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CN119265241A - 一种无相分离转录因子介导启始阶段重编程使细胞年轻化的方法 - Google Patents

一种无相分离转录因子介导启始阶段重编程使细胞年轻化的方法 Download PDF

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CN119265241A CN202310793813.XA CN202310793813A CN119265241A CN 119265241 A CN119265241 A CN 119265241A CN 202310793813 A CN202310793813 A CN 202310793813A CN 119265241 A CN119265241 A CN 119265241A
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Abstract

本发明提供一种无相分离转录因子介导启始阶段重编程使细胞年轻化的方法。通过对于转录因子进行无相分离的改进，构建重组载体导入目的细胞，控制细胞在启始重编程的阶段，达到年轻化的技术效果。

Description

一种无相分离转录因子介导启始阶段重编程使细胞年轻化的 方法
技术领域
本发明涉及基因工程、基因治疗、细胞治疗领域。
背景技术
诱导多能干细胞(iPSC)重编程技术，一条重要途径是通过转录因子(如OCT4、SOX2、KLF4和MYC,以下简称4因子)，使已分化的细胞诱导生成多能干细胞，整个过程即完全重编程，其中可以分为启始阶段、成熟阶段、稳定阶段(Koji et al,2013,Nelly et al.,2019)。在重编程过程中，细胞经历剧烈的转录水平和表观遗传修饰上的改变，使细胞身份、状态发生巨大改变。在启始阶段，早期多能性相关基因如TRA-1-60、NANOG、SSEA4、SALL4等快速上升表达，而体细胞身份特征基因表达水平变化不大；在成熟阶段，除上述早期多能性相关基因外，也会高表达DPPA5、LIN28等成熟期特异的多能性相关基因，而在启始阶段表达水平变化不大的体细胞身份特征基因则快速下降(Koji et al,2013,Nelly et al.,2019)，暗示这个阶段细胞已难以维持原本体细胞的身份特征；在稳定阶段，细胞已经完全建立多能性基因表达网络，变成了iPSC，除表达上述多能性相关基因外，也高表达OCT4、SOX2、KLF4等经典核心多能性转录因子，同时体细胞身份特征基因基本不表达。另外，这一过程还可以使细胞年轻化，年轻化可通过特定基因转录水平变化、细胞衰老标志物，特别是基于DNA甲基化的表观遗传年龄(epigenetic age,epiAge)来检测(Nelly et al.,2019,Antoine,et al,2022,Diljeet et al.,2022)。
部分重编程就是上述完全重编程进行到中途时停止，由于细胞年轻化在重编程的早期就发生，而体细胞身份特征的丢失在重编程的中后期才发生，因此这里存在一个时间窗口，使得细胞年轻化的同时又能保持细胞原本的身份特征，这是部分重编程使细胞年轻化的技术原理(Ocampo et al.2016)。目前报道的利用转录因子逆转年龄的方法主要如下：1.体外诱导时间限制的部分重编程，又称瞬时重编程(transient reprogramming)，如通过诱导表达系统限制4因子过表达时间，使人成纤维细胞重编程限制在启始阶段，这样可以逆转细胞的年龄，并维持成纤维细胞的特征(Nelly et al.,2019,Diljeet et al.,2022)；2.体内瞬时脉冲的重编程，如在小鼠体内通过可诱导的体系，瞬时脉冲过表达4因子，可以使早衰小鼠的器官变的年轻，也可以使野生型年龄的小鼠各器官一定的年轻化(Alejandroet al.,2016,Kristen et al,2022)；3.减少转录因子持续诱导的部分重编程(以下简称3因子重编程)，如在小鼠眼球内递送装载OSK转录因子序列的AAV病毒，可以治疗青光眼(Luet al.2020)。以上所述都是目前已有利用过表达转录因子逆转年龄的研究，但在避免诱导多能干细胞生成和有效逆转年龄的实际应用中，仍有很大改进空间，如人体内不可能通过小分子诱导表达体系来限制4因子表达时间，因此需要通过诸如工程化改造转录因子等途径来在源头上限制生成iPSC的风险，同时不影响细胞年轻化的效果。
相分离指细胞内某些蛋白质或者核酸分子可以通过多价相互作用，在周围原本均一的环境中产生物理化学性质不同的另一相，通常呈现液滴状特征，结果是形成无膜细胞器或者细胞结构，这一现象或结构即液-液相分离(liquid-liquid phase separation,LLPS)，简称相分离(Clifford,et al.2009,Li,et al.2012)。相分离描述了尺寸在微米级别的特定结构，它创造了一个相对独立的空间区域，选择性地富集分子；与周围环境相比，相分离形成的细胞结构通常有更高的蛋白密度以及减弱的分子微观运动，这可以促进某些生化反应。能形成相分离的蛋白结构特征仍在研究中。
本发明利用工程化改造的去掉相分离能力的转录因子(以下简称无相分离转录因子)，参与多因子部分重编程。发明人发现无相分离转录因子使得部分重编程滞留在启始阶段，使细胞年轻化的同时维持细胞身份特征，因此发明人将此称为启始阶段重编程技术。该技术在提高细胞年轻化效率的同时极大降低iPSC生成风险，更有希望应用于临床。
发明内容
一般术语定义
在权利要求和/或说明书中，当与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
在该公开内容中，“包含”、“包括”、“含有”、“具有”等具有中国、美国、欧洲等国专利法中赋予它们的含义，且可指“囊括”、“涵盖”等，“基本由......组成”、“基本组成为”等具有中国、美国、欧洲等国专利法中赋予它们的含义，该术语为开放式的，允许多于所引用的事项的存在，只要所引用的事项的基本或新颖特征不因多于所引用的事项的存在而改变，但排除现有技术的实施方案。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差，表示在列举范围内可合理预期的可替换的特征，特别是指给定的数量，例如意味着包括正负百分之五的偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
本发明所述的术语“同一性”“同源性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的相似度，且依然具有与原氨基酸序列或核苷酸序列相同的功能。
关于肽或多肽使用的术语“变体”是指氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守取代而不同但保留至少一种生物学活性的肽或多肽。变体还可以指具有与参考蛋白质基本相同的氨基酸序列的蛋白质，参考蛋白质具有保留至少一种生物学活性的氨基酸序列。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来识别。(Kyte等人，1982年，J.Mol.生物学.157:105-132)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知类似亲水指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。一方面，氨基酸具有±2的亲水指数的被替代。氨基酸的亲水性也可用于揭示导致蛋白质保留生物学功能的取代。在肽的上下文中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的测量，据报道与抗原性和免疫原性密切相关。美国专利号4,554,101，通过引用全部并入本文。取代具有相似亲水性值的氨基酸可导致保留生物学活性的肽，例如免疫原性，如本领域所理解的。可用亲水性值彼此相差在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水指数和亲水值均受该氨基酸特定侧链的影响。与该观察结果一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，尤其是那些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他属性。
如本文所用的关于核酸的术语“变体”是指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列基本相同的核酸；(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其基本相同的序列杂交的核酸。变体可以是在整个基因序列或其片段的全长上基本上相同的核酸序列。核酸、蛋白序列可以是66％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％在基因、蛋白序列或其片段的全长上相同。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
“杂交”是指于不同的严谨性条件下在互补多核苷酸序列(例如，表1和2中所列的基因)或其部分之间配对形成双链分子。(见，例如Wahl，GM.和S.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152：399；Kimmel，A.R.(1987)Methods Enzymol.152：507)。一般基因工程、细胞工程专业术语定义
术语“细胞”指天然存在或修饰的完整活细胞。细胞可以与其他细胞分离，与培养物中的其他细胞混合，或在组织(部分或完整)或生物体中混合。本文描述的方法可以在例如包含单个细胞、细胞群或包含细胞的组织或器官的样品上进行。
如本文所用，术语“哺乳动物细胞”是指源自哺乳动物受试者的适合移植到相同或不同受试者中的任何细胞。细胞可以是异种的、自体的或同种异体的。细胞可以是直接从哺乳动物受试者获得的原代细胞。细胞也可以是来源于从受试者获得的细胞的培养和扩增的细胞。在一些实施方案中，细胞已被遗传工程化以表达重组蛋白和/或核酸。
载体、重组载体用于承载目标基因，本发明中优选慢病毒载体(LentiviralVector,LV)，是逆转录病毒的一种，是RNA病毒，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。本发明中优选腺相关病毒载体(Adeno-associated viralvector,AAV)，是一种非整合型的DNA病毒，由于其具有较高的安全性、较低的免疫原性、较长的体内表达时间，被广泛应用于基因治疗。工程化mRNA，包括线性mRNA(linear mRNA)和环状mRNA(circular mRNA)，是一种新型的基因载体，适用于非病毒型的基因递送系统，可以用于体内基因治疗。本发明中优选环状mRNA，比线性mRNA具有更低的免疫原性、更高的稳定性，适合在体内长期表达治疗性蛋白，因此越来越多地被应用于基因治疗。但只要能够用于承载的载体都在本发明的保护范围之内。
宿主细胞包括分裂细胞、非分裂细胞；能有效感染原代细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、干细胞、间充质干细胞、心肌细胞、肝细胞、T细胞、肿瘤细胞等，又如成纤维细胞、上皮细胞、血液细胞、免疫细胞、神经细胞、胚胎细胞。更具体的，如人皮肤成纤维细胞，如HFF-1、HSF-1、HDF、BJ等；如人皮肤角质细胞，如HACAT等；如人T细胞，如Jurkat等；如人肺成纤维细胞，如IMR-90等。
重编程领域专业术语定义
术语“再生细胞”是指已用一种或多种细胞重编程因子处理或瞬时重编程的老化细胞，使得细胞具有年轻细胞的转录组学特征，同时仍保留一种或多种细胞身份标记。
术语“干细胞”是指保留通过有丝分裂细胞分裂更新自身的能力并且可以分化成多种特化细胞类型的细胞。全能干细胞是由卵子和精子细胞融合产生的。受精卵最初几次分裂产生的细胞也是全能的。这些细胞可以分化成胚胎和胚胎外细胞类型。胚胎干细胞是全能细胞的后代，具有多能性，可以分化成来自三个胚层中任何一个的细胞类型。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)来源于成体细胞，这些细胞被细胞重编程因子诱导成为胚胎干细胞样多能性状态。诱导性多能干细胞可以衍生自成体体细胞如皮肤或血液细胞，也具有向三个胚层中任何一个细胞类型分化的潜能。
如本文所用，术语“重编程”是指使用细胞重编程因子诱导体细胞转化为iPSC。重编程过程可以分为启始阶段、成熟阶段、稳定阶段共3个阶段。在启始阶段，细胞仍然维持原本的体细胞身份，但早期多能性相关基因如NANOG、SALL4等快速上升表达；在成熟阶段，体细胞身份特征快速丢失，且晚期的多能性相关基因如DPPA5、LIN28等表达上升；在稳定阶段，细胞完全丢失细胞身份，变成iPSC。另外，这一过程还可以使年老的细胞恢复活力(即消减所有或一些衰老标志)。
如本文所用，术语“细胞身份丢失”(loss of cell identity)是指体细胞经过重编程，失去了原本体细胞特异的形态、功能、表观遗传模式、基因表达谱等特征(即细胞身份)，获得了多能干细胞的各种特征，变成了iPSC。需要特别说明的是，体细胞的细胞身份是在重编程过程中逐步失去的，在启始阶段，细胞仍维持原本的细胞身份；到了成熟阶段，细胞已经失去了大部分细胞身份特征，获得了较高程度的多能干细胞特征，此时即使中止重编程，细胞仍有很大风险不能恢复原本的细胞身份。
术语“部分重编程”(partial reprogramming)是指使用一种或多种细胞重编程因子处理或瞬时重编程年老的细胞，使细胞恢复一定程度的活力，但又不足以去分化变成iPSC，保留其原本的细胞身份。“瞬时重编程”(transient reprogramming)是部分重编程的一种实现方式，是指细胞暴露于细胞重编程因子的时间足以使细胞恢复活力，但不足以引起去分化为iPSC。由于暴露时间非常短，这种瞬时重编程恢复活力的程度较低。
启始阶段重编程(initiation phase reprogramming)是指通过工程化改造细胞重编程因子，使对年老细胞的重编程滞留于启始阶段，从而有更长的安全时间窗口恢复活力，而且极大降低了变成iPSC的风险。其与瞬时重编程的主要区别在于对细胞重编程因子的工程化改造，从而可以在分子层面上人工控制重编程的阶段进程。
术语“液-液相分离”(liquid-liquid phase separation,LLPS)，简称相分离，是指细胞内某些蛋白质或者核酸分子可以通过多价相互作用，在周围原本均一的液态环境中产生物理化学性质不同的另一相，通常呈现为微米级别的液滴(类似水中的油滴)，这些液滴形成了一个相对独立的空间，选择性地富集某些蛋白质分子，使其有更高的蛋白密度以及减弱的分子微观运动，可以促进某些生化反应结果，例如基因的转录调控、染色体空间结构的改变等等。蛋白质形成相分离的机制有很多种，其中一类依赖蛋白的内部无序区(intrinsically disordered domain,IDR)，该结构域中的酸性极性氨基酸带有负电荷，可以相互作用形成相分离。另一类依赖赖氨酸的泛素化，通过多泛素化链的相互作用，也能形成相分离。“无相分离”指通过对形成相分离的IRD序列或关键氨基酸进行突变，造成变体蛋白质不能形成LLPS,从而影响(降低)其细胞内的生物学功能。
如本文所用，术语“细胞重编程因子”是指一组转录因子及其组合，其可将成体或分化细胞转化为多能干细胞。具体的，重编程因子是来自Oct家族、Sox家族、Klf家族、Myc家族、Nanog家族、Glis家族或Lin家族的因子。示例性重编程因子包括OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28、NANOG和/或GLIS1。其他示例性重编程因子包括CMYC、DPPA2、DPPA4、ESRRB、GDF3、GLIS1、KLF2、KLF4、KLF5、LIN28、LMYC、NANOG、NMYC、NR5A1、NR5A2、OCT-4、RCOR2、SALL1、SALL4、SOX1、SOX2、SOX3、TDRD12、TET1、TH2A、TH2B、UTF1、ZFP42、MDM2、CyclinD1、SV40大T抗原、SIRT6、TCL1A和RARy。其中“山中因子Yamanaka因子”，包括但不限于Oct-4、Sox4、Klf4和c-Myc四种转录因子基因组合(合称OSKM基因)，在某些方面，也可以是Oct4、Sox-2和Klf4基因(OSK基因)，在某些方面，也可以是Oct4、Klf4和c-Myc基因(OKM基因)，在某些方面，也可以是Sox-2、Klf4和c-Myc基因(KMS基因)。
Oct重编程因子是指转录因子八聚体家族中任何天然存在的成员，或其保持转录因子活性的变体，与最接近的相关因子相比相似(在至少50％、80％或90％的活性范围内)天然存在的家族成员,或至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域的多肽，并且可以进一步包含转录激活结构域。示例性的Oct多肽包括Oct-1、Oct-2、Oct-3/4、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9和Oct-11，例如Oct3/4(本文称为“Oct4")包含POU结构域。在一些实施方案中,变体与天然存在的Oct多肽家族成员相比在其整个序列中具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，本文提供的OCT4重编程因子蛋白质/多肽由优化的多核苷酸序列SEQ ID NO:1编码。因此，与野生型OCT4相比,SEQ ID NO:1构成改变的多核苷酸序列。与氨基酸序列SEQ ID NO:2相比在一些实施方案中编码更稳健的OCT4重编程因子的氨基酸序列。在一些实施方案中,OCT4重编程因子蛋白质/多肽由具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％的多核苷酸或氨基酸序列编码。
“Sox家族”是指编码SRY(性别决定区Y)-box 2的基因，也称为SOX2，与维持多能性相关。Sox多肽(例如Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox18)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。因此,本文所指的“蛋白质”、“SOX2蛋白质”等包括任何天然形式的Sox2转录因子或其保持Sox2转录因子活性(例如,在至少50％、80％、如通过本领域已知的方法测量的，与野生型Sox2相比具有90％或100％的活性。在一些实施例中，与天然存在的Sox2多肽相比,变体在其整个序列中具有至少90％的氨基酸序列同一性。具体的，在SEQ ID NO:23-24的基础上进行同一性控制的序列改进。
“Klf家族”是指Kruppel样因子4或编码Klf4蛋白的“Klf’基因是由小鼠klf4基因和人类klf4基因编码的蛋白质。示例性的Klf家族成员包括Klf1、Klf2、Klf3、Klf-4、Klf5、Klf6、Klf7、Klf8、Klf9、Klf10、Klf11、Klf12、Klf13、Klf14、Klf15、Klf16和Klf17。因此,本文所指的术语“KLF4”、“KLF4蛋白”等包括KFF4转录因子的任何天然存在形式或其保持KLF4转录因子活性(例如，在至少50％、与野生型KFF4相比，80％、90％或100％的活性,如通过本领域已知的方法测量的。在一些实施方案中,与天然存在的KFF4多肽相比,变体在其整个序列中具有至少85％或90％或95％的氨基酸序列同一性。例如SEQ ID NO:21-22所示的变体结构。
Myc家族的因子是指由与癌症有关的myc原癌基因编码的因子。N-Myc或L-myc也被用作替代c-Myc的可能重编程因子。因此,本文所指的术语“c-Myc”、“C-MYC”、“c-Myc蛋白”、“C-MYC蛋白”等包括cMyc转录因子的任何天然存在形式或变体其维持cMyc转录因子活性(例如,与野生型cMyc相比，活性至少在50％、80％、90％或100％以内，如通过本领域已知的方法所测量)。具体的，可以在SEQ ID NO:11-12的野生型序列基础上进行变体改进。
在本文所述的这个方面及其它所有方面的一个实施方式中，所述的重编程包括以下之一：将编码转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等的核酸序列导入所述分化的体细胞中，所述序列可操作地连接至用于表达所述因子的调节元件；导入重编程所述细胞分化状态的一个或多个蛋白因子；以及将所述细胞与诱导所述细胞分化状态重编程的小分子相接触。
变体
本发明还包括所述转录因子突变体的片段、衍生物和类似物。术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的转录因子突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的转录因子突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于野生型序列，肯定存在本发明上上段所述的任一位点的突变。
药物治疗领域术语定义
在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是猫的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
术语“对象”“个体”、“患者”或“受试者”包括(根据是否存在治疗用途选择添加)哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
本发明所述的“预防”指在疾病开始发展之前或之后通过施用本发明所述的产品来避免症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。
本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明所述产品的量或剂量。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
术语“基因治疗”指对个体细胞和/或生物组织的瞬时或永久的基因修饰(例如基因的表达、插入、改变或移除)以治疗疾病，例如肿瘤、遗传性疾病、衰老相关疾病和自体免疫疾病。最常见形式的基因治疗包括将功能基因导入细胞进行表达以治疗疾病，将功能基因插入特定或非特定的基因组位置以取代突变基因，然而其他形式包括直接纠正突变或修饰易受病原体感染的正常基因，或将基因或基因片段转入细胞进行其转录。
术语“细胞治疗”是指，通过一系列行为(如：在体外对活的自体(autologous)、同种(allogenic)、异种(xenogenic)细胞进行增殖、筛选，以恢复细胞和组织的功能，或以其他方法改变细胞生物学特性)达到治疗、诊断和预防目的的医药品。
本发明的第一方面涉及细胞年轻化方法
发明人通过研究细胞重编程三个阶段的机理，启始阶段(Initiation Phase)：细胞身份继续维持，早期多能性基因上调，表观遗传年龄(epigenetic age,epiAge)下降，细胞开始年轻化；成熟阶段(Maturation Phase)：细胞身份特征大幅丢失，晚期多能性基因上调；稳定阶段(Stabilization Phase)：细胞身份完全丢失，变成iPSC；因此，成熟阶段前为部分重编程(PR)的时间窗口。发明人发现了一种阻止细胞重编程进入成熟阶段，延长PR时间窗口，使细胞年轻化的同时又不会丢失细胞身份的新方法。所述方法为，使用工程化无相分离重编程因子，基于对转录因子的相分离功能相关区域的突变，使得转录因子失去了引发相分离的功能，导致其无力驱动细胞重编程进入成熟阶段，从而使重编程滞留在启始阶段，持续地使细胞年轻化，但又极大降低了重编程进入晚期阶段而丢失细胞身份的风险，该方法称为“启始阶段重编程”。
进一步的，所述无相分离工程化转录因子可以为OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、L-myc、LIN28、NANOG和GLIS1等因子。
本发明涉及对转录因子进行工程化改造，使其失去相分离能力，发明人发现对于转录因子立体结构的修饰改进的方式并不需要限定，只要能够使其失去相分离能力，使得细胞重编程滞留在启始阶段，都在本发明的保护范围内。
因此本发明涉及一种无相分离工程化转录因子介导的细胞启始阶段重编程的方法，其特征在于，使用无相分离工程化转录因子导入细胞实现。
一种细胞年轻化方法，其特征在于，使用无相分离工程化转录因子介导细胞启始阶段重编程。
一种细胞重编程方法，其特征在于，使用包含无相分离工程化转录因子的载体导入细胞中实现。
具体的，判定细胞年轻化的标准为，与参考值相比，再生细胞表现出一种或多种表观遗传标记的基因表达的变化，所述变化为升高或降低。
具体的，判定细胞年轻化的标准为，与参考值相比，再生细胞表现细胞DNA甲基化表观遗传年龄epiAge的变化，所述变化为降低。
具体的，判定细胞年轻化的标准例如，与参考值相比，再生细胞表现衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)阳性细胞比例的变化，所述变化为降低。
具体的，判定细胞年轻化的标准示例：相对于参考值，检测年轻化功能相关基因：COL1A1、COL3A1、COL4A1、FN1、LAMA5，基因表达水平提升；检测重编程启始阶段特征基因：NANOG、SALL4，基因表达水平提升；检测重编程成熟阶段特征基因：DPPA5、LIN28A，基因表达水平下降。可以用检测细胞的身份基因进行细胞验证，例如检测成纤维细胞身份特征基因：THY1、P4HB、S100A4、SERPINH1；根据不同的细胞选择不同的身份基因；经过检测身份基因表达相对于参考值能够提高。
所述参考值的选择，可以为相同细胞种类的空白细胞对照、又或者是野生型转录因子重组载体导入细胞作为对照；总之，参考值并非一个绝对的标准，而是针对修饰的转录因子重组载体导入细胞后用于比较的一个相对的比较基准。因此，以上针对“判定年轻化的标准”仅为示例，并非绝对化标准，只要能够证明细胞重编程滞留在启始阶段都在细胞年轻化判断标准的范围内。
本发明保护范围也并不仅限于上述示例性的功能基因，只要能够用于检测确定细胞部分重编程在启始阶段，都应该在本发明保护范围之内。
值得注意的是，细胞年轻化的方法、或细胞重编程的方法，可以用于治疗或诊断，也可以不用于治疗或诊断，可以对体内或离体细胞进行处理，而并不一定直接需要治疗的对象进行处理；在某一个具体的实施方式中，所述细胞年轻化的方法、或细胞重编程的方法，并不用于疾病的诊断、预防和治疗。
所述无相分离工程化转录因子元件修饰，具体的改造/突变/修饰方式可以为，以下改进方式仅为示例：
(1)对带电氨基酸进行突变，包括对酸性氨基酸带电氨基酸进行突变，和/或对碱性带电氨基酸进行突变，从而改变蛋白质内部无序区(IDR区)的带电氨基酸以调控凝聚态形成能力。
发明人发现，“IDR带负电荷是转录因子发生相分离”是原理之一，因此通过预测转录因子内部IDR区，例如通过VSL2算法进行Disorder Score预测OCT4的IDR，，例如得分大于一定数值的连续区域有较高可能性为IDR，所述数值并不特别限定，但可以是0.4-0.6的范围，优选0.5。对于OCT4进行示例性预测结果可知，OCT4的IDR分布于两端的活化域(Activation Domain,AD)，更具体的，是第1-140位、第288-360位氨基酸；中间DNA结合域-(DNA binding domain,DBD)则不属于IDR。值得注意的是，还可以使用替换性的打分标准，例如IUPred2和ANCHOR2的评分标准，但只要能够用于IDR区的预测打分，都在本发明的保护范围内。发明人经过预测，多种打分标准得到的结论是相同的(误差范围内)，因此本发明能够保护多种打分标准预测得到的IDR区结构。
具体的，可以对转录因子蛋白质内部无序区(IDR区)进行氨基酸修饰，或者对活化域进行修饰，进一步的，可以对带电氨基酸进行修饰；使得转录因子去除相分离能力。
具体的，可以将极性带电荷的氨基酸替换为中性氨基酸，所述极性带电氨基酸可以为酸性氨基酸；
优选的，可以将IDR区的极性带电荷的氨基酸替换为中性氨基酸，所述极性带电荷氨基酸可以为酸性氨基酸；
更具体的，可以将酸性氨基酸例如天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)突变为中性氨基酸，例如丙氨酸；
更具体的，可以将IDR区的酸性氨基酸例如天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)突变为中性氨基酸，例如丙氨酸.
在一个具体的实施例中，可以是对OCT4的野生型氨基酸序列进行突变改进；
所述OCT4野生型基因的蛋白序列的IDR区，可以占全序列的比例为，N端占38-40％，C端占19-24％。
优选的，可以是对SEQ ID NO：2的第1-140位进行上述突变改进，和/或对288-360位进行上述突变改进；值得注意的是，上述位置可以有前后约10-20个氨基酸位置的误差范围。
优选的，突变位点选自SEQ ID NO：2的8、20、31、108、138、291、297；26、56、68、91、96、98、104、113、125、127、130、134、135、296、299、341、343中至少一个；优选的，突变点选自SEQ ID NO：2的145、147、166、188、209、210、215、224、238、246、270、272中的至少一个。具体的，突变数量可以为1个、2个、3个……36个。
示例性的，可以是对野生型OCT4的基因进行突变，使得其蛋白的IDR区域的酸性极性氨基酸进行突变(D/E→A)，以下称为OCT4’；例如SEQ ID NO：4-10中任意一个所示，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
本发明还进一步保护表达上述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，示例性的，可以是SEQ ID NO：3所示，然而本领域技术人员知道，只要能够通过密码子表达得到目的蛋白，合理的密码子偏好变化得到不同的核苷酸序列都在保护范围内。
当然本发明并不限于上述转录因子的限定，只要进行IDR区带电氨基酸的修饰能够实现无相分离的功能的转录因子改造都在本发明的保护范围内。
(2)泛素化修饰
发明人发现，氨基酸被多泛素链(polyubiquitin chain)修饰后，多泛素链介导的相分离，因此将例如赖氨酸K替换成精氨酸R，不产生多泛素链修饰，可以避免相分离发生。但值得注意的是，本发明的保护范围在于提供了一种对转录因子进行泛素化突变避免相分离发生的方法，而并不局限于具体的突变方式。
示例性的，针对C-MYC转录因子，对其可被泛素化的赖氨酸进行突变(K→R)，也可以对其他转录因子进行泛素化突变。
具体的可以对SEQ ID NO：11-12进行突变处理，在SEQ ID NO：12的基础上可以对第51、52、126、143、148、157、206、269、275、289、298、317、323、326、341、355、371、389、392、397、398、412、422、428、430位中至少一个赖氨酸(K)进行突变处理；
优选的，可以是对以上位置中1个，2个，3个……25个位置进行突变处理；优选对第148、389位氨基酸两者之一，或两者一起进行突变处理；优选对20-25个位置进行突变处理；更优选对25个位置均进行突变处理；但只要能够实现去除泛素化链并进而达到目的效果，即避免相分离，则具体的突变位置的数量并不需要特别限定。
优选的，是对赖氨酸K进行突变为精氨酸的修饰方式；但并不限定具体方式，只要能够去除泛素化并实现避免相分离，都在保护范围内。
例如SEQ ID NO:14-20所示的变体作为示例，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
本发明还进一步保护表达上述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，示例性的，可以是SEQ ID NO：13所示，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列；然而本领域技术人员知道，只要能够通过密码子表达得到目的蛋白，根据表达细胞的需要合理的密码子偏好变化得到不同的核苷酸序列都在保护范围内。
当然本发明并不限于上述转录因子的限定，只要进行去除泛素化处理能够实现无相分离的功能的转录因子改造都在本发明的保护范围内。
(3)部分缺失处理，优选末端缺失处理，可以是对N端或C端进行部分缺失处理，或对基因的中间部分进行部分缺失处理；或者称为蛋白的IDR区部分缺失处理，即IDR区带电氨基酸部分缺失处理；或者称为蛋白的相分离关键调控区域缺失处理，即具有泛素化链修饰的关键赖氨酸缺失处理，或对产生相分离具有关键作用的氨基酸缺失处理。
示例性的，可以对转录因子N端或C端、其DBD以外的非关键区域进行缺失处理，例如对第1-20位进行缺失处理，进一步的，还可以是2-20、1-19、2-29、2-18、2-17、2、16位置进行缺失处理，这种处理方式不影响DBD区域，即不影响转录因子原本的DNA位点识别功能，但有可能去掉其IDR区域、泛素化链修饰的赖氨酸或其它关键氨基酸，从而避免发生相分离；
具体的，可以对SEQ ID NO：21-22所示的KLF转录因子4(KLF4)的序列进行部分删除，例如其重要的DBD区域位于C端的375-470位，因此可以对N端2-374位的IDR区域进行全部或部分缺失处理，得到例如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列；
具体的，可以对SEQ ID NO：23-24所示的性别决定Y盒转录因子2(SOX2)的序列进行部分删除，例如其重要的DBD区域和转录激活域位于中部的41-200位，因此可以对N端2-40位和/或C端201-317位的IDR区域进行全部或部分缺失处理，得到例如SEQ ID NO：41-43所示的氨基酸序列，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
具体的，可以对SEQ ID NO：1-2所示的OCT4的序列进行部分删除，例如其重要的DBD区域位于中部的141-287位，因此可以对N端2-140位和/或C端288-360位的IDR区域进行全部或部分缺失处理，得到例如SEQ ID NO：44-46所示的氨基酸序列，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
具体的，可以对SEQ ID NO：11-12所示的c-MCY的序列进行部分删除，例如其最重要的DBD为C端361-439位的bHLH-LZ结构域，因此可以对N端2-360位进行全部或部分缺失处理，得到例如SEQ ID NO：47-48所示的氨基酸序列，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。本发明还进一步保护表达上述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，示例性的，可以是SEQ ID NO：13所示，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列；然而本领域技术人员知道，只要能够通过密码子表达得到目的蛋白，合理的密码子偏好变化得到不同的核苷酸序列都在保护范围内。
当然本发明并不限于上述转录因子的限定，只要进行部分缺失处理从而能够实现无相分离的功能的转录因子改造都在本发明的保护范围内。
本发明的第二方面提供了包含工程化转录因子的元件
核酸元件
本发明进一步包括了前述工程化转录因子的核酸元件，所述元件可以是DNA元件、RNA元件，进一步的可以是mRNA元件、siRNA元件、环状RNA元件、环状mRNA元件、tRNA元件。
所述元件进一步包含Kozak序列、启动子序列、至少一个连接肽序列、UTR区、终止子序列、5’帽子、polyA尾等；所述核酸元件可以是DNA、RNA序列，也可以是进一步表达的蛋白元件。启动子可选自，诱导型启动子如TRE、TRE3G、TRE3GS、TRE3GV等，组成型启动子CMV、EFS、CAG、PGK等，转录后调控序列例如WPRE等，poly(A)尾例如SV40 poly(A)、pGH poly(A)等。
所述mRNA元件包括但不限于线性mRNA和环状mRNA。所述环状mRNA上可存在IRES和自剪切多肽2A元件。所述RNA可存在适度的修饰，包括但不限于假尿苷(Ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)、5-甲氧基-尿苷(5moU)、N6-甲基-腺苷(m6A)、5-甲基-胞苷(5m5C)等。所述RNA上可存在用于富集该RNA所需的与L7Ae、TAT等结合的序列。
重组载体元件
本发明中的元件可以进一步构建载体，可以为单顺反子、双顺反子或多顺反子。在本发明的一个具体实施方式中，所述的双顺反子或多顺反子基因的编码区可通过至少一种连接肽链接，连接肽可以为内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)或自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide，2A)。
可使用的IRES序列包括但不限于：小RNA病毒(例如FMDV)、瘟病毒(例如CFFV)、脊髓灰质炎病毒(例如PV)、脑心肌炎病毒(例如ECMV)、口蹄疫病毒(例如FMDV)、丙肝病毒(例如HCV)、古典猪瘟病毒(例如CSFV)、小鼠角膜白斑病毒(例如MLV)、猿免疫缺陷病毒(例如SIV)或蟋蟀麻痹病毒(例如CrPV)等。所述编码区亦可以通过“2A连接子”进行分割，所述“2A连接子”是来源于病毒的短肽(18-25个氨基酸)，又称“自我剪切”肽，能使一条转录产物产生多种蛋白，包括但不限于P2A/T2A/E2A/F2A等。
当多个转录因子串联时，具体的可以是SEQ ID NO：25-27所示。当然本发明也提供单独转录因子的载体，并进行一定比例的混合，例如1：1：1：1混合，1：2：1：2混合，1：2：2：1混合，2：1：1：1混合。混合物也在本发明保护范围内。
本发明进一步包括了前述工程化转录因子的重组载体，包括但不限于克隆载体、表达载体、穿梭载体、病毒载体(例如慢病毒载体、腺相关病毒载体，痘病毒相关载体等)。
重组蛋白
本发明进一步包括上述核酸元件翻译表达得到的重组蛋白元件，以及能够表达得到上述蛋白元件的所有核苷酸序列。蛋白元件在一定程度下维持功能，也能够包含一定的变体。
重组细胞
本发明进一步包括了导入前述载体的重组细胞。
具体的，本发明提供的方法可应用于需要再生的任何类型的细胞。细胞可以与其他细胞分离,与培养物中的其他细胞混合,或在组织(部分或完整)或活生物体中混合。本文描述的方法可以在例如包含单个细胞、细胞群或包含细胞的组织或器官的样品上进行。选择用于年轻化的细胞将取决于治疗与年龄相关的疾病或病症所需的治疗效果。,细胞是哺乳动物细胞。包括但不限于原核细胞、真核细胞，进一步的，可以是哺乳动物细胞，例如人、猴、鼠(大鼠、小鼠)、马、牛、羊、猪、狗、猫等。如CRFK猫肾细胞、PG-4(S+L-)猫脑细胞、F81猫肾细胞、FCA-S1猫皮肤细胞、CATK1猫肾细胞、MDCK(NBL-2)犬肾细胞、SCBN犬十二指肠细胞、DH82犬肾恶性组织增生症细胞、HEK293T、HEK293、BHK、CHO、3T3、NS0、Hela、HT-1080，PERC6、CAP、HKB-11、Huh-7等；在实施例中，细胞是人类细胞。在实施例中，细胞来自老年受试者。
本发明提供的方法可以在神经系统、肌肉系统、呼吸系统、心血管系统、骨骼系统、生殖系统、外皮系统、淋巴系统、排泄系统、内分泌系统(例如,神经系统)的细胞、组织或器官上进行。(内分泌和外分泌)或消化系统。如本文所述,任何类型的细胞都可能被再生,包括但不限于上皮细胞(例如,鳞状、立方形、柱状和假复层上皮细胞)、内皮细胞(例如,静脉、动脉和淋巴管内皮细胞)细胞)和结缔组织、肌肉和神经系统的细胞。此类细胞可包括但不限于表皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、卫星细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、角质形成细胞、基底细胞、成釉细胞、外分泌细胞、肌上皮细胞、成骨细胞、破骨细胞、神经元(例如,感觉神经元、运动神经元和中间神经元)、神经胶质细胞(例如,少突胶质细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞、雪旺细胞和卫星细胞)、柱状细胞、脂肪细胞、周细胞、星状细胞、肺细胞、血液和免疫系统细胞(例如,红细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)、激素分泌细胞、生殖细胞、间质细胞、晶状体细胞、感光细胞、味觉细胞和嗅觉细胞；以及来自肾、肝、胰腺、胃、脾、胆囊、肠、膀胱、肺、前列腺、乳房、泌尿生殖道、垂体细胞、口腔、食道、皮肤、头发、指甲、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、眼睛、鼻子或大脑。
具体的，细胞选自成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、骨骼肌干细胞、角质形成细胞、间充质干细胞和角膜上皮细胞。具体的，细胞是成纤维细胞。具体的，细胞是内皮细胞。具体的，细胞是软骨细胞。具体的，细胞是骨骼肌干细胞。具体的,细胞是角化细胞。具体的，细胞是间充质干细胞。具体的，细胞是角膜上皮细胞。
导入与递送
所述导入方法包括但不限于脂质体转染、微囊泡转染、外泌体转染、电穿孔、纳米载体转染、采用转染试剂进行化学转染；纳米载体包括脂质、聚合物或脂质-聚合物杂化物。
一种递送系统，用于递送上述核酸分子、包含核酸分子的重组载体、重组DNA分子、mRNA、重组蛋白质等。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒或“LNP”用于将核酸递送至细胞。如上所述，LNP可包含天然脂质或合成脂质,包括共轭脂质或聚合物(例如聚乙二醇化脂质)。LNP可包含中性脂质、两性离子脂质、可电离脂质、阳离子脂质和阴离子脂质中的任何一种或多种。在一些实施方案中，LNP包含天然或合成的单酰基或二酰基形式的磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA),或单酰基、二酰基、三酰基或四酰基形式心磷脂。在一些实施方案中，LNP是胶束或反胶束(反胶束)。在其他实施方案中，LNP是单层脂质体或多层脂质体。
本发明还涉及其他递送系统，如GalNAc共轭连接递送系统、脂质体LNP纳米递送系统(小分子配体、抗体及其它分子)和病毒样颗粒VLP递送、鱼精蛋白、高分子聚合物、无机纳米颗粒、外泌体、聚合物基质、病毒转染等。
本发明的第三方面涉及预防和/或治疗用途
本发明所涉及的核酸元件(DNA、RNA元件)、重组载体、重组蛋白、重组细胞可在多领域中实现预防和/或治疗用途，也用于在制备用于治疗疾病的药物中的用途。具体治疗的疾病包括但不限于细胞疗法、基因治疗、免疫细胞增殖、癌症治疗、衰老相关疾病治疗等。
本发明涉及的方法可用于使培养的细胞(例如,离体或体外)恢复活力以改善用于细胞疗法的功能和效力。用于治疗患者的细胞可以是自体的或同种异体的。优选地，细胞来源于患者或匹配的供体。例如，在离体治疗中，细胞直接从待治疗的患者获得，如本发明所述用编码细胞重编程因子的mRNA转染,并重新植入患者体内。这一类细胞可以例如从对患者进行的活组织检查或外科手术中获得。或者,需要再生的细胞可以用编码细胞重编程因子的mRNA在体内直接转染。在一些实施方案中,这种免疫细胞工程是离体进行的，例如，在细胞治疗产品的制造中，例如自体或同种异体嵌合抗原受体(CAR)-T、CAR-NK、CAR-M或CAR-NKT细胞。
本发明涉及的方法可以用于进行基因治疗。“基因治疗”用于指使用基因(即，遗传物质)来治疗和/或预防哺乳动物受试者(例如，人类)的疾病。在一些实施方案中，本发明所涉及的遗传物质(核酸元件(DNA、RNA元件)、重组载体等)被直接递送到哺乳动物受试者的至少一些细胞中。本发明可用于基因治疗的任何特定方法或组合物。可以利用前述的核酸元件、重组载体等导入哺乳动物细胞中实现基因治疗的目的。具体的，可以包括自体或离体的基因治疗。基因治疗也可以分为“生殖系细胞基因治疗”和“体细胞基因治疗”。在“生殖细胞基因治疗”的情况下，生殖细胞，即精子或卵细胞，被遗传修饰。遗传改变通常整合到它们的基因组中。因此，由于治疗产生的改变可以遗传，并将传递至后代。该方法可用于治疗遗传紊乱和遗传病。在“体细胞基因治疗”的情况下，治疗性基因被转移入个体的体细胞。任何修饰和效应将仅被限制至该个体，将不会由个体的子孙或后代遗传。具体策略包括但不限于DNA矫正、DNA置换、DNA增补、DNA失活的方式。
在另一方面,提供了用于诱导细胞例如免疫细胞增殖的方法。在一些实施方案中,该方法包括将细胞暴露于编码一种或多种重编程因子的mRNA,由此所述暴露实现一种或多种重编程因子在细胞中的表达以增强细胞增殖,同时保留其特性。在一些实施例中,诱导增殖的方法不诱导衰竭。在一些实施例中,增殖由衰竭的预防或逆转引起。
特定的，本发明的细胞年轻化治疗方式，可以用于“与年龄相关的疾病或病症”，具体是指与衰老相关的任何病症、疾病或病症,例如但不限于神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化、痴呆、和中风)、心血管和周围血管疾病(例如动脉粥样硬化、外周动脉疾病(PAD)、血肿、钙化、血栓形成、栓塞和动脉瘤)、眼部疾病(例如年龄相关性黄斑变性、青光眼、白内障、干眼症、糖尿病视网膜病变、视力减退)、皮肤病(真皮萎缩变薄、弹性增生和皮肤皱纹、皮脂腺增生或发育不全、老年性雀斑等色素沉着异常、头发花白、脱发或稀疏、慢性皮肤溃疡)、自身免疫性疾病(例如,风湿性多肌痛(PMR)、巨细胞动脉炎(GCA)、类风湿性关节炎(RA)、晶体关节病和脊椎关节病(SPA))、内科代谢功能障碍(例如,成人垂体功能减退症、甲状腺功能减退症、淡漠性甲状腺毒症、骨质疏松症、糖尿病、肾上腺功能不全、各种形式的性腺功能减退症和内分泌恶性肿瘤)、肌肉骨骼疾病(例如,关节炎、骨质疏松症、骨髓瘤、痛风、Paget病、骨骨折、骨髓衰竭综合征、强直、弥漫性特发性骨肥厚、血源性骨髓炎、肌肉萎缩、周围神经病变、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、杜氏肌营养不良症、原发性侧索硬化症和重症肌无力),消化系统疾病系统(例如肝硬化、肝纤维化、巴雷特食管)、呼吸系统疾病(例如肺纤维化、慢性阻塞性肺病、哮喘、慢性支气管炎、肺栓塞(PE)、肺癌和感染)、与细胞增殖相关的病症,以及任何其他与衰老相关的疾病和病症。
如本文所用,术语“涉及软骨退化的疾病或病症”是涉及软骨和/或关节退化的任何疾病或病症。术语“涉及软骨退化的疾病或病症”包括影响动物(包括人类)的椎间盘或关节(例如,关节)的病症、病症、综合征、疾病和损伤,并且包括但不限于关节炎、软骨畸形、脊柱关节病、强直性脊柱炎、红斑狼疮、复发性多软骨炎和干燥综合征。术语“肌肉退化疾病或病症”是涉及肌肉退化的任何疾病或病症。该术语包括病症、障碍、综合征、
影响肌肉组织的疾病和损伤,例如但不限于肌肉萎缩、肌肉废用、肌肉撕裂、烧伤、手术、周围神经病变、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、杜氏肌营养不良症、原发性侧索硬化症、重症肌无力、癌症、艾滋病、充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝病、肾衰竭、饮食失调、营养不良、饥饿、感染或糖皮质激素治疗。
与细胞增殖相关的病症是指由于细胞增殖引起的异常生长或延伸而发生的疾病(Walker,Cambridge Dictionary of Biology,Cambridge University Press:Cambridge,UK,1990)。增殖性疾病可能与:1)正常静止细胞的病理性增殖有关；2)细胞从其正常位置的病理迁移(例如,肿瘤细胞的转移)；3)基质金属蛋白酶(如胶原酶、明胶酶和弹性蛋白酶)等蛋白水解酶的病理表达；或4)病理性血管生成,如增殖性视网膜病变和肿瘤转移。示例性增殖性疾病包括癌症(即,恶性肿瘤”)、良性肿瘤、血管生成、炎症性疾病和自身免疫性疾病。
“癌症”是指一类以异常细胞的发展为特征的疾病,这些异常细胞不受控制地增殖并具有浸润和破坏正常身体组织的能力。示例性癌症包括但不限于听神经瘤；腺癌；肾上腺癌；肛门癌；血管肉瘤(例如淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、血管肉瘤)；阑尾癌；良性单克隆丙种球蛋白病；胆管癌(例如,胆管癌)；膀胱癌；乳腺癌(例如，乳腺腺癌、乳腺乳头状癌、乳腺癌、乳腺髓样癌)；脑癌(例如,脑膜瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤)、成神经管细胞瘤)；支气管癌；类癌瘤；宫颈癌(例如宫颈腺癌)；绒毛膜癌；脊索瘤；颅咽管瘤；结直肠癌(例如,结肠癌、直肠癌、结直肠腺癌)；结缔组织癌；上皮癌；室管膜瘤；内皮肉瘤(例如,卡波西肉瘤、多发性特发性出血性肉瘤)；子宫内膜癌(例如,子宫癌、子宫肉瘤)；食管癌(例如,食管腺癌、巴雷特腺癌)；尤因氏肉瘤；眼癌(例如眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)；熟悉的嗜酸性粒细胞增多症；胆囊癌；胃癌(例如,胃腺癌)；胃肠道间质瘤(GIST)；生殖细胞癌；头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌、口腔癌(例如口腔鳞状细胞癌)、咽喉癌(例如喉癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌))；造血系统癌症(例如,白血病,例如急性淋巴细胞白血病(ALL)(例如,B细胞ALL、T细胞ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)(例如,B细胞AML、T细胞AML)、慢性髓细胞性白血病白血病(CML)(例如,B细胞CML、T细胞CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)(例如,B细胞CLL、T细胞CLL))；淋巴瘤,例如霍奇金淋巴瘤(HL)(例如,B细胞HL、T细胞HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)(例如,B细胞NHL,例如弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)(例如,弥漫性大B细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区B细胞淋巴瘤(例如粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(即华氏巨球蛋白血症)、毛细胞白血病(HCL)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；和T细胞NHL,例如前体T淋巴母细胞淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)(例如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)(例如蕈样真菌病、Sezary综合征)、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤,结外自然杀伤T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤)；如上所述的一种或多种白血病/淋巴瘤的混合物；和多发性骨髓瘤(MM))、重链病(例如,α链病、γ链病、μ链病)；血管母细胞瘤；下咽癌；炎性肌纤维母细胞肿瘤；免疫细胞淀粉样变性；肾癌(例如肾母细胞瘤又名肾母细胞瘤、肾细胞癌)；肝癌(例如,肝细胞癌(HCC)、恶性肝细胞瘤)；肺癌(例如支气管癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌)；平滑肌肉瘤(LMS)；肥大细胞增多症(例如系统性肥大细胞增多症)；肌肉癌；骨髓增生异常综合征(MDS)；间皮瘤；骨髓增生性疾病(MPD)(例如,真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、特发性骨髓化生(AMM)又名骨髓纤维化(MF)、慢性特发性骨髓纤维化、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL),嗜酸性粒细胞增多综合征(HES))；成神经细胞瘤；神经纤维瘤(例如,1型或2型神经纤维瘤病(NF)、神经鞘瘤病)；神经内分泌癌(例如,胃肠胰腺神经内分泌肿瘤(GEP-NET)、类癌瘤)；骨肉瘤(例如,骨癌)；卵巢癌(例如,囊腺癌、卵巢胚胎癌、卵巢腺癌)；乳头状腺癌；胰腺癌(例如胰腺癌、导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)、胰岛细胞瘤)；阴茎癌(例如阴茎和阴囊佩吉特病)；松果体；原始神经外胚层肿瘤(PNT)；浆细胞瘤；副肿瘤综合征；上皮内肿瘤；前列腺癌(例如前列腺癌)；直肠癌；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；皮肤癌(例如,鳞状细胞癌(SCC)、角化棘皮瘤(KA)、黑色素瘤、基底细胞癌(BCC))；小肠癌(例如阑尾癌)；软组织肉瘤(例如,恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、脂肪肉瘤、恶性周围神经鞘瘤(MPNST)、软骨肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤)；皮脂腺癌；小肠癌；汗腺癌；滑膜瘤；睾丸癌(例如,精原细胞瘤、睾丸胚胎癌)；甲状腺癌(例如,甲状腺乳头状癌、甲状腺乳头状癌(PTC)、甲状腺髓样癌)；尿道癌；阴道癌；和外阴癌(例如佩吉特外阴病)。
本发明第四方面提供了药物组合物
药物组合物通常由主料和辅料构成，所述药物组合物可以用于预防也可以用于治疗，可以为标准化治疗也可以用于个性化治疗(细胞治疗、基因治疗)。
主料的选择主要为本发明第一、第二方面所提及的核酸元件、重组载体、重组细胞等为主要成分，可以通过串联方式形成重组载体，也可以通过单独构建载体，形成多种单独的转录因子进行混合形成混合物的方式。混合比例优选等比例混合，当然在维持相同活性功能的基础上，不同的比例也是被允许的。
本发明进一步提供了上述核酸元件、重组载体、重组细胞等在制备用于治疗通过介导细胞年轻化能够预防和治疗的疾病的药物中的用途。以及提供了用于治疗通过介导细胞年轻化能够预防和治疗的疾病的药物组合物。以及提供了，药物组合物，其用于治疗通过介导细胞年轻化能够预防和治疗的疾病。
当药物组合物为细胞的组合物时，尤其是再生细胞组合物时，还可包含一种或多种额外因子，例如营养素、细胞因子、生长因子、细胞外基质(ECM)组分、抗生素、抗氧化剂或免疫抑制剂以改善细胞功能或生存能力。
生长因子的例子包括但不限于成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子β(TGF-P)、上皮调节蛋白、表皮生长因子(“EGF”)、内皮细胞因子细胞生长因子(“ECGF”)、神经生长因子(“NGF”)、白血病抑制因子(“LIF”)、骨形态发生蛋白4(“BMP-4”)、肝细胞生长因子(“HGF”)、血管内皮生长因子-A(“VEGF-A”)和胆囊收缩素八肽。
在主料的基础上，可选的，所述药物组合物还包含一种以上的药学可接受的赋型剂、载体、辅料、媒介物。赋型剂、载体、辅料、媒介物的实例包括但不限于抗粘剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料、滑润剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、吸附剂、悬浮或分散剂或甜味剂。例示性赋型剂、载体、辅料、媒介物包括但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(一氢)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、蛋氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧基甲基纤维素钠、柠檬酸钠、乙醇酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维他命A、维他命E、维他命C及木糖醇。
所述药物组合物可呈注射制剂、口服制剂、吸入制剂或微针制剂的形式经制备。所述的注射制剂依据物态分类包括液体注射剂、注射用粉剂、注射用片剂；依据注射部分分类包括皮内注射剂、皮下注射剂、肌肉注射剂、静脉注射剂、腹腔注射、脊椎腔注射剂；优选的所述注射制剂的溶剂包括注射用水或生理盐水。优选静脉、肌肉、微针注射的方式。
用于口服使用的制剂包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、包括马铃薯淀粉的淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；制粒剂及崩解剂(例如，包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲纤维素钠、藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂及抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。用于口服使用的制剂也可呈可咀嚼片剂形式，或呈硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。粉剂、颗粒剂及丸剂可以使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥设备来制备。
用于口服制剂的其他药学上可接受的赋形剂包括但不限于着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂及缓冲剂。用于口服使用的制剂也可呈可咀嚼片剂形式，或呈硬明胶胶囊形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。粉剂、颗粒剂及丸剂可以使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥设备来制备。
所述注射制剂包括注射溶液、注射乳液、冻干剂、混悬注射剂等。注射制剂的辅料包括注射用水和至少一种增溶剂。所述增溶剂包括吐温80、乙醇、丙二醇、聚乙二醇400中的至少一种。优选地，所述增溶剂为吐温80或聚乙二醇400。注射制剂也包括但不仅限于蛋白纳米粒、环糊精包含物、脂质体、微球、储库型控释注射剂或无针注射释药系统。
组合治疗
本发明所涉及的核酸元件、重组载体、重组细胞，以及包含其的药物组合物，可以和其他药物进行组合治疗。以抗衰老治疗为例，启始阶段重编程也可以联合蛋白治疗，例如联合B18R蛋白，进行抗衰老治疗。
有益效果
细胞年轻化在重编程的早期就发生，而体细胞身份特征的丢失在重编程的中后期才发生，因此这里存在一个时间窗口，使得细胞年轻化的同时又能保持细胞原本的身份特征，这是部分重编程使细胞年轻化的技术原理。发明人发现转录因子失去相分离能力后，反而难以使重编程进入成熟阶段，从而滞留在启始阶段，使得细胞没有细胞身份丢失(Lossof cell identity)，因此会提高细胞年轻化程度的同时，有降低了生成iPSC的风险，并不会完全重编程，因此称为“启始阶段重编程”。通过功能基因的表型进行判断，确保细胞重编程阶段的验证，证明了细胞达到了年轻化的技术效果。
临床上，随着细胞衰老，细胞本身的功能逐渐下调，进而导致组织、器官以及系统层面发生衰老和紊乱。大量与年龄相关的疾病，包括但不限于神经退行性疾病，心血管和周围血管疾病，眼部疾病，皮肤病，自身免疫性疾病，代谢功能障碍，肌肉骨骼疾病，消化系统疾病，细胞增殖相关的病症以及肿瘤等，其根本原因即相关组织和器官的衰老和失调。通过对于特定组织和器官的细胞年轻化治疗，能够有效的缓解和治疗相关疾病，为广大人民造福。同时对健康寿命的延长有利于大大提高社会生产力，缓解医疗需求和压力，为老龄化社会创造新的财富。
附图说明
图1慢病毒载体构建。(A)慢病毒载体结构示意图；(B)慢病毒载体质粒酶切鉴定。
图2慢病毒质量检测。(A)慢病毒滴度检测和无菌检测结果；(B)慢病毒转导293T细胞后转基因KLF4的表达水平。
图3为实施例2用到的慢病毒载体的结构简图。
图4衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色实验。A)空白对照组染色结果代表性图片。B)OKMS重编程组染色结果代表性图片。C)O’KM’S重编程组染色结果代表性图片。D)各组SA-β-Gal染色阳性细胞比例统计。
图5皮肤成纤维细胞年轻化功能相关基因表达水平检测。OKMS重编程组与O’KM’S重编程组之间的差异显著性由t-检验确认。**：P<0.01，***：P<0.001。
图6皮肤成纤维细胞身份标志基因表达水平检测。OKMS重编程组与O’KM’S重编程组之间的差异显著性由t-检验确认。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。
图7.细胞重编程启始阶段标志基因表达水平检测。OKMS重编程组与O’KM’S重编程组之间的差异显著性由t-检验确认。**：P<0.01.
图8细胞重编程成熟阶段标志基因表达水平检测。OKMS重编程组与O’KM’S重编程组之间的差异显著性由t-检验确认。**：P<0.01，***：P<0.001。
图9细胞DNA甲基化表观遗传年龄(epiAge)分析结果。
图10实施例3用到的慢病毒载体的结构图谱
图11衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验。A)空白对照组染色结果代表性图片。B)OKM重编程组染色结果代表性图片。C)O’KM’重编程组染色结果代表性图片。D)各组染色阳性细胞比例统计。
图12皮肤成纤维细胞年轻化功能相关基因表达水平检测。OKM重编程组与O’KM’重编程组之间的差异显著性由t-检验确认。**：P<0.01，***：P<0.001。
图13皮肤成纤维细胞身份标志基因表达水平检测。OKM重编程组与O’KM’重编程组之间的差异显著性由t-检验确认。***：
图14细胞重编程启始阶段标志基因表达水平检测。OKM重编程组与O’KM’重编程组之间的差异显著性由t-检验确认。n.s.：不显著，***：P<0.001。
图15细胞重编程成熟阶段标志基因表达水平检测。OKM重编程组与O’KM’重编程组之间的差异显著性由t-检验确认。***：P<0.001。
图16AAV载体构建。(A)AAV-TRE3G-OKS载体结构示意图；(B)AAV-TRE3G-OKS载体质粒酶切鉴定；(C)AAV-TRE3G-O’KS载体结构示意图；(D)AAV-TRE3G-O’KS载体质粒酶切鉴定。
图17qPCR法测定AAV载体滴度。(A)原始扩增曲线组；(B)标准曲线；(C)AAV载体滴度测定结果。
图18部分重编程因子不同组合环状RNA载体构建。
图19部分重编程因子不同组合环状RNA成环验证。(A)2％ E-gel电泳结果显示MYC-circRNA,KLF4-circRNA,OCT4-P2A-SOX2-circRNA,Lin28A-P2A-Nanog-circRNA，如箭头所示具有环状RNA形成。(B和C)0.6％琼脂糖凝胶电泳30分钟(上)，及电泳90分钟(下)结果显示OSK-circRNA，O’SK-circRNA及O’KM’-circRNA,OKM-circRNA,OKMS-circRNA如箭头所示具有环状RNA形成。
图20部分重编程因子环状RNA转染HEK293T细胞，蛋白表达WB验证结果
图21野生型OKSMLN因子环状RNA转染成纤维细胞诱导iPSC，第7天后出现克隆。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1基因合成与慢病毒(LV)载体构建
1转录因子单元件序列设计
设计OCT4’以及变体OCT4’1-6的序列，参见SEQ ID NO:4-10，并设计对应的核苷酸序列，例如SEQ ID NO:3所示；设计C-MYC以及变体C-MYC的序列，参见SEQ ID NO：14-20，并设计对应的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：13所示；设计KLF4序列，参见SEQ ID NO:22，并设计对应的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：21所示；设计SOX2序列，参见SEQ ID NO：24，并设计对应的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：23所示。
设计连接子序列，P2A、T2A、E2A序列，例如SEQ ID NO：25-27所示；设计Kozak序列，GCCGCCACC；设计TRE3G启动子序列如SEQ ID NO：63所示；设计SV40 poly(A)序列，如SEQ IDNO：64所示
2构建转录因子元件串联的序列
通过上述元件连接构成串联的序列，仅为示例，可以是SEQ ID NO：28-33所示，名称分别为OCT4'-P2A-KLF4s-T2A-MYC'-E2A-SOX2串联序列(简称O’KM’S，对应SEQ ID NO:28)，OCT4-P2A-KLF4s-T2A-MYC-E2A-SOX2串联序列(简称OKMS，对应SEQ ID NO:29)，OCT4'-P2A-KLF4s-T2A-MYC'串联序列(简称O’KM’，对应SEQ ID NO:30)，OCT4-P2A-KLF4s-T2A-MYC串联序列(简称OKM，对应SEQ ID NO:31)，OCT4'-P2A-KLF4s-T2A-SOX2串联序列(简称O’KS，对应SEQ ID NO:32)，OCT4-P2A-KLF4s-T2A-SOX2串联序列(简称OKS，对应SEQ ID NO:33)。
3慢病毒载体构建与包装(由赛业生物科技有限公司执行)
3.1慢病毒载体构建：
1)基因合成
基因合成O’KM’S、OKMS、O’KM’和OKM片段。
2)载体骨架酶切
在载体骨架上选择合适的酶切位点进行酶切。
酶切使用NEB的CutSmart体系如下
酶切结束后点回收胶，使用胶回收试剂盒(NEB Monarch DNA)将条带回收回来，将需要的骨架片段和目的片段准备好，用于后续的连接实验。
3)连接转化
将上述合成基因以及其它相关元件分别依次与线性化的载体骨架进行连接。连接使用C115Infusion连接酶体系如下：
加样物料 体积
处理后的骨架 100ng
连接片段 50ng
2×酶混合物 5μL
无菌水 Up to 10μL
连接反应结束后，将对应抗性的平板提前拿至37℃培养箱倒置烘干，同时预热500μL无抗培养基；从-80℃冰箱拿出感受态工程菌，放置冰上15-20min直至融化，吸取连接液的一半至感受态中，用手轻弹5下，冰浴30min；迅速将感受态转移至预热好的42℃水浴锅中热击1min(热击时间为45-90s，时间控制严格)；热击时间结束，立马转移至冰上放置2min，再将感受态转移至提前预热好的500μl培养基中，放置37℃摇床1h；取菌液4000rpm/2min离心去上清(弃掉400μl上清)，将平板倒上20个左右玻璃珠，将菌液吸打混匀涂到对应抗性的平板上，放置对应温度培养箱过夜培养。
过夜培养后进行菌检打开超净台紫外，20min后关闭紫外并开启三档风，取75％乙醇擦拭超净台后开始菌检；于超净台上，加入25μl灭菌水至96孔PCR板底部，对着光检查底部有无空气；用手拿已灭菌10μl白色枪头轻轻蘸取过夜培养平板上的单克隆菌斑，挑到相应的96孔反应板中，使用10μl的排枪进行吹打混匀2-3次，逐排吸取4μl转移到新的96孔反应板中作为模板进行PCR反应。在原96孔板模板中加入50μl无抗肉汤培养基，盖上已灭菌的96孔PCR板盖后放置30℃培养箱。
4)菌检
菌检使用P222-AA Taq酶反应体系如下
加样物料 体系
2×Taq酶混合物 12.5μL
单菌落水悬液 4μL
2×酶混合物 2×0.75μL
无菌水 Up to 25μL
P222-AA Taq酶PCR反应程序
菌检反应结束后点TBE检测胶，核对条带大小是否和理论条带大小符合，然后接3.5mL Amp抗性肉汤培养基于48深孔板内，放置于37度摇床过夜培养。
5)质粒提取
质粒提取使用Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit(27106)试剂盒，将抽提好的质粒进行浓度测定，在1.5mL的EP管管壁上标注浓度，浓度大于50ng/μL为提取成功，可以进行酶切鉴定。
6)酶切鉴定
使用NTI/SnapGene软件在现有的内切酶的基础上寻找可用酶切方案，鉴定质粒是否正确，酶切体系如下
加样物料 体系
Buffer 2μL
单酶/双酶 0.7μL/0.5μL
质粒 600～800ng
无菌水 Up to 20μL
配好体系后放置于对应酶的适应温度45min，取出酶切好的体系，加5ul溴酚蓝/甲基橙点TAE检测胶后用凝胶成像仪拍照核对条带大小(结果见附图1)。
如果条带正确当天吸取30μL质粒准备送测。送至金唯智测序连接区域的序列。
7)质粒送测序
构建的质粒送到金唯智处进行测序，通过测序则证明载体构建成功。
物料情况
物料 来源
PCR酶 诺唯赞P515
PCR胶回收试剂盒 QIA Gel Extraction Kit(28706)
连接酶 诺唯赞C115
菌检Taq酶 诺唯赞P222
感受态细胞 唯地生物DH5α
质粒提取 QIAprep Spin Miniprep Kit(27106)试剂盒
PCR、菌捡和测序引物合成及基因合成 金唯智
构建成功的慢病毒载体，包括LV-TRE3G-OKM、LV-TRE3G-O’KM’、LV-TRE3G-OKMS、LV-TRE3G-O’KM’S，其质粒序列参见SEQ ID NO:34-37。
3.2慢病毒包装：
1)慢病毒质粒和辅助质粒(SL3、SL4和SL5)共传染到293T细胞中。
2)病毒收获：转染48小时后，离心收集细胞上清液。
3)转化浓缩：对上述细胞上清液进行PEG8000浓缩、蔗糖密度梯度超速离心等处理。
4)质量检测：物理状态检测、无菌检测和滴度检测等，滴度检测使用qPCR法(结果见附图2A)。
5)转基因表达检测：将上述慢病毒载体分别与表达TET3G的慢病毒载体共转导293T细胞，加强力霉素(dox)进行诱导表达。48h后提取RNA样本，使用转基因KLF4特异的引物检测转基因KLF4的表达水平(结果见附图2B)。
实施例2：四因子启始阶段重编程使人皮肤成纤维细胞年轻化
实验方案：
1)选取一株60岁以上女性供体来源的原代人皮肤成纤维细胞系FY-009，使用专用的表皮细胞培养基培养，传代，选择状态良好的细胞系用于后续病毒感染实验；
2)成纤维细胞体外培养第4代以后，接种于12孔板，待融合度40％左右，分为3组：第一组空白对照组，不添加病毒；第二组OKMS重编程组，加入慢病毒LV-TRE3G-OKMS和LV-EFS-Tet3G；第三组O’KM’S重编程组，加入慢病毒LV-TRE3G-O’KM’S和LV-EFS-Tet3G。(慢病毒载体由赛业生物科技有限公司制备，结构简图见附图3)。同时加入促进病毒感染效率的聚凝胺(polybrene)。
3)24h后弃掉上清，换成含20％胎牛血清的高糖DMEM培养液
4)继续换液，加入强力霉素(dox)诱导转录因子表达，此后两天换一次液
5)加dox诱导14天后，收集各组细胞用于检测。
6)对各组细胞进行衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色，检测其衰老程度(实验结果见附图4)。结果显示两个重编程组均能使细胞年轻化，而O’KM’S重编程组的年轻化程度更高。
7)提取各组细胞RNA样品，进行实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)，检测年轻化功能相关基因：COL1A1、COL3A1、COL4A1、FN1、LAMA5(实验结果见附图5)；检测成纤维细胞身份特征基因：THY1、P4HB、S100A4、SERPINH1(实验结果见附图6)；检测重编程启始阶段特征基因：NANOG、SALL4(实验结果见附图7)；检测重编程成熟阶段特征基因：DPPA5、LIN28A(实验结果见附图8)。结果O’KM’S重编程组比OKMS重编程组使细胞表达显著更高的年轻化功能相关基因以及身份特征基因，而且从重编程阶段特征基因来看，前者仍处于启始阶段，后者已进入成熟阶段。
8)收集各组细胞进行甲基化芯片检测，对检测结果进行epiAge分析(分析结果见附图9)。结果显示空白对照组的epiAge在60岁以上，与供体实际年龄接近。OKMS部分重编程组使细胞的epiAge下降至42岁，而O’KM’S部分重编程组使细胞的epiAge下降得更低至39岁。
实施例3：3因子启始阶段重编程使人皮肤成纤维细胞年轻化
实验方案：
1)人皮肤成纤维细胞用专用的表皮细胞培养液培养，传代，选择状态良好的细胞系用于后续病毒感染实验；
2)成纤维细胞体外培养第4代以后，接种于12孔板，待融合度40％左右，分为3组：第一组空白对照组，不添加病毒；第二组OKM重编程组，加入慢病毒LV-TRE3G-OKM和LV-EFS-Tet3G；第三组O’KM’重编程组，加入慢病毒LV-TRE3G-O’KM’和LV-EFS-Tet3G。(慢病毒载体由赛业生物科技有限公司制备，结构简图见附图10)。同时加入促进病毒感染效率的聚凝胺(polybrene)。
3)24h后弃掉上清，换成含20％胎牛血清的的高糖DMEM培养液
4)继续换液，加入强力霉素(dox)诱导转录因子表达，此后两天换一次液
5)加dox诱导14天后，收集各组细胞用于检测。
6)对各组细胞进行衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色，检测其衰老程度(实验结果见附图11)。结果显示两个重编程组均能使细胞年轻化，但OKM重编程组的使细胞年轻化的程度较低，而O’KM’重编程组的年轻化程度较高。
7)提取各组细胞RNA样品，进行实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)，检测年轻化功能相关基因：COL1A1、COL3A1、COL4A1、FN1、LAMA5(实验结果见附图12)；检测成纤维细胞身份特征基因：THY1、P4HB、S100A4、SERPINH1(实验结果见附图13)；检测重编程启始阶段特征基因：NANOG、SALL4(实验结果见附图14)；检测重编程成熟阶段特征基因：DPPA5、LIN28A(实验结果见附图15)。结果O’KM’重编程组比OKM重编程组使细胞表达显著更高的年轻化功能相关基因以及身份特征基因，而且从重编程阶段特征基因来看，前者仍处于启始阶段，后者已进入成熟阶段。
实施例4基因合成与腺相关病毒(AAV)载体构建
1转录因子单元件序列设计
设计OCT4’以及变体OCT4’1-6的序列，参见SEQ ID NO:4-10，并设计对应的核苷酸序列，例如SEQ ID NO:3所示；设计C-MYC以及变体C-MYC的序列，参见SEQ ID NO：14-20，并设计对应的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：13所示；设计KLF4序列，参见SEQ ID NO:22，并设计对应的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：21所示；设计SOX2序列，参见SEQ ID NO：24，并设计对应的核苷酸序列，例如SEQ ID NO：23所示。
设计连接子序列，P2A、T2A、E2A序列，例如SEQ ID NO：25-27所示。设计Kozak序列，gccgccaccatgg；设计TRE3G启动子序列，如SEQ ID NO:63所示，设计hGH poly(A)序列如SEQID NO:65所示。
2构建转录因子元件串联的序列
通过上述元件连接构成串联的序列，仅为示例，可以是SEQ ID NO：32-33所示，名称分别为OCT4'-P2A-KLF4s-T2A-SOX2串联序列(简称O’KS，对应SEQ ID NO:32)，OCT4-P2A-KLF4s-T2A-SOX2串联序列(简称OKS，对应SEQ ID NO:33)
3AAV载体构建与包装(由赛业生物科技有限公司执行)
3.1AAV载体构建：
1)在AAV骨架质粒上选择合适的酶切位点组合，将AAV骨架质粒和酶在37℃孵育1小时，随后通过琼脂糖凝胶电泳回收对应的酶切后线性骨架质粒。
2)基因合成OKS和O’KS片段，将基因片段以及其它相关元件分别通过同源重组试剂盒(诺唯赞，C115)克隆到线性骨架质粒上，将反应体系转化感受态细菌，涂板、挑菌、摇菌、提取。进行酶切鉴定和测序鉴定。
3)酶切和测序鉴定结果确认无误后(酶切鉴定结果见附图16)，选正确菌液的质粒再进行一次转化感受态细菌，涂板、挑菌、扩增、提取为AAV包装所需的质粒，包括AAV-TRE3G-OKS、AAV-TRE3G-O’KS，其质粒序列参见SEQ ID NO:38-39。
3.2AAV包装：
1)AAV病毒质粒、辅助质粒和包装质粒共传染到293T细胞中。
2)病毒收获：转染48小时后，离心收集细胞上清液。
3)转化浓缩：对上述细胞上清液进行PEG8000浓缩、蔗糖密度梯度超速离心等处理。
4)质量检测：物理状态检测、无菌检测和滴度检测等，滴度检测使用qPCR法(滴度检测结果见附图17)。
实施例5基因合成与环状mRNA载体构建
1.部分重编程因子不同串联组合环状RNA载体构建
a)部分重编程因子不同串联组合环状RNA的设计：分别设计单基因，双基因，三基因及四基因串联体，不同基因之间以P2A,T2A,E2A串联肽进行串联。不同基因串联组合的载体结构示意图见附图18及，见表1.
b)成环元件选择：采用来自于金鱼藻属的Anabaena group I intron或固氮弧菌属Azoarcussp.BH7的group I intron重排，形成的成环框架PIE(permuted intron-exon)结构，将不同的部分重编程因子组合目的基因序列重组于PIE框架内，并重组至pBlueScript IISK(+)质粒中
AnaPIE元件：
5’元件序列如SEQ ID NO：49所示；3’元件序列如SEQ ID NO：50所示AzoPIE元件：
5’元件序列：如SEQ ID NO：51所示；3’元件序列：如SEQ ID NO：52所示
c)质粒合成：重组后的质粒委托第三方序列合成公司进行合成，合成后的质粒采用EcoR I进行模板线性化处理，得到转录前模板
2.部分重编程因子不同串联组合环状RNA制备及成环验证
a)环状RNA体外转录及环化：
体外转录体系如下：表2
于PCR仪中37℃孵育3h，然后用DNase I(5U/μL)消化线性DNA模板，消化浓度：5U/μg DNA模板，消化条件：37℃消化20min
环化反应：
配制环化体系，环化体系如下：表3
将配制好的环化体系放置于PCR仪中60℃孵育20min
b)环状RNA纯化及鉴定：
将环化体系转移至1.5mL离心管中，加入0.5倍体积的浓度为7.5M的氯化锂和50mMEDTA的RNA沉淀溶液，混匀于-20℃冰箱沉淀1h。沉淀完成后，4℃下18360×g离心15min，尽量去除上清。加入800μL的70％的乙醇溶液，吹洗沉淀，相同条件再次离心，尽量去除上清后挥干乙醇，每个实验组用100μL无酶水重悬。测定含量浓度值及1％琼脂糖凝胶电泳、或2％E-Gel电泳鉴定circRNA大小。电泳结果显示有环状RNA形成，结果见附图19.
3.部分重编程因子真核细胞转染蛋白表达验证
a)细胞制备及mRNA转染：
取一瓶T75培养的HEK293T/17细胞，在细胞汇合度为80％-90％时进行铺板。弃培养基，加入PBS清洗，弃PBS，加入0.05％胰酶消化细胞，待细胞变圆，弃去胰酶，用10mL不含抗生素的10％FBS细胞培养基吹打细胞使之分散。细胞计数，调整细胞浓度至1×106cells/mL±10％，取10块48孔板，分别接种0.2mL细胞悬液，并将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱培养24小时±4小时
将MYC-circRNA,KLF4-circRNA,OCT4-P2A-SOX2-circRNA,Lin28A-P2A-Nanog-circRNA各0.4ugcircRNA溶于25μL无血清DMEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟。将1μLLipohigh转染试剂溶于25μL无血清DMEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5分钟。将上步含有LipoHigh的培养基加入含有circRNA的培养基中，轻轻混匀，室温静置20分钟。从培养箱中取出细胞培养板，逐滴滴入接种好的细胞中，轻轻混匀后置于37℃，5％ CO2培养箱中进行培养。4～8小时后，弃液，加入0.5mL含2％FBS的培养基继续培养。
b)西方印迹分析(Western blot,WB)结果见附图20，结果显示环状RNA：MYC-circRNA,KLF4-circRNA,OCT4-P2A-SOX2-circRNA,Lin28A-P2A-Nanog-circRNA均能够表达相应的蛋白。
4.野生型OKSMLN环状RNA转染成纤维细胞诱导iPSC，功能验证实验：将人皮肤成纤维细胞种植于12孔板，生长至汇合度80％-90％。使用转染试剂LipofectamineMessengerMAX(赛默飞世尔科技)包裹环状RNA:MYC-circRNA,KLF4-circRNA,OCT4-P2A-SOX2-circRNA,Lin28A-P2A-Nanog-circRNA，按2μg总mRNA/孔的量与成纤维细胞共孵育，进行转染，24h后，终止转染，观察细胞生长情况。转染后第7天，继续观察细胞生长情况，观察是否有克隆出现，结果见附图21。结果显示，野生型OSKMLN环状RNA能够成功诱导成纤维细胞产生多能干细胞样克隆。
环状RNA序列
MYC环状RNA MYC-circRNA SEQ ID NO：53
KLF4环状RNA KLF4-circRNA SEQ ID NO：54
Lin28A-P2A-Nanog环状RNA LN-circRNA SEQ ID NO：55
OCT4-P2A-SOX2环状RNA OS-circRNA SEQ ID NO：56
OCT4'-P2A-SOX2-T2A-KLF4s环状RNA O'SK-circRNA SEQ ID NO：57
OCT4-P2A-SOX2-T2A-KLF4s环状RNA OSK-circRNA SEQ ID NO：58
OCT4'-P2A-KLF4s-T2A-MYC'环状RNA O'KM'-circRNA SEQ ID NO：59
OCT4-P2A-KLF4s-T2A-MYC环状RNA OKM-circRNA SEQ ID NO：60
OCT4'-P2A-KLF4s-T2A-MYC'-E2A-SOX2环状RNA O'KM'S-circRNA SEQ ID NO：61
OCT4-P2A-KLF4s-T2A-MYC-E2A-SOX2环状RNA OKMS-circRNA SEQ ID NO：62

Claims (40)

1.一种细胞年轻化方法，其特征在于，使用无相分离工程化重编程因子介导细胞启始阶段重编程。
2.根据权利要求1所述的方法，所述年轻化的判断方式为，与参考值相比，表观遗传学标记基因表达水平相对于参考值升高或降低。
3.权利要求1所述的方法，所述细胞年轻化的表现为，再生细胞表现衰老相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)阳性细胞比例的变化，所述变化为相对于参考值降低。
4.权利要求2所述的方法，所述细胞年轻化的表征为，相对于参考值，细胞DNA甲基化表观遗传年龄epiAge水平降低和/或年轻化功能相关基因表达水平提升；和/或重编程启始阶段特征基因表达水平提升；和/或重编程成熟阶段特征基因表达水平下降；和/或细胞身份基因表达水平提升。
5.权利要求4所述的方法，所述年轻化功能相关基因包括COL1A1、COL3A1、COL4A1、FN1、LAMA5；所述检测重编程启始阶段特征基因包括NANOG、SALL4；所述检测重编程成熟阶段特征基因包括DPPA5、LIN28A；所述检测细胞的身份基因包括THY1、P4HB、S100A4、SERPINH1。
6.一种细胞启始阶段重编程方法，其特征在于，使用包含无相分离工程化重编程因子的元件导入细胞中实现。
7.一种无相分离工程化转录因子，其特征在于，能够介导细胞启始阶段重编程。
8.权利要求1-7中所述的无相分离工程化转录因子，其特征在于，所述工程化无相分离重编程因子，基于对转录因子的相分离功能相关区域的修饰，使得转录因子失去了引发相分离的功能。
9.权利要求8所述的工程化转录因子，所述修饰包括对转录因子蛋白IDR区进行氨基酸的修饰、部分缺失处理、泛素化突变。
10.根据权利要求9所述的工程化转录因子，进一步的，可以对蛋白IDR区的极性带电氨基酸或酸性氨基酸进行突变；进一步的可以将极性带电荷氨基酸或酸性氨基酸替换为中性氨基酸；更进一步的，可以将酸性氨基酸例如天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)突变为中性氨基酸，例如丙氨酸。
11.根据权利要求10所述的工程化转录因子，可以对SEQ ID NO：2所示的序列的1-140位和/或288-360位进行突变，所述位置包含前后10-20个氨基酸的误差范围。
12.根据权利要求10所述的工程化转录因子，可以对SEQ ID NO：2所示的序列的8、20、31、108、138、291、297；26、56、68、91、96、98、104、113、125、127、130、134、135、296、299、341、343、145、147、166、188、209、210、215、224、238、246、270、272中至少一个位置进行突变。
13.根据权利要求11或12所述的工程化转录因子，突变后得到的序列可以为SEQ IDNO：4-10中任意一个所示，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
14.权利要求9所述的工程化转录因子，所述修饰可以为不产生多泛素链修饰的突变方式；进一步的，可以是赖氨酸K替换成不产生泛素链修饰的氨基酸；进一步的，可以替换为精氨酸R。
15.根据权利要求14所述的工程化转录因子，可以对SEQ ID NO：12的第51、52、126、143、148、157、206、269、275、289、298、317、323、326、341、355、371、389、392、397、398、412、422、428、430位中至少一个位置进行突变处理。
16.根据权利要求15所述的工程化转录因子，进一步的优选对148、389氨基酸中至少一个进行突变处理；优选对第20-25位的氨基酸进行突变处理；优选对权利要求15所述的所有位置进行突变处理。
17.根据权利要求16所述的工程化转录因子，突变后得到的序列可以为SEQ ID NO:14-20所示的变体作为示例，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
18.权利要求9所述的工程化转录因子，所述部分缺失处理，在于对蛋白的相分离关键调控区域缺失处理，或对产生相分离具有关键作用的氨基酸缺失处理。
19.权利要求18所述的工程化转录因子，所述部分缺失处理优选末端缺失处理，或者对IDR区进行缺失处理，或者对DBD以外的非关键区域进行缺失处理；优选的，对IDR区带电氨基酸部分缺失处理，或者对泛素化链修饰的关键氨基酸进行缺失处理。
20.根据权利要求19所述的工程化转录因子，所述对泛素化链修饰的关键氨基酸为赖氨酸。
21.根据权利要求19所述的工程化转录因子，可以对SEQ ID NO：21-22所示的SOX2序列进行部分删除；优选对2-40位和/或201-317位进行全部或删除处理，得到例如SEQ ID NO：41-43所示的氨基酸序列，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
22.根据权利要求19所述的工程化转录因子，可以对SEQ ID NO：1-2所示的OCT4的序列进行部分删除；优选对2-140位和/或C端288-360位进行全部或删除处理，得到例如SEQ IDNO：44-46所示的氨基酸序列，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
23.根据权利要求19所述的工程化转录因子，可以对SEQ ID NO：11-12所示的c-MYC的序列进行部分删除；优选对2-360位进行全部或部分缺失处理，得到例如SEQ ID NO：47-48所示的氨基酸序列，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
24.能够表达权利要求7-23中所述工程化转录因子的核酸。
25.权利要求24所述的核酸，包括SEQ ID NO：3、13、21，或者能够达到相同功能的至少85％或90％或95％以上同一性的序列。
26.一种包含权利要求7-25中所述工程化转录因子的元件，包括DNA、RNA、重组载体、重组蛋白、重组细胞；优选的，所述重组载体可以为腺相关病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体等。
27.权利要求25所述的元件，所述RNA元件，进一步的可以是线性mRNA元件、siRNA元件、环状RNA元件、环状mRNA元件、tRNA元件等。
28.权利要求25所述的元件，所述重组载体，可以为单顺反子、双顺反子或多顺反子，通过至少一种连接肽连接。
29.权利要求26所述的元件，所述重组载体可以为多个转录因子串联而成，可以通过或不通过至少一种连接肽连接，进一步的，所述连接肽可以选自SEQ ID NO：25-27所示。
30.根据权利要求7-25所述的工程化转录因子或权利要求26-29所述的元件，其特征在于，选自OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、L-MYC、LIN28、NANOG和GLIS1中至少一个。
31.根据权利要求30所述的工程化转录因子或元件，工程化转录因子可以顺次串联连接，连接顺序可以为OCT4-SOX2，LIN28-NANOG、OCT4-SOX2-KLF4、OCT4-KLF4-c-MYC、OCT4-KLF4-c-MYC-SOX2。
32.根据权利要求31所述的工程化转录因子或元件，所述串联序列可以为SEQ ID NO：28-33所示，所述重组载体的序列可以为SEQ ID NO：34-39所示。
33.一种工程化转录因子，所述转录因子中至少一个经过了权利要求8-23所述的转录因子修饰。
34.一种递送系统，用于递送权利要求26-32所述的元件。
35.根据权利要求34所述的递送系统，进一步的可以为脂质体LNP、外泌体递送、GalNAc系统、VLP递送、鱼精蛋白、高分子聚合物、无机纳米颗粒、外泌体、聚合物基质、病毒转染等。
36.权利要求7-25中所述的工程化转录因子或权利要求26-32中所述的包含工程化转录因子的元件或权利要求34-35所述的递送系统在细胞疗法、基因治疗、免疫细胞增殖、癌症治疗、衰老相关疾病治疗中的用途，或在用于制备用于细胞疗法、基因治疗、免疫细胞增殖、癌症治疗、衰老相关疾病治疗的药物中的用途。
37.一种药物组合物，包含至少一种权利要求7-25中所述的工程化转录因子或权利要求26-32中所述的包含工程化转录因子的元件或权利要求34-35所述的递送系统。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，所述药物组合物可以是混合物。
39.一种组合治疗的方法，使用权利要求37-38所述的药物组合物与其他关联性药物进行组合使用。
40.一种组合治疗的方法，使用权利要求37-38所述的药物组合物与B18R蛋白进行组合治疗。
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