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CN118908958B - 一种cdk4/6小分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种cdk4/6小分子荧光探针及其制备方法和应用

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CN118908958B
CN118908958B CN202410974834.6A CN202410974834A CN118908958B CN 118908958 B CN118908958 B CN 118908958B CN 202410974834 A CN202410974834 A CN 202410974834A CN 118908958 B CN118908958 B CN 118908958B
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cdk4
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fluorescent probe
small molecule
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高玉祺
张洁
齐士翔
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Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
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Abstract

本发明公开了一种CDK4/6小分子荧光探针及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明提供的CDK4/6小分子荧光探针，其具有式(I)所示结构，探针响应基团新颖，选择性好；且制备方法反应条件温和，原料便宜易得，操作及后处理简单；与CDK4/6蛋白的亲和力高，灵敏度高。

Description

一种CDK4/6小分子荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种CDK4/6小分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
细胞周期由四个阶段组成：S期(主要为DNA复制)，M期(主要为有丝分裂)以及S和M之间的两个间隙(G1和G2)。在非增殖细胞中也存在一种名为G0的静止状态。细胞周期受到各种特定的蛋白质的控制和调节，例如：细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、细胞周期蛋白和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，CDK的失调会导致细胞周期失衡和无限的细胞增殖，从而促进恶性肿瘤的发生和发展。CDK与其相应的细胞周期蛋白结合并形成功能性异二聚体复合物。到目前为止，已经发现了20种CDKs和29个细胞周期蛋白。CDK包括细胞周期相关的CDK(CDK1、CDK2、CDK4和CDK6)和转录CDK(CDK7-9、CDK11-13、CDK19)。根据其功能不同可分为两个亚家族：CDKs 1–6、11和14-18用于调节细胞周期，CDK 7-13、19和20用于转录。CDK的活化由与其调节亚基(细胞周期蛋白)和磷酸化抑制蛋白的关联控制。CDK4当通过磷酸化pRb与细胞周期蛋白D配位时，与其密切相关的CDK6在从G1到S的过渡中起着至关重要的作用，pRb以未磷酸化状态来抑制G1期到S期的过渡。细胞周期蛋白D-的畸变CDK4/6-INK4-pRb通路在肿瘤中经常发生，因此肿瘤也被认为是细胞周期疾病。特别是随着对细胞周期调控机制的不断研究取得重大进展，CDKs在细胞周期调控中起着核心作用。因此，小分子CDK抑制剂是抗癌化疗研究的一个热门领域。
CDK抑制剂的研究中，一个重要的课题是涉及CDK4/6抑制剂的(用于治疗不同的肿瘤类型)组合治疗方案的测试和鉴定。CDK4/6抑制剂触发肿瘤细胞的细胞周期停滞，在某些情况下，能够触发衰老。其中，Palbociclib(帕博西林)是一种CDK4/6的特异性抑制剂，近年来已成为治疗乳腺癌，特别是雌激素受体阳性乳腺癌的明星药物。确定将CDK4/6抑制剂从细胞抑制化合物转化为细胞毒性化合物并释放肿瘤细胞杀伤的联合治疗至关重要。全基因组高通量筛选以及对小鼠癌症模型和PDX的分析将有助于解决这个问题。细胞周期蛋白D-CDK4/6生物学的另一个尚未开发的领域是这些蛋白质可能参与其他病理发生，如代谢紊乱。该领域的研究可能会将CDK4/6抑制剂的使用扩展到其他疾病的治疗。这些问题确保了CDK4/6生物学在未来几年内仍将是基础、转化和临床研究的活跃领域。
小分子荧光探针具有快速、灵敏、高通量和易于自动化等特点，在蛋白标记与成像技术中有着重要的应用。目前小分子荧光探针已经广泛应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。但是能够专一地与目标蛋白结合的小分子探针种类仍然较少，主要因素是设计和合成方法的缺乏。特别是，目前还没有用于研究CDK4/6蛋白间相互作用的小分子荧光探针。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明提供了一种CDK4/6小分子荧光探针及其制备方法和应用，该探针可以特异性结合CDK4/6蛋白；应用此小分子探针，能够更深入了解CDK4/6蛋白间的作用机制及发现更有效的抑制剂。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，一种CDK4/6小分子荧光探针，具有式(I)所示结构：
其中，R1选自如下结构中的任意一种：
或者n＝1、2、3或5。
第二方面，一种CDK4/6小分子荧光探针，具有式(I)所示结构：
其中，R1选自如下结构中的任意一种：
或者
m＝1或2。
第三方面，上述CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
将Palbociclib与式(II)所示化合物进行酰胺化反应，生成式(III)所示化合物，将式(III)所示化合物脱保护基后与丹磺酰氯进行酰胺缩合反应，即得式(I)所示化合物；
n＝1、2、3或5，式(II)；
n＝1、2、3或5，式(III)；
或者，将Palbociclib与3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸进行酰胺化反应，生成化合物，将生成的所述化合物脱保护基后与丹磺酰氯进行酰胺缩合反应，即得式(I)所示化合物；
或者，7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色酮-3-羧酸与硫酰氯反应生成羧酸衍生物，然后与式(III)所示化合物通过亲核取代反应得到式(I)所示化合物；
或者，4-(3-苯氧基丙基)-1,3-二氧杂环己-2-烯-2-酮与氯磺酸通过磺化反应得到中间体，中间体经过酰胺化反应，再与式(III)所示化合物通过亲核取代反应得到式(I)所示化合物；
或者，4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯甲酸与式(III)所示化合物通过酰胺缩合反应生成式(I)所示化合物；
或者，4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑与式(III)所示化合物通过酰胺缩合反应生成式(I)所示化合物；
或者，式(IV)所示化合物经过卤代反应后，再与2,3,3-三甲基吲哚反应，反应产物与式(V)所示化合物反应后，与式(III)所示化合物或者Palbociclib经过酰胺缩合反应生成式(I)所示化合物；式(V)所示化合物为2,3,3-三甲基吲哚经烷基化获得；
n＝1或2，式(IV)；
可选的，式(II)所示化合物在DIEA和HATU存在的条件下，与Palbociclib反应生成式(III)所示化合物，式(III)所示化合物与三氟乙酸反应脱保护基，之后在DIEA的条件下与丹磺酰氯进行酰胺缩合反应，生成式(I)所示化合物。
可选的，7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色酮-3-羧酸在氮气保护下加入SOCl2，加入DMF反应得羧酸衍生物，将羧酸衍生物依次加入DIEA和HATU进行反应，再加入式(III)所示化合物进行亲核取代反应，生成式(I)所示化合物。
可选的，4-(3-苯氧基丙基)-1,3-二氧杂环己-2-烯-2-酮在冰浴条件下加入氯磺酸，之后加热回流获得中间体，将中间体在冰浴条件下加入三乙胺反应，之后加入盐酸二甲胺反应，加入N,N-二异丙基乙胺反应后，再加入式(III)所示化合物进行亲核取代反应，生成式(I)所示化合物。
可选的，4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯甲酸中依次加入N,N-二异丙基乙胺、HATU反应，之后与式(III)所示化合物进行亲核取代反应，生成式(I)所示化合物。
可选的，4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑加入N,N-二异丙基乙胺反应后，与式(III)所示化合物进行亲核取代反应，生成式(I)所示化合物。
可选的，式(IV)所示化合物与NaI在N2反映下发生卤代反应；之后加入乙酸乙酯进行反应，之后加入2,3,3-三甲基吲哚反应，获得化合物04；2,3,3-三甲基吲哚与碘甲烷回流反应，析出化合物05的结晶；在反应产物04中加入丙二醛二苯胺盐酸盐混合后，在氮气保护下加入醋酸和醋酸酐进行回流反应；之后加入化合物05、、吡啶和乙酸，进行回流反应，得到化合物06；向化合物06中依次加入DIEA和HATU，之后加入式(III)所示化合物进行亲核取代反应，生成式(I)所示化合物。
或者，得到化合物06之后，向化合物06中依次加入DIEA和HATU，之后加入Palbociclib进行亲核取代反应，生成式(I)所示化合物。
第四方面，第一方面和第二方面所述的CDK4/6小分子荧光探针的应用，包括：识别CDK4/6蛋白方面和/或制备识别CDK4/6蛋白产品中的应用。
第五方面，第一方面所述的CDK4/6小分子荧光探针的应用，包括：在细胞周期阻滞和/或制备细胞周期阻滞产品中的应用；
或者，在癌细胞荧光成像和/或制备癌细胞荧光成像产品中的应用。
本发明的有益效果为：
1.本发明的探针响应基团新颖，选择性好；且制备方法反应条件温和，原料便宜易得，操作及后处理简单。
2.本发明的探针分子生物活性强，与CDK4/6蛋白的亲和力高，灵敏度高；可以用于CDK4/6蛋白及其高表达的肿瘤细胞或组织的标记；可以作为识别CDK4/6蛋白的探针及CDK4/6蛋白在生理、病理及相关疾病中有广阔的应用前景。
3.本发明的探针可直接反应化合物对CDK4/6蛋白的抑制活性，可用于DK4/6蛋白抑制剂的高通量筛选及其在抗肿瘤评价中的应用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1表示实施例4中的光学活性测定结果图；
图2表示实施例6中的细胞活性测定结果图；
图3表示实施例8中的探针分子的细胞成像结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
以下实施例中，缩写所代表的含义如下：
DMSO：二甲基亚砜；
DIEA：N,N-二异丙基乙胺；
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；
TEA：三乙胺；
CDCl3：氘代氯仿；
SOCl2:氯化亚砜,亚硫酰氯；
Tris：三羟甲基氨基甲烷；
BSA：牛血清白蛋白；
DTT：二硫苏糖醇；
ATP：三磷酸腺苷；
1H NMR：核磁共振氢谱；
13C NMR：核磁共振碳谱；
HRMS(ESI)：高分辨质谱(电喷雾电离)。
下面结合具体实施例对本发明技术方案做进一步阐述。
实施例1
CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，
反应路线如下式所示：
n＝1,2,3或5。
反应步骤包括：
S1、以化合物(1)和Palbociclib为原料进行反应后生成中间体(3)；
S2、加入三氟乙酸，将中间体(3)转化为中间体(4)；
S3、加入丹酰氯与中间体(4)进行反应即得化合物(6)，即所示的靶向CDK4/6蛋白的小分子荧光探针。
其中，当n＝1,2,3或者5时，化合物(1)分别化合物(1a)、(1b)、(1c)、(1d)；化合物(3)分别化合物(3a)、(3b)、(3c)、(3d)，化合物(4)分别化合物(4a)、(4b)、(4c)、(4d)；化合物(6)分别化合物(6a)、(6b)、(6c)、(6d)。
当n＝1时，化合物(1a)为Boc-beta-丙氨酸，步骤包括：
S1、将Boc-beta-丙氨酸(化合物(1a)，51mg,0.268mmol)溶于二氯甲烷(5mL)，加入DIEA(55μM,0.334mmol)和HATU(165mg,0.446mmol)室温反应一小时；之后加入Palbociclib(化合物(2)，100mg,0.223mmol)反应，在室温下搅拌12h；随后用二氯甲烷萃取，再用1MNaOH溶液洗涤，旋除溶剂，得到黄色固状物质；用硅胶柱层析法将所得化合物进行纯化，旋除溶剂后得到黄色固体，将黄色固体溶解在石油醚和乙酸乙酯(6:1)配比溶液中，过滤，得到黄色固体的化合物(3a)，产率为94.3％。化合物(3a)，m.p.:160-176℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.13(s,1H),8.96(s,1H),8.08(d,J＝3.0Hz,1H),7.88(d,J＝9.0Hz,1H),7.51(dd,J＝9.1,3.1Hz,1H),6.73(s,1H),5.83(p,J＝8.7Hz,1H),3.61(d,J＝5.5Hz,5H),3.22-3.10(m,6H),2.42(s,3H),2.31(s,3H),2.25(s,2H),2.00(q,J＝7.0,6.6Hz,1H),1.89(s,1H),1.82-1.72(m,1H),1.58(d,J＝5.3Hz,2H),1.37(s,9H),0.95-0.79(m,1H)。
S2、将化合物(3a)(130mg,0.21mmol),5mL三氟乙酸与5mL二氯甲烷置于25mL茄形瓶中，搅拌溶解，2h后反应完毕，旋除溶剂,饱和碳酸氢钠调PH＝7～8，加水和二氯甲烷萃取，旋干，得到化合物(4a),黄色固体120mg，未经二次纯化直接进行下一步反应。
S3、将化合物(4a)(100mg,0.193mmol)溶于二氯甲烷，加入DIEA(21mg,0.164mmol)、丹磺酰氯(化合物(5)，72mg,0.231mmol)，室温下反应24h,用二氯甲烷对反应液进行萃取，1M柠檬酸洗，干燥旋除溶剂后经柱层析纯化。旋除溶剂后得到黄色固体，将黄色固体溶解在正己烷和二氯甲烷(7：1)配比溶液中，过滤，最终得到化合物(6a)，即靶向CDK4/6蛋白的小分子荧光探针TYZJ-2202，黄色固体，产率为48％。小分子荧光探针TYZJ-2202，m.p.:160-167℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.14(s,1H),8.96(s,1H),8.47(d,J＝8.5Hz,1H),8.28(d,J＝8.7Hz,1H),8.15(dd,J＝7.3,1.2Hz,1H),8.05(d,J＝3.0Hz,1H),7.95-7.85(m,2H),7.71-7.56(m,2H),7.47(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),5.83(p,J＝8.8Hz,1H),3.51(t,J＝5.1Hz,2H),3.40(d,J＝4.6Hz,2H),3.05(dd,J＝7.9,4.7Hz,6H),2.81(s,6H),2.45(d,J＝7.0Hz,2H),2.43(s,4H),2.31(s,3H),2.28-2.19(m,2H),1.89(s,2H),1.83-1.72(m,2H),1.60(dd,J＝12.7,6.8Hz,2H).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ202.90,168.91,161.22,158.97,158.88,158.71,155.23,151.84,145.25,145.16,143.55,142.54,136.36,129.95,129.78,129.54,128.83,128.36,125.81,124.09,119.56,115.62,115.46,115.37,107.11,53.42,49.11,48.70,45.52,44.83,41.06,32.99,31.77,31.43,28.04,25.61,22.53,14.43,14.10。
当n＝2时，化合物(1b)为N-BOC-GAMMA-氨基丁酸，步骤包括：
S1、按照上述n＝1的合成步骤S1，以化合物(1b)为原料生成黄色固体(3b)，产率为85.1％,m.p.:202-214℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.13(s,1H),8.95(d,J＝10.2Hz,1H),8.08(d,J＝3.1Hz,1H),7.88(d,J＝9.1Hz,1H),7.58–7.44(m,1H),6.81(s,1H),5.83(t,J＝8.9Hz,1H),3.60(s,6H),3.17(s,2H),3.11(s,6H),2.95(d,J＝6.3Hz,2H),2.42(s,3H),2.31(s,2H),2.25(s,2H),1.99(s,1H),1.89(s,2H),1.77(s,2H),1.67–1.53(m,7H),1.36(d,J＝10.3Hz,1H),0.85(s,1H)。
S2、将化合物(3b)(120mg,0.190mmol),5mL三氟乙酸与5mL二氯甲烷置于25mL茄形瓶中，搅拌溶解，2h后反应完毕，旋除溶剂,饱和碳酸氢钠调PH＝7～8，加水和二氯甲烷萃取，旋干，得到化合物(4b),黄色固体120mg，未经二次纯化直接进行下一步反应，化合物(4b)在实施例2与实施例3中，又称中间体2203-04。
S3、将化合物(4b)(120mg,0.225mmol)溶于二氯甲烷中，依加DIEA(58mg,0.45mmol)、丹磺酰氯(化合物(5)，84mg,0.27mmol)，室温下反应24h，用二氯甲烷对反应液进行萃取，1M柠檬酸洗，干燥旋除溶剂后经柱层析纯化。旋除溶剂后得到黄色固体，将黄色固体溶解在正己烷和二氯甲烷(7：1)配比溶液中，过滤，最终得到化合物6b，即靶向CDK4/6蛋白的小分子荧光探针TYZJ-2203，黄色固体，产率为46.5％。m.p.:151-162℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.14(s,1H),8.96(s,1H),8.46(d,J＝8.5Hz,1H),8.31(d,J＝8.6Hz,1H),8.17-8.04(m,2H),7.98-7.86(m,1H),7.61(dt,J＝8.7,7.3Hz,2H),7.49(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),7.25(d,J＝7.5Hz,1H),5.84(p,J＝8.9Hz,1H),3.51(t,J＝5.1Hz,2H),3.05(d,J＝5.4Hz,4H),2.82(s,8H),2.43(s,3H),2.31(s,3H),2.30-2.23(m,5H),2.18(t,J＝7.3Hz,2H),1.90(d,J＝8.6Hz,2H),1.82-1.74(m,2H),1.57(dt,J＝21.7,7.7Hz,4H).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ202.91,170.37,161.22,158.99,158.73,155.23,151.84,145.25,143.61,142.54,129.87,129.53,129.51,128.88,128.29,125.83,124.08,119.55,115.55,107.12,60.23,53.40,49.18,48.84,45.53,44.74,42.52,42.42,41.08,31.78,31.42,29.55,28.04,25.60,25.16,22.53,21.23,14.56,14.43,14.10。
当n＝3时，化合物(1c)为Boc-5-氨基戊酸，步骤包括：
S1、按照本实施例的S1的合成步骤，以化合物(1c)为原料，和Palbociclib(化合物(2))合成黄色固体(3c)，产率为74.7％,m.p.165-177℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.12(s,1H),8.96(s,1H),8.08(d,J＝3.0Hz,1H),7.88(d,J＝9.0Hz,1H),7.50(dd,J＝9.1,3.1Hz,1H),6.76(s,1H),5.90–5.67(m,1H),3.61(s,4H),3.14(d,J＝21.3Hz,6H),2.89(q,J＝6.6Hz,2H),2.42(s,3H),2.34(t,J＝7.5Hz,2H),2.31(s,3H),2.24(d,J＝10.1Hz,2H),1.99(p,J＝7.1Hz,1H),1.89(s,2H),1.84–1.68(m,1H),1.65–1.55(m,2H),1.49(q,J＝7.4Hz,2H),1.37(s,9H)。
S2、将产物(3c)(115mg,0.178mmol),5mL三氟乙酸与5mL二氯甲烷置于25mL茄形瓶中，搅拌溶解，2h后反应完毕，旋除溶剂,饱和碳酸氢钠调PH＝7～8，加水和二氯甲烷萃取，旋干，得到化合物(4c),黄色固体115mg，未经二次纯化直接进行下一步反应。
S3、将化合物(4c)(115mg,0.211mmol)溶于二氯甲烷,逐加DIEA(137mg,1.055mmol)、丹磺酰氯(化合物(5),78mg,0.252mmol),室温下反应24h,用二氯甲烷对反应液进行萃取，1M柠檬酸洗，干燥旋除溶剂后经柱层析纯化。旋除溶剂后得到黄色固体，将黄色固体溶解在正己烷和二氯甲烷(7：1)配比溶液中，过滤，最终得到化合物(6c)，即靶向CDK4/6蛋白的小分子荧光探针TYZJ-2201，黄色固体，产率为48％。m.p.:135-142℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.15(s,1H),8.96(s,1H),8.46(d,J＝8.5Hz,1H),8.31(d,J＝8.6Hz,1H),8.15-8.06(m,2H),7.93-7.85(m,2H),7.60(ddd,J＝14.2,8.6,7.4Hz,2H),7.50(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),7.25(d,J＝7.5Hz,1H),5.96-5.76(m,1H),3.57(s,2H),3.51(s,2H),3.18-3.06(m,7H),2.82(s,1H),2.43(s,3H),2.32(s,3H),2.20(t,J＝7.0Hz,4H),1.89(s,3H),1.83-1.73(m,4H),1.66-1.55(m,2H),1.39(dq,J＝12.0,5.7,4.7Hz,4H),1.23(s,1H).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ202.91,170.83,161.22,158.99,158.72,155.23,151.80,145.25,143.65,142.54,136.65,136.36,129.79,129.58,129.53,128.67,128.25,125.86,124.04,119.63,115.55,115.52,107.11,53.41,49.37,48.95,45.53,45.02,42.68,42.58,41.12,32.01,31.78,31.42,29.27,28.03,25.60,22.53,22.24,14.43,14.10。
当n＝5时，化合物(1d)为7-(N-叔丁氧羰基氨基)庚酸，步骤包括：
S1、按照本实施例中化合物(3a)的反应步骤，以化合物(1d)和Palbociclib(化合物(2))合成黄色固体(3d)，产率68.3％,m.p.170-177℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.13(s,1H),8.95(d,J＝9.2Hz,1H),8.08(d,J＝3.1Hz,1H),7.88(d,J＝9.1Hz,1H),7.59–7.36(m,1H),6.81(s,1H),6.01–5.71(m,1H),3.60(s,4H),3.17(s,2H),3.11(s,4H),2.95(d,J＝6.3Hz,3H),2.45-2.39(m,3H),2.36(d,J＝7.3Hz,2H),2.34-2.26(m,3H),2.25(s,2H),2.03-1.94(m,2H),1.96-1.84(m,2H),1.83-1.72(m,2H),1.68-1.55(m,4H),1.36(d,J＝10.3Hz,9H),0.94-0.73(m,1H)。
S2、将化合物(3d)(101mg,0.150mmol),5mL三氟乙酸与5mL二氯甲烷置于25mL茄形瓶中，搅拌溶解，2h后反应完毕，旋除溶剂,饱和碳酸氢钠调PH＝7～8，加水和二氯甲烷萃取，旋干，得到化合物(4d),黄色固体101mg，未经二次纯化直接进行下一步反应。
S3、将化合物(4d)(81mg,0.131mmol)溶于二氯甲烷,逐加DIEA(34mg,0,212mmol)、丹磺酰氯化合物((5)，49mg,0.157mmol),室温下反应24h,用二氯甲烷对反应液进行萃取，1M柠檬酸洗，干燥旋除溶剂后经柱层析纯化。旋除溶剂后得到黄色固体，将黄色固体溶解在正己烷和二氯甲烷(7：1)配比溶液中，过滤，最终得到化合物(6d)，即靶向CDK4/6蛋白的小分子荧光探针TYZJ-2204，黄色固体，产率为28.6％。m.p.:156-160℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.13(s,1H),8.95(d,J＝10.2Hz,1H),8.08(d,J＝3.1Hz,1H),7.88(d,J＝9.1Hz,1H),7.56-7.46(m,1H),6.87-6.76(m,1H),5.91-5.77(m,1H),3.60(s,4H),3.23-3.14(m,2H),3.14-3.09(m,6H),3.00-2.89(m,3H),2.45-2.39(m,3H),2.36(d,J＝7.3Hz,3H),2.31(s,3H),2.27-2.19(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.94-1.85(m,2H),1.83-1.72(m,2H),1.66-1.55(m,4H),1.36(d,J＝10.3Hz,9H),0.94-0.74(m,1H).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ202.91,171.03,161.20,158.88,158.66,155.20,151.77,145.24,143.59,142.57,136.64,136.38,129.76,129.73,129.58,129.50,128.71,128.21,125.81,124.01,119.65,115.51,115.29,107.04,53.42,49.38,48.96,45.51,45.06,42.75,41.11,39.41,32.51,31.76,29.38,28.61,28.02,26.16,25.61,25.00,14.09。
或者，反应路线如下式所示：
与上述n＝1、2、3或5时的区别在于：化合物(1)为化合物(1e)，即3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸时；化合物(3)为化合物(3e)；化合物(4)为化合物(4e)；化合物(6)为化合物(6e)；步骤包括：
S1、按照本实施例中化合物(3a)的反应步骤，以化合物(1e)和Palbociclib(化合物(2))合成黄色固体(3e)，产率85.6％，m.p.:197-199℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.22(s,1H),8.97(s,1H),8.08(d,J＝3.0Hz,1H),7.89(d,J＝9.0Hz,1H),7.51(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),6.81(t,J＝5.8Hz,1H),5.91–5.72(m,1H),3.62(d,J＝6.2Hz,5H),3.37(d,J＝7.6Hz,7H),3.18(d,J＝5.0Hz,2H),3.12(d,J＝4.9Hz,1H),3.09–3.04(m,2H),2.63(t,J＝6.6Hz,2H),2.43(s,2H),2.31(s,2H),2.28–2.19(m,2H),1.89(s,2H),1.83–1.74(m,2H),1.63–1.54(m,2H),1.37(s,8H).
S2、将产物(3e)(120mg,0.181mmol)加入5mL三氟乙酸与5mL二氯甲烷置于25mL茄形瓶中，搅拌溶解，2h后反应完毕，旋除溶剂,饱和碳酸氢钠调pH＝7～8，加水和二氯甲烷萃取，旋干，得到4e,黄色固体118mg，未经二次纯化直接进行下一步反应。
S3、将产物4e(118mg,0.209mmol)溶于二氯甲烷,逐加DIEA(54mg,0.418mmol)、原料5(67.6mg,0.258mmol)，室温下反应24h,用二氯甲烷对反应液进行萃取，1M柠檬酸洗，干燥旋除溶剂后经柱层析纯化。旋除溶剂后得到黄色固体，将黄色固体溶解在正己烷和二氯甲烷(7：1)配比溶液中，过滤，即靶向CDK4/6蛋白的小分子荧光探针TYZJ-2205，产率为78.6％,m.p.:167-170℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.18(s,1H),8.97(s,1H),8.46(d,J＝8.5Hz,1H),8.32(d,J＝8.6Hz,1H),8.17–8.08(m,2H),7.99(t,J＝5.8Hz,1H),7.91(d,J＝9.0Hz,1H),7.61(ddd,J＝11.2,8.6,7.4Hz,2H),7.50(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),7.25(d,J＝7.5Hz,1H),5.90–5.52(m,1H),3.65–3.49(m,4H),3.42(t,J＝6.5Hz,2H),3.31(t,J＝5.8Hz,2H),3.20–3.09(m,4H),2.98(q,J＝5.8Hz,2H),2.82(s,5H),2.51(p,J＝1.9Hz,1H),2.43(d,J＝4.4Hz,5H),2.32(s,4H),2.27–2.20(m,2H),2.00(s,1H),1.94–1.88(m,1H),1.82–1.74(m,1H),1.59(q,J＝6.0Hz,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,1H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ202.88,169.25,161.22,158.95,158.69,155.23,151.79,145.27,143.61,142.55,136.84,136.42,129.77,129.58,129.52,128.54,128.21,125.81,124.03,119.73,115.53,115.42,107.09,69.19,66.83,60.22,55.37,53.43,49.33,48.90,45.52,42.72,41.13,40.63,39.37,33.00,31.76,28.03,25.60,21.22,14.09.HRMS(ESI)m/z calcd forC41H50N9O6S([M+H]+)793.3600；found 793.3599.
实施例2
CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，反应路线如下式所示：
。
反应步骤包括：
S1、7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色酮-3-羧酸与硫酰氯反应生成羧酸衍生物，然后与式(III)所示化合物通过亲核取代反应得到式(I)所示化合物。
或者，S2、4-(3-苯氧基丙基)-1,3-二氧杂环己-2-烯-2-酮与氯磺酸通过磺化反应得到中间体，中间体经过酰胺化反应，再与式(III)所示化合物通过亲核取代反应得到式(I)所示化合物。
或者，S3、4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯甲酸与式(III)所示化合物通过酰胺缩合反应生成式(I)所示化合物。
或者，S4、4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑与式(III)所示化合物通过酰胺缩合反应生成式(I)所示化合物。
具体的，S1的具体步骤为：
在50ml圆底烧瓶中，加入7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色酮-3-羧酸(化合物2306-01，1.913mmol，500mg)，然后加入氮气保护的SOCl2(1.913mmol，0.14ml)，加入2滴DMF，室温搅拌反应1h，反应物料直接在真空下浓缩；加入石油醚5ml，搅拌过滤，得化合物2306-02。反应物不需要纯化，直接用于下一步；将化合物2306-02(0.536mmol，135mg)溶于DMF中，5分钟后，加入DIEA(0.894mmol，115.5mg)。15分钟后，再加入HATU(00.536mmol，150mg)，反应混合物在室温下反应50分钟；向反应溶液中加入中间体2203-04(0.447mmol，238mg)；最终混合物在室温下反应24小时。用柠檬酸洗，水和二氯甲烷多次萃取产物。收集有机层并真空浓缩。粗产物经硅胶柱色谱纯化(甲醇：二氯甲烷＝1:30)，得到黄色固体TYZJ-2306，为CDK4/6分子荧光
探针。产率27.4％,m.p.:215-218℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),8.96(s,1H),8.72-8.58(m,2H),8.07(d,J＝3.0Hz,1H),7.87(d,J＝9.0Hz,1H),7.66(d,J＝9.0Hz,1H),7.49(dd,J＝9.1,3.1Hz,1H),6.78(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),6.61(d,J＝2.4Hz,1H),5.91-5.74(m,1H),3.68-3.58(m,4H),3.51-3.44(m,3H),3.20-3.15(m,2H),3.10(d,J＝5.8Hz,2H),2.42(s,5H),2.31(s,3H),2.27-2.18(m,2H),1.88(s,2H),1.82-1.72(m,3H),1.58(d,J＝5.6Hz,2H),1.22(s,2H),1.12(t,J＝7.0Hz,6H).HRMS(ESI)m/z calcd forC42H50N9O6([M+H]+)776.3879；found 776.3875。
S2的具体步骤为：
将4-(3-苯氧基丙基)-1,3-二氧杂环己-2-烯-2-酮(化合物2307-01，6.47mmol,1g)在冰浴中缓慢加入氯磺酸(6ml)中。1小时后，将溶液加热至80℃回流6小时。将得到的混合物缓慢倒入冰水中，过滤，用水洗涤两次，将沉淀物在二氯甲烷中溶解，用二氯甲烷:石油醚(7:1)溶液洗涤，旋干，得到940mg灰色晶体(化合物2307-02)。产率：80.34％,m.p.:73-76℃.1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.21(d,J＝7.5Hz,1H),7.68(d,J＝7.5Hz,1H).
将得到的中间体2307-02(2.05mmol,520mg)在冰浴中溶解于10ml乙腈中，加入三乙胺(3.32mmol,135.34mg)，反应半小时后加入盐酸二甲胺(2.05mmol,135.34mg)，转移至室温，反应2小时。反应液真空浓缩，粗产物经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)得到白色固体2307-03。产率：28％,m.p.:90-93℃.1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90(d,J＝7.4Hz,1H),7.49(d,J＝7.3Hz,1H),2.90(s,6H).
将中间体2307-03(0.213mmol,58mg)置于50ml玻璃罐中，溶解于二氯甲烷中，5分钟后加入N,N-二异丙基乙胺(0.3192mmol,72mg)。反应溶液中加入中间体2203-04(0.1912mmol,100mg)。最终的混合物在室温下反应24小时。用二氯甲烷提取，用1M柠檬酸溶液洗涤。有机层在真空中收集和浓缩。粗产物经硅胶柱层析(甲醇:二氯甲烷＝1:30)纯化得到黄色固体TYZJ-2307，为CDK4/6分子荧光探针。产率:56.8％,m.p.:187-191℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.15(s,1H),8.96(s,1H),8.46(t,J＝5.6Hz,1H),8.09(d,J＝2.9Hz,1H),7.89(d,J＝9.0Hz,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,1H),7.50(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H),6.37(d,J＝8.2Hz,1H),5.92-5.69(m,1H),3.73-3.57(m,4H),3.48-3.41(m,2H),3.38(d,J＝7.0Hz,0H),3.22-3.09(m,4H),2.69(s,6H),2.59-2.49(m,4H),2.32(s,3H),2.28-2.20(m,2H),2.03-1.84(m,4H),1.80-1.71(m,2H),1.59(t,J＝6.0Hz,2H),1.09(t,J＝7.0Hz,1H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ202.91,170.78,161.21,158.97,158.72,155.22,146.99,145.27,144.81,143.62,142.55,141.88,140.95,136.39,129.76,125.81,115.48,107.09,105.36,99.09,65.39,53.39,49.29,48.94,44.98,43.09,41.25,37.93,31.77,30.00,28.03,25.60,23.69,15.63,14.10.HRMS(ESI)m/z calcd for C36H44N11O6S([M+H]+)758.3192；found 758.3191。
S3的具体步骤为：
将4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯甲酸(反应物2308-01，0.267mmol,100mg)置于50ml锥形瓶中，溶解于二氯甲烷中；5min后，加入DIEA(0.448mmol,58mg)；15分钟后，加入HATU(0.336mmol,127mg)；反应混合物在室温下反应50分钟；在反应溶液中加入中间体2203-04(0.224mmol,119.31mg)。最后的混合物在室温下反应24小时；用二氯甲烷提取，用1M柠檬酸溶液洗涤；有机层在真空中收集和浓缩。粗产物经硅胶柱层析(甲醇:二氯甲烷＝1:30)纯化得到黄色固体TYZJ-2308，为CDK4/6分子荧光探针。产率:72.14％,m.p.:178-181℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.17(s,1H),8.96(s,1H),8.39(t,J＝5.6Hz,1H),8.08(d,J＝3.0Hz,1H),7.90(d,J＝9.0Hz,1H),7.65–7.57(m,2H),7.55–7.46(m,1H),7.18-7.10(m,9H),7.04(d,J＝1.8Hz,1H),7.02(d,J＝1.8Hz,1H),6.99(d,J＝1.9Hz,1H),6.98(d,J＝2.3Hz,2H),6.96-6.95(m,1H),5.94-5.72(m,1H),3.60(q,J＝6.1Hz,4H),3.34(s,3H),3.26(q,J＝6.6Hz,2H),3.16(d,J＝5.0Hz,2H),3.11(d,J＝5.3Hz,2H),2.43(s,3H),2.41(s,2H),2.31(s,3H),2.28-2.20(m,3H),1.96-1.84(m,2H),1.81-1.71(m,4H),1.64-1.53(m,2H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ202.92,170.86,166.20,161.21,158.97,158.73,155.23,146.48,145.25,143.66,143.36,143.25,142.55,141.85,140.30,136.42,132.92,131.10,131.05,130.95,129.76,128.40,128.36,128.30,127.26,127.22,127.16,125.80,115.45,107.08,65.40,53.39,49.26,48.95,45.03,41.21,31.78,30.21,28.03,25.61,25.16,15.64,14.11.HRMS(ESI)m/z calcd for C55H55N8O4([M+H]+)891.4341；found 891.4340。
S4的具体步骤为：
将4-氯-7-硝基苯并[c][1,2,5]噁二唑(反应物2309-01,0.226mmol,45mg)置于50ml玻璃罐中，溶解于二氯甲烷中，5分钟后加入DIEA(0.376mmol,49mg)。在反应溶液中加入中间体2203-04(0.188mmol,100mg)；最终的混合物在室温下反应24小时；用二氯甲烷提取，用1M柠檬酸溶液洗涤；有机层在真空中收集和浓缩；粗产物经硅胶柱层析(甲醇:二氯甲烷＝1:30)纯化得到黄色固体TYZJ-2309，为CDK4/6分子荧光探针。产率:56.8％,m.p.:207-209℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.14(s,1H),9.57(s,1H),8.95(s,1H),8.52(d,J＝8.9Hz,1H),8.08(s,1H),7.89(d,J＝9.0Hz,1H),7.50(d,J＝9.1Hz,1H),6.46(d,J＝9.0Hz,1H),5.89-5.76(m,1H),3.62(dd,J＝12.9,6.5Hz,4H),3.52(s,2H),3.24-3.08(m,4H),2.53(d,J＝11.3Hz,4H),2.31(s,3H),2.24(q,J＝8.8Hz,2H),2.00-1.91(m,2H),1.89(s,2H),1.78(s,2H),1.67-1.55(m,2H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ202.93,170.66,161.21,158.96,158.71,155.21,145.26,144.94,144.62,143.62,142.54,138.44,136.40,129.75,125.80,121.10,115.47,107.08,99.62,53.40,49.26,48.93,44.96,43.49,41.27,31.77,29.83,28.03,25.60,23.65,14.09.HRMS(ESI)m/z calcd for C34H38N11O6([M+H]+)694.2855；found 694.2857。
实施例3
CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，反应路线如下式所示：
反应步骤包括：
S1、化合物01经取代反应后得到中间体04。
S2、化合物03反应为中间体05后，再与中间体04反应生成中间体06。
S3、中间体06与化合物2203-04经酰胺缩合反应后生成化合物TYZJ-2310～2311；
或者，S4、中间体06与化合物08经酰胺缩合反应后生成化合物TYZJ-2312。
当n＝2时，包括步骤：
S1、将7-溴庚酸(化合物01-a)(584mg,2.793mmol)和NaI(935mg,6.425mmol)溶于无水丙酮中，在N2气保护下搅拌过夜。先除去溶剂，然后将产物溶解在二氯甲烷中。通过过滤去除无机盐。将反应液浓缩和真空干燥制得化合物03-a为黄白色固体。反应混合物用于下一个反应，无需进一步纯化。产率：84.8％,m.p.:39-41℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.03(s,1H),3.29(s,2H),2.22(s,2H),1.72(s,2H),1.50(s,2H),1.32(dt,J＝13.1,7.3Hz,4H)
将7-碘庚酸(02-a)(02)(10.743mmol，2.0166g)加入50mL圆底烧瓶中，加入2,3,3-三甲基吲哚(化合物03，7.16mmol，1.1394g)；
然后在氮气保护下加入15mL乙腈溶剂，在80℃回流24h。将乙腈旋除，加入大量乙酸乙酯，剧烈搅拌1小时，完成反应。将白色固体过滤得到产品04-a。产率：78.5％,m.p.:175-177℃
S2、在50mL茄形烧瓶中，加入2,3,3-三甲基吲哚(化合物03，12.46mmol，2.0g)，加入乙腈25mL使原料溶解，然后加入碘甲烷(1.3mmol，2.3g)，在80℃下回流反应12h。反应结束时从烧瓶中析出大量结晶，再用乙腈洗涤三次，得紫色晶体，化合物05，产率:94.5％。熔点：257-259℃。Yield 94.5％.mp:257-259℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92-7.90(m,1H),7.85-7.82(m,1H),7.66-7.59(m,2H),3.97(s,3H),2.76(s,3H),1.53(s,6H)。
将1-(6-羧基己基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-碘化鎓(化合物04-a，6.043mmol，2.51g)和丙二醛二苯胺盐酸盐(5.49mmol，1.142g)加入50mL双口烧瓶中，在氮气保护下注入5mL醋酸和5mL醋酸酐，在80℃下用5mL乙酸和5mL醋酐回流反应。4h后，将溶剂旋干，向烧瓶中加入1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚-1-碘化鎓(化合物05，5.49mmol，1.653g)、吡啶4mL、乙酸4mL，回流反应2h。反应完成后，除去溶剂，用1M柠檬酸洗，二氯甲烷萃取，反应液经真空浓缩干燥，用中性氧化铝(石油醚：二氯甲烷＝10：1)进行柱层析，得到黑金色固体，化合物06-a，产率：92.7％.mp:289-290℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.16(s,1H),8.34(t,J＝13.1Hz,2H),7.62(d,J＝7.4Hz,2H),7.45–7.36(m,4H),7.30–7.20(m,2H),6.54(t,J＝12.3Hz,1H),6.29(s,1H),6.26(s,1H),5.77(s,1H),3.60(s,5H),3.30(t,J＝7.0Hz,3H),3.09(m,6H),2.70(s,2H),2.18(t,J＝8.0Hz,2H),1.97-1.85(m,2H),1.68(s,12H).
S3、向50mL圆底烧瓶中，将中间体化合物06-a(0.204mmol，127mg)溶于10mL干燥的二氯甲烷溶剂中，加入DIEA(0.408mmol，53mg)，搅拌10min后，向反应液中加入HATU(0.306mmol，85.7mg)，搅拌半小时后，向反应液中加入化合物2203-04(0.245mmol，130.5mg)。室温反应24h后，用柠檬酸和饱和盐水洗涤该化合物两次，用无水硫酸钠干燥并过滤，浓缩液经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝5：1)纯化，得化合物TYZJ-2310，蓝色固体粉末,为CDK4/6分子荧光探针。产率：17.8％.mp:355-357℃.1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.79(s,1H),8.09(d,J＝9.1Hz,1H),8.01(d,J＝2.9Hz,1H),7.75(td,J＝13.0,3.3Hz,2H),7.34–7.24(m,5H),7.18–7.10(m,2H),7.07–6.98(m,2H),6.68(t,J＝12.5Hz,1H),6.49(d,J＝5.9Hz,1H),6.20-6.07(m,2H),5.89-5.74(m,1H),5.23(s,2H),3.91(t,J＝7.8Hz,2H),3.68(dt,J＝20.7,5.1Hz,4H),3.50(s,3H),3.27(q,J＝6.1Hz,2H),3.14(t,J＝5.0Hz,2H),2.45(d,J＝16.5Hz,5H),2.31-2.16(m,8H),2.05-1.92(m,2H),1.86-1.78(m,4H),1.76-1.68(m,19H),1.61(d,J＝4.0Hz,16H),1.49-1.30(m,5H),1.25-1.09(m,1H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ202.79,173.74,173.04,172.95,171.63,161.42,158.03,157.24,155.55,153.18,152.90,145.24,143.39,142.74,141.90,141.83,141.10,140.79,130.82,128.84,128.70,126.38,126.04,125.35,125.13,122.20,122.10,113.80,110.81,110.38,103.88,103.80,54.12,53.47,49.79,49.57,49.35,49.10,46.06,45.26,44.18,41.36,39.11,35.84,31.57,31.22,30.75,29.71,28.34,28.10,28.01,27.96,27.11,26.00,25.78,25.16,24.86,22.71,14.14,14.00,8.68.HRMS(ESI)m/z calcd for C61H75N10O4([M+H]+)1011.5969；found 1011.5972.
当n＝1时，步骤包括：
S1、将6-溴己酸(化合物01-b，2.2094g,11.327mmol)和NaI(3.0999g,20.681mmol)溶于10ml无水丙酮中，在N2气保护下搅拌5小时。先旋除溶剂，然后将产物溶解在二氯甲烷中。通过过滤去除无机盐，将反应液浓缩和真空干燥，得到黄白色固体化合物03-b。产率：96％,m.p.:40-41℃.
将6-碘己酸(化合物02-b，10.32mmol，2.5g)加入50mL圆底烧瓶中，加入碘丙酸(化合物03)(6.885mmol，1.096g)，在氮气保护下加入15mL乙腈溶剂，并在80℃回流24h。将乙腈旋除，加入大量乙酸乙酯，剧烈搅拌1小时，完成反应。得到白色固体，对固体进行过滤，得到中间体化合物04-b。产率：72.8％,m.p.:167-171℃。
S2、在50mL茄形烧瓶中，加入2,3,3-三甲基吲哚(化合物03，12.46mmol，2.0g)，加入乙腈25mL使原料溶解，然后加入碘甲烷(1.3mmol，2.3g)，在80℃下回流反应12h。反应结束时从烧瓶中析出大量结晶，再用乙腈洗涤三次，得紫色化合物05。产率:94.5％。熔点：257-259℃。产率：94.5％.mp:257-259℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92-7.90(m,1H),7.85-7.82(m,1H),7.66-7.59(m,2H),3.97(s,3H),2.76(s,3H),1.53(s,6H).
将1-(5-羧戊基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-碘化鎓(化合物04-b，4.485mmol，1.8g)和丙二醛二苯胺盐酸盐(4.077mmol，1.052g)加入50mL双口烧瓶中，在氮气保护下注入5mL醋酸和5mL醋酸酐，在80℃下用5mL乙酸和5mL醋酸酐回流反应。4h后，将溶剂旋除，向烧瓶中加入1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚-1-碘化鎓(化合物05，4.077mmol，1.227g)、5mL吡啶和5mL乙酸，回流反应2h。除去溶剂，用1M柠檬酸洗，二氯甲烷萃取，反应液经真空浓缩干燥，用中性氧化铝(石油醚：二氯甲烷＝10∶1)进行柱层析，得到黑金色固体，化合物06-b。产率：87.6％.mp:278-281℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.34(t,J＝13.1Hz,2H),7.63(d,J＝7.4Hz,2H),7.41–7.34(m,4H),7.41–7.18(m,2H),6.58(t,J＝12.4Hz,1H),6.30(dd,J＝22.4,13.8Hz,2H),4.10(t,J＝7.3Hz,2H),3.45-3.28(m,3H),2.20(t,J＝7.3Hz,2H),1.69(s,14H),1.55-1.43(m,2H),1.40-1.30(m,2H).
S3、向50mL圆底烧瓶中，将中间体化合物06-b(0.172mmol，105mg)溶于10mL干燥的二氯甲烷溶剂中，加入DIEA(0.258mmol，33mg)，搅拌10分钟后，向反应液中加入HATU(0.258mmol，73mg)，搅拌半小时后，向反应液中加入化合物2203-04(0.2065mmol，110mg)。室温反应12h后，用柠檬酸和饱和盐水洗涤该化合物两次，用无水硫酸钠干燥并过滤，浓缩液经柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝5：1)，得产物TYZJ-2311，蓝色固体粉末,为CDK4/6分子荧光探针。产率：42.8％.mp:346-349℃.1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.79(s,1H),8.09(d,J＝9.1Hz,1H),8.01(s,1H),7.76(t,J＝13.1Hz,2H),7.35–7.24(m,4H),7.20(s,1H),7.18–7.11(m,2H),7.01(t,J＝8.7Hz,2H),6.67(t,J＝12.5Hz,1H),6.47(t,J＝5.8Hz,1H),6.20-6.08(m,2H),5.84-5.75(m,1H),3.91(t,J＝7.6Hz,2H),3.74-3.58(m,4H),3.50(s,2H),3.30-3.19(m,2H),3.14(t,J＝5.1Hz,2H),3.05(t,J＝5.2Hz,2H),2.41(t,J＝7.5Hz,5H),2.32-2.11(m,7H),2.04-1.93(m,2H),1.87-1.77(m,4H),1.73(d,J＝7.9Hz,3H),1.61(d,J＝2.4Hz,14H),1.50-1.39(m,2H),1.21-1.16(m,1H).13C-NMR(101MHz,CDCl3)δ198.02,168.69,168.29,166.81,156.67,153.30,152.51,150.79,148.38,148.12,140.51,138.65,137.97,137.15,137.08,136.30,136.02,126.01,124.08,123.94,121.70,120.63,120.39,117.45,117.36,108.93,106.00,105.59,99.19,99.02,72.61,72.30,71.98,49.36,45.09,44.87,44.61,44.36,40.53,36.61,34.36,31.42,26.81,26.45,26.04,23.35,23.25,23.21,22.29,21.71,21.03,20.50,20.11,9.24.HRMS(ESI)m/z calcd for C60H73N10O4([M+H]+)997.5811；found 997.5810.
优选的，当n＝1时，不采用步骤S3，与中间体化合物2203-04反应；而是采用步骤S4，与palbociclib反应：
S4、向50mL圆底烧瓶中，将化合物06-b(0.285mmol，0.127g)溶于10mL干燥的二氯甲烷溶剂中，加入DIEA(0.356mmol，0.046g)，搅拌10分钟后，向反应溶液中加入HATU(0.308mmol，0.086g)，搅拌半小时后，将化合物palbociclib(化合物08，0.2374mmol，0.145g)加入到反应液中。室温反应12h后，用柠檬酸和饱和盐水洗涤该化合物2次，用无水硫酸钠干燥并过滤，浓缩液经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20：1)纯化，得产物蓝色固体粉末TYZJ-2312，为CDK4/6分子荧光探针。产率：32％.mp:340-345℃.1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.09(s,1H),8.94(s,1H),8.32(td,J＝13.1,5.7Hz,2H),8.06(d,J＝3.1Hz,1H),7.85(d,J＝9.0Hz,1H),7.60(dd,J＝12.0,7.3Hz,2H),7.51–7.44(m,1H),7.39(d,J＝4.1Hz,2H),7.36-7.33(m,2H),7.25-7.17(m,2H),6.55(t,J＝12.3Hz,1H),6.35-6.17(m,2H),5.88-5.71(m,1H),4.18-4.04(m,2H),3.58(d,J＝5.8Hz,7H),3.10(dt,J＝10.2,4.8Hz,4H),2.43(s,2H),2.36(t,J＝7.2Hz,2H),2.31(s,2H),2.29-2.19(m,2H),1.89(s,2H),1.76(dd,J＝11.9,6.6Hz,4H),1.67(d,J＝10.6Hz,11H),1.59(dd,J＝9.9,4.2Hz,4H),1.41(d,J＝7.5Hz,2H),1.24(d,J＝10.9Hz,1H).13C-NMR(101MHz,DMSO-d6)δ203.03,173.67,173.01,171.03,161.17,158.74,158.55,155.18,154.46,144.95,143.52,143.12,142.52,142.49,141.54,141.41,129.92,128.90,128.73,125.75,125.11,122.91,122.71,115.51,111.53,111.43,107.26,103.72,103.48,53.36,49.32,49.29,48.87,45.09,43.70,41.15,32.25,31.78,31.47,28.04,27.63,27.40,27.24,26.17,25.63,24.98,14.13.HRMS(ESI)m/zcalcd for C56H66N9O3([M+H]+)912.5284；found 912.5288.
实施例4
光学活性测定
本实施例提供了探针分子的光谱数据。
将实施例1～3中获得的三个系列的CDK4/6分子荧光探针分别溶于pH＝7.4的PBS缓冲液中得到浓度为10μM的溶液，利用酶标仪以及紫外分光光度计得到了三个系列探针的荧光激发光谱、荧光发射光谱以及最大紫外吸收波长，结果如表1和图1所示，图1中，(a)表示荧光探针TYZJ-2201～2205的荧光激发光谱(EX)图，(b)表示荧光探针TYZJ-2201～2205的荧光发射光谱(EM)图，(c)表示荧光探针TYZJ-2306的荧光激发光谱(EX)图，(d)表示荧光探针TYZJ-2306的荧光发射光谱(EM)图，(e)表示荧光探针TYZJ-2307的荧光激发光谱(EX)图，(f)表示荧光探针TYZJ-2307的荧光发射光谱(EM)图，(g)表示荧光探针TYZJ-2308的荧光激发光谱(EX)图，(h)表示荧光探针TYZJ-2308的荧光发射光谱(EM)图，(i)表示荧光探针TYZJ-2309的荧光激发光谱(EX)图，(j)表示荧光探针TYZJ-2309的荧光发射光谱(EM)图，(k)表示荧光探针TYZJ-2310～2312的荧光激发光谱(EX)图，(l)表示荧光探针TYZJ-2310～2310的荧光发射光谱(EM)图。
表1
探针分子 紫外吸收波长(nm) 荧光激发波长(nm) 荧光发射波长(nm)
TYZJ-2201 384.5 371.4 527.8
TYZJ-2202 375.5 370.0 526.2
TYZJ-2203 379.0 371.2 530.0
TYZJ-2204 382.0 369.0 529.0
TYZJ-2205 378.5 368.4 530.0
TYZJ-2306 428.0 415.6 481.8
TYZJ-2307 388.0 371.2 532.0
TYZJ-2308 370.5 637.8 528.0
TYZJ-2309 360.0 483.8 536.6
TYZJ-2310 610.0/645.0 641.4 658.0
TYZJ-2311 610.0/647.0 642.8 659.0
TYZJ-2312 615.0/647.0 642.4 657.8
实施例5
酶学活性测定
本实施例表明了探针分子对两种激酶的亲和能力强弱。
本实施例中所有酶促反应均在30℃下进行40分钟；配置反应混合物，反应混合物中含有40mM Tris(氨丁三醇，pH 7.4)、10mM MgCl2(氯化镁)、0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)、1mM DTT(二硫苏糖醇)、10μM ATP(三磷酸腺苷)、0.2ug/ml激酶(CDK4或CDK6中的一种)和100uM脂质底物(本实施例中，脂质底物选用市售的PI-3激酶活性测定用脂质底物)。用10％的二甲基亚砜稀释化合物(化合物选自实施例1～3中制备的多种荧光探针中的一种)获得稀释液，然后在50μl的反应混合物中加入5μl稀释液，这样所有反应中二甲基亚砜的最终浓度都是1％。
使用Kinase-Glo Plus发光激酶检测试剂盒进行检测，它通过量化激酶反应后溶液中剩余的ATP量来测量激酶活性，检测产生的发光信号与存在的ATP量相关，而与激酶活性量成反比。IC50值是用Prism GraphPad sofeware软件通过归一化剂量反应拟合非线性回归计算得出的。
表2表示：实施例4中目标化合物对细胞周期依赖性激酶4/6的亲和力结果；其中，共分为三个系列：TYZJ-2201～TYZJ-2205为实施例1制得，TYZJ-2306～TYZJ-2309为实施例2制得，TYZJ-2310～TYZJ-2312为实施例3制得。
表2
探针分子 CDK4 IC50(nM) CDK6 IC50(nM)
TYZJ-2201 324 548
TYZJ-2202 1595 1812
TYZJ-2203 151 193
TYZJ-2204 2040 3611
TYZJ-2205 2008 3613
TYZJ-2306 284 874
TYZJ-2307 658 1055
TYZJ-2308 1936 5135
TYZJ-2309 90 156
TYZJ-2310 445 1067
TYZJ-2311 170 267
TYZJ-2312 99 184
Palbociclib 11 17
可以看出，这三个系列探针对于CDK4/6蛋白具有亲和力。每一个系列中，都有一组酶活较好的化合物。在三个系列探针中，系列1的TYZJ-2203优于同系列探针，说明连接基团碳链的缩短可能有利于探针分子与CDK4/6的结合。系列2的TYZJ-2309对CDK4/6亲和力好于同系列的探针，我们认为引入带硝基的荧光团可能有利于与CDK4/6的结合，但不排除硝基的毒性问题。系列3的TYZJ-2312较同系列探针对CDK4/6亲和力更强，说明减少连接基团碳链可能有利于探针分子与CDK4/6的结合。对进一步开发活性更好的CDK4/6探针具有重要的指导意义。
实施例6
细胞活性测定
本实施例表明了实施例1中所得探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的细胞活性影响。
取对数期乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231分别接种于96孔板，待细胞贴壁后，将实施例1所得的探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205按浓度梯度加入，每种探针分子每个浓度均设置三个复孔，此外，每块96孔板至少留六个孔作为空白对照组。由于96孔板最外围一周蒸发过快，为避免其造成的试验误差我们在96孔板最外围一周加100μL PBS，之后再培养72h。之后每个孔中加入10μL CCK-8(细胞计数试剂)工作液，孵育30min，以酶标仪在450nm波长下读取OD值，数据如图2所示，其中，(a)表示对乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞活性影响结果，(b)表示对乳腺癌细胞MCF-7的细胞活性影响结果。
通过图2的数据可以看出，探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205对MCF-7和MDA-MB-231均没有明显的细胞毒性，这有利于后续生物评价实验的进行。
实施例7
细胞周期测定
本实施例表明了实施例1中所得探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的细胞周期影响。
取对数期乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231接种于6孔板，待细胞贴壁后，将实施例1所得探针加入孔中，使得每孔化合物的浓度为5μM，孵育24h后，细胞全收集，PBS清洗后离心，加入75％乙醇固定2h以上。固定后PBS清洗，离心，加入RNA酶和PI染料避光孵育30min后于流式细胞分析仪检测。所得数据如表3和表4所示；其中，表3表示探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205对MDA-MB-231细胞的周期阻滞，表4表示探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205对MCF-7细胞的周期阻滞。
表3
表4
通过表3和表4可以看出，加入探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205的实验组同正常生长的肿瘤细胞con组比较，可以对两种乳腺癌细胞的G1/S期进行阻滞，说明实施例1所得的该系列探针分子可以抑制G1期到S期的过渡，并且对MDA-MB-231细胞的阻滞作用更明显。此周期阻滞实验是为了初步验证阳性药Palbociclib在进行结构修饰改造之后还是否具备周期阻滞性，为后续实验挑选出合适的化合物及细胞株型。
实施例8
探针分子的细胞成像研究
本实施例提供了实施例1中所得探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205在乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞成像效果。
取对数期乳腺癌细胞MDA-MB-231接种于共聚焦小皿中，待细胞贴壁后加入浓度为10μM的探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205中的一种(图3中表示为探针)，和浓度为10μg/mL的吖啶橙染料(图3中表示为AO)，染色20min后于共聚焦显微镜下拍照，结果如图3所示。
通过图3可知，探针分子TYZJ-2201～TYZJ-2205和吖啶橙染料都显示出较强的荧光信号，说明可以用于标记乳腺癌细胞。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种CDK4/6小分子荧光探针，其特征在于，具有式(I)所示结构：
式(I)；
其中，R1选自如下结构中的任意一种：或者；n=1、2、3或5。
2.一种CDK4/6小分子荧光探针，其特征在于，具有式(I)所示结构：
式(I)；
其中，R1选自如下结构中的任意一种：、、、或者；
m=1或2。
3.一种如权利要求1或2所述的CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，
反应路线如下式所示：
，n=1,2,3或5；
或者，反应路线如下式所示：
；
或者，反应路线如下式所示：
；
或者，反应路线如下式所示：
；
或者，反应路线如下式所示：
；
或者，反应路线如下式所示：
；
或者，反应路线如下式所示：
，m=1或2。
4.如权利要求3所述的CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物(1)在DIEA和HATU存在的条件下，与Palbociclib反应生成化合物(3)，化合物(3)与三氟乙酸反应脱保护基，之后在DIEA的条件下与丹磺酰氯进行酰胺缩合反应，生成化合物(6)。
5.如权利要求3所述的CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物2306-01在氮气保护下加入SOCl2、DMF反应得羧酸衍生物2306-02，将羧酸衍生物2306-02依次加入DIEA、HATU和化合物2203-04进行亲核取代反应，生成化合物TYZJ-2306。
6. 如权利要求3所述的CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物2307-01在冰浴条件下加入氯磺酸，之后加热回流获得中间体2307-02，将中间体2307-02在冰浴条件下加入三乙胺，加入盐酸二甲胺、N, N-二异丙基乙胺反应后得到化合物2307-03，再加入化合物2203-04进行亲核取代反应，生成化合物TYZJ-2307。
7. 如权利要求3所述的CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物2308-01中依次加入N, N-二异丙基乙胺、HATU与化合物2203-04进行亲核取代反应，生成化合物TYZJ-2308。
8. 如权利要求3所述的CDK4/6小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，化合物2309-01加入N, N-二异丙基乙胺，与化合物2203-04进行亲核取代反应，生成化合物TYZJ-2309。
9.一种如权利要求1~2任一所述的CDK4/6小分子荧光探针在制备识别CDK4/6蛋白产品的应用。
10.一种如权利要求1~2任一所述的CDK4/6小分子荧光探针在制备细胞周期阻滞产品中的应用。
11.一种如权利要求1~2任一所述的CDK4/6小分子荧光探针在制备癌细胞荧光成像产品中的应用。
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