CN118853754B - OsNRAMP3基因在提高水稻种子铁含量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OsNRAMP3基因在提高水稻种子铁含量中的应用，属于生物技术领域，本发明通过植物基因组克隆获得水稻OsNRAMP3基因，构建了pCAMBIA1301过表达载体，通过农杆菌侵染分别获得了OsNRAMP3基因过表达株系OX1和OX2，分析了OsNRAMP3基因过表达株系种子中铁含量，结果表明，OsNRAMP3过表达株系种子中铁含量高于野生型，揭示了OsNRAMP3基因在铁转运方面的作用，为作物富铁品种育种提供新的基因资源。

Description

OsNRAMP3基因在提高水稻种子铁含量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及OsNRAMP3基因在提高水稻种子铁含量中的应用。

背景技术

金属转运蛋白在维持金属稳态中起着作用。随着分子遗传分析的进展，发现了许多种膜蛋白，包括通道、泵和转运蛋白，参与金属的转运和稳态，其中NRAMP（天然耐药相关巨噬细胞蛋白）家族基因在金属转运中起着重要作用。

NRAMP蛋白质构成了一个高度保守的整膜蛋白家族，参与二价金属的转运。NRAMP基因已经在生物中被广泛发现，包括细菌、真菌、植物和动物。这个家族的第一个成员NRAMP1(SLC11A1)已经在小鼠中被表征为一种抗内源性病原体（如利什曼虫、分枝杆菌和沙门氏菌）的抗性基因。许多研究已经证实NRAMP1是哺乳动物对内源性细菌感染的宿主抗性的关键组分。在感染的巨噬细胞中，NRAMP1会迅速被招募到不断成熟的吞噬体膜上，这个转运蛋白的突变会导致对细菌感染的敏感性增加。NRAMP1调节巨噬细胞区域内必需的二价金属（如Fe²⁺和Mn²⁺）的浓度，但NRAMP1在宿主抗性中的确切功能仍存在争议。DCT1/DMT1/NRAMP2(SLC11A2)，作为哺乳动物中第二个被发现的NRAMP基因，是一个H⁺/二价金属共转运体，参与肠道铁吸收和在转铁蛋白循环期间从内体释放铁。

近年来，已经在各种植物物种中鉴定出了NRAMP基因。到目前为止，已经在拟南芥中确定并部分表征了NRAMP基因家族的六个成员。AtNramp1表达受缺铁诱导，在根中控制植物铁离子的稳态。AtNramp3和AtNramp4也受到缺铁的诱导，促进液泡中铁离子的转运，而过表达该基因铁含量没有显著的变化。据报道，AtNramp3和AtNramp4在成年拟南芥植物的锰离子稳态中起重要作用。但是目前还没有研究表明过表达OsNRAMP3基因可以提高水稻种子中的铁含量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种OsNRAMP3基因在提高水稻种子铁含量中的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：

基于国家水稻数据中心官网 (https://www.ricedata.cn/gene/) 公布的水稻全基因组测序，获得水稻OsNRAMP3基因 (GenBank: AK070574.1，LOC_AK070574) 的核苷酸序列信息。OsNRAMP3基因编码框核苷酸序列长度为1653 bp，由550个氨基酸组成，其序列可以通过国家水稻数据中心官网查询获得。

本发明还构建一系列表达载体，含有上述基因的表达载体或转基因植物系以及含有所述载体的宿主细胞在提高植物铁含量的功能也落入本发明的保护范围之内。

本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述OsNRAMP3基因，还包括与OsNRAMP3基因具有较高同源性（如同源性高于85％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％）的同源基因在富铁方面的功能。

本发明通过水稻原生质体瞬时转化的方法鉴定OsNRAMP3的亚细胞定位情况。根据OsNRAMP3的CDS基因序列构建了GFP::OsNramp3-pBI221瞬时表达载体，通过水稻原生质体瞬时转化并进行激光共聚焦显微观察发现OsNRAMP3蛋白定位于液泡膜上。

本发明公开的OsNRAMP3基因在水稻的根、茎、叶、种子中均有表达，其中茎、叶和种胚中表达量较高；OsNRAMP3基因受缺铁诱导表达，具体表现在：在无铁培养下，水稻根和茎中的OsNRAMP3基因表达量均高于有铁培养下的表达量。

本发明公开的OsNRAMP3基因具有转运铁的生物学功能，具体表现在：通过构建酵母表达载体OsNRAMP3-pDR196，利用缺陷型酵母DEY1453在不同浓度含铁量的培养基上的生长速度发现，OsNRAMP3具有恢复缺陷型酵母生长的能力，说明，OsNRAMP3具有转运Fe的能力。

本发明公开的OsNRAMP3基因在植物中转运铁的生物学功能，具体表现在：将构建成功的植物表达载体，利用农杆菌介导的水稻转化系统将目标基因导入野生型水稻（Oryzasativacv. Kitaake），OsNRAMP3在水稻中过量表达后引起了水稻生长状态的改变，这种改变在无铁或者加铁的情况下均有发生；并且过量表达水稻株系种子中的铁含量显著高于野生型水稻，高达3.2倍。

具体地，可通过所述基因编辑载体导入所述目的植物。所述方法中，所述基因编辑载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

为了提高植物的优良性状，本发明还保护一种新的植物育种方法，所述方法为：通过提高目的植物中OsNRAMP3蛋白的活性，获得种子的铁含量高于目的植物的植株；或者通过过量表达OsNRAMP3基因，获得种子的铁含量高于目的植物的植株；

其中，本发明所述目的植物是水稻。

另外，本发明还公开了一种提高植物种子中铁含量的方法，构建OsNRAMP3-pCAMBIA1301过表达载体，将构建出的过表达载体转化到植物组织或植物细胞中，将OsNRAMP3基因在植物组织或植物细胞中进行过表达，获得的OsNRAMP3基因过表达株系的铁含量提高。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：水稻，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根（包括块茎）、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

本发明通过植物基因组克隆获得水稻OsNRAMP3基因，构建了OsNRAMP3-pCAMBIA1301过表达载体，通过农杆菌侵染分别获得了OsNRAMP3基因过表达株系OX1和OX2，分析了OsNRAMP3基因过表达株系种子中铁含量，结果表明，OsNRAMP3过表达株系种子中铁含量高于野生型，揭示了OsNRAMP3基因在铁转运方面的作用，为作物富铁品种育种提供新的基因资源。

附图说明

图1是OsNRAMP3基因克隆情况，图1中，A是基因扩增产物电泳图，B是OsNramp3-pMD18-T酶切验证图。

图2是OsNRAMP3基因结构示意图。

图3是OsNRAMP3基因的荧光检测结果。图3中，A和B是构建的瞬时表达载体示意图，C1是绿色荧光信号检测视野下的细胞图，C2是红色荧光信号检测视野下的细胞图，C3是绿色和红色信号合并视野下的细胞图。

图4是OsNRAMP3的组织表达情况。

图5是OsNRAMP3基因的酵母实验，图5中，A是酵母生长实验，B是酵母生长速度比较图。

图6是OsNRAMP3过表达材料的获得，图6中，A：水稻胚性愈伤；B：转化与筛选；C：分化培养；D：生根培养；E：温室生长。

图7为OsNRAMP3过表达材料的鉴定情况，图7中，A：OsNRAMP3-pCAMBIA1301过表达载体示意图；B：OsNRAMP3过表达株系OX1和OX2和野生型水稻作为对照材料的Northern检测；C：OsNRAMP3过表达株系OX1和OX2和野生型水稻kitaake（简写为k）的SDS-PAGE和Western检测；D：OsNRAMP3过表达株系OX1和OX2和野生型水稻种子中铁含量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

在介绍具体实施例前，为便于本领域技术人员详细了解本申请的相关研发情况，以下结合附图对本发明的原理、部分实验材料、检测方法等情况进行说明：

1. 植物材料总RNA的提取及反转录

取0.2 g的植物材料，在液氮中迅速研磨成灰白色粉末进行实验。在粉末中加入600 µL Buffer EL，振荡1 min待粉末完全混匀后，立即离心5 min(12000 rpm)，转移上清至吸附柱III中离心1 min (12000 rpm)，将上清转入新管并加入300 µL无水乙醇调节上柱环境，充分混匀后将混合物分批加入吸附柱V中，离心30 s(12000 rpm)，弃滤液。随后在吸附柱V中分步加入RWA和RWB并离心除杂 (RWB要洗杂两遍)。洗杂后换新的收集管空柱离心2min(12000 rpm)，室温晾干后加水洗脱 (低温高速离心2 min)。洗脱后总RNA置于冰上暂存或液氮速冻后置于-80℃保存。

将提取得到的总RNA用Nanodrop测量浓度后，按照5 µg总RNA的量进行RNA模板变性，设置PCR程序 (65℃加热5 min，12℃降温5min)，运行程序结束并且降温后取出变性产物，冰浴2 min。冰浴后加入gDNA wiper Mix混匀，置于42℃孵育2 min。在取出的混液中依次加入RT Mix、HiScript IIIEnzyme Mix、Oligo (dT) 20VN以及RNase-free ddH₂O。将上述液体用移液枪吹打混匀后，设置PCR程序 (25℃加热5 min，37℃加热45 min，85℃处理5s)，取出后的cDNA产物可用于后续实验，或在-80℃保存。

2. 载体构建

过表达载体的构建流程：

提取野生型水稻材料的RNA，将得到的总RNA用Nanodrop测量浓度后反转录为cDNA。同时在国家水稻数据中心官网 (https://www.ricedata.cn/gene/) 下载LOC_AK070574的CDNA序列，并通过DNAMAN和Primer express3.0 设计特异性引物，以野生型日本特早熟粳稻品种Kitaake 水稻材料的cDNA为模板，用PCR反应 (PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，37次循环；72℃延伸5 min，12℃降温5 s) 克隆OsNRAMP3基因的编码序列，将PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，琼脂糖凝胶电泳图如图1中A所示。图1中B是构建到pMD18-T质粒上之后的酶切验证图，后续进行的基因测序，测序结果正确。使用天根的DNA回收纯化试剂盒对目的条带进行回收并将回收的目的基因与pCAMBIA1301进行连接 (55℃连接30 min)，图2是OsNRAMP3基因的结构示意图，包含有13个内含子和13个外显子；图7中A是构建的OsNRAMP3-pCAMBIA1301过表达载体的结构示意图。

3. OsNRAMP3蛋白的亚细胞定位

首先制备水稻原生质体：选取培养瓶中黑暗培育14±2天，生长状态良好的水稻黄化苗。取幼茎用刀片将其切成1±0.5 mm的细段，转移至盛有酶解液 (Cellulase RS, 1.5%(w/v); Macerozyme R10, 0.7% (w/v); D-Mannitol, 0.4 M; CaCl₂, 20 mM; MES-KOH(pH 5.7), 20 mM; BSA, 0.1% (w/v); KCl, 20 mM.) 的平皿中，并将平皿避光置于30℃恒温摇床上 (60±20 rpm)，消化6±2 h。在消化完全的细胞悬浮液中缓慢加入与酶解液等体积的W5缓冲液，轻晃平皿混匀液体终止消化。并将混合的细胞悬液用300目细胞筛过滤至预冷的圆底离心管中 (缓慢研磨)，4℃离心2 min (转速200 g)，弃上清后沿管壁加入5 mLW5缓冲液。轻旋离心管使管底原生质体沉淀重悬，置于冰上自然沉降30 min。吸除上清后完成水稻原生质体制备。

其次水稻原生质体转化 (全程避光)：在制备好的水稻原生质体中沿管壁加入转化所需的MMG缓冲液 (MgCl₂, 15 mM; D-Mannitol, 0.4 M; MES-KOH (pH 5.7), 4 mM)，轻旋离心管至原生质体重新悬浮于缓冲液中。与此同时将待转化的pCambia1300-35S-CTO1-GFP质粒和pCambia1300-35S-CTO1-RFP分装进2 mL圆底离心管中 (质粒总量10-20 µg, 体积不超过20 µL)，在转化时加入相应体积的原生质体细胞悬液并拨匀，随后加入提前配制的PEG转化液 (D-Mannitol, 0.2 M; CaCl₂, 100 mM; PEG4000, 40% (w/v)) 拨匀并置于室温反应15 min。转化反应完成时加入4倍体积的W5缓冲液 (CaCl₂, 125 mM; NaCl,154 mM; KCl, 5 mM; MES-KOH (pH 5.7), 2 mM) 终止反应，室温离心2 min (转速100g)，去除上清后加入W5缓冲液1 mL，在离心管中重悬原生质体。后将离心管平躺于平皿中，在28℃条件下，培养12±4 h。次日取出过夜培养的样品，自然沉降并去除700 µL上清，以剩余缓冲液重悬原生质体。取少量原生质体悬液置于快速超分辨激光共聚焦显微镜下成像观察并拍摄图片。本实验以拟南芥中已报道的AtNRAMP3蛋白融合红色荧光蛋白的红色荧光信号作为液泡膜定位的对照，观察OsNRAMP3蛋白的定位情况。结果如图3所示：图中A是mCherry-AtNRAMP3瞬时表达载体结构示意图，B是OsNRAMP3-GFP瞬时表达载体结构示意图。在水稻叶片细胞中OsNRAMP3-GFP融合蛋白的绿色荧光信号（图3中C1）与定位液泡膜的mCherry-AtNRAMP3红色荧光信号（图3中C2）完全重合，如图3中C3所示，这种信号分布说明OsNRAMP3-GFP的融合蛋白定位于液泡膜。

4.OsNRAMP3的组织表达分析

为了研究OsNRAMP3基因的表达模式，分别提取水稻根、茎、叶和种子中总RNA，通过RT-PCR检测OsNRAMP3在这些组织中表达的情况，发现根、茎、叶和种子中都有表达，且茎和叶中表达量稍高，而根和种子中表达量较低。进一步通过real-time PCR检测幼苗，根、茎、叶、花、胚和胚乳中表达（图4），发现OsNRAMP3在这些组织中都有表达，其中茎、叶和胚中表达量较高，其它部位的表达量较低。

5.酵母的生长实验

酵母转化载体的构建：利用RT-PCR方法从水稻mRNA扩增1.1kb OsIRT1和OsNRAMP3，扩增时引物两端设计了EcoRⅠ、Sal Ⅰ位点，测序正确后，用EcoRⅠ和Sal Ⅰ酶切；

取1μg pDR196质粒用Hind III和Sal I消化，经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化线性载体片段；将载体和目的片段按1:3的摩尔比进行连接反应，反应条件为16℃过夜。连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定阳性克隆；重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定后即可用于酵母转化实验。

酵母转化：酵母菌株DEY1453划线YPD板，28℃培养箱培养2-3天；挑单克隆菌于5mLYPD液体培养基，28℃摇床摇菌，之后转接至50mL YPD摇至OD值为1左右；3000rpm离心5min集菌； 25mL 灭菌水漂洗，涡旋混匀，离心集菌；再次用25mL 灭菌水涡旋，1mL分装至1.5mL离心管中； 6000rpm离心5min，去上清，加入100μL one-step buffer 涡旋混匀； 加入6μLcarrier DNA混匀（先将carrier DNA煮20min，冰上冷却）；加入1μL 载体DNA，混匀；45℃温育30min，期间每10min振荡一次。将温育后的酵母均匀涂布于相应的Drop-out培养基上，28℃培养箱培养3天；筛选长出的菌落重新划线获取单克隆；将只转化载体质粒的菌落（做阴性对照）和转化OsIRT1（做阳性对照）和OsNRAMP3的菌落转接到加入20μM Fe离子的Drop-out培养液中，待菌摇至OD值为1时，分别点板至加入0,5,20和100μM Fe离子的Drop-out板上，观察转化OsNRAMP3的DEY1453缺陷型酵母菌是否恢复转运铁的能力。如图5所示，图5中A是酵母生长实验，图5中B是酵母生长速度比较图。可以看出转化OsNRAMP3的DEY1453缺陷型酵母菌在0μM培养基上能够恢复缺陷型酵母的生长能力，且在0,5,20和100μM Fe离子的Drop-out培养基上的生长速度比缺陷型酵母的生长速度快很多。

6.遗传材料创制

野生型日本特早熟粳稻品种Kitaake 为出发植株，用OsNRAMP3基因的CDS序列构建出的含有35S启动子的pCAMBIA1301过表达载体，将构建出的表达载体导入农杆菌中，通过农杆菌侵染水稻愈伤组织（图6中A），利用获得的愈伤组织继续诱导得到再生苗（图6中B：转化与筛选；图6中C：分化培养；图6中D：生根培养；图6中E：温室生长），通过抗性筛选获得OsNRAMP3基因过表达株系 (OX1，OX2)。

分别取野生型株系（WT）和过表达株系 (OX1，OX2)的叶片进行RNA提取，10μg RNA加入1/2体积上样量的上样缓冲液（若多加一滴EB则上样缓冲液减少为1/3体积上样量），混匀后放置70℃加热变性10min，立即置于冰上，足够冷后离心机甩一下。80v 电泳约3hr，其间准备膜、吸水纸、盐桥、滤纸。跑完电泳后用2×SSC洗胶10min。剪长度比胶大1mm的HybondN⁺膜尼龙膜及两张滤纸，尼龙膜用ddH₂O从上到下润湿后，然后将膜浸泡入适当的10xSSC（10xSSC：1.5MNaCl，0.16MNa₃C₆H₅O₇.2H₂O，pH 7.0）转移液中至少泡5min；托盘中加入适当体积转移液，搭建转移桥，由下至上依次为：吸水纸，凝胶（点样孔向下）、尼龙膜、两张滤纸、玻璃板、400 g重物；用玻璃棒赶走各层间的气泡，同时剪去尼龙膜一角作为标记；转膜8-12h，期间更换数次滤纸。将湿润的未染色的尼龙膜置于一张干的滤纸上，在波长254nm处按照1.5J/cm²的剂量照射1分45秒，呈现的Northern检测结果如图7B所示。

取OsNRAMP3基因过表达材料的叶片约0.1 g置于研钵中，向研钵中加入400 μL 全蛋白提取液 (E buffer： 125 mM Tris-HCl，pH 8.8；50 mM Na₂S₂O₅；1% (w/v) SDS；10%(w/v) Glycerol)，充分研磨后转移至1.5 mL 离心管中，震荡15 min，室温离心 (12,000g，10 min)，吸取上清至新的1.5 mL 离心管中，获得OsNRAMP3过表达材料的总蛋白溶液；若溶液仍浑浊，可重复上述离心过程，最后收集上清液进行Western blot。提前清洗准备配置聚丙烯酰胺凝胶的相关工具，并配制15%的聚丙烯酰胺凝胶：上层为浓缩胶，浓度 (丙烯酰胺) 4.5%，下层为分离胶，浓度 (丙烯酰胺) 15%。按比例配置凝胶，待其凝固后。准备1×SDS-PAGE电泳缓冲液，并在4℃冰箱中预冷。向提取出的OsNRAMP3过表达材料总蛋白溶液中加入上样缓冲液 (5 mM Tris-HCl, pH 8.8; 1.2% (w/v) SDS; 1% (w/v) Glycerol; 1%(w/v) β-Mercaptoethanol; 0.0001% (w/v) Bromophenol blue)，高温加热10 min，使其彻底变性后，将样品用上样器加入凝胶上样孔，并开始电泳 (每块胶电流10 mA, 时间4-6h)。根据溴汾蓝指示剂和蛋白Marker的位置判断目的蛋白位置，当目的蛋白跑到凝胶2/3处停止电泳（图7中C）。与此同时配置转膜缓冲液，并提前将滤纸以及硝酸纤维素膜置于转膜缓冲液中浸泡。小心地将凝胶从玻璃板上取下也置于转膜缓冲液中浸泡。将滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸依次放好，扣好转膜夹，开始转膜 (电流180 mA, 时间1.5 h)。转膜结束，取出带有蛋白的硝酸纤维素膜，放入8%的脱脂牛奶中室温封闭1 h，随后用TTBS (50 mMTris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% (v/v) Tween-20) 置换脱脂牛奶，以此清洗封闭后的硝酸纤维素膜 (共清洗3次，每次5 min)。将洗好的硝酸纤维素膜转入1%的脱脂牛奶(含有一抗) 中在4℃孵育过夜。回收一抗后用TTBS清洗硝酸纤维素膜 (共清洗5次，每次5min)。将洗好的硝酸纤维素膜转移到1%的脱脂牛奶 (含有二抗) 中，室温孵育1 h。孵育结束用TTBS清洗硝酸纤维素膜 (共清洗4次，每次5 min)。将化学发光液A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜的蛋白面朝下与此混合液充分接触；1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X光片夹中。在暗室中，将1× 显影液和定影液分别倒入塑料盘中；在红灯下取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1 cm）；打开X光片夹，把X光片放在膜上，勿移动，盖上X光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1～5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X光片夹，取出X光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，立刻终止显影。显影时间一般为1-2 min（20-25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片。以水稻野生型材料作阴性对照，OsNRAMP3基因过表达材料中NRAMP3-FLAG蛋白在CaMV 35S 启动子的驱动下稳定表达。

7.水稻成熟种子铁含量的测定

野生型水稻和过表达株系OX1和OX2水稻成熟干种子去种皮后研磨成粉末状备用。取0.01-0.3g烘干研磨好的材料于分析天平称重并记录质量。称好的材料转移至微波消解管中，并向管中分别加入5mL硝酸（可静置过夜）后加2mL双氧水，静置20分钟后上微波消解仪。消解后溶液冷却至室温，蒸馏水定容消解液至100mL容量瓶。定容好的溶液过滤去掉残渣。使用电感耦合等离子发射光谱（iCAP）测定过滤后溶液中的Fe、Mn、Zn、Cu等离子含量。

结果计算：离子含量（μg/g）= 测定结果（μg/mL）×100mL（提取液体积）×0.001/样品质量（g），检测结果如图7中D所示，过表达株系水稻种子中的铁含量高于野生型水稻，高达3.2倍。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (3)

1.OsNRAMP3基因在提高水稻种子铁含量中的应用，其特征在于，所述OsNRAMP3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过构建OsNRAMP3-pCAMBIA1301过表达载体，获得OsNRAMP3基因过表达株系，所述过表达株系的种子中的铁含量高于野生型。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以野生型水稻为出发植株，将构建出的过表达载体导入农杆菌中，通过农杆菌侵染水稻愈伤组织，利用获得的愈伤组织继续诱导得到再生苗，通过抗性筛选获得OsNRAMP3基因过表达株系。