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CN118995718A - 含有末端核苷酸修饰的双链寡核苷酸及其在抑制agt基因表达中的应用 - Google Patents

含有末端核苷酸修饰的双链寡核苷酸及其在抑制agt基因表达中的应用 Download PDF

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CN118995718A CN202411487769.0A CN202411487769A CN118995718A CN 118995718 A CN118995718 A CN 118995718A CN 202411487769 A CN202411487769 A CN 202411487769A CN 118995718 A CN118995718 A CN 118995718A
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Abstract

本公开提供一种含有末端核苷酸修饰的双链寡核苷酸及其在抑制AGT基因表达中的应用，属于核酸药物技术领域。本公开提供的双链寡核苷酸可诱导沉默复合体（RISC）‑介导的血管紧张素原（AGT）基因的RNA转录物的切割，抑制AGT基因的表达，从而有助于治疗或预防由血管紧张素原（AGT）基因介导的疾病或病症，具有良好的应用前景。

Description

含有末端核苷酸修饰的双链寡核苷酸及其在抑制AGT基因表 达中的应用
技术领域
本公开涉及核酸药物技术领域，具体涉及一种含有末端核苷酸修饰的双链寡核苷酸及其在抑制AGT基因表达中的应用。
背景技术
血管紧张素原（AGT），也被称为SERPINA8或ANHU，是serpin家族的成员并且是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的组分，RAAS在血压调节中起着关键作用。肾脏的近肾小球细胞将肾素分泌至循环中。它主要在肝脏中产生，并且释放到循环中，在此处肾素将其转化为血管紧张素I。随后通过血管紧张素转化酶（ACE）将血管紧张素I转化成血管紧张素II。血管紧张素II是引起血管收缩的肽激素，其进而可以增加血压。血管紧张素II也刺激肾上腺皮质的激素醛固酮的分泌。醛固酮使肾脏增加钠和水的重吸收，导致体内流体体积的增加，进而可以增加血压。RAAS途径的过度刺激或活动可导致高的血压。慢性高的血压被称为高血压。高血压患者的高的血压需要心脏更加努力地使血液循环通过血管。
世界卫生组织（WHO）已将高血压确定为心血管发病的主要原因。高血压是各种疾病、病症和病状的主要危险因素，所述疾病、病症和病状诸如预期寿命缩短、慢性肾病、中风、心肌梗塞、心力衰竭、血管动脉瘤（例如主动脉瘤）、外周动脉疾病、心脏损伤（例如，心脏扩大或肥大）和其他心血管相关疾病、病症和/或病状。
尽管可用于治疗高血压的抗压药数量大，但超过三分之二的受试者用一种抗压药不能得到控制并且需要两种或更多种选自不同药物类别的抗压药。由于依从性和副作用随着用药增加而增加，这进一步降低了具有受控血压的受试者的数量。因此，用于患有血管紧张素原相关疾病的受试者的替代疗法和组合疗法仍有待研究。
有鉴于此，特提出本公开。
发明内容
本公开提供一种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸可诱导沉默复合体（RISC）-介导的血管紧张素原（AGT）基因的RNA转录物的切割，抑制AGT基因的表达，可用于治疗或预防由血管紧张素原（AGT）基因介导的疾病或病症。本公开还提供包括所述双链寡核苷酸的缀合物、药物组合物、试剂盒以及它们在抑制或降低AGT基因表达或治疗AGT基因介导的疾病或症状的方法和用途。
本公开包括如下技术方案：
在本公开的第一方面，本公开提供一种抑制AGT基因表达的双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述反义链包含或选自如式（A）所示的任一条序列中的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，或包含与所述连续核苷酸之间具有1、2或3个核苷酸差异的核苷酸序列；所述正义链包含至少17个核苷酸，且所述正义链与所述反义链互补或基本互补形成双链体区，所述基本互补是指所述正义链和所述反义链在所述双链体区的错配不超过3个核苷酸；
式（A）5'-X1GUUUCUUCAUCCAGUUGA(X2)m(X3)n-3'；
其中，X1选自A或U；
(X2)m(X3)n表示3'端的突出碱基，X2、X3各自独立的选自A、U、G、C或T，m和n独立地选自0或1，且m+n≥1。
进一步地，所述核苷酸X2、X3中的至少1个为[2’-R1-2’-R2]双取代修饰核苷酸，所述双取代修饰核苷酸指核苷酸的核糖2’位羟基和氢被取代的核苷酸，其中R1和R2各自独立地选自卤素（优选F）、任选取代的C1-C6烷基（优选甲基或乙基）或任选取代的C1-C6烷氧基（优选甲氧基）。
在本公开的一些具体实施方式中，X1选自A。在本公开的另一些具体实施方式中，X1选自U。
在本公开的一些可选实施方式中，(X2)m(X3)n选自GG、UU、TT、CC、AA、G、U、T、C或A。在本公开的另一些可选实施方式中，(X2)m(X3)n选自UU或U。在本公开的一些具体实施方式中，(X2)m(X3)n选自UU。在本公开的另一些具体实施方式中，(X2)m(X3)n选自U。
根据本公开的实施例，所述反义链包含或选自A1）-A3）所示的任一条序列，或与上述任一序列具有1个或2个核苷酸差异的核苷酸序列：
A1）5'-AGUUUCUUCAUCCAGUUGAUU-3'；
A2）5'-AGUUUCUUCAUCCAGUUGAU-3'；
A3）5'-UGUUUCUUCAUCCAGUUGAUU-3'。
根据本公开的实施例，所述正义链包含或选自B1）-B2）所示的任一条序列中的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，或包含与该连续核苷酸之间具有1、2或3个核苷酸差异的核苷酸序列；
B1）5'-UCAACUGGAUGAAGAAACU-3'；
B2）5'-UCAACUGGAUGAAGAAACA-3'。
在本公开的具体实施中，所述反义链包含或选自A1）-A3）所示的任一条序列，且所述正义链包含或选自B1）-B2）所示的任一条序列。
在本公开的一些具体实施方案中，所述双链寡核苷酸选自下列中的一组或多组：
1）反义链具有如A1（SEQ ID NO.3）所示核苷酸序列，且正义链具有如B1（SEQ IDNO.1）所示核苷酸序列；
2）反义链具有如A2（SEQ ID NO.4）所示核苷酸序列，且正义链具有如B1（SEQ IDNO.1）所示核苷酸序列；
3）反义链具有如A3（SEQ ID NO.5）所示核苷酸序列，且正义链具有如B2（SEQ IDNO.2）所示核苷酸序列。
表1 双链寡核苷酸的裸序列核苷酸信息
在本公开的一些实施方式中，所述双链寡核苷酸中的每个核苷酸独立地选自经修饰或未修饰的核苷酸。
在本公开的一些实施方式中，所述双链寡核苷酸的正义链或反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，例如，所述修饰的核苷酸为核糖基团以及任选的磷酸基团被修饰的核苷酸基团，但不限于此。
根据本公开的实施例，所述双链寡核苷酸中的全部核苷酸基本上都选自经修饰的核苷酸。其中，“该双链寡核苷酸中的全部核苷酸基本上都选自经修饰的核苷酸”是指双链寡核苷酸中的核苷酸大部分但不是全部为经修饰的核苷酸，并且可以包含不多于5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
根据本公开的实施例，所述双链寡核苷酸中的全部核苷酸选自经修饰的核苷酸，所述修饰包括核苷酸的核糖基2'位单取代或双取代修饰中的一种或两种。
其中，未修饰的核苷酸的结构式为：，Base代表核苷碱基，每个核苷酸上的核苷碱基独立地选自尿嘧啶U、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C、腺嘌呤A或鸟嘌呤G。
在本公开可选的实施方式中，所述双链寡核苷酸中的每个核苷酸各自独立地选自下列经修饰的核苷酸：
2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-(CH2)x-O-R3修饰的核苷酸、2'-O-Si(R4)3修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、脱碱基核苷酸、类核苷酸或者[2’-F-2’-甲基]双取代修饰的核苷酸。
本公开所述的类核苷酸选自肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）、吗啉代核苷酸（Morpholino nucleic acid，MNA）、桥核酸（bridged nucleic acid，BNA）、锁核酸（lockednucleic acid，LNA）、乙二醇核酸/甘油核酸（glycol nucleic acid，GNA）、苏阿糖核酸（threose nucleic acid，TNA）或非锁定核酸（unlocked nucleic acid，UNA）中的一种或多种。
其中，x选自1或2，R3选自任选取代的C1-6烷基或任选取代的C1-6烷氧基，若R3含有取代基，所述取代基选自卤素、C1-6烷氧基、羟基或氨基。
R4独立地选自任选取代的C1-6烷基，若R4含有取代基，所述取代基选自卤素、C1-C3烷基或者C1-C3烷氧基。
在本公开中，2'-O-(CH2)x-R3修饰的核苷酸是指核苷酸的核糖基2'位羟基被-O-(CH2)x-R3取代。其中，在x选自1时，所述2'-O-(CH2)x-R3修饰的核苷酸选自2'-O-乙氧基甲基修饰的核苷酸或2'-O-2,2,2-三氟乙氧基甲基修饰的核苷酸。在x选自2时，所述2'-O-(CH2)x-R3修饰的核苷酸选自2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸（又称2'-O-moe修饰的核苷酸）。
在本公开的一些具体实施方案中，所述2'-O-(CH2)x-O-R3修饰的核苷酸选自2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸或2'-O-乙氧基甲基修饰的核苷酸。
在本公开中，“2'-O-Si(R4)3修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位羟基被-O-Si(R4)3取代所形成的核苷酸。示例性地，2'-O-TBDMS修饰的核苷酸、2'-O-TIPS修饰的核苷酸或2'-O-TOM修饰的核苷酸；其中，TBDMS的结构式为，TIPS的结构式为，TOM的结构式为。
在本公开的一些具体实施方式中，所述2'-O-Si(R4)3修饰的核苷酸选自2'-O-TBDMS修饰的核苷酸、2'-O-TIPS修饰的核苷酸或2'-O-TOM修饰的核苷酸。
在本公开的一些具体实施方式中，所述[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸的结构式为；Base代表核碱基A、U、G、C或T。
根据本公开的实施例，所述双链寡核苷酸中的全部核苷酸选自经修饰的核苷酸，所述修饰包括核苷酸的核糖基2'位单取代修饰或2'位双取代修饰，所述双链寡核苷酸中的核苷酸各自独立地选自下列经修饰的核苷酸：2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸中的至少三种。
在本公开的一些具体实施方案中，所述双链寡核苷酸的反义链中含有至少一个2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，所述反义链第20位和/或第21位核苷酸为[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸。
在本公开的一些具体实施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链第19位核苷酸为[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸。
在本公开的一些实施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链中核苷酸序列的第7-10位中的至少3个核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸独立地选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在本公开的一些实施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链中核苷酸序列的第7-10位中的至少3个核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第19位核苷酸选自[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸独立地选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
根据本公开的实施例，按照5'末端到3'末端的方向，所述反义链中核苷酸序列的第2、6、9-12、14和16位的核苷酸中至少四个核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，且第2、6、14和16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第20和/或21位核苷酸选自[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
根据本公开的实施例，所述反义链中核苷酸序列的第2、6、9-12、14和16位的核苷酸中至少四个核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，且第2、6、14和16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第8和/或15位的核苷酸选自2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸，第20和/或21位核苷酸选自[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
根据本公开的实施例，所述双链寡核苷酸的每个核苷酸独立地选自经修饰的核苷酸，所述修饰选自下列（1）-（2）中的任一种：
1）按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链中核苷酸序列的第7-10位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；且所述反义链中核苷酸序列的第2、6、9、14和16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第20和/或21位核苷酸选自[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
2）按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链中核苷酸序列的第7-10位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；且所述反义链中核苷酸序列的第2、6、9、14和16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第15位的核苷酸选自2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸，第20和/或21位核苷酸选自[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸。
根据本公开的实施例，所述正义链和/或所述反义链独立地包含一个或多个硫代磷酸酯键。
根据本公开的实施例，所述正义链的下列核苷酸之间的连接中至少一个或至少两个为硫代磷酸酯键：
所述正义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
以及，
所述反义链的下列核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯键：
反义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接，以及第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接，以及第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。
在本公开的一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述反义链第10位核苷酸和第11位核苷酸之间的核苷间键选自硫代磷酸酯键。
根据本公开的实施例，按照5'末端到3'末端方向，所述双链寡核苷酸的正义链包含或选自MB1）-MB4）所示经修饰的核苷酸序列的任一条：
MB1）UmsCmsAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmCmsUm；
MB2）UmsCmAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmsCmsUm；
MB3）UmsCmAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmsCms(NM)；
MB4）UmsCmsAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmCmsAm。
根据本公开的实施例，按照5'末端到3'末端方向，所述双链寡核苷酸的反义链包含或选自MA1）-MA5）所示经修饰的核苷酸序列的任一条：
MA1）AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmsUmCmCmAfGmUfUmGmAms(NM)s(NM)；
MA2）AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmsUmCmCmAfG(moe)UfUmGmAms(NM)s(NM)；
MA3）AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmUmCmCmAfG(moe)UfUmGmsAms(NM)；
MA4）AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmUmCmCmAfG(moe)UfUmGmAms(NM)s(NM)；
MA5）UmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmUmCmCmAfG(moe)UfUmGmAms(NM)s(NM)。
在本公开的一些具体实施方式中，所述双链寡核苷酸包括表2所示的组1）-组5）中一组或多组。
表2 双链寡核苷酸修饰序列的核苷酸信息
其中，C、G、U、A、T分别表示胞苷-3'-磷酸酯、鸟苷-3'-磷酸酯、尿苷-3'-磷酸酯、腺苷-3'-磷酸酯、胸苷-3'-磷酸酯；m表示该字母m左侧相邻的一个大写字母所表示的核苷酸为2'-O-甲基修饰的核苷酸；f表示该字母f的左侧相邻的一个大写字母所表示的核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；(moe)表示该组合标识(moe)的左侧相邻的一个大写字母所表示的核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；s表示其左侧相邻的一个核苷酸和右侧相邻的一个核苷酸之间的核苷间键为硫代磷酸键；
(NM)表示核糖2’位羟基和氢被[2’-F-2’-甲基]取代的核苷酸，结构式为。
可选的实施方式中，所述双寡链核苷酸选自siRNA。
在本公开的第二方面，本公开提供一种缀合物，所述缀合物包含本公开第一方面所述的双链寡核苷酸，以及缀合至所述双链寡核苷酸上的一个或多个能够与细胞受体结合的配体。
其中，配体能够共价地或以其它化学方式缀合到所述双链寡核苷酸上，且配体和细胞受体的结合能够促进缀合物特异性靶向至靶细胞并将缀合物内吞至靶细胞中，以抑制靶细胞中AGT mRNA翻译成氨基酸和转化为蛋白质，可有效地缓解、预防和/或治疗血管紧张素原（AGT）基因介导的疾病或病症。
在本公开的一些可选实施方式中，所述配体选自去唾液酸糖蛋白受体配体（ASGPR配体）。
在本公开的一些可选实施方式中，所述配体包含至少一个N-乙酰基半乳糖胺（N-Acetyl Galactosamine，GalNAc）。
在本公开的一些可选实施方式中，所述配体选自如式（Ⅰ）所示的结构，或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐：
Ⅰ
式（Ⅰ）中，*代表所述配体与双链寡核苷酸的缀合位点，j选自1、2、3或4；
在本公开的一些可选实施方案中，每个Z各自独立地选自羟基或巯基。在本公开的一些具体实施方案中，每个Z都是羟基。
在本公开的一些实施方案中，每个p各自独立地为1或2。
在本公开的一些具体实施方案中，每个p都是1。
在本公开的一些实施方案中，每个q各自独立地为1或2。
在本公开的一些具体实施方案中，每个q都是1。
在本公开的一些具体实施方案中，每个p都是1，且每个q都是1。
每个L各自独立地选自C1-C30亚烷基或；其中，每个RL2a各自独立地选自C1-C10亚烷基，每个RL2b各自独立地选自O、S、NH或-NH-C(O)-，k选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
进一步地，在本公开的一些具体实施方案中，所述配体具有如式（Ⅱ）所示的结构，或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐：
Ⅱ
式（Ⅱ）中，j选自1、2、3或4；L独立地选自-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-CH2-NH-CO-(CH2)5-、-(CH2)2-NH-CO-(CH2)4-、-(CH2)3-NH-CO-(CH2)3-、-(CH2)4-NH-CO-(CH2)2-或-(CH2)5-NH-CO-CH2-。
在本公开的一些可选实施方案中，每个L独立地选自-CH2-CH2-或-(CH2)2-NH-CO-(CH2)4-。
在本公开的一些具体实施方案中，L选自-CH2-CH2-。
在本公开的一些具体实施方案中，L选自-(CH2)2-NH-CO-(CH2)4-。
在本公开的一些具体实施方案中，所述配体具有式（Ⅲ）、式（Ⅳ）、式（Ⅴ）或式（Ⅵ）所示的结构、或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐：
、、、。
根据本公开的实施例，所述配体的数量选自一个，一个所述配体缀合到双链寡核苷酸正义链的3'末端。
根据本公开的实施例，所述配体的数量选自两个，两个所述配体分别缀合到双链寡核苷酸正义链的5'末端和反义链的3'末端。
在本公开的一些具体实施方式中，所述缀合物包括表3所示的R303079、R303082、R303086、R303087、R303088、R303089中一组或多组。
表3 缀合物的核苷酸信息
其中，(CR01008×2)、(CR01008×3)和(CR01008×4)均代表配体；若配体位于正义链的5'末端，则表示该配体缀合连接到正义链的5'末端；若配体位于正义链的3'末端，则表示该配体缀合连接到正义链的3'末端；若配体位于若配体位于反义链的3'末端，则表示该配体缀合连接到反义链的3'末端。
(CR01008×2)的结构式为：；
(CR01008×3)的结构式为：；
(CR01008×4)的结构式为：。
在本公开的第三方面，本公开提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如下任意项以及药学上可接受的辅料：
（I）本公开第一方面所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）本公开第二方案所述的缀合物。
所述双链寡核苷酸和缀合物均可使AGT的mRNA降解，抑制AGT的表达。由此，本公开的药物组合物可有效地预防和/或治疗由血管紧张素原（AGT）基因介导的疾病或病症。
本公开的药物组合物包括适于胃肠外施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂型形式存在并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。可以与辅料物质组合来制备单剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗作用的siRNA的量。
在本公开的第四方面，本公开提供如下任意项在制备用于缓解、预防和/或治疗AGT基因介导的疾病或病症的药物中的用途：
（I）本公开第一方面所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）本公开第二方面所述的缀合物；和/或
（Ⅲ）本公开第三方面所述的药物组合物。
根据本公开的实施例，所述疾病或病症包括高血压、临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤和心室纤维化。
本公开所述的双链寡核苷酸、缀合物或药物组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定（例如通过临床试验）。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，例如按照每天四次、每天三次、每天两次、每天一次或每隔一天一次的剂量施用，或每天给予若干次剂量可按比例地减少施用。
可通过本领域己知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药（气雾剂）、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药（包括口腔含化给药和舌下给药），优选静脉注射内给药。
在本公开的第五方面，本公开提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如下任意项：
（I）本公开第一方面所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）本公开第二方面所述的缀合物；和/或
（Ⅲ）本公开第三方面所述的药物组合物。
本公开提供的双链寡核苷酸、缀合物和药物组合物可诱导沉默复合体（RISC）-介导的血管紧张素原（AGT）基因的RNA转录物的切割，抑制AGT基因的表达，有助于治疗或预防由血管紧张素原（AGT）基因介导的疾病或病症。
附图说明
图1为实施例1中给予siRNA缀合物后，食蟹猴血清中AGT蛋白的变化水平。
具体实施方式
下面将结合实施例对本公开的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
术语解释
在本公开中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本公开所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本公开中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本公开中，在本公开中，“2'位单取代修饰”是指核苷酸中核糖的2'位羟基被取代。
在本公开中，“2'位双取代修饰”是指核苷酸中核糖的2'位羟基和2'位氢同时被取代。例如[2'-F-2'-甲基]取代修饰的核苷酸，其结构式为。
在本公开中，术语“小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）”是一个长17到25个核苷酸的双链RNA，包含正义链和反义链。siRNA通过形成沉默复合体（RNA-inducedsilencing complex，RISC），介导RISC途径的RNA转录物靶向切割。具体地，siRNA通过已知的RNA干扰（RNAi）过程指导mRNA序列的特异性降解，抑制mRNA翻译成氨基酸和转化为蛋白质。例如，siRNA可调节（例如抑制）AGT在细胞中的表达。
在本公开中，术语“互补”是指第一序列的寡核苷酸在一定条件下和第二序列的寡核苷酸杂交并形成双链结构的能力。
在本公开中，术语“核苷酸差异”和术语“核苷酸碱基差异”和术语“核苷酸序列的差异”可以互换使用。是指相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸的碱基种类发生了改变。例如，在原核苷酸序列中的一个核苷酸碱基为A时，在相同或相对应位置处的核苷酸碱基改变为U、C、G或dT、dC、dG等的情况下，认为该位置处存在核苷酸序列的差异。此处需要说明的是，在相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸仅在是否存在修饰或修饰类型方面存在区别的情况下，不认为该位置处存在核苷酸序列的差异。
在本公开中，术语“突出端”是指至少一个未配对的核苷酸从双链寡核苷酸双螺旋结构中突出，也是siRNA结构中除双链区以外的核苷酸序列。例如：当正义链和/或反义链中一链的3'端超出另一链5'端、或者当正义链和/或反义链中一链的5'端超出另一链3'端时，即有核苷酸突出端。该突出端可包含至少一个核苷酸、至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多个核苷酸。核苷酸突出端可包含或其组成可为核苷酸/核苷类似物，包括脱氧核苷酸/核苷。该突出端可位于正义链、反义链或其任何组合。此外，突出端的核苷酸可出现在反义或正义链的5'末端、3'末端或两端均出现。
在本公开中，术语“抑制AGT基因的表达”包括任何水平的AGT基因的抑制，例如，AGT基因表达的至少部分抑制，如抑制至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约 40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约 65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约 90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%。其中，可以基于与AGT基因表达相关的任何变量的水平来评价AGT基因的表达，例如，AGT的mRNA水平或蛋白水平。可以通过与对照水平相比，这些变量中一个或多个的绝对或相对水平的降低来评价抑制。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如，给药前的基线水平，或从未处理或用对照(如，仅用缓冲剂的对照或无活性剂对照)处理的相似受试者、细胞或样品测定的水平。
在本公开中，“缀合”是指两个或多个化学部分之间通过共价连接的方式彼此连接；“缀合物”是指各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物；“缀合分子”理解为可通过反应缀合至寡核苷酸，最终形成本公开的寡核苷酸缀合物的特定化合物。
在本公开中，“药物组合物”可指用于疾病的治疗，也可用于细胞的体外培养实验。用于疾病的治疗时，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性siRNA与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。
在本公开中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本公开所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本公开中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的siRNA不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
除了任何常规的辅料外，与本公开的siRNA不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
下面通过具体的实施例进一步说明本公开，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本公开。
除非另有说明，本公开使用的siRNA序列均委托昆山奥泰生物技术有限公司合成；本公开使用的PCR引物合成均委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
本公开涉及的体内活性实验的不同时间点AGT蛋白的检测数据，计算方法概述如下：
；
在本公开的上下文中，除非另有说明，体内活性实验数据均以表示，实验数据均采用GraphPad prism 8.0软件进行制图和分析。
在本公开的上下文中，除非另有说明，以下提供的试剂比例均按体积比（v/v）计算。
化合物的制备
除非另有说明，本公开在化合物的制备中所用试剂均购自北京偶合科技有限公司。其中，主要试剂的信息如表4所示。
表4
其中，CPG代表可控孔径玻璃（Controlled Pore Glass）载体。
制备例1 化合物CR01008的制备：
（1-1）化合物CR01008的合成结构如下所示：
化合物CR01008的合成路线如下所示：
。
（1-1-1）化合物2的合成：
将化合物1（反式-4-(Boc-氨基)环己基甲醛，10.0g，1.0eq）和甲醛水溶液（8.9g，37质量%，2.4eq）溶于33ml甲醇中，滴加13ml浓度为45.3质量质量%的KOH水溶液，滴加完毕后在25℃下搅拌反应30分钟，升温至60℃并在60℃下回流反应2小时。反应结束后，待反应液冷却至室温后减压蒸干反应液，得到白色固体状的粗品。向粗品中加入少量水打浆，过滤，得到白色固体状的化合物2（9g，收率78. 9%）。MS-ESI (m/z) = 260 [M + H]+。
（1-1-2）化合物3的合成：
将化合物2（9g，1eq）溶于70ml的1,4-二氧六环中，加入氯化氢的1,4-二氧六环溶液（45ml，4M），在25℃下搅拌反应1小时。反应结束后，减压蒸干反应液，得到白色固体状的化合物3（6.8g，收率100%）。
（1-1-3）化合物5的合成：
将化合物3（1.8g，2.0eq）、化合物4（5-[[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)-2-四氢吡喃基]氧基]戊酸，2.1g，1.0eq）和DIEA（N,N-二异丙基乙胺，3.5g，6.0eq）溶于15ml的DMF中，加入HBTU（1.9g，1.1eq），在N2气氛中在25℃下搅拌反应3小时。反应结束后，减压蒸干反应液，反相柱色谱纯化（22体积%乙腈水溶液），得到白色固体状的化合物5（1.78g，收率64.4%）。MS-ESI (m/z) = 589[M + H]+。
（1-1-4）化合物6的合成：
将化合物5（1.54g，1.0eq）溶于15ml吡啶中，用冰水浴将反应体系降温至0℃并在0℃下加入DMTrCl（4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷，1.32g，1.5eq），在25℃下反应3小时，向反应液中加入15ml甲醇淬灭反应。反应结束后，减压蒸干反应液，反相柱色谱纯化（60体积%乙腈的水溶液），得到黄色固体状的化合物6（1g，收率42.7%）。MS-ESI (m/z) = 891 [M + H]+。
（1-1-5）化合物CR01008的合成：
将化合物6（1.08g，1.0eq）溶于20ml无水二氯甲烷中，分别加入DCI（115mg，0.8eq）和化合物7（双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，732mg，2.1eq），氮气置换3次，在25℃下搅拌反应2小时。反应结束后，向反应液中加入20ml饱和碳酸氢钠水溶液，用20ml二氯甲烷萃取3次（3×20ml），合并有机相，减压蒸干有机相，反相色谱柱纯化（72体积%乙腈水溶液）后真空干燥12小时，得到白色粉末状的化合物CR01008（1g，收率76.0%）。MS-ESI (m/z) =1091 [M + Na]+。
H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)δ1.05 (d,J= 6.7 Hz, 6H).1.14 (d,J= 6.7 Hz,6H), 1.37 – 1.17 (m, 5H), 1.60 – 1.40 (m, 6H),1.68 – 1.62 (m, 1H),1.80 (s,3H),1.80 (s, 3H),1.92 (s, 3H), 2.02 (s, 5H),2.13 (s, 3H),2.71 (t,J= 5.9 Hz,2H), 2.79 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 2.87 (d,J= 8.4 Hz, 1H),3.36 (s, 1H), 3.58 – 3.39(m, 3H), 3.69 – 3.60 (m, 2H), 3.75 (s, 7H), 3.90 (dt,J= 11.2, 8.8 Hz, 1H),4.05 (s, 3H),4.51 (d,J= 8.4 Hz, 1H),4.99 (dd,J= 11.3, 3.4 Hz, 1H), 5.24 (d,J=3.4 Hz, 1H), 5.78 (s, 1H),6.93 – 6.87 (m, 4H),7.35 – 7.21 (m, 7H), 7.44 –7.37 (m, 2H), 7.66 (d,J= 7.8 Hz, 1H), 7.84 (d,J= 9.2 Hz, 1H)。
（1-2）化合物CR01008Z的合成：
化合物CR01008Z的合成路线如下所示：
（1-2-1）化合物9的合成：
将化合物6（500mg）溶于10ml二氯甲烷中，加入化合物8（丁二酸酐，112mg）、DMAP（6.8mg）和TEA（226.2mg），氮气置换3次，在25℃下搅拌反应16小时，flash纯化，得到化合物9（300mg，收率53.6%）。MS-ESI (m/z) = 1013 [M + Na]+。
（1-2-2）化合物CR01008Z的合成：
向20ml样品瓶中加入化合物9（50mg、氨基CPG（1.25g，80μmol/g，0.1mmol）、HBTU（27mg）、DIEA（12mg），摇床反应16小时。反应结束后，过滤反应液得到滤饼，滤饼先用10ml乙腈洗涤一次（1×10ml）、再经过真空干燥。向20ml样品瓶中加入干燥后的滤饼、DMAP（3mg）、Cap1（10ml，200V）和Cap2（1ml，20V），摇床反应6小时。反应结束后，过滤反应液得到滤饼，滤饼先用10ml乙腈洗涤一次（1×10ml）、再经过真空干燥，得到化合物CR01008Z（1.03g，载量20-30μmol/g）。
其中，Cap1和Cap2为盖帽试剂，Cap1为浓度为20体积%的N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；Cap2为浓度为20体积%乙酸酐的乙腈溶液。
制备例2 化合物NM054的合成：
本制备例中，化合物NM054的合成路线如下所示：
（2-1）化合物NM054-2的合成：
向500ml反应釜中加入化合物NM054-1（3g，11.54mmol，1.0eq，(2'R)-2'-脱氧-2'-氟-2'-甲基脲苷，CAS号为863329-66-2）和吡啶（30ml），降至0℃，分批加入4,4'-双甲氧基三苯甲基氯（4.29g，12.7mmol，1.1eq），氮气置换3次，反应体系在氮气气氛中25℃下搅拌3小时，HPLC显示无原料。反应完毕后，浓缩反应液，加入纯化水（50ml）和乙酸乙酯（50ml）萃取，分出有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，柱层析纯化，得到化合物NM054-2（2.7g，收率41.7%）。MS ESI (m/z) =563.0 [M + H]+。
（2-2）化合物NM054的合成：
向100ml反应釜中加入化合物NM054-2（2.7g，4.8mmol，1.0eq），分批加入双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦（1.74g，5.76mmol，1.2eq），再加入4,5-二氰基咪唑（0.45g，3.8mmol，0.8eq，简称DCI，CAS号为1122-28-7）和二氯甲烷（27ml），氮气置换3次，反应体系在氮气气氛中25℃下搅拌3小时。反应完毕后，向反应液中加入碳酸氢钠水溶液（20ml），分出有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，并过滤、浓缩，反相柱层析纯化（洗脱液：乙腈/水=90/10，v/v），得到化合物NM054（3.0g）。MS ESI (m/z) = 763 [M + H]+。
制备例3 siRNA的制备：
（3-1）正义链（SS）的合成：
通过亚磷酰胺核酸固相合成法的方法，以固相载体的化合物为起始循环按照核苷酸序列按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。在合成过程，将化合物NM054看作一个核苷单体。
每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。合成条件给定如下：
将核苷单体配制成浓度为0.1M的核苷单体的乙腈溶液。
每一步的脱保护反应的条件相同。脱保护反应的条件：温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液（3体积%），二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应的条件相同。偶联反应的条件为：温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为浓度为0.5M的5-乙硫基-1H-四氮唑的乙腈溶液，硫代试剂为浓度为0.2M的氢化黄原素的乙腈/吡啶混合溶液（乙腈和吡啶体积比为1:1）。
每一步盖帽反应的条件均相同。盖帽反应的条件为：温度为25℃；反应时间为2分钟；盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的Cap1和Cap2的混合溶液，Cap1为浓度为20体积%的N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5，Cap2为年攻读为20体积%的乙酸酐的乙腈溶液；Cap1盖帽试剂中的N-甲基咪唑、Cap2盖帽试剂中的乙酸酐与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:1。
每一步氧化反应的条件相同。氧化反应的条件为：温度为25℃；反应时间为3秒；氧化试剂浓度为0.05M的碘水，碘与偶联反应中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1；氧化反应在水/吡啶混和溶剂（水和吡啶的体积比为1:9）中进行。硫化反应的条件为：温度为25℃；反应时间为360秒；硫代试剂浓度为0.2M氢化黄原素的吡啶溶液，硫代试剂与偶联反应中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为4:1；硫代反应在在水/吡啶混和溶剂（水和吡啶的体积比为1:9）中进行。
待最后一个核苷单体连接完成后，依次对固相载体上连接的核酸序列进行切割、脱保护、纯化、脱盐，随后冻干获得正义链，其中：
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有固相载体的核苷酸序列加入到浓度为25质量%的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃下反应16小时，除去溶剂，真空浓缩至干。在氨水处理后，相对于单链核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，脱除核糖上的2'-O-TBDMS保护。
纯化和脱盐的条件：利用制备型离子色谱纯化柱（Source 15Q）通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂1为20mM磷酸钠（pH=8.1），溶剂为水/乙腈混合溶液（水和乙腈的体积比为9:1）；洗脱剂2为1.5M氯化钠，20mM磷酸钠（pH=8.1），溶剂为水/乙腈混合溶液（水和乙腈的体积比为9:1）；洗脱梯度为洗脱剂1:洗脱剂2=(100:0)-(50:50)。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，脱盐条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱（IEX-HPLC）进行纯度检测；使用液质联用（LC-MS）进行分子量检测，比较分子量的实测值与理论值，若实测值和理论值一致，表明得到siRNA的正义链。
（3-2）反义链（AS）的合成：
利用通用固相载体合成了反义链。反义链的固相合成方法中的脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化反应条件、切割和脱保护条件、纯化和脱盐的条件与步骤（3-1）合成正义链相同。
检测：使用离子交换色谱（IEX-HPLC）进行纯度检测；使用液质联用（LC-MS）进行分子量检测，比较分子量的实测值与理论值，若实测值和理论值一致，表明得到siRNA的反义链。
（3-3）siRNA的合成：
将步骤（3-1）中合成的正义链和步骤（3-2）中合成的反义链以等摩尔比混合，溶于注射用水中并加热至95℃，缓慢冷却至室温并在室温下保持10分钟，使正义链和反义链通过氢键形成双链结构，从而得到具有表2所示正义链和反义链的siRNA。
制备例4 siRNA缀合物的合成
（4-1）正义链的合成
通过亚磷酰胺核酸固相合成法的方法，利用载体化合物（例如Universal CPG载体、Universal PS载体、化合物CR01008Z）起始，按照核苷酸序列从3'端到5'端的方向逐一连接核苷单体。在合成过程中，将化合物CR01008、化合物NM054分别看作一个核苷单体。
每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。本制备例正义链的合成中的脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化反应条件、切割和脱保护条件、纯化和脱盐的条件与步骤（3-1）正义链的合成条件相同。
在正义链的合成过程中，得到二簇CR01008载体（记为(CR01008×2)或(CR01008)×2）、三簇CR01008载体（记为(CR01008×3)或(CR01008)×3）、四簇CR01008载体（记为(CR01008×4)或(CR01008)×4）等。
二簇CR01008的结构式为：。
三簇CR01008的结构式为：。
四簇CR01008的结构式为：。
（4-2）反义链的合成
按照制备例3中步骤（3-2）所示反义链合成方法合成了本制备例的反义链。
（4-3）按照制备例3中步骤（3-3）所示方法合成siRNA缀合物。
其中，(CR01008)×3载体缀合到正义链3'末端的siRNA缀合物的结构式如下所示：
；其中，表示siRNA，SS代表siRNA的正义链，AS代表siRNA的反义链。(CR01008×3)通过磷酸二酯键缀合到siRNA的正义链3'末端。
(CR01008)×4载体缀合到正义链3'末端的siRNA缀合物的结构式如下所示：
；其中，表示siRNA，SS代表siRNA的正义链，AS代表siRNA的反义链。(CR01008×4)通过磷酸二酯键缀合到siRNA的正义链3'末端。
两个(CR01008)×2载体分别缀合到正义链5'末端和反义链3'末端的siRNA缀合物的结构式如下所示：
；其中，表示siRNA，SS代表siRNA的正义链，AS代表siRNA的反义链。两个(CR01008×2)分别通过磷酸二酯键缀合到siRNA的正义链5'末端和反义链3'末端。
生物学检测实验：
除非另有说明，本公开在生物学检测实验中所用试剂耗材和仪器设备均来源于市售产品。
实施例1siRNA缀合物在正常食蟹猴体内药效比较：
本实施例采用ELISA法测定RZ003089、R303079、R303082、R303086、R303087、R303088、R303089单次给药后不同时间点食蟹猴血清中AGT蛋白的表达。
缀合物RZ003089的核苷酸信息如下：
正义链（5'-3'）：UmsCmsAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmCmUm_(CR01008×3)；
反义链（5'-3'）：AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmUmCmCmAfG(moe)UfUmGmAmsGmsGm。
动物分组、给药及组织样本收集：
将3-5kg体重的健康食蟹猴按照血清AGT蛋白水平进行分组，每组3只，雄性。每个测试组给予预定剂量的药物缀合物并增加溶媒对照组。所有动物根据体重计算给药剂量，采用背部肩胛间区皮下注射方式单次给药，各药物缀合物以6 mg（以siRNA计算）/mL的0.9%氯化钠注射液形式给药，给药体积为给药体积1 mL/kg（食蟹猴体重），即每一药物缀合物的给药剂量为6 mg（以siRNA计算）/kg（食蟹猴体重）。溶媒对照组给予不含siRNA缀合物的0.9%氯化钠注射液1 mL/kg（食蟹猴体重）。于给药当天记为第1天（记为D0，给药前）、给药后的第7天（记为D7）、第14天（记为D14）、第21天（记为D21）、第28天（记为D28）、第35天（记为D35）、第42天（记为D42）采集食蟹猴血清，使用人血管紧张素原（AGT）试剂盒（IBL，27412）进行AGT蛋白表达测定。试验进行中。
表5 给予所述siRNA缀合物后，食蟹猴血清中AGT蛋白变化水平
实施例1的结果如表5和图1所示，结果表明，单次给药6mg/kg剂量下RZ003089、R303079、R303082、R303086、R303087、R303088、R303089均能明显降低食蟹猴血清中AGT蛋白水平；随着观察时间的延长，R303082和R303089对血清AGT蛋白效果略优于RZ003089。
以上具体实施方式只是对本发明内容的示意性说明，不代表本发明内容的限制。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本公开的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本公开的保护范围。

Claims (17)

1.一种抑制AGT基因表达的双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述反义链包含或选自如式（A）所示的序列中的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，或包含与所述连续核苷酸之间具有1、2或3个核苷酸差异的核苷酸序列；所述正义链包含至少17个核苷酸，且所述正义链与所述反义链互补或基本互补形成双链体区，所述基本互补是指所述正义链和所述反义链在所述双链体区的错配不超过3个核苷酸；
式（A）5'-X1GUUUCUUCAUCCAGUUGA(X2)m(X3)n-3'；
其中，X1选自A或U；
(X2)m(X3)n表示3'端的突出碱基，X2、X3各自独立地选自A、U、G、C或T，m和n独立地选自0或1，且m+n≥1；
进一步地，所述核苷酸X2、X3中的至少1个为[2’-R1-2’-R2]双取代修饰核苷酸，所述双取代修饰核苷酸指核苷酸的核糖2’位羟基和氢被取代的核苷酸，其中R1和R2各自独立地选自卤素、任选取代的C1-C6烷基或任选取代的C1-C6烷氧基。
2.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述反义链包含或选自A1）-A3）所示的任一条序列，或与上述任一序列具有1个或2个核苷酸差异的核苷酸序列：
A1）5'-AGUUUCUUCAUCCAGUUGAUU-3'；
A2）5'-AGUUUCUUCAUCCAGUUGAU-3'；
A3）5'-UGUUUCUUCAUCCAGUUGAUU-3'；
所述正义链包含或选自B1）-B2）所示的任一条序列中的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，或包含与该连续核苷酸之间具有1、2或3个核苷酸差异的核苷酸序列；
B1）5'-UCAACUGGAUGAAGAAACU-3'；
B2）5'-UCAACUGGAUGAAGAAACA-3'。
3.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述反义链包含或选自A1）-A3）所示的任一条序列，且所述正义链包含或选自B1）-B2）所示的任一条序列。
4.根据权利要求3所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸选自下列中的一组或多组：
1）反义链具有如A1所示核苷酸序列，且正义链具有如B1所示核苷酸序列；
2）反义链具有如A2所示核苷酸序列，且正义链具有如B1所示核苷酸序列；
3）反义链具有如A3所示核苷酸序列，且正义链具有如B2所示核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸中的全部核苷酸选自经修饰的核苷酸，所述修饰包括核苷酸的核糖基2'位单取代或2'位双取代修饰中的一种或两种；
所述双链寡核苷酸中的每个核苷酸各自独立地选自下列经修饰的核苷酸：
2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-(CH2)x-O-R3修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、脱碱基核苷酸、类核苷酸或者[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸；
其中，x选自1或2，R3选自任选取代的C1-6烷基或任选取代的C1-6烷氧基，若R3含有取代基，所述取代基选自卤素、C1-6烷氧基、羟基或氨基；
所述[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸的结构式为；Base代表核碱基A、U、G、C或T。
6.根据权利要求5所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸中的全部核苷酸选自经修饰的核苷酸，所述修饰包括核苷酸的核糖基2'位单取代修饰或2'位双取代修饰，所述双链寡核苷酸中的每个核苷酸各自独立地选自下列经修饰的核苷酸：2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸。
7.根据权利要求6所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸的每个核苷酸独立地选自经修饰的核苷酸，所述修饰选自下列（1）-（2）中的任一种：
1）按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链中核苷酸序列的第7-10位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；且所述反义链中核苷酸序列的第2、6、9、14和16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第20和/或21位核苷酸选自[2'-F-2'-甲基]双取代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；
2）按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链中核苷酸序列的第7-10位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；且所述反义链中核苷酸序列的第2、6、9、14和16位的核苷酸选自2'-氟代修饰的核苷酸，第15位的核苷酸选自2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸，第20和/或21位核苷酸选自 [2’-F-2’-甲基]双取代修饰的核苷酸，其余位置的核苷酸选自2'-O-甲基修饰的核苷酸；
所述正义链和/或所述反义链独立地包含一个或多个硫代磷酸酯键。
8.根据权利要求7所述的双链寡核苷酸，其特征在于，
所述正义链的下列核苷酸之间的连接中至少一个或至少两个为硫代磷酸酯键：
所述正义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的5’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3’端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
以及，
所述反义链的下列核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯键：反义链的5’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接，以及第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接； 所述反义链的3’端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接以及第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。
9.根据权利要求8所述的双链寡核苷酸，其特征在于，按照5'末端到3'末端方向，所述双链寡核苷酸的正义链包含或选自MB1）- MB4）所示经修饰的核苷酸序列的任一条：
MB1）UmsCmsAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmCmsUm；
MB2）UmsCmAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmsCmsUm；
MB3）UmsCmAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmsCms(NM)；
MB4）UmsCmsAmAmCmUmGfGfAfUfGmAmAmGmAmAmAmCmsAm；
按照5'末端到3'末端方向，所述双链寡核苷酸的反义链包含或选自MA1）-MA5）所示经修饰的核苷酸序列的任一条：
MA1）AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmsUmCmCmAfGmUfUmGmAms(NM)s(NM)；
MA2）AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmsUmCmCmAfG(moe)UfUmGmAms(NM)s(NM)；
MA3）AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmUmCmCmAfG(moe)UfUmGmsAms(NM)；
MA4）AmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmUmCmCmAfG(moe)UfUmGmAms(NM)s(NM)；
MA5）UmsGfsUmUmUmCfUmUmCfAmUmCmCmAfG(moe)UfUmGmAms(NM)s(NM)；
其中，m表示该字母m左侧相邻的一个大写字母所表示的核苷酸为2'-O-甲基修饰的核苷酸；f表示该字母f的左侧相邻的一个大写字母所表示的核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；(moe)表示该组合标识(moe)的左侧相邻的一个大写字母所表示的核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；s表示该字母s左侧相邻的一个核苷酸和右侧相邻的一个核苷酸之间的核苷间键选自硫代磷酸酯键；
(NM)表示核糖2’位羟基和氢被[2’-F-2’-甲基]取代的核苷酸，结构式为。
10.根据权利要求9所述的双链寡核苷酸，其特征在于，所述双链寡核苷酸选自组1）-组5）中一组或多组：
组1：由SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7组成的双链寡核苷酸；
组2：由SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.9组成的双链寡核苷酸；
组3：由SEQ ID NO.10与SEQ ID NO.11组成的双链寡核苷酸；
组4：由SEQ ID NO.12与SEQ ID NO.13组成的双链寡核苷酸；
组5：由SEQ ID NO.14与SEQ ID NO.15组成的双链寡核苷酸。
11.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物包含权利要求1-10任一项所述的双链寡核苷酸，以及缀合至所述双链寡核苷酸上的一个或多个能够与细胞表面受体结合的配体；
所述配体具有式（Ⅰ）所示的结构、或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐：
Ⅰ
式（Ⅰ）中，*代表所述配体与所述双链寡核苷酸的缀合位点；
j选自1、2、3或4；
每个Z各自独立地选自羟基或巯基；
每个p各自独立地为1或2；
每个q各自独立地为1或2；
每个L各自独立地选自C1-C30亚烷基或；其中，每个RL2a各自独立地选自C1-C10亚烷基，每个RL2b各自独立地选自O、S、NH或-NH-C(O)-，k选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其特征在于，所述配体具有如式（Ⅱ）所示的结构、或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐：
Ⅱ
式（Ⅱ）中，j选自1、2、3或4；L独立地选自-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-CH2-NH-CO-(CH2)5-、-(CH2)2-NH-CO-(CH2)4-、-(CH2)3-NH-CO-(CH2)3-、-(CH2)4-NH-CO-(CH2)2-或-(CH2)5-NH-CO-CH2-。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其特征在于，所述配体具有式（Ⅲ）、式（Ⅳ）、式（Ⅴ）或式（Ⅵ）所示的结构，或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐：
、、、。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其特征在于，所述配体的数量选自一个，一个所述配体缀合到双链寡核苷酸正义链的3'末端；或者，
所述配体的数量选自两个，两个所述配体分别缀合到双链寡核苷酸正义链的5'末端和反义链的3'末端。
15.根据权利要求14所述的缀合物，其特征在于，所述缀合物选自R303079、R303082、R303086、R303087、R303088、R303089中一组或多组。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包括如下任意项以及药学上可接受的辅料：
（I）权利要求1-10任一项所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）权利要求11-15任一项所述的缀合物。
17.如下任意项在制备用于缓解、预防和/或治疗AGT基因介导的疾病或病症的药物中的用途：
（I）权利要求1-10任一项所述的双链寡核苷酸；和/或
（II）权利要求11-15任一项所述的缀合物；和/或
（Ⅲ）权利要求16所述的药物组合物。
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