞培养系统中；

c.检测神经元外延以确定其药物的效应。

38.权利要求36的检测系统，其中神经粘附分子选自层粘连蛋白、纤连蛋白、N-钙粘着蛋白、BSP-2(小鼠N-CAM)、D-2、224-1A6-A1、L1-CAM、NILE、Nr-CAM、TAG-1(轴突蛋白-1)、Ng-CAM和F3/F11。

39.权利要求36的检测系统，其中神经粘附分子是L1。

40.权利要求37的检测系统，其中神经粘附分子选自层粘连蛋白、纤连蛋白、N-钙粘着蛋白、BSP-2(小鼠N-CAM)、D-2、224-1A6-A1、L1-CAM、NILE、Nr-CAM、TAG-1(轴突蛋白-1)、Ng-CAM和F3/F11。

41.权利要求37的检测系统，其中神经粘附分子是L1。

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