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CN119061009A - 一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途 - Google Patents

一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途 Download PDF

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CN119061009A
CN119061009A CN202410706089.7A CN202410706089A CN119061009A CN 119061009 A CN119061009 A CN 119061009A CN 202410706089 A CN202410706089 A CN 202410706089A CN 119061009 A CN119061009 A CN 119061009A
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CN
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conjugate
nucleotide
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CN202410706089.7A
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任青云
邹致富
陈允甫
陈慧梦
汪璞
张英俊
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Guangdong HEC Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Guangdong HEC Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途。本发明提供了一种双链siRNA、其缀合物或其盐，还涉及所述双链siRNA及其缀合物在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎疾病的药物中的用途。另外还涉及一种新型的化合物，以及所述化合物在DNA核苷酸固相合成的原料、siRNA药物合成的原料、siRNA药物的研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的用途，尤其是在本发明所述双链siRNA药物的合成原料方面的用途。并且，本发明还涉及一种新型的核苷酸残基，以及其在用于siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的应用，以及在作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用。

Description

一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途
技术领域
本发明属于小核酸药物领域，本发明的目的在于提供一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途。本发明还提供了所述双链siRNA及其缀合物在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎疾病的药物中的用途。另外，本发明还涉及一种新型的化合物，以及所述化合物在DNA核苷酸固相合成的原料、寡核苷酸药物的合成原料、siRNA药物的合成原料、siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的应用(用途)，尤其是在用作本发明所述双链siRNA药物的合成原料的用途。并且，本发明还涉及一种新型的核苷酸残基，以及其在用于siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的应用，以及在作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用。
背景技术
乙型病毒性肝炎(又称乙型肝炎或乙肝)是严重威胁全球的一类传染病，目前全球公认的两大类乙肝治疗药物为干扰素和核苷类似物，但是这两类药物存在使用后容易产生耐药性或使用受限等多种弊端，如干扰素容易产生不良反应、核苷类药物存在耐药性和停药后复发问题。因此，若能从基因水平沉默病毒的基因表达，阻断HBV的生成和复制，由此从根本上降低病毒复制和对肝细胞的侵染，无疑将是最为理想的乙肝治疗手段。小干扰核酸，即小干扰RNA或短干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可基于RNA干扰(RNAinterference，RNAi)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断任何感兴趣的目的基因(例如引发如癌症等疾病的基因)的表达，从而达到治疗疾病的目的。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，之后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNA干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，被称为小干扰核酸(siRNA)。双链siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)。在RNA干扰过程中，双链siRNA中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的双链siRNA、其缀合物、其盐及它们的用途，具体涉及本发明所述双链siRNA及其缀合物在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎疾病的药物中的用途。另外，本发明还涉及一种新型的化合物，以及所述化合物在DNA核苷酸固相合成的原料、siRNA药物的合成原料、siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的用途，尤其是在作为本发明所述双链siRNA药物的合成原料的用途。并且，本发明还涉及一种新型的核苷酸残基，以及其在siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的用途，以及作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用。本发明所述双链siRNA及其缀合物对HBV具有较高的基因表达抑制活性和/或较低的毒性。
一方面，本发明涉及一种双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述双链siRNA包括一条正义链和一条反义链，且所述双链siRNA包含一个或多个Y，所述Y为所述双链siRNA中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。任选地，所述Y可以在所述双链siRNA的任意位置。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述双链siRNA包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个Y。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述双链siRNA包含1、2、3、4或5个Y。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述反义链包含如5’-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3’(SEQ ID NO:40)所示的序列，或在如SEQ ID NO:40所示序列中使用Y替换了一个或多个核苷酸残基的序列；其中，所述反义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述反义链的长度不超过23个核苷酸，其中所述Y具有本发明所述的含义。任选地，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:40所示的序列的任意位置。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述正义链包含如5’-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3’(SEQ ID NO:20)所示的序列，或在如SEQ ID NO:20所示序列中使用Y替换了一个或多个核苷酸残基的序列，其中，所述正义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述正义链的长度不超过23个核苷酸。任选地，所述Y替换发生在如SEQ ID NO：20所示的序列的任意位置。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中的正义链或反义链的70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的核苷酸和Y都是经修饰的。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中的正义链和反义链的70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的核苷酸和Y都是经修饰的。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中的每一个核苷酸和Y都是经修饰的。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中所述修饰选自以下中的至少之一：2’-甲氧基修饰、2’-甲氧基乙基修饰、2’-氟代修饰、硫代磷酸酯基连接、2’-脱氧修饰、2’-氨基修饰、锁核酸修饰、解锁核酸修饰、乙二醇核酸修饰和5’-乙烯基磷酸酯修饰。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述正义链包含在如SEQ ID NO:20所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中所述正义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述正义链包含在如SEQ ID NO:20所示的序列中使用Y替换了1个核苷酸残基的序列。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，反义链包含在如SEQ ID NO：40所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中所述反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述反义链包含在如SEQ ID NO:40所示的序列中使用Y替换了1个核苷酸残基的序列。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:20所示序列的5’端的第1位～第19位(即所述Y替换任选地发生在SEQ IDNO:20所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位)。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:40所示序列的5’端的第1位～第21位(即所述Y替换任选地发生在SEQ IDNO:40所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21位)。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述正义链包含如5’-g●u●guGcACUucgcuucaca-3’(SEQ ID NO:19)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，所述正义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:19所示序列的5’端的第1位～第19位(即所述Y替换任选地发生在如SEQ ID NO:19所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位)，所述正义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述反义链包含如5’-u●G●ugaAgCGaaguGcAcac●u●u-3’(SEQ ID NO:36)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，所述反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在所述反义链SEQ ID NO:36的5’端的第1～第21位(即所述Y替换任选地发生在如SEQ ID NO:36所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位)，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述反义链包含在如5’-u●G●uga(Agn)gCGaaguGcAcac●u●u-3’(SEQ ID NO:33)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:33所示序列5’端的第1～第21位((即所述Y替换任选地发生在如SEQ ID NO:33所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位))，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
如无特别说明，在本发明上下文中，大写字母C、G、U、A表示天然核苷酸的碱基组成；小写字母c、g、u、a分别表示其相应大写字母所代表的核苷酸上的核糖2位被甲氧基修饰；大写字母下面的下划线表示该字母所代表的核苷酸上的核糖2位被氟修饰；Agn为腺苷-乙二醇核酸；间隔号“●”表示与间隔号“●”左右相邻的两个核苷酸残基之间为硫代磷酸酯基连接；Y为
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链包含以下核苷酸序列之一：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21；
所述正义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，所述反义链包含以下核苷酸序列中的之一：
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；
所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述双链siRNA包含以下之一：
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；或
具有包含SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，双链siRNA或其缀合物选自本发明说明书表1中的S1至S143、S146、S147和S150之一。在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA缀合物包含所述双链siRNA和缀合基团，即，所述双链siRNA缀合物为所述双链siRNA与缀合基团缀合后的缀合物，其中所述缀合基团包括但不限于L-96或DAW40007-4，所述L-96和DAW40007-4的结构分别为：
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述缀合基团与双链siRNA的正义链的3’末端或5’末端缀合。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述缀合基团与双链siRNA的正义链的3’末端缀合。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或磷酸基团与所述缀合基团链接。
另一方面，本发明还涉及一种核苷酸残基Y，其结构为：
另一方面，本发明还涉及一种化合物，其具有如式(I)所示的结构，或如式(I)所示的化合物的立体异构体、互变异构体或可接受的盐，
R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，所述各甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代；
Z和Y1各自独立地为H、氘、羟基保护基团、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、磷酸酯基基团、硫代磷酸酯基团、亚磷酸酰胺基基团或氢磷酸盐基团；
M为固相支持体，优选为羟基或氨基功能化的固相支持体，更优选为树脂或CPG，进一步优选为大孔树脂或CPG，更进一步为优选胺甲基树脂、羟基树脂或-NHCPG；
R为-NHR2或-N＝CH-NRaRb；
R2为氨基保护基团；
各Ra和Rb独立地为H或氨基保护基团，或Ra、Rb和与它们所连接的N原子一起形成5-6个环原子组成的杂环基，所述各5-6个环原子组成的杂环基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代；
其中，各j独立地为1、2、3、4或5。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-12烷基、C1-12烷基C(＝O)-、C1-12烷硅基、C6-10芳基C1-6烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、其中，各j、M、X、Rx、Ry、Rc和Rd具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-10烷基、C1-10烷基C(＝O)-、C1-10烷硅基、C6-10芳基C1-4烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、其中，各j、M、X、Rx、Ry、Rc和Rd具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-8烷基、C1-8烷基C(＝O)-、C1-8烷硅基、苯基C1-3烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、其中，各j、M、X、Rx、Ry、Rc和Rd具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-6烷基、C1-6烷基C(＝O)-、C1-6烷硅基、苄基、苯乙基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、其中，各j、M、X、Rx、Ry、Rc和Rd具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，X为Cl或Br。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rx和Ry独立地为羟基保护基团。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rc和Rd独立地为H或氨基保护基团；或Rc、Rd和与它们所连接的N原子一起形成5-6个环原子组成的杂环基，所述5-6个环原子组成的杂环基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代。
在本发明所述化合物的一些实施例中，R2为9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、甲基、叔丁基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、C1-6烷氧基或R3C(＝O)-，其中，R3具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Ra和Rb独立地为独立地为H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或R4C(＝O)-，或Ra、Rb和与它们所连接的N原子一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基，所述吡咯烷基、吗啉基、哌啶基和哌嗪基各自独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代，其中，R4具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各R3和R4独立地为C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-6烷基苯基或苄基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各R3和R4独立地为C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-4烷基苯基或苄基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各R3和R4独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、2,2,2-三氯乙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、1-丁氧基、2-甲基-l-丙氧基、2-丁氧基、叔丁氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-3烷基苯基或苄基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rx和Ry独立地为苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、氰基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷基C(＝O)-、C1-6烷硅基、苯基、卤素取代的苯基、苄基或苯乙基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rx和Ry独立地为苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、CNCH2-、CN(CH2)2-、CNCH(CH3)2CH2-、CN(CH2)3-、CNCH(CH3)2CH2CH2-、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、、C1-4烷基C(＝O)-、C1-4烷硅基、苯基、卤素取代的苯基、苄基或苯乙基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rc和Rd独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或R4C(＝O)-，或Rc、Rd与它们所连接的N原子一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基，所述吡咯烷基、吗啉基、哌啶基和哌嗪基各自独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代。
在本发明所述化合物的一些实施例中，本发明所述化合物具有如式(II)所示的结构，
在本发明的另一方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，和药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，本发明还涉及本发明所述的双链siRNA缀合物、其缀合物和本发明所述所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎疾病的药物中的用途。
在本发明的另一方面，本发明还涉及本发明所述的核苷酸残基在作为用于siRNA的药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的应用，所述核苷酸残基的结构为：
在本发明所述的核苷酸残基应用的一些实施例中，所述siRNA药物为本发明所述的双链siRNA药物。
在本发明的另一方面，本发明还涉及本发明所述的化合物在DNA核苷酸固相合成的原料、寡核苷酸药物的合成原料、siRNA药物的合成原料、siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的应用。
在本发明的再一方面，本发明还涉及本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用，其中，所述寡聚核苷酸是含有10～50个核苷酸或核苷酸碱基对的核苷酸序列，且所述寡聚核苷酸能够抑制或阻断基因的表达，所述核苷酸残基的结构为：
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述基因为HBV基因。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述寡聚核苷酸为siRNA。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述siRNA包括正义链和反义链。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述核苷酸残基仅嵌入到所述siRNA的正义链上。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述核苷酸残基仅嵌入到所述siRNA的反义链上。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述核苷酸残基嵌入到所述siRNA的正义链和反义链上。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述siRNA的正义链包含如SEQ ID NO:19所示的序列。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述siRNA的反义链包含如SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:33所示的序列。
本发明详细说明书
定义和一般术语
在本发明中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本发明中，术语“小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)”是一类长度为17到30个核苷酸的双链RNA分子，包含正义链和反义链。siRNA通过形成沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，介导RISC途径的RNA转录物靶向切割。具体地，siRNA通过已知的RNA干扰(RNAi)过程指导mRNA序列的特异性降解，抑制mRNA翻译成氨基酸和转化为蛋白质。例如，siRNA可调节(例如抑制)乙肝病毒在细胞中的表达。
在本发明中，术语“反义链(或称引导链)”是指包括与靶序列(如乙肝病毒的mRNA中一段序列)基本上互补的区域的siRNA链。“正义链(或称随从链)”是指含有与反义链基本上互补的区域的siRNA链。本发明所述双链siRNA中的反义链或正义链中的含有一个或多个(例如，2、3、4或5个)核苷酸残基Y，所述Y具有本发明所述的结构。
术语“基本上互补”是指完全互补或至少部分互补，例如反义链与靶序列完全互补或至少部分互补。在部分互补的情况下，错配可以存在于分子的内部或末端区域内，其中，最耐受的错配存在于末端区域内，例如在siRNA任一链的5’-和/或3’-末端的5、4、3或2个核苷酸内部。
需要说明的是，反义链与mRNA的“至少部分基本上互补”是指反义链具有与感兴趣的mRNA(例如编码乙肝病毒的mRNA)的一个连续部分基本互补的多核苷酸。或者，如果一种多核苷酸与编码乙肝病毒的mRNA的部分基本上非间断互补，则该反义链与所述乙肝病毒的mRNA的至少一部分互补。
在本发明中，术语“靶序列”是指在编码乙肝病毒基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
本公开中，双链siRNA类似物是指核糖核酸分子的复合体，其具有双链结构，包含两条反向平行的且基本上互补的核酸链，其相对于靶RNA具有“正义”和“反义”定向。在本公开中，“互补”具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。嘌吟碱基腺嘌吟(A)始终与嘧啶碱基尿嘧啶(U)相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的尿嘧啶配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。
在本发明中，术语“抑制乙型肝炎病毒基因的表达”包括任何水平的乙型肝炎病毒(简称乙肝病毒)基因的抑制，例如，乙肝病毒基因表达的至少部分抑制，如抑制至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。其中，可以基于与乙肝病毒基因表达相关的任何变量的水平来评价乙肝病毒基因的表达，例如，乙肝病毒的mRNA水平或乙肝病毒蛋白水平。可以通过与对照水平相比，这些变量中一个或多个的绝对或相对水平的降低来评价抑制。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如，给药前的基线水平，或从未处理或用对照(如，仅用缓冲剂的对照或无活性剂对照)处理的相似受试者、细胞或样品测定的水平。
在本发明中，“药物组合物”可指用于疾病的治疗，也可用于细胞的体外培养实验。用于疾病的治疗时，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性双链siRNA与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。
本发明所述的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，优先为未修饰的核苷酸。本发明的双链siRNA含有正义链和反义链。
本发明所述“嵌入”表示嵌入基团与序列中至少一个核苷酸残基相连接，包括在序列中使用嵌入基团(如Y)替换了一个核苷酸残基。
本发明所述“嵌入基团”为天然核苷酸碱基的类似物的残基，不同于任何公开专利的天然核苷酸碱基，将其引入核酸序列后，可使序列具备一定功能(如带来不可预料的活性)。如本发明所述Y，其作为嵌入基团嵌入寡聚核苷酸序列中后，能够抑制基因的表达，进而产生不可预料的活性。
本发明所述“寡聚核苷酸嵌入基团”是指所述嵌入基团与寡聚核苷酸中至少一个核苷酸残基相连接，包括在寡聚核苷酸中使用嵌入基团(如Y)替换了一个核苷酸残基。
本发明所述Y嵌入的序列是指所述序列中存在至少一个核苷酸残基与Y相连接，包括如在序列中使用Y替换了一个核苷酸残基的序列。本发明所述Y嵌入的序列还可以任选被修饰，如甲氧基修饰、氟代修饰和硫代磷酸酯基连接等。本发明所述Y嵌入的序列包括但不限于：Y嵌入的siRNA、Y嵌入的正义链和Y嵌入的反义链。
本发明所述的缀合基团包括药学上可接受的缀合基团，一般来说，药学上可接受的缀合基团包含药学上可接受的靶向分子和任选的接头(linker)。示例性的缀合基团、接头、靶向分子的种类可参见WO2015006740A2和CN114555188A的公开内容。示例性的缀合基团包括但不限于本发明所述的L96、NAG37或DAW40007-4。
除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。
本发明所述双链siRNA缀合物是双链siRNA和药学上可接受的缀合基团连接形成的化合物，并且双链siRNA和药学上可接受的缀合基团共价连接。
在本发明中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本发明中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的双链siRNA或其缀合物或其盐不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
在本文中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物、RNAi试剂或siRNA给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述RNAi试剂、siRNA或siRNA缀合物的药物给予有需要的个体。
如无特别说明，在本发明上下文中，大写字母C、G、U、A表示天然核苷酸的碱基组成；小写字母c、g、u、a分别表示其相应大写字母所代表的核苷酸上的核糖2位被甲氧基修饰；大写字母下面的下划线表示该字母所代表的核苷酸上的核糖2位被氟修饰；间隔号“●”表示与间隔号“●”左右相邻的两个核苷酸残基之间为硫代磷酸酯基连接，如核苷酸残基之间无“●”，则表示核苷酸残基之间是通过磷酸酯基链接例如，“g●u"表示g和u残基之间通过硫代磷酸酯基连接，“gu"表示g和u残基之间通过磷酸酯基连接；Agn为腺苷-乙二醇核酸(Glycol nucleic acid，GNA，)；双链siRNA中的Y表示其中，本发明所述的核糖2位被氟修饰是指核糖2位的羟基被F替换；所述的核糖2位被甲氧基修饰是指核糖2位的羟基被甲氧基替换。
在本发明上下文中，Bz表示苯甲酰基；MMTr表示4’-甲氧基三苯甲基；DMTr表示4’,4’-二甲氧基三苯基甲基。
本发明中，“磷酸酯基团”、“磷酸酯基”、“磷酸酯键”可互换使用，包括磷酸一酯基、磷酸二酯基或磷酸三酯基。“硫代磷酸酯基团”中的“磷酸酯基团”也具有同样的含义。若无特别说明，天然核苷酸间磷酸酯基为磷酸二酯基。如无特殊说明，本发明所述的Y替换了一或多个核苷酸残基的序列，是指1个Y对应替换1个核苷酸残基，而非1个Y替换2个或以上核苷酸残基，如果是替换2个核苷酸残基则应当是2个Y分别替换2个核苷酸残基。如，反义链包含在如SEQ ID NO：40所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，则应当是表示，反义链包含在如SEQ ID NO：40所示的序列中使用0个、1个、2个、3个、4个或5个Y分别替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列。
术语“氧代”指＝O基团。例如，碳原子与氧原子通过双键连接，其中形成酮或醛。
如本文所使用，“化学修饰”或“修饰”意指当与天然存在的对应物相比时具有化学差异的结构，包括经化学手段的所有改变，例如化学部分的添加或去除，或以一个化学部分取代另一个化学部分。
本发明化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本发明含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
可以通过手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本发明还包括一些与本文中记载的那些相同的，但一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数的原子置换的同位素标记的本发明化合物。可结合到本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、123I、125I和36Cl等。
除另有说明，当一个位置被特别地指定为氘(D)时，该位置应理解为具有大于氘的天然丰度(其为0.015％)至少1000倍的丰度的氘(即，至少10％的氘掺入)。示例中化合物的具有大于氘的天然丰度可以是至少1000倍的丰度的氘、至少2000倍的丰度的氘、至少3000倍的丰度的氘、至少4000倍的丰度的氘、至少5000倍的丰度的氘、至少6000倍的丰度的氘或更高丰度的氘。本发明还包括各种氘化形式的式(I)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(I)化合物。在制备氘化形式的式(I)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
本发明所述的缀合基团可以增强治疗剂向诸如人或动物的对象内特定靶位置(例如，特定器官或组织)的递送。在本发明的一些实施方式中，所述缀合基团可以增强表达抑制性双链siRNA的靶向递送。在本发明的一些实施方式中，所述缀合基团可以增强表达抑制性双链siRNA向肝脏的递送。
本发明所述的缀合基团可以直接或间接地连接至化合物，诸如治疗剂，例如，表达抑制性寡聚核苷酸，例如，表达抑制性寡聚核苷酸的3’或5’末端。在本发明的一些实施方式中，表达抑制性寡聚核苷酸包括一个或多个修饰的核苷酸。在本发明的一些实施方式中，表达抑制性寡聚核苷酸是RNAi试剂，诸如包含正义链和反义链的双链siRNA试剂。在本发明的一些实施方式中，本发明所公开的缀合基团连接至双链siRNA试剂的正义链的3’末端。在一些实施方式中，本发明所公开的缀合基团经由磷酸酯、硫代磷酸酯或膦酸酯基团在双链siRNA试剂正义链3’末端与表达抑制性寡聚核苷酸试剂连接。
本发明中立体化学的定义和惯例的使用通常参考以下文献：S.P.Parker,Ed.,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,NewYork；and Eliel,E.and Wilen,S.,"Stereochemistry of Organic Compounds",JohnWiley&Sons,Inc.,New York,1994.本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但绝不限于，非对映异构体，对映异构体，阻转异构体，和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀D、L或R、S用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或(+)、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，(-)或l是指化合物是左旋的，前缀(+)或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体，异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50：50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。
术语“互变异构体”或“互变异构的形式”是指不同能量的结构的同分异构体可以通过低能垒互相转化。例如质子互变异构体(即质子转移的互变异构体)包括通过质子迁移的互变，如酮-烯醇和亚胺-烯胺的同分异构化作用。
术语“组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上可药用的盐或前体的药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“可药用赋形剂”或“药学上可接受的赋形剂”包括但不限于任何已经被美国食品和药物管理局批准对于人类或家畜动物使用可接受的任何助剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增香剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
如无特殊说明，本发明的“化合物”、“配体”、“核酸缀合物”、“双链siRNA缀合物”、“双链siRNA”、“核酸”均可独立地以盐、混合盐或非盐(例如游离酸或游离碱)的形式存在。当以盐或混合盐的形式存在时，其可为药学上可接受的盐。
术语“可接受的盐”包括可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。“可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过本领域已知的方法制备。
“药学上可接受的碱加成盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐，优选钠盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺类、仲胺类及叔胺类，被取代的胺类，包括天然的被取代胺类、环状胺类及碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。这些盐可通过本领域已知的方法制备。
像本发明所描述的，本发明的化合物可以任选地被一个或多个取代基所取代，如上面的通式化合物，或者像实施例里面特殊的例子，子类，和本发明所包含的一类化合物。一般而言，术语“取代的”，表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个任选的取代基团可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不止一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。
另外，需要说明的是，除非以其他方式明确指出，在本文中通篇采用的描述方式“各…和…独立地为”、“…和…各自独立地为”和“…和…分别独立地为”可以互换，应做广义理解，其既可以是指在不同基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
在本发明中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-6烷基”特别指独立公开的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
本发明使用的术语“烷基”包括1-20个碳原子饱和直链或支链的单价烃基，其中烷基可以独立任选地被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。其中一些实施例是，烷基基团含有1-12个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-10个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-8个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-6个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-4个碳原子，另外一些实施例是，烷基基团含有1-3个碳原子。烷基基团更进一步的实例包括，但并不限于，甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)、异丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)、正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基丙基或异丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)、1-甲基丙基或仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)、叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)、正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)、正庚基、正辛基、正壬基、正葵基，等等。
术语“烷氧基”表示烷基基团通过氧原子与分子其余部分相连，其中烷基基团具有如本发明所述的含义。除非另外详细说明，所述烷氧基基团含有1-12个碳原子。在一些实施方案中，烷氧基基团含有1-8个碳原子；在另一些实施方案中，烷氧基基团含有1-6个碳原子；在另一些实施方案中，烷氧基基团含有1-4个碳原子；在又一些实施方案中，烷氧基基团含有1-3个碳原子。所述烷氧基基团可以任选地被一个或多个本发明描述的取代基所取代。
烷氧基基团的实例包括，但并不限于，甲氧基(MeO、-OCH3)、乙氧基(EtO,-OCH2CH3)、1-丙氧基(n-PrO,n-丙氧基,-OCH2CH2CH3)、2-丙氧基(i-PrO,i-丙氧基,-OCH(CH3)2)、1-丁氧基(n-BuO,n-丁氧基,-OCH2CH2CH2CH3)、2-甲基-l-丙氧基(i-BuO,i-丁氧基,-OCH2CH(CH3)2)、2-丁氧基(s-BuO,s-丁氧基,-OCH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙氧基(t-BuO,t-丁氧基,-OC(CH3)3)、1-戊氧基(n-戊氧基,-OCH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊氧基(-OCH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊氧基(-OCH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁氧基(-OC(CH3)2CH2CH3)，3-甲基-2-丁氧基(-OCH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-l-丁氧基(-OCH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-l-丁氧基(-OCH2CH(CH3)CH2CH3)等等。
术语“烯基”表示含有2-12个碳原子，或2-8个碳原子，或2-6个碳原子，或2-4个碳原子的直链或支链的一价、二价或多价烃基，其中至少有一个位置的C-C为sp2双键，其中烯基的基团可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代，包括有“顺”、“反”或"Z"、"E"异构体，其中具体的实例包括，但并不限于，乙烯基(-CH＝CH2)，丙烯基(-CH＝CHCH3)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)等等，其中所述烯基基团可以独立地未被取代或被一个或多个本发明所描述的取代基所取代。
术语“M-M1个环原子组成的”表示所述环状基团由M-M1个环原子所组成，所述的环原子包括碳原子和/或O、N、S、P等杂原子。例如，“3-6个环原子组成的杂环基”代表其包括3、4、5或6个环原子组成的单杂环基。
术语“杂环基”是指包含3-12个环原子的，非芳香族的饱和或部分不饱和的单环、双环或三环体系，其中至少一个环原子选自氮、硫或氧原子。其中，所述杂环基基团可以任选地被一个或多个本发明描述的取代基所取代。除非另外说明，杂环基可以是碳基或氮基，且-CH2-基团可以任选地被-C(＝O)-或-C(＝S)-替代。环的硫原子可以任选地被氧化成S-氧化物。环的氮原子可以任选地被氧化成N-氧化物。在一些实施方案中，杂环基为3-12个环原子组成的杂环基，在一些实施方案中，杂环基为5-10个环原子组成的杂环基，在一些实施方案中，杂环基为3-6个环原子组成的杂环基，在一些实施方案中，杂环基为4-6个环原子组成的杂环基，在一些实施方案中，杂环基为5-6个环原子组成的杂环基，在另一些实施方案中，杂环基为4个原子组成的杂环基，是指包含4个环原子的单价或多价的，饱和或部分不饱和的，非芳香性的单环，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。在另一些实施方案中，杂环基为5个原子组成的杂环基，是指包含5个环原子的单价或多价的，饱和或部分不饱和的，非芳香性的单环，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。在另一些实施方案中，杂环基为6个原子组成的杂环基，是指包含6个环原子的单价或多价的，饱和或部分不饱和的，非芳香性的单环，其中至少一个环原子选自氮、硫和氧原子。“杂环基”同样也包括杂环基团与饱和或部分不饱和环或杂环稠合所形成的基团。杂环的实例包括，但并不限于，吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、高哌啶基、环氧丙基、氮杂环庚基、氧杂环庚基、硫杂环庚基、氧氮杂卓基、二氮杂卓基、硫氮杂卓基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己基、1,3-二氧戊基、吡唑啉基、二噻烷基、二噻茂烷基、二氢噻吩基、吡唑烷基咪唑啉基、咪唑烷基、1,2,3,4-四氢异喹啉基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、氮杂双环[2.2.2]己基、3H-吲哚基喹嗪基和N-吡啶基尿素。杂环基团的实例还包括，1,1-二氧代硫代吗啉基，其中环上碳原子被氧代(＝O)取代的实例实例包括，但不限于嘧啶二酮基、1,2,4-噻二唑-5(4H)-酮基，1,2,4-噁二唑-5(4H)-酮基，1H-1,2,4-三唑-5(4H)-酮基等，其中环上碳原子被基团＝S所取代的实例包括，但不限于1,2,4-噁二唑-5(4H)-硫酮基，1,3,4-噁二唑-2(3H)-硫酮基等。
术语“杂原子”表示一个或多个O、S、N、P和Si，包括N、S和P任何氧化态的形式；伯、仲、叔胺和季铵盐的形式；或者杂环中氮原子上的氢被取代的形式，例如，N(像3,4-二氢-2H-吡咯基中的N)，NH(像吡咯烷基中的NH)或NR(像N-取代的吡咯烷基中的NR，其中，R表示本发明所述的取代基)。
术语“烷硅基”和“烷基硅基”表示甲硅基(-SiH3)基团中的氢原子分别独立地被1个、2个或3个烷基基团所取代。其中，一些实施方案是，烷基硅基是1个、2个或3个C1-12烷基连接到硅原子上形成的较低级的烷基硅基基团。在另一些实施方案中，烷硅基是1个、2个或3个C1-9烷基连接到硅原子上形成的较低级的烷基硅基基团。在另一些实施方案中，烷硅基是1个、2个或3个C1-6烷基连接到硅原子上形成的较低级的烷基硅基基团。在另一些实施方案中，烷硅基是1个、2个或3个C1-4烷基连接到硅原子上形成的较低级的烷基硅基基团。还在另外一些实施方案中，烷硅基是1个、2个或3个C1-3烷基连接到硅原子上形成的较低级的烷基硅基基团。合适的烷硅基基团可以是单烷基硅基、二烷基硅基或三烷基硅基，烷硅基的实例包括，但并不限于，三甲基硅基(-Si(CH3)3)、三乙基硅基(-Si(CH2CH3)3)、三正丙基硅基(-Si(CH2CH2CH3)3)等等。
术语“羟基保护基”是指一个不稳定的化学部分，它在一个或多个合成程序过程中保护羟基基团不发生不希望的反应。在该一个或多个合成程序后，该羟基保护基可被选择性地去除。本领域中已知的羟基保护基总体上描述于T.H.格林(Greene)和P.G.M.伍兹(Wuts)，有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，第3版，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约(1999)中。本发明羟基保护基的例子包括但不限于C1-12烷基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、甲氧羰基、叔-丁氧基羰基、异丙氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2-糠基氧基羰基、烯丙氧羰基、乙酰基(Ac或-C(O)CH3)、甲酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基(Bz或-C(O)C6H5)、C1-10烷基(甲基，叔丁基等)、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、C6-10芳基C1-4烷基(如苄基，苯乙基等)、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基(triphenylmethyl或trityl)、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-10烷硅基(如三甲基甲硅烷基(TMS或-Si(CH3)3))、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、MMTr、DMTr或4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基等。
术语“氨基保护基”是指在合成程序过程中保护氨基基团不发生不希望的反应的不稳定化学部分。在该一个或多个合成程序后，如此处所述的氨基保护基可被选择性地去除。本领域中已知的氨基保护基总体上描述于T.H.格林(Greene)和P.G.M.伍兹(Wuts)，有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，第3版，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约(1999)中。氨基保护基的实例包括但不限于乙酰基、叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基以及苄氧基羰基等。
术语“固相支持体”具体表示在其上可发生寡核苷酸合成的任何颗粒、珠或表面。例如无机固相支持体和有机固相支持体，均可选择用于在本发明实施例中。无机固相支持体优选地选自硅胶和可控微孔玻璃珠(Controlled-pore glass，简称CPG)。有机固相支持体为树脂，优选大孔树脂，更优选高度交联的聚苯乙烯、Tentagel(由低交联的聚苯乙烯基质组成的接枝共聚物，聚乙二醇(PEG或POE)接枝于其上)、聚乙烯乙酸酯(PVA)、波罗斯(Poros)-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物、氨基聚乙二醇和纤维素等。本发明的优选实施例利用基于CPG的固相支持体。许多其他可购买的固相支持体均属于本发明。
附图说明
附图1显示了本发明化合物DAW30227(即双链siRNA缀合物S146)、对照化合物DAW30025(即双链siRNA缀合物S149)和溶媒对照组(生理盐水)在HBV-Tg小鼠模型实验中对HBsAg的抑制效果。其中，附图中的SD表示单次给药(singledose)。
附图2显示了本发明化合物DAW30335(即双链siRNA缀合物S147)、对照化合物DAW30025(即双链siRNA缀合物S149)、DAW30336(即siRNA缀合物S151)和溶媒对照组(生理盐水)在AAV小鼠模型实验中对HBsAg的抑制效果。
本发明化合物的详细描述
本发明提供了一种新的靶向化合物，该靶向化合物可用于制备将寡核苷酸靶向递送至肝脏的核酸药物。本发明的还提供了一种核苷酸缀合物、其制备方法及应用，该核苷酸缀合物具有较高的体内递送效率、较好的稳定性、肝细胞中较高的基因表达抑制活性和/或较低的毒性。再一方面，本发明还进一步提供了一种siRNA试剂、其制备方法及应用，该siRNA试剂具有较高的体内递送效率、较好的稳定性、HBV中具有较高的基因表达抑制活性和/或较低的毒性。
本发明的目的在于提供一种新型的双链siRNA、其缀合物、其盐及它们的用途，具体涉及本发明所述双链siRNA及其缀合物在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎疾病的药物中的用途。另外，本发明还涉及一种新型的化合物，以及所述化合物在DNA核苷酸固相合成的原料、siRNA药物的合成原料、siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的用途，尤其是在作为本发明所述双链siRNA药物的合成原料的用途。并且，本发明还涉及一种新型的核苷酸残基，以及其在siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的用途，以及作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用。本发明所述双链siRNA及其缀合物对HBV具有较高的基因表达抑制活性和/或较低的毒性。
一方面，本发明涉及一种双链siRNA、其缀合物或其盐，所述双链siRNA包括一条正义链和一条反义链，其中，所述双链siRNA包含一个或多个Y(即，本发明所述双链siRNA包含至少一个Y)，所述Y为除非特别说明，本发明所述双链siRNA中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。任选地，所述Y可以在所述双链siRNA的任意位置。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述双链siRNA包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个Y。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述双链siRNA包含1、2、3、4或5个Y。任选地，所述Y可以在所述双链siRNA的任意位置。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中的正义链包含至少一个(例如，1、2、3、4或5个)Y。任选地，所述Y可以在所述正义链的任意位置。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中的反义链包含至少一个(例如，1、2、3、4或5个)Y。任选地，所述Y可以在所述反义链的任意位置。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中，正义链包含0个或至少一个(例如，1、2、3、4或5个)Y，反义链包含至少一个(例如，1、2、3、4或5个)Y。任选地，所述Y可以在所述正义链或反义链的任意位置。
在本发明所述的双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，本发明所述的双链siRNA的反义链的长度不超过30个核苷酸。优选地，本发明所述的双链siRNA的反义链的长度不超过23个核苷酸。更优选地，本发明所述的双链siRNA的反义链的长度不超过21个核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，本发明所述的双链siRNA的正义链的长度不超过30个核苷酸。优选地，本发明所述的双链siRNA的正义链的长度不超过23个核苷酸。更优选地，本发明所述的双链siRNA的正义链的长度不超过19或21个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述反义链包含如5’-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3’(SEQ ID NO:40)所示的序列，或在如SEQ ID NO:40所示序列中使用Y替换了一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)核苷酸残基的序列；其中，所述反义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。任选地，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:40所示序列的任意位置，
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述正义链包含如5’-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3’(SEQ ID NO:20)所示的序列，或在如SEQ ID NO:20所示序列中使用Y替换了一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)核苷酸残基的序列；其中，其中，所述正义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述正义链的长度不超过23个核苷酸。任选地，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:20所示序列的任意位置。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述反义链包括在如5’-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3’(SEQ ID NO:40)所示序列中使用Y替换了一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)核苷酸残基的序列；所述正义链包含如5’-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3’(SEQ ID NO:20)所示的序列，或在如SEQ ID NO:20所示序列中使用Y替换了一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)核苷酸残基的序列；其中，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:40或SEQ IDNO:20所示序列的任意位置，所述反义链和正义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中的正义链或反义链的70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的核苷酸和Y都是经修饰的。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中的正义链和反义链的70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的核苷酸和Y都是经修饰的。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA中的每一个核苷酸和Y都是经修饰的。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中所述修饰选自以下中的至少之一：2’-甲氧基修饰(即核糖2位的羟基被甲氧基替换)、2’-甲氧基乙基修饰(即核糖2位的羟基被甲氧基乙基替换)、2’-氟代修饰(即核糖2位的羟基被F基替换)、硫代磷酸酯基连接、2’-脱氧修饰、2’-氨基修饰(即核糖2位的羟基被氨基替换)、锁核酸修饰、解锁核酸修饰、乙二醇核酸修饰和5’-乙烯基磷酸酯修饰。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述正义链包含在如SEQ ID NO:20所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中所述正义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述正义链包含在如SEQ ID NO:20所示的序列中使用Y替换了1个核苷酸残基的序列。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，反义链包含在如SEQ ID NO:40所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中所述反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述反义链包含在如SEQ ID NO:40所示的序列中使用Y替换了1个核苷酸残基的序列。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:20所示序列的5’端的第1位～第19位(即所述Y替换任选地发生在SEQ IDNO:20所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位)。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:40所示序列的5’端的第1位～第21位(即所述Y替换任选地发生在SEQ IDNO:40所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21位)。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，其中，所述正义链包含如5’-g●u●guGcACUucgcuucaca-3’(SEQ ID NO:19)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，所述正义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在所述SEQ ID NO:19的5’端的第1位～第19位(即所述Y替换任选地发生在如SEQ ID NO:19所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位)，所述正义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述反义链包含如5’-u●G●ugaAgCGaaguGcAcac●u●u-3’(SEQ ID NO:36)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，所述反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在所述反义链SEQ ID NO:36的5’端的第1～第21位(即所述Y替换任选地发生在如SEQ ID NO:36所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位)，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述反义链包含在如5’-u●G●uga(Agn)gCGaaguGcAcac●u●u-3’(SEQ ID NO:33)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:33所示序列5’端的第1～第21位((即所述Y替换任选地发生在如SEQ ID NO:33所示序列5’端的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19位))，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
如无特别说明，在本发明上下文中，寡核苷酸或者siRNA中的大写字母C、G、U、A表示天然核苷酸的碱基组成；小写字母c、g、u、a分别表示其相应大写字母所代表的核苷酸上的核糖2位被甲氧基修饰；大写字母下面的下划线表示该字母所代表的核苷酸上的核糖2位被氟修饰；Agn为腺苷-乙二醇核酸；间隔号“●”表示与间隔号“●”左右相邻的两个核苷酸残基之间为硫代磷酸酯基连接。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链包含以下核苷酸序列之一：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21；
所述正义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，所述反义链包含以下核苷酸序列中的之一：
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；
所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述双链siRNA包含以下之一：
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸；或
具有包含SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各种独立地不超过23个核苷酸。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA选自表1中的S1至S143之一。在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的另一些实施例中，所述双链siRNA的缀合物选自表1中的S146、S147和S150。
表1
其中，大写字母C、G、U、A表示天然核苷酸的碱基组成；小写字母c、g、u、a分别表示其相应大写字母所代表的核苷酸上的核糖2位被甲氧基修饰；大写字母下面的下划线表示该字母所代表的核苷酸上的核糖2位被氟修饰；间隔号“●”表示与间隔号“●”左右相邻的两个核苷酸残基之间为硫代磷酸酯基连接；Agn为腺苷-乙二醇核酸(Glycol nucleicacid，GNA)；双链siRNA中的Y表示
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA缀合物包含所述双链siRNA和缀合基团，即，所述双链siRNA缀合物为所述双链siRNA与缀合基团缀合后的缀合物，其中所述缀合基团包括但不限于L-96或DAW40007-4，所述L-96和DAW40007-4的结构分别为：
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述缀合基团与双链siRNA的正义链的3’末端或5’末端缀合。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述缀合基团与双链siRNA的正义链的3’末端缀合。
在本发明的所述双链siRNA、其缀合物或其盐的一些实施例中，所述双链siRNA通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或磷酸基团与所述缀合基团链接。
在本发明的所述双链siRNA，其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA的正义链的3’末端或5’末端通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或磷酸基团与所述缀合基团链接。
另一方面，本发明还涉及一种核苷酸残基Y，其结构为：
另一方面，本发明还涉及一种化合物，其具有如式(I)所示的结构，或如式(I)所示的化合物的立体异构体、互变异构体或可接受的盐，
其中，各R、Z、Y1和R1具有如本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，所述各甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、羟基保护基团、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团、亚磷酸酰胺基团或氢磷酸盐基团，其中，各j和M具有本发明所述的含义。
只要能使本发明所述的化合物参与寡核苷酸合成的任何Y1基团都属于本发明，如磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团、亚磷酸酰胺基团或氢磷酸盐基团等活性的磷酸基团都属于本发明的内容，它们可以通过本发明所述化合物可以通过本领域公开的制备方法得到，如通过硕士毕业论文《核酸的化学合成研究以及4’-C-羟基修饰siRNA的合成及干扰活性测试》第三节记载的磷酸二酯法、磷酸三酯法、氢磷酸法的制备方法获得本申请化合物，再如通过文献kyle W.Knouse等“unlocking P(V):Reagents for chiral phosphorothioatesynthesis”2018.第6-9页所记载的方法制备得到。
本发明所述的磷酸酯包括磷酸二酯和三酯；所述的硫代磷酸酯包括磷酸二酯和三酯；所述的氢磷酸盐基团是指磷酸基团与碱所成盐后的基团。
在本发明所述化合物的一些实施例中，M为固相支持体，优选为羟基或氨基功能化的固相支持体，更优选为树脂或CPG，进一步优选为大孔树脂或CPG，更进一步优选为胺甲基树脂、羟基树脂或-NHCPG；
在本发明所述化合物的一些实施例中，R为-NHR2或-N＝CH-NRaRb；其中。各R2、Ra和Rb具有如本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，R2为氨基保护基团。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Ra和Rb独立地为H或氨基保护基团，或Ra、Rb和与它们所连接的N原子一起形成5-6个环原子组成的杂环基，所述各5-6个环原子组成的杂环基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各j独立地为1、2、3、4或5。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-12烷基、C1-12烷基C(＝O)-、C1-12烷硅基、C6-10芳基C1-6烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、其中，各j、M、X、Rx、Ry、Rc和Rd具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-10烷基、C1-10烷基C(＝O)-、C1-10烷硅基、C6-10芳基C1-4烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、其中，各j、M、X、Rx、Ry、Rc和Rd具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-8烷基、C1-8烷基C(＝O)-、C1-8烷硅基、苯基C1-3烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、其中，各j、M、X、Rx、Ry、Rc和Rd具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-6烷基、C1-6烷基C(＝O)-、C1-6烷硅基、苄基、苯乙基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、其中，各j、M、X、Rx、Ry、Rc和Rd具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，X为Cl或Br。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rx和Ry独立地为羟基保护基团。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rc和Rd独立地为H或氨基保护基团；或Rc、Rd和与它们所连接的N原子一起形成5-6个环原子组成的杂环基，所述5-6个环原子组成的杂环基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代。
在本发明所述化合物的一些实施例中，R2为9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、甲基、叔丁基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、C1-6烷氧基或R3C(＝O)-，其中，R3具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Ra和Rb独立地为独立地为H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或R4C(＝O)-，或Ra、Rb和与它们所连接的N原子一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌啶基和哌嗪基，所述吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基各自独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代，其中，R4具有本发明所述的含义。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各R3和R4独立地为C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-6烷基苯基或苄基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各R3和R4独立地为C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-4烷基苯基或苄基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各R3和R4独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、2,2,2-三氯乙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、1-丁氧基、2-甲基-l-丙氧基、2-丁氧基、叔丁氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-3烷基苯基或苄基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rx和Ry独立地为苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、氰基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷基C(＝O)-、C1-6烷硅基、苯基、卤素取代的苯基、苄基或苯乙基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rx和Ry独立地为苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、CNCH2-、CN(CH2)2-、CNCH(CH3)2CH2-、CN(CH2)3-、CNCH(CH3)2CH2CH2-、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、、C1-4烷基C(＝O)-、C1-4烷硅基、苯基、卤素取代的苯基、苄基或苯乙基。
在本发明所述化合物的一些实施例中，各Rc和Rd独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或R4C(＝O)-，或Rc、Rd与其所连接的N原子一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基，所述吡咯烷基、吗啉基、哌啶基和哌嗪基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代。
在本发明所述化合物的一些实施例中，本发明所述化合物具有如式(II)所示的结构，
在本发明的另一方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，和药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，本发明还涉及本发明所述的siRNA缀合物、其缀合物和本发明所述所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎疾病的药物中的用途。
在本发明的另一方面，本发明还涉及本发明所述的核苷酸残基在作为用于siRNA的药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的应用，所述核苷酸残基的结构为：
在本发明所述的核苷酸残基应用的一些实施例中，所述siRNA药物为本发明所述的双链siRNA药物。
在本发明的另一方面，本发明还涉及本发明所述的化合物在DNA核苷酸固相合成的原料、寡核苷酸药物的合成原料、siRNA药物的合成原料、siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的应用。
在本发明的再一方面，本发明还涉及本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用，其中，所述寡聚核苷酸是含有10～50个核苷酸或核苷酸碱基对的核苷酸序列，且所述寡聚核苷酸能够抑制或阻断基因的表达，所述核苷酸残基的结构为：
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述基因为HBV基因。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述寡聚核苷酸为siRNA。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述siRNA包括正义链和反义链。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述核苷酸残基仅嵌入到所述siRNA的正义链上。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述核苷酸残基仅嵌入到所述siRNA的反义链上。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述核苷酸残基嵌入到所述siRNA的正义链和反义链上。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述siRNA的正义链包含如SEQ ID NO:19所示的序列。
在本发明所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用的一些实施例中，其中，所述siRNA的反义链包含如SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:33所示的序列。
另一方面，本发明还了提供了一种抑制患者体内肝细胞中特定基因的表达的方法，其包括向患者给予本发明双链siRNA和双链siRNA缀合物或其组合物，所述核酸配体缀合物或其组合物可为治疗有效量。本发明的核酸缀合物、核酸缀合物的制剂、给药和治疗疾病方法
本发明所述的核酸缀合物(如siRNA缀合物或药物组合物)的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，例如按照每天四次、每天三次、每天两次、每天一次或每隔一天一次的剂量施用，或每天给予若干次剂量可按比例地减少施用。
可通过本领域己知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)，优选静脉注射内给药。
本发明公开的药物组合物包括适于胃肠外施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂型形式存在并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。可以与辅料物质组合来制备单剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗作用的siRNA的量。一般而言，以百分之一为单位，该量为约1％至约99％活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种抑制乙型肝炎病毒基因的表达或活性的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前述的siRNA、前述的siRNA缀合物或前述的药物组合物与细胞进行接触。如前所述，前述的siRNA和siRNA缀合物均可使乙型肝炎病毒的mRNA降解，抑制HBV的表达和复制。因此，本发明的方法可用于抑制乙型肝炎病毒基因的表达或活性。例如可于动物体内抑制乙型肝炎病毒基因的表达或活性；或者为非疾病治疗目的抑制乙型肝炎病毒基因的表达或活性，例如在体外抑制乙型肝炎病毒基因的表达或活性，以进行后续研究。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种预防和/或治疗乙型肝炎病毒引起的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向受试者施用药学上可接受量的前述的siRNA、前述的siRNA缀合物或前述的药物组合物。根据本发明的实施例，该方法可有效预防和/或治疗乙型肝炎病毒引起的相关疾病。
本发明所述化合物、双链siRNA、双链siRNA缀合物的一般合成方法
一般地，本发明的化合物、核酸缀合物可以通过本发明所描述的方法制备得到，除非有进一步的说明，其中取代基的定义如式(I)和(II)所示。下面的反应方案和实施例用于进一步举例说明本发明的内容。
下面所描述的实施例，除非其他方面表明，所有的温度定为摄氏度(℃)。色谱柱使用硅胶柱，硅胶(200-300目)购于青岛海洋化工厂，NH2CPG都是购置于河北迪纳兴科。核磁共振光谱以CDC13、DMSO-d6、CD3OD或丙酮-d6为溶剂(以ppm为单位)，用TMS(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰)，d(doublet，双峰)，t(triplet，三重峰)，m(multiplet，多重峰)，br(broadened，宽峰)，dd(doublet of doublets，双二重峰)，dt(doublet of triplets，双三重峰)，br.s(broadened singlet，宽单峰)，q(四重峰)。偶合常数J，单位用赫兹(Hz)表示。
低分辨率质谱(MS)数据通过配备G1312A二元泵和a G1316A TCC(柱温保持在30℃)的Agilent6320系列LC-MS的光谱仪来测定的，G1329A自动采样器和G1315B DAD检测器应用于分析，ESI源应用于LC-MS光谱仪。
高分辨率质谱(MS)数据通过配备G1311A四元泵和G1316A TCC(柱温保持在30℃)的Agilent 6130系列LC-MS的光谱仪来测定的，G1329A自动采样器和G1315D DAD检测器应用于分析，ESI源应用于HR-MS光谱仪。
下面简写词的使用贯穿本发明：
EDCI 1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺 EDCI 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺
HOBT 1-羟基苯并三唑 EA 乙酸乙酯
TFA 三氟乙酸 HOBT 1-羟基苯并三唑
Py 吡啶 DMAP 4-二甲氨基吡啶
PE 石油醚 MsCl 甲磺酰氯
ACN 乙腈 TMSOTf 三氟甲磺酸三甲基硅酯
Ac2O 乙酸酐 THF 四氢呋喃
Boc 叔丁氧羰基 mL 毫升
MeOH 甲醇 min 分钟
DMSO 二甲亚砜 M,N,mol/L 摩尔/升
DMF N,N-二甲基甲酰胺 h 小时
DCM 二氯甲烷 RT,rt 室温
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。尤其是小核酸的合成和核酸缀合物的合成，是可以根据本发明的实施例或本领域的常规调整合成得到。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明所述化合物的合成方法
以下合成方案列出了制备本发明中公开化合物的一般实验步骤，包括本领域技术人员根据实际情况可做适当方法的修改或原料的调整即可制备得到本发明所述化合物。其中，各R1和R具有如本发明所述的含义；其中，Z1为羟基保护基团，Y2为M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团、亚磷酸酰胺基团或氢磷酸盐基团，其中M具有本发明所述的含义。除非特别说明，本发明所述的化合物可以通过以下合成方案描述的方法制备得到。
合成方案1：
化合物(1-C)可参考合成方案1的制备方法得到，首先，化合物(1-A)经羟基保护基团保护，得到化合物(1-B)，化合物(1-B)与合适的磷酸试剂或固相支持体反应，得到含活性的磷酸基团或固相支持体的化合物(1-C)。化合物(1-C)的立体异构体同样可以参考合成方案1的制备方法得到。
制备实施例
在以下制备实施例中，发明人以本发明的部分化合物为例，详细描述了本发明化合物的制备过程，其中，为CPG。
实施例1：单体的合成
步骤1:化合物1-2的合成
将(2R,3R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-甲腈(即化合物1-1)(1.0g,3.43mmol)加入到吡啶(15mL)中，混合物氮气保护，降至-5℃，再滴加1,3二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(1.13mL,3.53mmol)，加完后，反应混合物升温至25℃搅拌反应20h。反应液减压浓缩除去溶剂，残余物经硅胶柱层析分离纯化(淋洗剂：PE/EA(v/v)＝2/3)，得白色固体化合物1-2(1.38g,75.3％)，MS(ESI,pos.ion)m/z:534.3[M+H]+.
步骤2:化合物1-3的合成
将化合物1-2(1.08g,2.02mmol)和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(0.48g,4.04mmol)加入到甲苯(15mL)中，升温至50℃搅拌反应4h。反应完后，减压浓缩，得化合物1-3，为白色泡沫状固体(1.19g,100％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:589.3[M+H]+；1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ8.95(s,1H),8.15(s,1H),6.90(d,J＝4.4Hz,1H),6.80(d,J＝4.5Hz,1H),6.49(d,J＝5.7Hz,1H),4.58(dd,J＝5.7,4.4Hz,1H),4.23–4.12(m,3H),3.92(dd,J＝13.2,2.5Hz,1H),3.25(s,3H),3.19(s,3H),1.06–1.04(m,7H),1.01(dd,J＝7.2,2.0Hz,6H),0.96(dd,J＝8.8,7.0Hz,8H),0.89(t,J＝7.6Hz,7H).
步骤3:化合物1-4的合成
将化合物1-3(0.84g,1.43mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，降温至0℃，然后依次加入碘甲烷(0.41g,2.86mmol)和氢化钠(0.11g,2.86mmol,60％)，0℃下搅拌反应20min。反应完后，将反应液倒入饱和NH4Cl溶液中，用EA萃取，浓缩有机相，残留物经硅胶柱层析分离(EA/PE(v/v)＝1/1)纯化，得化合物1-4，为白色固体(0.71g，83％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:603.40[M+H]+.
步骤4:化合物1-5的合成
将化合物1-4(5.1g,8.46mmol)、四氢呋喃(50mL)和四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(9.48mL,9.48mmol,1M)混合，室温搅拌反应。反应完后，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析分离(MeOH/DCM(v/v)＝1/20)纯化，得白色固体化合物1-5(2.4g,79％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:361.3[M+H]+.
步骤5:化合物1-6的合成
将化合物1-5(2.4g,6.66mmol)、二氯甲烷(50mL)、三乙胺(2.02g,19.98mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.081g,0.67mmol)混合，然后降温至0℃，再分批加入4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(2.71g,7.99mmol)。所得反应混合物升至室温搅拌反应3h。降温至0℃，分两次共加入4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(1.35g)，在0℃下，继续搅拌反应2h。反应体系加入MeOH(1mL)和DCM(100mL)稀释，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱纯化(EA/PE(v/v)＝2/1)，得到浅黄色固体化合物1-6(4.0g,91％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:663.7[M+H]+.
步骤6:化合物1的合成
将化合物1-6(2.0g,3.02mmol)和1H-四氮唑(0.25g,3.62mmol)加入到二氯甲烷(40mL)中，氮气保护，再滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(1.92mL,6.04mmol)，室温搅拌反应4h。反应完后，加入DCM(20mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10mL)，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(EA/PE(v/v)＝4/1)纯化，得到化合物1(2.13g,82％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:864.9[M+H]+；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(s,1H),8.00(d,J＝12.0Hz,1H),7.45–7.39(m,2H),7.34–7.28(m,4H),7.22(qd,J＝7.6,6.4,3.5Hz,3H),7.02(dd,J＝6.8,4.5Hz,1H),6.92(dd,J＝4.6,3.1Hz,1H),6.78(td,J＝8.5,4.4Hz,4H),4.93(dd,J＝25.0,5.0Hz,1H),4.64–4.43(m,2H),4.05–3.88(m,2H),3.79(dd,J＝3.7,2.4Hz,6H),3.60(d,J＝6.3Hz,4H),3.48(dd,J＝10.5,3.6Hz,1H),3.27(s,3H),3.24(s,3H),2.66(d,J＝6.4Hz,1H),2.06(s,1H),1.28(t,J＝7.1Hz,2H),1.19(dd,J＝6.8,4.1Hz,8H),1.04(d,J＝6.8Hz,4H).
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ150.01,149.80.
实施例2：载体(化合物DAW40007-3)的合成
步骤1：化合物2-2的合成
将化合物2-1(2.50g,28.05mmol)和三乙胺(7.8mL,56.1mmol)溶于DCM(120mL)中，0℃条件下滴加氯甲酸苄酯(9.57g,56.1mmol)。加完后，反应混合物升至室温搅拌20h，加入饱和氯化铵溶液(50mL)稀释，分液，弃去水相，浓缩有机相，所得残留物经硅胶柱层析分离(MeOH/DCM(V/V)＝1/30)纯化，得白色固体化合物2-2(2.96g,47.2％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:224.2[M+H]+；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(d,J＝4.2Hz,5H),5.11(s,2H),5.00(s,1H),4.19–4.14(m,1H),3.70–3.64(m,2H),3.24(t,J＝6.4Hz,2H),3.15(q,J＝4.6Hz,1H),1.90(dq,J＝14.2,5.0,4.3Hz,2H),1.77–1.71(m,1H).
步骤2：化合物2-4的合成
将化合物2-3(1.5g,4.56mmol)和化合物2-2(1.22g,5.47mmol)溶于1,2-二氯乙烷(30mL)中，再加入3A分子筛(2.0g)，室温条件下搅拌10min。再加入TMSOTf(0.51g,2.28mmol)，反应混合物于室温搅拌18h。将反应液倒入饱和碳酸氢钠溶液(100mL)中，然后用DCM(100mL)萃取，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，所得残留物经硅胶柱层析(PE/EA(V/V)＝2/1至0/1)纯化，得到浅棕色油状物化合物2-4(1.8g,71.51％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:553.3[M+H]+.
步骤3：化合物2-5的合成
将化合物2-4(0.57g,1.03mmol)和钯碳(0.11g,0.1mmol,10％)加入到THF(10mL)中，再加入TFA(0.12g,1.03mmol)，随后氢气置换三次，然后在氢气氛围中，于室温下搅拌19h，反应完后，硅藻土过滤，减压蒸干溶剂，得到浅棕色油状化合物2-5(0.55g,100.32％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:419.3[M-TFA+H]+。
步骤4：化合物2-7的合成
将化合物2-6(0.46g,2.29mmol，购买于上海毕得医药科技有限公司)和化合物2-5(1.16g,2.18mmol)溶于DCM(30mL)中，依次加入HOBT(0.46g,3.44mmol)、HBTU(1.30g,3.44mmol)和DIPEA(2.66mL,16.03mmol)，反应混合物于室温反应16h。反应完后，依次加入水(20mL)和DCM(50mL×2)，有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液(30mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，减压蒸干溶剂，所得残留物经硅胶柱层析分离纯化(MeOH/EA(v/v)＝1/20)，得到白色固体2-7(1.0g,收率72.7％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:602.3[M+H]+；
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.39–5.33(m,1H),5.07(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.58(d,J＝8.4Hz,1H),4.21–4.09(m,3H),4.04(t,J＝6.7Hz,1H),3.89(dt,J＝10.4,5.1Hz,1H),3.60–3.50(m,1H),3.30–3.13(m,2H),2.16(s,3H),2.04(s,3H),1.97(s,3H),1.94(s,3H),1.67–1.56(m,4H),1.48(s,9H),1.41–1.37(m,2H),1.02–0.98(m,2H).
步骤5：化合物2-8的合成
将化合物2-7(0.72g,1.17mmol)溶于DCM(8mL)中，然后加入TFA(0.87mL,11.7mmol)，反应混合物于25℃搅拌16h，浓缩溶剂，得棕色油状化合物2-8(0.74g,103.1％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:502.2[M+H]+；
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.36(d,J＝3.3Hz,1H),5.08(dd,J＝11.3,3.3Hz,1H),4.58(d,J＝8.4Hz,1H),4.16–4.10(m,3H),4.08–4.02(m,1H),3.92–3.85(m,1H),3.58–3.50(m,1H),3.26–3.20(m,2H),2.16(s,3H),2.04(d,J＝5.2Hz,6H),1.98(s,3H),1.97(s,3H),1.61–1.56(m,4H),1.54–1.52(m,2H),1.42–1.38(m,2H).
步骤6：化合物2-10的合成
将化合物2-9(0.19g,0.30mmol)和化合物2-8(0.50g,0.99mmol)溶于DCM(30mL)中，然后再依次加入HOBT(0.17g,1.26mmol)、HBTU(0.48g,1.26mmol)和DIPEA(0.5mL,3.0mmol)，反应混合物于30℃搅拌3h。反应完后，加入水(20mL)淬灭反应，再用DCM(100mL×2)萃取，合并有机相，有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液(40mL)和饱和氯化钠溶液(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，所得残留物经硅胶柱层析分离纯化(DCM/MeOH(v/v)＝10/1)，得到白色固体化合物2-10(0.23g,收率37％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:1046.3[M/2+H]+；
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.78(t,J＝5.8Hz,2H),7.38–7.36(m,3H),5.36(d,J＝3.4Hz,3H),5.13(s,2H),5.08(dd,J＝11.2,3.4Hz,3H),4.58(d,J＝8.4Hz,3H),4.21–4.08(m,9H),4.04(t,J＝6.7Hz,3H),3.93–3.82(m,3H),3.73–3.66(m,12H),3.60–3.52(m,3H),3.29–3.18(m,6H),2.52(t,J＝6.0Hz,6H),2.38(t,J＝7.4Hz,2H),2.20(t,J＝7.7Hz,2H),2.16(s,9H),2.04(s,9H),1.97(s,9H),1.95(s,9H),1.62–1.56(m,12H),1.50–1.42(m,6H),1.35–1.27(m,16H),1.04–0.97(m,6H).
步骤7：化合物2-11的合成
将化合物2-10(0.20g,0.094mmol)溶于甲醇(10mL)中，然后加入Pd/C(10mg,10％)，氢气置换三次，反应混合物在氢气氛围中，于室温下搅拌11h。反应完后，反应混合物经硅藻土过滤，所得滤液减压蒸干溶剂，得到白色固体化合物2-11(0.19g,100％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:1001.1[M/2+H]+.
步骤8：化合物DAW40007-1的合成
将化合物2-11(0.28g,0.14mmol)溶于DCM(20mL)中，依次加入HOBT(0.038g,0.28mmol)、HBTU(0.080g,0.21mmol)、DIPEA(0.054g,0.42mmol)和化合物13(0.068g,0.16mmol)，反应混合物于室温搅拌13h，反应完后，加水(10mL)淬灭反应，用DCM(20mL)萃取，有机相用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)洗涤，减压蒸干溶剂，所得残留物用乙腈(10mL)溶解后，经反相制备柱分离(乙腈/水溶液(v/v)＝43％至60％，50min)，向制备分离后的含产物的溶液加入食盐使溶液饱和，分出有机相，水相用乙腈(100mL×2)萃取，合并有机相，合并的有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，残留物加入乙腈(30mL)，再经硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到浅黄色固体化合物DAW40007-1(0.080g,收率24％)。
MS(ESI,neg.ion)m/z:2400.18[M-H]-；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.31(s,3H),7.81(d,J＝9.2Hz,3H),7.57(t,J＝6.0Hz,3H),7.35–7.26(m,4H),7.20(td,J＝8.9,3.0Hz,5H),6.95(s,1H),6.88(ddd,J＝8.8,5.8,2.2Hz,4H),5.22(d,J＝3.4Hz,3H),4.97(dd,J＝11.2,3.5Hz,4H),4.49(d,J＝8.5Hz,3H),4.40(d,J＝4.8Hz,1H),4.15(s,1H),4.07–4.00(m,9H),3.88(dt,J＝11.2,8.8Hz,3H),3.74(s,9H),3.59–3.48(m,12H),3.17(dd,J＝8.8,5.0Hz,1H),3.10–2.95(m,8H),2.35(t,J＝6.3Hz,6H),2.10(s,9H),2.08(s,3H),2.04(d,J＝4.7Hz,2H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.78(s,9H),1.40(d,J＝12.2Hz,17H),1.31–1.16(m,18H),0.79(q,J＝3.2Hz,6H).
步骤9：化合物DAW40007-2的合成
将化合物DAW40007-1(0.080g,0.033mmol)溶于DCM(10mL)中，加入DIPEA(0.029mL,0.17mmol)、丁二酸酐(0.008g,0.083mmol)和DMAP(0.014g,0.12mmol)，40℃搅拌5h，补加丁二酸酐(10mg)，继续反应16h后，补加DCM(10mL)、丁二酸酐(10mg)和DIPEA(0.05mL)，再继续搅拌9h，然后补加丁二酸酐(10mg)，再反应10h后，加入DCM(20mL)稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)洗涤，弃去水相，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，得白色固体化合物DAW40007-2(0.08g,96.07％)。MS(ESI,neg.ion)m/z:2500.12[M-H]-.
步骤10：化合物DAW40007-3的合成
将化合物DAW40007-2(0.08g,0.032mmol)、HBTU(0.015g,0.04mmol)和DIPEA(0.011mL,0.064mmol)溶于ACN(5mL)中，室温搅拌5min。随后转移至含有0.35g H2N-CPG(购置于河北迪纳兴科)的固相合成仪中，震荡22.5h。抽滤，滤饼用DCM/MeOH(V/V＝9/1,10mL)和DCM(10mL)冲洗，并抽干，所得滤饼稀释在25％ Ac2O/Py溶液(5mL)中搅拌反应3h，过滤，滤饼依次用DCM/MeOH(V/V＝9/1,10mL)和DCM(10mL)冲洗，减压抽干，得到白色固体DAW40007-3(0.357g)，测负载量为14.95μmol/g。
本领域公知，DAW40007-4为DAW40007-3进行化学反应后的残基，其通过共价键与 核酸结合。
化合物L96的合成
化合物L96按照专利申请WO2014025805A1记载的方法制备获得。
L96缀合基团结构为：
实施例3：双链siRNA和双链siRNA缀合物的合成
1、未连接缀合基团的双链siRNA的合成
未连接缀合基团的siRNA正义链和反义链的合成步骤如下：
按照理论产量1μmol合成规格完成。称取1μmol规格固相支持物CPG(购置于河北迪纳兴科)所有的2’-修饰的RNA亚磷酰胺单体和辅助试剂均为商品化所得，所有的亚磷酰胺单体以0.1M无水乙腈溶液提供。对于磷酸骨架硫代修饰的寡聚核苷酸以0.1M DDTT溶液作为硫代试剂。5-乙硫基-1H-四唑乙腈溶液(0.25M)作为活化剂(购置于苏州柯乐玛)，0.02M碘的吡啶/水溶液作为氧化剂，以及3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液作为脱保护试剂，放置于KA-H8型号DNA/RNA自动合成仪对应的试剂指定位置。设置合成程序并输入指定的寡聚核苷酸碱基序列。检查无误后，开始循环寡聚核苷酸合成。每步偶合时间为6分钟，硫化时间6分钟。经自动循环后，得到含固相支持物CPG的寡核苷酸。
用干燥氩气吹干上述得到的含固相支持物CPG的核苷酸，然后转移到2mL EP管中，并加入28％氨水溶液(1.8mL)，于55℃加热5～18小时。过滤，用水(0.5mL)洗涤滤饼，合并滤液，减压浓缩后，得到白色或黄色胶状固体。反相制备纯化后，浓缩制备液，过凝胶柱，除去过量盐，得到寡聚核苷酸。所得寡聚核苷酸浓度由微量紫外分光光度计(SPECTRO statNano)测定含量。在Agilent 6530LC-MS Q-Tof系统上，完成质谱检测分析。以一级扫描后，再去卷积后计算核酸分子量。
退火步骤：
将上述合成得到的双链siRNA正义链按等摩尔量与上述合成得到的反义链混合，加热至95℃，控温10min后，缓慢降至室温。随后冻干得目标双链siRNA。
2、siRNA缀合物的合成：
反义链的合成，参考上述未接缀合基团的正义链和反义链合成方法得到。
正义链的合成：将通用固相支持物CPG换为本发明制备得到的缀合基团-固相支持物CPG(如化合物DAW40007-3)，参考反义链合成方法制备得到本发明双链siRNA缀合物的正义链。
退火步骤：
将上述合成得到的双链siRNA缀合物的正义链按等摩尔量与上述合成得到的反义链混合，加热至95℃，控温10min后，缓慢降至室温。随后冻干得目标siRNA缀合物。
上述合成得到的双链siRNA和双链siRNA缀合物见表1-A。
表1-A：本发明合成得到的双链siRNA和双链siRNA缀合物
大写字母C、G、U、A表示天然核苷酸的碱基组成；小写字母c、g、u、a分别表示其相应大写字母所代表的核苷酸上的核糖2位被甲氧基修饰；大写字母下面的下划线表示该字母所代表的核苷酸上的核糖2位被氟修饰；间隔号“●”表示与间隔号“●”左右相邻的两个核苷酸残基之间为硫代磷酸酯基连接；Agn为腺苷-乙二醇核酸(Glycol nucleic acid，GNA)；双链siRNA中的Y表示双链siRNA中的X表示
实施例4本发明核酸或缀合物的细胞活性和细胞毒性测试
采用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养肝癌细胞(Hep AD38)，在5％CO2、37℃恒温培养箱中培养。待肝癌细胞处于对数生长期且状态良好时(70％汇合度)用于实验。于96孔板中每孔种入1.5×104个细胞，24h后按照RNAiMAX转染试剂(赛默飞)说明书分别转染实施例3表1中不同的、一系列浓度的双链siRNA，然后在37℃、5％CO2条件下孵育72h后，使用HBsAg ELISA试剂盒(上海科华)和CCK8试剂盒(DOJINDO)分别检测HBsAg表达量和细胞毒性。本发明双链siRNA试剂对HBsA的抑制活性较好，且明显优于对照S144的HBsA抑制活性。可见本申请所述双链siRNA中，核苷酸残基Y的引入，对双链siRNA的活性有明显的提高作用，并且，本申请所述双链siRNA的细胞毒性小。部分双链siRNA或其缀合物的HBsA抑制活性和细胞毒性结果见表2。
表2：本发明部分双链siRNA或缀合物的抑制活性和细胞毒性结果
其中，大写字母C、G、U、A表示天然核苷酸的碱基组成；小写字母c、g、u、a分别表示其相应大写字母所代表的核苷酸上的核糖2位被甲氧基修饰；大写字母下面的下划线表示该字母所代表的核苷酸上的核糖2位被氟修饰；间隔号“●”表示与间隔号“●”左右相邻的两个核苷酸残基之间为硫代磷酸酯基连接。
实施例6：应用PHH体外感染模型评价抗乙型肝炎病毒(HBV)活性
实验步骤如下
转染加药：第0天，将复苏后的PHH调整到合适密度(6.67E+05cells/ml)，接种到48孔细胞培养板中，每孔1.32E+05细胞。第1天，加入D型HBV感染PHH(800GE/cell)。第2天，更换新鲜培养基。第4天，弃掉细胞培养基，将测试物倍比稀释到需要浓度，然后用LipofectamineTMRNAiMAX转染的方式加入细胞中。测试物的起始浓度均为500pM，5倍稀释，且均设置7个浓度，2复孔，只加转染试剂的孔作为Medium control。转染4-5小时后更换不含化合物的新鲜培养基。培养基中DMSO终浓度为2％。第6天，更换不含化合物的新鲜培养基。第8天，收集细胞上清，并用CCK-8检测细胞活力。
自由摄取加药：第0天，先将测试物用无酶水稀释到需要的浓度，起始浓度为500nM，5倍稀释，均设置7个浓度，2复孔，每孔22μl加入到细胞培养板中。复苏冻存的PHH，将PHH调整到合适密度(6.67E+05cells/ml)，每孔1.32E+05细胞；铺板同时测试物自由摄取进入细胞。第1天，更换培养基，用D型HBV感染PHH(800GE/cell)。第2天，更换不含病毒和化合物的新鲜培养基。培养基中DMSO终浓度为2％。第4，6天，更换不含化合物的新鲜培养液。第8天，收集细胞上清，并用CCK-8检测细胞活力。
样品检测：qPCR检测细胞培养上清中HBV DNA的含量；ELISA检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg的含量。本发明双链siRNA缀合物在细胞中降低HBsAg、HBeAg、DNA水平实验结果见表3。
表3：本发明双链siRNA缀合物在细胞中降低HBsAg、HBeAg、DNA水平实验结果
实验结果表明：双链siRNA缀合物S146具有较好的HBsAg、HBeAg和DNA抑制活性，在不需要转染的情况下，其对HbsAg、HBeAg和DNA的抑制活性都明显优于对照S148。
实施例6：乙型肝炎病毒转基因小鼠实验
1.HBV-Tg转基因小鼠实验
实验方法
实验动物：HBV-Tg转基因小鼠，C57B/6N-Tg(1.28HBV)/Vst,SPF级雄性，6-8周龄，16-20g，购自北京维通达生物技术有限公司，动物生产合格证号：SCXK(京)2019-0002，动物的饲养是由北京维通达生物技术有限公司负责，采用单只单笼饲养。
动物分组：根据小鼠血清HBsAg(为主)和HBeAg(为次)定量检测结果，将动物进行分层随机分组，每组5只。
供试品配制与给药：根据各供试品的纯度计算所需药物粉末用量。按照0.6mg/mL的给药浓度，加入相应的生理盐水，振荡混匀至无色透明液体。将第一次给药当天定义为第0天。各组动物均于第0天单次给药，皮下给药体积均为5mL/kg。动物给药当天如需采血，则给药在采血后进行。
主要观察指标：在第3天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天各称重和取血1次，并分离血清用于HBsAg和HBeAg水平测定。
血清HBsAg和HBeAg水平测定：取血后分离血清，用PBS溶液稀释后送检。每份样品取出血清10μL，用PBS溶液稀释到500μL(稀释50倍)。血清HBsAg和HBeAg水平分别使用乙肝e抗原测定试剂盒(迈克生物)和乙肝表面抗原测定试剂盒(迈克生物)进行测定。
HBV-Tg转基因小鼠实验结果
受试化合物在HBV-Tg小鼠模型实验中，本发明siRNA缀合物对HBsAg抑制效果见附图1。
实验结果表明：与溶媒对照组相比，3mg/Kg剂量下，受试化合物DAW30227(即双链siRNA缀合物S146)对HBsAg具有明显的抑制效果，且在降低HBeAg方面也有一定抑制作用。另外，双链siRNA缀合物S146对HBsA的抑制活性明显优于对照DAW30025(即siRNA缀合物S149)。
2.乙型肝炎病毒AAV小鼠实验
实验方法：
rAAV8-1.3HBV/C57BL/6小鼠模型制备和分组：通过向C57小鼠尾部静脉注射rAAV8-1.3HBV(C型)，制备持续性HBV感染的小鼠动物模型。AAV病毒注射剂量为1E+11vg/只，注射病毒6周后取血检测血清中HBeAg、HBsAg和ALT的含量。根据小鼠血清HBsAg(为主)和HBeAg(为次)定量检测结果，将35只动物进行分层随机分组，每组5只。
供试品配制与给药：根据各供试品的纯度计算所需药物粉末用量。按照0.6mg/mL的给药浓度，加入相应的生理盐水，振荡混匀至无色透明液体。将第一次给药当天定义为第0天。各组动物均于第0天单次给药，皮下给药体积均为5mL/kg。动物给药当天如需采血，则给药在采血后进行。
主要观察指标：在第3天、第7天、第14天、第21天、第28天各称重和取血1次，并分离血清用于HBsAg和HBeAg水平测定。
血清HBsAg和HBeAg水平测定：取血后分离血清，用PBS溶液稀释后送检。每份样品取出血清10μL，用PBS溶液稀释到500μL(稀释50倍)。血清HBsAg和HBeAg水平分别使用乙肝e抗原测定试剂盒和乙肝表面抗原测定试剂盒进行测定。
乙型肝炎病毒AAV小鼠实验结果
受试化合物在Tg/HBV小鼠模型实验中，本发明siRNA缀合物对HBsAg抑制效果见附图2。
实验结果表明：与溶媒对照组相比，3mg/Kg剂量下，受试化合物DAW30335(即siRNA缀合物S147)对HBsAg具有明显的抑制效果，且在降低HBeAg方面也有一定抑制作用。另外，siRNA缀合物S147对HBsAg的抑制活性明显优于对照DAW30025(即siRNA缀合物S149)和DAW30336(即siRNA缀合物S151)。
实施例7：大鼠皮下注射给予本申请缀合物的毒性实验
实验方法：
对大鼠5次给药，共计29天，临床观察，解剖前麻醉后腹主动脉采血，通过检测血生化ALT、AST、ALP、CK、UREA、CREA、TP、ALB、GLU、TBIL、DBIL、CHO、TG、Na、K、Cl、A/G、GLB；血液学WBC、RBC、HB、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、MPV、WBC分类及其百分比；血凝PT、APTT、FIB。另外观察组织病毒学，包括称重脏器、主动脉、食管、胃、十二指肠、盲肠、结肠、回肠、空肠、直肠、肺脏(附主支气管)、肠系膜淋巴结、胰腺、垂体、眼球、甲状腺/甲状旁腺、唾液腺、前列腺、膀胱、精囊腺、股骨、胸骨、给药部位的皮肤和肌肉(末次给药做好标记)、及大体观察到的异常组织。
统计方法：统计采用SPSS16.0。每组体重、血生化、血液学、脏器重量及系数计算均数和标准差，并按照以下方法统计：①首先用Levene’s检验方法进行数据均一性检验，如果数据均一(检验P>0.05)，则进行单因素方差分析检验(ANOVA)；如果Levene’s检验的结果显著(p≤0.05)，则进行Kruskal-wallis检验。②如果方差分析检验结果显著(p≤0.05)，则进一步用Dunnett参数检验法进行多重比较检验；如果方差分析结果不显著(p>0.05)，则统计结束。③如果Kruskal-wallis检验结果显著(p≤0.05)，则进一步用秩次转换后的Dunnett检验；如果Kruskal-wallis检验结果不显著(p>0.05)，则统计结束。临床症状观察、摄食量以及解剖观察数据不进行统计学处理。
实验结论：实验表明，临床观察、血生化、血液学、脏器重量和组织病理结果整体显示本发明siRNA缀合物的安全性良好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (37)

1.一种双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述双链siRNA包括一条正义链和一条反义链，且所述双链siRNA包含一个或多个Y，所述Y为所述双链siRNA中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。
2.根据权利要求1所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述反义链包含如5’-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3’(SEQ ID NO:40)所示的序列，或在如SEQ ID NO:40所示序列中使用Y替换了一个或多个核苷酸残基的序列；其中，所述反义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述正义链包含如5’-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3’(SEQ ID NO:20)所示的序列，或在如SEQ ID NO:20所示序列中使用Y替换了一个或多个核苷酸残基的序列，其中，所述正义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述正义链的长度不超过23个核苷酸。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述正义链或反义链中的70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的核苷酸和Y都是经修饰的；任选地，所述双链siRNA中的每一个核苷酸和Y都是经修饰的。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中所述修饰选自以下中的至少之一：2’-甲氧基修饰、2’-甲氧基乙基修饰、2’-氟代修饰、硫代磷酸酯基连接、2’-脱氧修饰、2’-氨基修饰、锁核酸修饰、解锁核酸修饰、乙二醇核酸修饰和5’-乙烯基磷酸酯修饰。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述正义链包含在如SEQ ID NO:20所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中所述正义链中的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。
7.根据权利要求1-6任一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，反义链包含在如SEQ ID NO:40所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中所述反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:20所示序列的5’端的第1位～第19位。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:40所示序列的5’端的第1位～第21位。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述正义链包含在如5’-g●u●guGcACUucgcuucaca-3’(SEQ ID NO:19)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，所述正义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在所述SEQ ID NO:19的5’端的第1～第19位，所述正义链的长度不超过23个核苷酸。
11.根据权利要求1-10任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述反义链包含在如5’-u●G●ugaAgCGaaguGcAcac●u●u-3’(SEQ ID NO:36)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，所述反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在所述反义链SEQ ID NO:36的5’端的第1～第21位，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
12.根据权利要求1-10任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述反义链包含在如5’-u●G●uga(Agn)gCGaaguGcAcac●u●u-3’(SEQ ID NO:33)所示的序列中使用Y替换了0个、1个、2个、3个、4个或5个核苷酸残基的序列，其中，反义链的每一个核苷酸和Y各自独立地是经修饰的或未修饰的，所述Y替换发生在如SEQ ID NO:33所述序列5’端的第1～第21位，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
13.根据权利要求1-12任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，所述正义链包含以下核苷酸序列中的之一：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21；
所述正义链的长度不超过23个核苷酸。
14.根据权利要求1-13任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，所述反义链包含以下核苷酸序列之一：
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和SEQID NO:39；
所述正义链的长度不超过23个核苷酸。
15.根据权利要求1-14任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述双链siRNA包含以下之一：
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；
具有包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸；或
具有包含SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列的正义链和具有包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列的反义链，所述正义链和反义链的长度各自独立地不超过23个核苷酸。
16.根据权利要求1-15任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述双链siRNA或其缀合物选自S1至S143、S146、S147和S150中的之一。
17.根据权利要求1-16任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述双链siRNA缀合物为所述双链siRNA与缀合基团L96或DAW40007-4缀合后的缀合物，所述缀合基团L-96和DAW40007-4的结构分别为：
18.根据权利要求17所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述缀合基团与双链siRNA的正义链的3’末端或5’末端缀合，优选地与双链siRNA的正义链的3’末端缀合。
19.根据权利要求17或18所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，其中，所述双链siRNA通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或磷酸基团与所述缀合基团链接。
20.一种核苷酸残基Y，其结构为：
21.一种化合物，其具有如式(I)所示的结构，或如式(I)所示的化合物的立体异构体、互变异构体或可接受的盐，
R1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，所述各甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代；
Z和Y1各自独立地为H、氘、羟基保护基团、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团、亚磷酸酰胺基团或氢磷酸盐基团；
M为固相支持体，优选为羟基或氨基功能化的固相支持体，更优选为树脂或CPG，进一步优选为大孔树脂或CPG，更进一步优选为胺甲基树脂、羟基树脂或-NHCPG；
R为-NHR2或-N＝CH-NRaRb；
R2为氨基保护基团；
各Ra和Rb独立地为H或氨基保护基团，或Ra、Rb和与它们所连接的N原子一起形成5-6个环原子组成的杂环基，所述各5-6个环原子组成的杂环基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、正丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代；
其中，各j独立地为1、2、3、4或5。
22.根据权利要求21所述化合物，其中，Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-12烷基、C1-12烷基C(＝O)-、C1-12烷硅基、C6-10芳基C1-6烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、或
Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-10烷基、C1-10烷基C(＝O)-、C1-10烷硅基、C6-10芳基C1-4烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、 或
Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-8烷基、C1-8烷基C(＝O)-、C1-8烷硅基、苯基C1-3烷基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、 或
Z和Y1各自独立地为H、氘、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-6烷基、C1-6烷基C(＝O)-、C1-6烷硅基、苄基、苯乙基、HOC(＝O)(CH2)jC(＝O)-、M-C(＝O)(CH2)jC(＝O)-、三苯基甲基、MMTr、DMTr、4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基、
其中，X为Cl或Br；
各Rx和Ry独立地为羟基保护基团；
各Rc和Rd独立地为H或氨基保护基团；或Rc、Rd和与它们所连接的N原子一起形成5-6个环原子组成的杂环基，所述5-6个环原子组成的杂环基独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代。
23.根据权利要求21或22所述化合物，其中，R2为9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、甲基、叔丁基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、C1-6烷氧基或R3C(＝O)-；
各Ra和Rb独立地为独立地为H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或R4C(＝O)-，或Ra、Rb和与它们所连接的N原子一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基，所述吡咯烷基、吗啉基、哌啶基和或哌嗪基各自独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代；
其中，各R3和R4独立地为C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-6烷基苯基或苄基；或
各R3和R4独立地为C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-4烷基苯基或苄基；或
各R3和R4独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、2,2,2-三氯乙基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、1-丁氧基、2-甲基-l-丙氧基、2-丁氧基、叔丁氧基、苯基、卤素取代的苯基、C1-3烷基苯基或苄基。
24.根据权利要求22-23任意一项所述化合物，各Rx和Ry独立地为苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、氰基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷基C(＝O)-、C1-6烷硅基、苯基、卤素取代的苯基、苄基或苯乙基；或
各Rx和Ry独立地为苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、对甲氧基苄基二苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、CNCH2-、CN(CH2)2-、CNCH(CH3)2CH2-、CN(CH2)3-、CNCH(CH3)2CH2CH2-、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、、C1-4烷基C(＝O)-、C1-4烷硅基、苯基、卤素取代的苯基、苄基或苯乙基；
各Rc和Rd独立地为H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、烯丙氧羰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或R4C(＝O)-，或Rc、Rd和与它们所连接的N原子一起形成吡咯烷基、吗啉基、哌啶基或哌嗪基，所述吡咯烷基、吗啉基、哌啶基和哌嗪基各自独立地任选地被1、2、3或4个选自氘、羟基、氰基、F、Cl、Br、I、甲氧基、乙氧基、1-丙氧基和2-丙氧基的取代基所取代。
25.根据权利要求21-24任意一项所述化合物，其具有如式(II)所示的结构，
26.一种药物组合物，其包含权利要求1-19任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，和药学上可接受的载体。
27.如权利要求1-19任意一项所述的双链siRNA缀合物、其缀合物和其盐或如权利要求26所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎疾病的药物中的用途。
28.如权利要求21-25任意一项所述的化合物在DNA核苷酸固相合成的原料、寡核苷酸药物的合成原料、siRNA药物的合成原料、siRNA药物研究、基因功能研究和/或全基因库的筛选方面的应用。
29.如权利要求20所述的核苷酸残基作为寡聚核苷酸嵌入基团的应用，其中，所述寡聚核苷酸是含有10～50个核苷酸或核苷酸碱基对的核苷酸序列，且所述寡聚核苷酸能够抑制或阻断基因的表达。
30.根据权利要求29所述的应用，其中，所述基因为HBV基因。
31.根据权利要求29或30所述的应用，其中，所述寡聚核苷酸为siRNA。
32.根据权利要求31任意一项所述的应用，其中，所述siRNA包括正义链和反义链。
33.根据权利要求32所述的应用，其中，所述核苷酸残基仅嵌入到所述siRNA的正义链上。
34.根据权利要求32或33所述的应用，其中，所述核苷酸残基仅嵌入到所述siRNA的反义链上。
35.根据权利要求32-34任意一项所述的应用，其中，所述核苷酸残基嵌入到所述siRNA的正义链和反义链上。
36.根据权利要求32-35任意一项所述的应用，其中，所述siRNA的正义链包含如SEQ IDNO:19所示的序列。
37.根据权利要求32-36任意一项所述的应用，其中，所述siRNA的反义链包含如SEQ IDNO:36或SEQ ID NO:33所示的序列。
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