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CN118994321B - 一种美容环肽试剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种美容环肽试剂的制备方法及其应用 Download PDF

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CN118994321B CN202411480945.8A CN202411480945A CN118994321B CN 118994321 B CN118994321 B CN 118994321B CN 202411480945 A CN202411480945 A CN 202411480945A CN 118994321 B CN118994321 B CN 118994321B
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Abstract

本发明公开了一种美容环肽试剂的制备方法及其应用，属于美容试剂制备技术领域；该制备方法包括，将环肽、添加剂和甘油混合，获得美容环肽试剂；环肽至少包括环六肽‑2；添加剂至少包括没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，没食子酸卵磷脂复合物具有苯酚基团和磷酸基团，柚皮素酰腙类衍生物具有苯酚基团和烟酸酰肼基团。本发明提供了一种具有生物相容性高的、透皮吸收性能优越的、抗皱紧致和美白提亮效果更佳的美容环肽试剂及其应用。

Description

一种美容环肽试剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及美容试剂制备技术领域，具体涉及一种美容环肽试剂的制备方法及其应用。
背景技术
六肽-2（Hexapeptide-2），一种由六个氨基酸组成的短肽，具有与黑色素细胞上黑皮质素-1（MC1R）受体高度的亲和力。作为α-促黑素细胞激素（α-MSH）的拮抗剂，六肽-2能够与MC1R受体竞争性结合，有效抑制酪氨酸酶的活化，降低黑色素的生物合成。与间苯二酚类美白剂相比，六肽-2更温和且更安全，同时也具备抗衰老特性和促进胶原蛋白生成的潜力。然而，六肽-2在实际应用中也面临一些挑战，包括较差的稳定性、较低的透皮吸收率以及容易被体内蛋白酶分解等。
在化妆品研发领域，将直链肽分子转化为环肽的新兴技术正逐渐被应用。环化过程赋予了肽分子更卓越的稳定性，同时显著提升了其透皮吸收效率，增强了其生物利用度。这一技术革新为化妆品行业带来了高效且安全的活性成分，预示着化妆品功效性和安全性的双重飞跃。对现有文献及专利检索发现，申请公布号CN114634554A公开了一种抗皱环六肽化合物及其制备方法，环化后的六肽-1的透皮渗透性、抗皱功效要优于直链肽；申请公布号CN116284256A公开了一种六肽-9环肽及其应用，环六肽-9在皮肤抗皱和紧致方面都具有比六肽-9直链肽更加杰出的功效，能显著促进胶原蛋白Ⅲ（Collagen Ⅲ）和整合素β4（Integrin β4）的表达，具有更低的细胞毒性，更好的皮肤渗透性。
鉴于直链六肽-2的局限性，通过将其加工成环六肽-2，并开发出一种具有生物相容性高的、透皮吸收性能优越的、促进胶原蛋白生成和抑制酪氨酸酶相对活性和黑色素生成效果更佳的美容环肽试剂，在美白提亮、抗皱和抗衰老等方面具有现实意义和市场前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有生物相容性高的、透皮吸收性能优越的、促进胶原蛋白生成和抑制酪氨酸酶相对活性和黑色素生成效果更佳的美容环肽试剂及其制备方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种美容环肽试剂的制备方法，包括，将环肽、添加剂和甘油混合，得到混合液；环肽至少包括环六肽-2；添加剂至少包括没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，没食子酸卵磷脂复合物具有苯酚基团和磷酸基团，柚皮素酰腙类衍生物具有苯酚基团和烟酸酰肼基团。
本发明提供了一种美容环肽试剂的制备方法，该方法将环六肽-2与没食子酸卵磷脂复合物、柚皮素酰腙类衍生物和甘油混合，获得具有生物相容性高的、透皮吸收性能优越的、促进胶原蛋白生成和抑制酪氨酸酶相对活性和黑色素生成效果更佳的美容环肽试剂；没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物具有较高的生物利用度、较强的稳定性和抗氧化活性，不仅能够提高美容环肽试剂的生物相容性和透皮性能，而且能够通过清除自由基，抑制酪氨酸酶相对活性和黑色素生成，并且促胶原蛋白生成，实现肌肤美白提亮、抗皱紧致的美容效果。
优选地，环肽和添加剂的质量比为1：0.002-0.05。
优选地，环肽和甘油的用量比为1g：2-10mL。
优选地，没食子酸卵磷脂复合物由大豆卵磷脂接枝没食子酸进行衍生得到。
优选地，没食子酸卵磷脂复合物的制备，具体为，
将大豆卵磷脂加入至无水乙醇，边搅拌边逐渐加入没食子酸，缓慢升温至40-60℃，持续搅拌冷凝回流反应2-4h，直至反应溶液澄清，在40-50℃下旋蒸去除乙醇，经非水滤膜过滤，将滤液真空抽滤干燥12-36h，获得没食子酸卵磷脂复合物。
更优选地，大豆卵磷脂和无水乙醇的固液比为1g：10-30mL。
更优选地，大豆卵磷脂和没食子酸的质量比为1：0.2-1。
优选地，柚皮素酰腙类衍生物由柚皮素和6-羟基烟酸酰肼进行反应得到。
优选地，柚皮素酰腙类衍生物的制备，具体为，
将柚皮素和6-羟基烟酸酰肼混合，加入乙醇和乙酸，搅拌溶解，将混合液在600-800W条件下加热2-10min，再用甲醇重结晶，洗涤、过滤、干燥后，获得柚皮素酰腙类衍生物。
更优选地，柚皮素和6-羟基烟酸酰肼的质量比为1：1-2。
更优选地，柚皮素和乙醇的固液比为1g：2-5mL。
更优选地，柚皮素和乙酸的固液比为1g：0.2-0.5mL。
优选地，环六肽-2的结构式如式Ⅰ所示：
。
优选地，环六肽-2的制备，包括，将2-氯三苯甲基氯（CTC）树脂与经Fmoc基团保护的氨基酸类试剂进行偶联反应，获得直链肽树脂，切割树脂后获得全保护直链肽，再通过环化作用获得环六肽-2。
更优选地，经Fmoc基团保护的氨基酸类试剂的偶联顺序依次为：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH。
优选地，环六肽-2的制备，具体为，
步骤S1：取2-氯三苯甲基氯（CTC）树脂于固相合成反应管中，加入二氯甲烷（DCM）溶胀，抽干溶剂，使用二甲基甲酰胺（DMF）和DCM各洗涤CTC树脂2-10次；
步骤S2：将Fmoc-Lys(Boc)-OH溶解于DMF，加入N,N-二异丙基乙胺（DIPEA），将反应液加至步骤S1得固相合成反应管中，常温下振荡2-4h，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂2-10次，加入DIPEA/甲醇/DCM混合溶液封端处理20-40min，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂2-10次，抽干后加入哌啶（Pip）/DMF混合溶液进行反应5-15min，再次加入Pip/DMF混合溶液进行反应5-15min，再用DMF和DCM各洗涤CTC树脂2-10次，抽干待用；
步骤S3：将Fmoc-D-Phe-OH、1-羟基苯并三唑（HOBt），加入DMF溶解，再加入N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）活化10-30min，随后将溶液加入上述固相合成反应管中，常温下振荡2-4h，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂2-10次，抽干后加入Pip/DMF混合溶液进行反应5-15min，再次加入Pip/DMF混合溶液进行反应5-15min，再用DMF和DCM各洗涤CTC树脂2-10次，抽干待用；重复该步骤，依次连接Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH；
步骤S4：在固相合成反应管中加入三氟乙酸（TFA）/DCM混合溶液，常温震荡2-4h，过滤并收集滤液，旋干，获得全保护直链肽H-His(Trt)-{D-Trp}(Boc)-Ala-Trp(Boc)-{D-Phe}-Lys(Boc)-OH；将HOBt、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐（PyBOP）和DIPEA溶解于DCM中，在0-5℃下缓慢加入全保护直链肽，于常温搅拌反应6-24h，反应结束后，使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，冷冻干燥，获得目标环六肽-2粗品Cyclo(His(Trt)-{D-Trp}(Boc)-Ala-Trp(Boc)-{D-Phe}-Lys(Boc))；
步骤S5：将环六肽-2粗品加入至脱除侧链保护基溶液中，常温震荡反应2-4h裂解，获得裂解液；将裂解液加入到甲基叔丁基醚中，搅拌20-40min，析出大量白色沉淀，过滤并用甲基叔丁基醚2-10次洗涤滤饼，得到环六肽-2粗品，经反向高效液相色谱进行纯化，再使用冻干机冷冻干燥后，得精品环六肽-2 Cyclo(His-{D-Trp}-Ala-Trp-{D-Phe}-Lys)。
更优选地，步骤S1中CTC树脂的载样量为0.4-0.5mmol/g，CTC树脂和DCM的固液比为1g：10-15mL。
更优选地，步骤S2中Fmoc-Lys(Boc)-OH和DMF的固液比为1g：0.5-1.5mL。
更优选地，步骤S2中Fmoc-Lys(Boc)-OH和DIPEA的固液比为1g：0.1-1mL。
更优选地，步骤S2中DMF和DIPEA/甲醇/DCM混合溶液的体积比为1：4-8，DIPEA/甲醇/DCM混合溶液包括DIPEA、甲醇和DCM，DIPEA和甲醇的体积比为1：1-2，DIPEA和DCM的体积比为1：3-5。
更优选地，步骤S2中DMF和Pip/DMF混合溶液的体积比为1：4-6，Pip/DMF混合溶液包括Pip和DMF，Pip/DMF混合溶液中Pip和DMF的体积比为1：2-10。
更优选地，步骤S3中Fmoc-D-Phe-OH和HOBt的摩尔比为1：1-2。
更优选地，步骤S3中Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOBt的摩尔比为1：1-2。
更优选地，步骤S3中Fmoc-Ala-OH和HOBt的摩尔比为1：1-2。
更优选地，步骤S3中Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和HOBt的摩尔比为1：1-2。
更优选地，步骤S3中Fmoc-His(Trt)-OH和HOBt的摩尔比为1：1-2。
更优选地，步骤S3中HOBt和DMF的固液比为1g：0.2-1mL。
更优选地，步骤3中HOBt和DIC的摩尔比为1：1-2。
更优选地，步骤S3中DMF和Pip/DMF混合溶液的体积比为1：1-3，Pip/DMF混合溶液包括Pip和DMF，Pip/DMF混合溶液中Pip和DMF的体积比为1：4-6。
更优选地，步骤S4中固相合成反应管中反应物和TFA/DCM混合溶液的固液比为1g：20-30mL，TFA/DCM混合溶液包括TFA和DCM，TFA/DCM混合溶液中TFA和DCM的体积比为1：50-150。
更优选地，步骤S4中全保护直链肽和HOBt的摩尔比为1：2-4。
更优选地，步骤S4中全保护直链肽和PyBOP的摩尔比为1：2-4。
更优选地，步骤S4中全保护直链肽和DIPEA的摩尔比为1：4-8。
更优选地，步骤S4中HOBt和DCM的固液比为1：0.5-1.5mL。
更优选地，步骤S5中环六肽-2粗品和脱除侧链保护基溶液的固液比为1g：5-15mL，脱除侧链保护基溶液包括TFA、三异丙基硅烷（TIS）和H2O，TFA和TIS的体积比为1：0.01-0.1，TFA和H2O的体积比为1：0.01-0.1。
更优选地，步骤S5中裂解液和甲基叔丁基醚的体积比为1：4-6。
优选地，添加剂包括没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物。
优选地，添加剂包括没食子酸卵磷脂复合物、柚皮素酰腙类衍生物和松香季戊四醇酯。
优选地，一种美容环肽试剂的制备方法，具体为，
将环六肽-2与没食子酸卵磷脂复合物、柚皮素酰腙类衍生物、松香季戊四醇酯和甘油混合，获得美容环肽试剂。松香季戊四醇酯能够进一步提高美容环肽试剂的生物相容性，帮助美容环肽试剂更好的透皮吸收，同时通过促进I型胶原蛋白和III型胶原蛋白生成和抑制酪氨酸酶相对活性和黑色素生成，实现美容效果。
更优选地，环六肽-2与没食子酸卵磷脂复合物的质量比为1：0.002-0.01。
更优选地，环六肽-2与柚皮素酰腙类衍生物的质量比为1：0.01-0.02。
更优选地，环六肽-2与松香季戊四醇酯的质量比为1：0.002-0.01。
更优选地，环六肽-2与甘油的用量比为1g：2-10mL。
本发明还提供了制备得到的美容环肽试剂。
本发明还提供了美容环肽试剂用于刺激胶原蛋白生成的用途。
优选地，皮肤中胶原蛋白包括I型胶原蛋白和III型胶原蛋白。
I型胶原蛋白是皮肤中最丰富的胶原蛋白类型，约占皮肤胶原总量的80%~85%，其独特的螺旋结构赋予皮肤和骨骼组织高度的强度和弹性，保持它们的结构和功能稳定。此外，I型胶原蛋白在肌肉的收缩与伸展过程中也扮演着关键角色，对肌肉健康和运动功能的维持起着重要作用。与之相比，III型胶原蛋白则以一种较为疏松的丝网状结构存在，约占皮肤胶原总量的10%~15%。主要散布于表皮真皮连接处I型胶原周围，为皮肤提供弹性和抗应力性，具有促修复弹的作用。在皮肤中，I型胶原蛋白主要提供支撑结构和支撑力，而III型胶原蛋白则提供弹性和抗应力性。胶原蛋白的流失，尤其是I型胶原蛋白的减少，会导致面部出现皱纹和凹陷，影响皮肤的紧致度。同样，III型胶原蛋白的缺乏也会使皮肤失去原有的弹性和抗应力性，从而影响皮肤的整体健康和外观。因此，可以通过检测I型胶原蛋白和III型胶原蛋白浓度，评估待测美容环肽试剂的刺激胶原蛋白生成效果。
本发明的研究证明，经美容环肽试剂处理后的人皮肤成纤维细胞HFF-1的I型胶原蛋白浓度和III型胶原蛋白浓度显著提高，证明本发明制备得美容环肽试剂刺激胶原蛋白生成具有更佳的效果。
本发明还提供了美容环肽试剂用于美白提亮肤色的用途。
优选地，美容环肽试剂通过降低细胞中cAMP浓度，抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素的生成，实现美白提亮肤色的效果。
当人体遭受紫外线辐射时，皮肤中的角质形成细胞展现出较低的耐受性。为了应对这一生理挑战，这些细胞会分泌α-MSH（α-黑色素细胞刺激素，亦称为促黑激素），这是一种由13个氨基酸残基组成的神经内分泌激素，属于黑色素细胞刺激素家族的一员。α-MSH的释放在皮肤深层发挥作用，与黑色素细胞表面的MC1R受体结合，激活腺苷酸环化酶（AC），该酶催化ATP转化为cAMP。cAMP，作为细胞内的“第二信使”，其浓度的增加激活了蛋白激酶A（PKA），进而增强了酪氨酸酶的活性，加速了黑色素的合成过程，以保护皮肤免受紫外线的进一步伤害。因此，可以通过检测细胞内cAMP浓度，酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量来评估美容环肽试剂的美容提亮肤色效果。
本发明的研究证明，经美容环肽试剂处理后小鼠黑色素瘤细胞B16的cAMP浓度，酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均显著降低，为肌肤带来了美白提亮的显著效果。
本发明由于采用了没食子酸卵磷脂复合物、柚皮素酰腙类衍生物和松香季戊四醇酯为添加剂，与环六肽-2和甘油混合制备美容环肽试剂，因而具有如下有益效果：本发明制备得美容环肽试剂能够促进细胞活力，细胞活力大于102%，具有良好的生物相容性；本发明制备得美容环肽试剂具有良好的透皮性能，在12h的透皮扩散百分比大于34%，便于肌肤吸收并迅速发挥作用；本发明制备得美容环肽试剂能够促进I型胶原蛋白和III型胶原蛋白生成，在24h处理后人皮肤成纤维细胞HFF-1的I型胶原蛋白浓度显著提高至710ng/mL以上、III型胶原蛋白浓度提高至55ng/mL以上，能够有效减少皱纹，增强皮肤的紧致度，实现肌肤抗皱紧致的美容效果；本发明制备得美容环肽试剂能够有效抑制酪氨酸酶相对活性和黑色素生成，在24h处理后小鼠黑色素瘤细胞B16的cAMP浓度降低至0.3μM以下，酪氨酸酶相对活性显著降低至80%以下，黑色素相对含量降低至85%以下，实现肌肤美白提亮的美容效果。
附图说明
图1为本发明得环六肽-2电喷雾质谱结果图。
图2为本发明得美容环肽试剂的细胞毒性结果图。
图3为本发明得美容环肽试剂对Ⅰ型胶原蛋白浓度的影响结果图。
图4为本发明得美容环肽试剂对III型胶原蛋白浓度的影响结果图。
图5为本发明得美容环肽试剂对cAMP含量的影响结果图。
图6为本发明得美容环肽试剂对酪氨酸酶相对活力的影响结果图。
图7为本发明得美容环肽试剂对黑色素相对含量的影响结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，以下为部分试剂及材料的缩写，除特殊说明外本文所使用的氨基酸均为L型。
表1 缩写对应中文含义
实施例1：
S1、一种环六肽-2的制备方法，包括，
步骤S11：称取载样量为0.45mmol/g的2-氯三苯甲基氯（CTC）树脂于固相合成反应管中，加入DCM溶胀，抽干溶剂，使用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次。CTC树脂的载样量为0.45mmol/g，CTC树脂和DCM的固液比为1g：12mL。
步骤S12：将Fmoc-Lys(Boc)-OH溶解于DMF，加入DIPEA，将反应液加至步骤S11得固相合成反应管中，常温下振荡3h，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，加入DIPEA/甲醇/DCM混合溶液封端处理30min，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干后加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再次加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干待用。Fmoc-Lys(Boc)-OH和DMF的固液比为1g：1mL；Fmoc-Lys(Boc)-OH和DIPEA的固液比为1g：0.16mL；DMF和DIPEA/甲醇/DCM混合溶液的体积比为1：6，DIPEA/甲醇/DCM混合溶液包括DIPEA、甲醇和DCM，DIPEA/甲醇/DCM混合溶液中DIPEA、甲醇的体积比为1：1，DIPEA和DCM的体积比为1：4；DMF和Pip/DMF混合溶液的体积比为1：5，Pip/DMF混合溶液包括Pip和DMF，Pip/DMF混合溶液中Pip和DMF的体积比为1：5。
步骤S13：取Fmoc-D-Phe-OH，HOBt，加入DMF溶解，再加入DIC活化20min，随后将溶液加入步骤S12得固相合成反应管中，常温下振荡3h，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干后加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再次加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干待用。Fmoc-D-Phe-OH和HOBt的摩尔比为1：1；Fmoc-D-Phe-OH和DMF的固液比为1g：2mL；Fmoc-D-Phe-OH和DIC的摩尔比为1：1；DMF和Pip/DMF混合溶液的体积比为1：2，Pip/DMF混合溶液包括Pip和DMF，Pip/DMF混合溶液中Pip和DMF的体积比为1：5。
步骤S14：取Fmoc-Trp(Boc)-OH，HOBt，加入DMF溶解，再加入DIC活化20min，随后将溶液加入步骤S13得固相合成反应管中，常温下振荡3h，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干后加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再次加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干待用。Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOBt的摩尔比为1：1；Fmoc-Trp(Boc)-OH和DMF的固液比为1g：2.6mL；Fmoc-Trp(Boc)-OH和DIC的摩尔比为1：1；DMF和Pip/DMF混合溶液的体积比为1：2，Pip/DMF混合溶液包括Pip和DMF，Pip/DMF混合溶液中Pip和DMF的体积比为1：5。
步骤S15：取Fmoc-Ala-OH，HOBt，加入DMF溶解，再加入DIC活化20min，随后将溶液加入步骤S14得固相合成反应管中，常温下振荡3h，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干后加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再次加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干待用。Fmoc-Ala-OH和HOBt的摩尔比为1：1；Fmoc-Ala-OH和DMF的固液比为1g：1.5mL；Fmoc-Ala-OH和DIC的摩尔比为1：1；DMF和Pip/DMF混合溶液的体积比为1：2，Pip/DMF混合溶液包括Pip和DMF，Pip/DMF混合溶液中Pip和DMF的体积比为1：5。
步骤S16：取Fmoc-D-Trp(Boc)-OH，HOBt，加入DMF溶解，再加入DIC活化20min，随后将溶液加入步骤S15得固相合成反应管中，常温下振荡3h，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干后加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再次加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干待用。Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和HOBt的摩尔比为1：1；Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和DMF的固液比为1g：2.6mL；Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和DIC的摩尔比为1：1；DMF和Pip/DMF混合溶液的体积比为1：2，Pip/DMF混合溶液包括Pip和DMF，Pip/DMF混合溶液中Pip和DMF的体积比为1：5。
步骤S17：取Fmoc-His(Trt)-OH，HOBt，加入DMF溶解，再加入DIC活化20min，随后将溶液加入步骤S15得固相合成反应管中，常温下振荡3h，用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干后加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再次加入Pip/DMF混合溶液进行反应10min，再用DMF和DCM各洗涤CTC树脂5次，抽干待用。Fmoc-His(Trt)-OH和HOBt的摩尔比为1：1；Fmoc-His(Trt)-OH和DMF的固液比为1g：3.1mL；Fmoc-His(Trt)-OH和DIC的摩尔比为1：1；DMF和Pip/DMF混合溶液的体积比为1：2，Pip/DMF混合溶液包括Pip和DMF，Pip/DMF混合溶液中Pip和DMF的体积比为1：5。
步骤S18：在步骤S17得固相合成反应管中加入TFA/DCM混合溶液，常温震荡3h，过滤并收集滤液，获得全保护直链肽H-His(Trt)-{D-Trp}(Boc)-Ala-Trp(Boc)-{D-Phe}-Lys(Boc)-OH；将HOBt、PyBOP和DIPEA溶解于DCM（100mL）中，在0℃下缓慢加入全保护直链肽，于常温搅拌反应12h，反应结束后，使用旋转蒸发仪蒸干溶剂，冷冻干燥，获得目标环六肽-2粗品Cyclo(His(Trt)-{D-Trp}(Boc)-Ala-Trp(Boc)-{D-Phe}-Lys(Boc))。步骤S17得固相合成反应管中反应物和TFA/DCM混合溶液的固液比为1g：23mL，TFA/DCM混合溶液包括TFA和DCM，TFA/DCM混合溶液中TFA和DCM的体积比为1：100；全保护直链肽和HOBt的摩尔比为1：1；全保护直链肽和PyBOP的摩尔比为1：1；全保护直链肽和DIPEA的摩尔比为1：6；HOBt和DCM的固液比为1：0.5-1.5mL。
步骤S19：将步骤S18得环六肽-2粗品加入至脱除侧链保护基溶液中，常温震荡反应3h裂解，获得裂解液；将裂解液加入到甲基叔丁基醚中，搅拌30min，析出大量白色沉淀，过滤并用甲基叔丁基醚5次洗涤滤饼，得到环六肽-2粗品，经反向高效液相色谱进行纯化，再使用冻干机冷冻干燥后，得精品环六肽-2 Cyclo(His-{D-Trp}-Ala-Trp-{D-Phe}-Lys)。步骤S18得环六肽-2粗品和脱除侧链保护基溶液的固液比为1g：10mL，脱除侧链保护基溶液包括TFA、TIS和H2O，TFA和TIS的体积比为90：5，TFA和H2O的体积比为90：5：5；裂解液和甲基叔丁基醚的体积比为1：5。
S2、一种美容环肽试剂的制备，包括，
一种美容环肽试剂的原料为环六肽-2和甘油。将环六肽-2和甘油混合，获得美容环肽试剂。环六肽-2和甘油的用量比为1g：5mL。
实施例2：
除了在一种美容环肽试剂的制备中，额外添加了相对于实施例1中环六肽-2质量的0.5%没食子酸卵磷脂复合物和2%柚皮素酰腙类衍生物以外，其他条件同实施例1。
S1、没食子酸卵磷脂复合物的制备，包括，
将大豆卵磷脂加入无水乙醇，边搅拌边逐渐加入没食子酸，缓慢升温至50℃，持续搅拌冷凝回流反应3h，直至反应溶液澄清，在45℃下旋蒸去除乙醇，经0.45μm非水滤膜过滤，将滤液真空抽滤干燥24h，获得没食子酸卵磷脂复合物。大豆卵磷脂和无水乙醇的固液比为1g：20mL；大豆卵磷脂和没食子酸的质量比为1：0.24。
S2、柚皮素酰腙类衍生物的制备，包括，
取柚皮素和6-羟基烟酸酰肼，加入乙醇和乙酸，搅拌溶解，将混合液在700W条件下加热5min，再用甲醇洗涤4次，过滤，干燥，获得柚皮素酰腙类衍生物。柚皮素和6-羟基烟酸酰肼的摩尔比为1：1；柚皮素和乙醇的固液比为1g：3.6mL；柚皮素和乙酸的固液比为1g：0.36mL。
实施例3：
除了在一种美容环肽试剂的制备中，没食子酸卵磷脂复合物的使用量更改为相对于实施例1中环六肽-2质量的0.25%以外，其他条件同实施例2。
实施例4：
除了在一种美容环肽试剂的制备中，柚皮素酰腙类衍生物的使用量更改为相对于实施例1中环六肽-2质量的1%以外，其他条件同实施例2。
实施例5：
除了在一种美容环肽试剂的制备中，额外添加了相对于实施例1中环六肽-2质量的0.5%没食子酸卵磷脂复合物、2%柚皮素酰腙类衍生物和1%松香季戊四醇酯以外，其他条件同实施例2。
实施例6：
除了在一种美容环肽试剂的制备中，松香季戊四醇酯的使用量更改为相对于实施例1中环六肽-2质量的0.5%以外，其他条件同实施例5。
对比例1：
S1、直链六肽-2的制备，
除了步骤S18的方法更改为：在步骤S17得固相合成反应管中加入TFA/DCM混合溶液，常温震荡3h，过滤并收集滤液，旋干，获得全保护直链肽H-His(Trt)-{D-Trp}(Boc)-Ala-Trp(Boc)-{D-Phe}-Lys(Boc)-OH；步骤S17得固相合成反应管中反应物和TFA/DCM混合溶液的固液比为1g：4mL，TFA/DCM混合溶液包括TFA和DCM，TFA/DCM混合溶液中TFA和DCM的体积比为1：100以外，其余条件同实施例1中步骤S11至步骤S17。
S2、一种美容肽类试剂的制备，包括，
一种美容环肽试剂的原料为直链六肽-2和甘油。将直链六肽-2和甘油混合，获得美容环肽试剂。直链六肽-2和甘油的用量比为1g：5mL。
对比例2：
除了在一种美容环肽试剂的制备中，额外添加了相对于实施例1中环六肽-2质量的0.5%没食子酸卵磷脂复合物以外，其他条件同实施例1。
S1、没食子酸卵磷脂复合物的制备，同实施例2。
对比例3：
除了在一种美容环肽试剂的制备中，额外添加了相对于实施例1中环六肽-2质量的2%柚皮素酰腙类衍生物以外，其他条件同实施例1。
S1、柚皮素酰腙类衍生物的制备，同实施例2。
对比例4：
除了在一种美容环肽试剂的制备中，额外添加了相对于实施例1中环六肽-2质量的1%松香季戊四醇酯以外，其他条件同实施例1。
实验例：
1、环六肽-2分子量的测定
通过电喷雾质谱法测定本发明得环六肽-2的分子量。图1为本发明得环六肽-2电喷雾质谱结果图，[M/2+H]+离子峰的质荷比(m/z)为429.39，[M+H]+离子峰的质荷比(m/z)为857.26，质谱测得的分子量为856.25，这说明本发明的方法能够制备环六肽-2。
2、细胞毒性测试
取对数生长期的人皮肤角质细胞HaCaT制成单细胞悬液接种于96孔板上，每孔加入100μL细胞悬液，使细胞密度为1×105cells/孔，在37℃、5%CO2条件下培养24h使细胞贴壁；设置空白组、样品组和调零组，在空白组和样品组中每孔加入100μL的DMEM培养液；在样品组中每孔加入实施例1-6得美容环肽试剂至终浓度为400ppm；调零组无细胞接种，仅加入100μL的DMEM培养液。给药完成后将96孔板放置在37℃、5％CO2条件的培养箱中培养24h后倒置显微镜观察，离心去除培养液，用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）冲2遍后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝溶液，继续培养4h。终止培养，吸去培养液。每孔加入100μL二甲基亚枫（DMSO），置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm处测量各孔的吸光值计算细胞活力，细胞活力（%）=(样品组OD-调零组OD）/（空白组OD-调零组OD)×100％。
图2为本发明得美容环肽试剂的细胞毒性结果图。与空白组相比，实施例1-6和对比例1-4的细胞活力均升高，这说明本发明实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂均具有较高的生物相容性。实施例1得美容环肽试剂高于对比例1，是由于实施例1使用环六肽-2制备美容环肽试剂，对比例1使用直链六肽-2制备美容环肽试剂，这说明实施例1得美容环肽试剂生物相容性高于对比例1。实施例2得美容环肽试剂高于实施例1，是由于实施例2在美容环肽试剂中额外添加了没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；实施例2得美容环肽试剂的细胞活力高于实施例3-4，是由于实施例3-4得美容环肽试剂分别降低没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物的使用量；实施例2得美容环肽试剂的细胞活力高于对比例2-3，是由于对比例2-3单独添加没食子酸卵磷脂复合物或柚皮素酰腙类衍生物制备美容环肽试剂；这说明在美容环肽试剂中协同添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，使美容环肽试剂提高细胞活力的效果更佳。实施例5得美容环肽试剂的细胞活力高于实施例2，是由于在美容环肽试剂的制备中，实施例5除了额外添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，还额外添加了松香季戊四醇酯；实施例5得美容环肽试剂的细胞活力高于实施例6，是由于松香季戊四醇酯的使用量不同；实施例5得美容环肽试剂的细胞活力高于对比例4，是由于对比例4仅额外添加松香季戊四醇酯，未添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；这说明在美容环肽试剂中添加松香季戊四醇酯，能够进一步提高美容环肽试剂的生物相容性。
3、透皮性测试
扩散池一端用巴马香猪皮覆盖，使皮肤角质层朝向供给池，在供给池中分别加入1mL的PBS溶液，添加实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂至终浓度为400ppm，接受池中注入7mL预先脱气处理的PBS作为接收液，搅拌速度为350r/min，温度为（32±1）℃进行透皮实验。处理24h后，用PBS溶液将皮肤表面残留样品冲洗干净，剪碎皮肤，加入5mL的PBS溶液，匀浆，10000r/min条件下离心30min收集上清液，经0.22μm滤膜过滤后得到澄清皮中匀浆液；皮下透过液经0.22μm滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定皮中匀浆液和皮下透过液的样品浓度，并计算扩散百分比，扩散百分比（%）=皮中匀浆液或皮下透过液肽浓度/初始浓度×100%，测定结果如表2所示。
表2 透皮性能结果
由表2可知，实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂都可以较好地进行透皮吸收，二者皆不会透过真皮层进入皮下组织。在皮肤匀浆中，实施例1得美容环肽试剂的扩散百分比高于对比例1，是由于实施例1使用环六肽-2制备美容环肽试剂，对比例1使用直链六肽-2制备美容环肽试剂，这说明实施例1得美容环肽试剂的透皮扩散效果优于对比例1。实施例2得美容环肽试剂的扩散百分比高于实施例1，是由于实施例2在美容环肽试剂中额外添加了没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；实施例2得美容环肽试剂的扩散百分比高于实施例3-4，是由于实施例3-4得美容环肽试剂分别降低没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物的使用量；实施例2得美容环肽试剂的扩散百分比高于对比例2-3，是由于对比例2-3单独添加没食子酸卵磷脂复合物或柚皮素酰腙类衍生物制备美容环肽试剂；这说明在美容环肽试剂中协同添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，使美容环肽试剂的透皮效果更佳。实施例5得美容环肽试剂的扩散百分比高于实施例2，是由于在美容环肽试剂的制备中，实施例5除了额外添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，还额外添加了松香季戊四醇酯；实施例5得美容环肽试剂的扩散百分比高于实施例6，是由于松香季戊四醇酯的使用量不同；实施例5得美容环肽试剂的扩散百分比高于对比例4，是由于对比例4仅额外添加松香季戊四醇酯，未添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；这说明在美容环肽试剂中添加松香季戊四醇酯，能够进一步提高美容环肽试剂的透皮效果。
4、对I型胶原蛋白和III型胶原蛋白表达影响的测定
将处于对数生长期的人皮肤成纤维细胞HFF-1调整为4×105个/mL细胞悬浮液，取2mL细胞悬浮液等量接种于6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱培养24h。细胞培养24h后，分别设置空白组，模型组和样品组，除空白组，模型组和样品组分别置于30J/cm2UVB光源下进行辐照，辐照结束后，弃废液，空白组、模型组和样品组每孔加入2mL的DMEM培养液，样品组中添加实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂至终浓度为400ppm，继续置于培养箱培养24h后，收集细胞上清液用于胶原含量测定，按照Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）ELISA试剂盒说明书和III型胶原（Collagen III）ELISA试剂盒说明书步骤操作，检测其胶原蛋白浓度。
图3为本发明得美容环肽试剂对Ⅰ型胶原蛋白浓度的影响结果图，图4为本发明得美容环肽试剂对III型胶原蛋白浓度的影响结果图。模型组的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量在UVB诱导下显著降低（P＜0.01），证明模型造模成功。与模型组相比，实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂处理后的人皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量均升高，这说明本发明实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂均可刺激I型和III型胶原蛋白的生成。实施例1得美容环肽试剂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量高于对比例1，是由于实施例1使用环六肽-2制备美容环肽试剂，对比例1使用直链六肽-2制备美容环肽试剂，这说明实施例1得美容环肽试剂刺激I型和III型胶原蛋白的生成效果优于对比例1。实施例2得美容环肽试剂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量高于实施例1，是由于实施例2在美容环肽试剂中额外添加了没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；实施例2得美容环肽试剂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量高于实施例3-4，是由于实施例3-4得美容环肽试剂分别降低没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物的使用量；实施例2得美容环肽试剂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量高于对比例2-3，是由于对比例2-3单独添加没食子酸卵磷脂复合物或柚皮素酰腙类衍生物制备美容环肽试剂；这说明在美容环肽试剂中协同添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，使美容环肽试剂提高I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量的效果更佳。实施例5得美容环肽试剂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量高于实施例2，是由于在美容环肽试剂的制备中，实施例5除了额外添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，还额外添加了松香季戊四醇酯；实施例5得美容环肽试剂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量高于实施例6的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量，是由于松香季戊四醇酯的使用量不同；实施例5得美容环肽试剂的I型胶原蛋白和III型胶原蛋白含量高于对比例4，是由于对比例4仅额外添加松香季戊四醇酯，未添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；这说明在美容环肽试剂中添加松香季戊四醇酯，能够进一步刺激I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的生成，从而实现抗皱紧致的美容效果。
5、对α-MSH/cAMP信号的调控作用
取小鼠黑色素瘤细胞B16培养至对数生长期，将细胞悬浮液浓度调整到1×105个/mL，取100µL细胞悬浮液等量接种于96孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱培养24h，弃废液，分别设置空白组，模型组和样品组，空白组、模型组和样品组每孔加入100µL的DMEM培养液，样品组添加实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂至终浓度为400ppm，继续置于培养箱培养12h后，抽除培养基，模型组和样品组每孔加入含浓度为0.2µmol/L的α-MSH溶液的DMEM培养液，置于培养箱培养24h后，对细胞进行裂解，收集细胞裂解溶液，按照cAMP ELISA试剂盒的步骤完成操作，在酶标仪450nm处测定各组的吸光度。
图5为本发明得美容环肽试剂对cAMP含量的影响结果图，模型组的cAMP含量显著提高（P＜0.01），证明模型造模成功。与模型组相比，经实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂处理后的cAMP含量降低，这说明本发明实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂均可降低α-MSH诱导的cAMP含量。实施例1得美容环肽试剂的cAMP含量低于对比例1，是由于实施例1使用环六肽-2制备美容环肽试剂，对比例1使用直链六肽-2制备美容环肽试剂，这说明实施例1得美容环肽试剂降低cAMP效果优于对比例1。实施例2得美容环肽试剂的cAMP含量低于实施例1，是由于实施例2在美容环肽试剂中额外添加了没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；实施例2得美容环肽试剂的cAMP含量低于实施例3-4，是由于实施例3-4得美容环肽试剂分别降低没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物的使用量；实施例2得美容环肽试剂的cAMP含量低于对比例2-3，是由于对比例2-3单独添加没食子酸卵磷脂复合物或柚皮素酰腙类衍生物制备美容环肽试剂；这说明在美容环肽试剂中协同添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，使美容环肽试剂提高cAMP含量的效果更佳。实施例5得美容环肽试剂的cAMP含量低于实施例2，是由于在美容环肽试剂的制备中，实施例5除了额外添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，还额外添加了松香季戊四醇酯；实施例5得美容环肽试剂的cAMP含量低于实施例6，是由于松香季戊四醇酯的使用量不同；实施例5得美容环肽试剂的cAMP含量低于对比例4，是由于对比例4仅额外添加松香季戊四醇酯，未添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；这说明在美容环肽试剂中添加松香季戊四醇酯，能够进一步降低α-MSH诱导的cAMP含量。
6、体外酪氨酸酶和黑色素的抑制作用
取小鼠黑色素瘤细胞B16培养至对数生长期，将细胞悬浮液浓度调整到1×105个/mL，取100µL细胞悬浮液等量接种于96孔板，置于37℃、5% CO2培养箱培养24h。细胞培养24h后，分别设置空白组，模型组和样品组，除空白组，其余各组分别置于30 J/cm2UVB光源下进行辐照，辐照结束后，弃废液，空白组、模型组和样品组每孔加入100µL的DMEM培养液，样品组添加实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂至终浓度为400ppm，继续置于培养箱培养24h后，弃去上清，用PBS溶液清洗3次，每孔加入100μL免疫染色通透液（1% Triton X-100），-80℃冻存40min，室温融化裂解细胞，取细胞裂解液离心，取100μL上清液，加入0.1%左旋多巴溶液100μL，37℃放置2h，于475nm波长处测吸光度，计算酪氨酸酶相对活性。另取培养24h后细胞，弃去上清，用PBS溶液清洗3次，每孔加入100μL的含10%DMSO的1.0mol/LNaOH溶液，80℃水浴加热充分裂解细胞，离心取上清，于405nm波长处测吸光度，计算黑色素相对含量。
图6为本发明得美容环肽试剂对酪氨酸酶相对活力的影响结果图，图7为本发明得美容环肽试剂对黑色素相对含量的影响结果图，模型组的酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量在UVB诱导下显著提高（P＜0.01），证明模型造模成功。与模型组相比，经实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂处理后的B16细胞中酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均降低，这说明本发明实施例1-6和对比例1-4得美容环肽试剂均可抑制黑色素生成和酪氨酸酶相对活性。实施例1得美容环肽试剂的酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均低于对比例1，是由于实施例1使用环六肽-2制备美容环肽试剂，对比例1使用直链六肽-2制备美容环肽试剂，这说明实施例1得美容环肽试剂降低酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量效果优于对比例1。实施例2得美容环肽试剂的酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均低于实施例1，是由于实施例2在美容环肽试剂中额外添加了没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；实施例2得美容环肽试剂的酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均低于实施例3-4，是由于实施例3-4得美容环肽试剂分别降低没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物的使用量；实施例2得美容环肽试剂的酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均低于对比例2-3，是由于对比例2-3单独添加没食子酸卵磷脂复合物或柚皮素酰腙类衍生物制备美容环肽试剂；这说明在美容环肽试剂中协同添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，使美容环肽试剂抑制酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量的效果更佳。实施例5得美容环肽试剂的酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均低于实施例2，是由于在美容环肽试剂的制备中，实施例5除了额外添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，还额外添加了松香季戊四醇酯；实施例5得美容环肽试剂的酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均低于实施例6，是由于松香季戊四醇酯的使用量不同；实施例5得美容环肽试剂的酪氨酸酶相对活性和黑色素相对含量均低于对比例4，是由于对比例4仅额外添加松香季戊四醇酯，未添加没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物；这说明在美容环肽试剂中添加松香季戊四醇酯，能够进一步抑制黑色素生成和酪氨酸酶相对活性，实现肌肤的美白提亮效果。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种美容环肽试剂的制备方法，包括，将环肽、添加剂和甘油混合，获得美容环肽试剂；所述环肽至少包括环六肽-2；所述添加剂至少包括没食子酸卵磷脂复合物和柚皮素酰腙类衍生物，所述没食子酸卵磷脂复合物具有苯酚基团和磷酸基团，所述柚皮素酰腙类衍生物具有苯酚基团和烟酸酰肼基团；
所述环六肽-2的结构式如式Ⅰ所示：
；
所述没食子酸卵磷脂复合物由大豆卵磷脂接枝没食子酸进行衍生得到；
没食子酸卵磷脂复合物的制备：将大豆卵磷脂加入至无水乙醇，边搅拌边逐渐加入没食子酸，缓慢升温至40-60℃，持续搅拌冷凝回流反应2-4h，直至反应溶液澄清，在40-50℃下旋蒸去除乙醇，经非水滤膜过滤，将滤液真空抽滤干燥12-36h，获得没食子酸卵磷脂复合物；大豆卵磷脂和无水乙醇的固液比为1g：10-30mL，大豆卵磷脂和没食子酸的质量比为1：0.2-1；
所述柚皮素酰腙类衍生物由柚皮素和6-羟基烟酸酰肼进行反应得到；
柚皮素酰腙类衍生物的制备：将柚皮素和6-羟基烟酸酰肼混合，加入乙醇和乙酸，搅拌溶解，将混合液在600-800W条件下加热2-10min，再用甲醇重结晶，洗涤、过滤、干燥后，获得柚皮素酰腙类衍生物，柚皮素和6-羟基烟酸酰肼的质量比为1：1-2，柚皮素和乙醇的固液比为1g：2-5mL，柚皮素和乙酸的固液比为1g：0.2-0.5mL。
2.根据权利要求1所述一种美容环肽试剂的制备方法，其特征在于，所述环肽和添加剂的质量比为1：0.002-0.05。
3.根据权利要求1所述一种美容环肽试剂的制备方法，其特征在于，所述环肽和甘油的用量比为1g：2-10mL。
4.根据权利要求1所述一种美容环肽试剂的制备方法，其特征在于，所述环六肽-2的制备方法，包括，将2-氯三苯甲基氯（CTC）树脂与经Fmoc基团保护的氨基酸类试剂进行偶联反应，获得直链肽树脂，切割树脂后获得全保护直链肽，再通过环化作用获得环六肽-2。
5.根据权利要求4所述一种美容环肽试剂的制备方法，其特征在于，所述经Fmoc基团保护的氨基酸类试剂的偶联顺序依次为：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH。
6.权利要求1-5任一所述方法制备得到的美容环肽试剂。
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