CN119431549B - 一种LTα1β2体外表达生产方法 - Google Patents

Abstract

本专利涉及一种成本低、活性高的分泌型LTα1β2细胞因子的体外表达方法。通过去除LTα亚基的信号肽序列，LTβ亚基的跨膜结构域和信号肽序列，亚基之间通过G4S柔性连接子，将1个LTα亚基和2个LTβ亚基连接在一起，并在该蛋白复合物C端加上6×his标签，然后将其构建到pPIC9K质粒上，利用毕赤酵母表达系统表达出分泌型LTα1β2。之后通过镍柱纯化，超滤透析至1×PBS中。后续通过Q‑PCR、WB、流式细胞术实验方法验证其具备较高活性。

Description

一种LTα1β2体外表达生产方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种LTα1β2体外表达生产方法。

背景技术

淋巴毒素α(LTα)又称TNFβ，最初在20世纪60年代被描述为一种由活化淋巴细胞产生的细胞毒因子，能够杀死转化细胞系。LTα形成可溶性同型三聚体(LTα3)，后者可与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、TNFR2和HVEM(Herpesvirusentrymediator)结合。

当与具有跨膜结构域的淋巴毒素β(LTβ)共表达时，LTα形成细胞表面结合异型三聚体(LTα1β2)，后者可专门与LTβ受体(LTβR)结合。LTα1β2由淋巴细胞表达，例如活化T淋巴细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)和3型先天淋巴细胞(ILC3)。LTβR主要由基质细胞表达，包括内皮细胞、间充质细胞和上皮细胞，以及髓样细胞，例如树突状细胞(DC)和巨噬细胞。这种特定的表达模式意味着LTα1β2/LTβR相互作用充当淋巴细胞和基质细胞之间的通讯信号。现有的研究也表明LTα1β2在淋巴器官发育中起主导作用。

除了淋巴器官发生之外，有相关研究还表明，淋巴毒素成员控制着不同免疫细胞的发育和稳态，以及免疫反应的许多方面。例如，LTβR促进NK和NKT细胞的发育。LT成员对于生发中心的形成和体液免疫至关重要。病毒感染后，LTβR信号转导还控制淋巴器官的基质细胞和巨噬细胞中I型干扰素的产生。此外，另有研究表明，在已建立的CT26细胞系衍生的皮下肿瘤中，单克隆抗体(mAb)介导的LTβR激活会导致T细胞浸润(可能由促炎趋化因子介导)和肿瘤坏死。重组LTα1β2和LIGHT蛋白或激动剂LTβRmAb可以抑制人结肠癌和软组织肉瘤细胞系的体外生长，这支持了免疫细胞通过LTβR与肿瘤细胞相互作用以抑制自发性肿瘤发展的观点。同样，Yang等人利用肉瘤转移到肺部的同基因小鼠模型以及肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的过继转移，先前证明了LTβR是体内CTL介导的肿瘤排斥的直接效应物.关于机制，激动剂mAb刺激LTβR诱导caspase和线粒体依赖性细胞凋亡，并激活人类癌细胞系中的经典和替代NF-κB通路.此外，NF-κB抑制可促进CT26结肠癌细胞体内转移潜能，这表明在这种情况下，LTβR介导的细胞凋亡和NF-κB信号通路的激活可能协同作用以抑制肿瘤发展。

除此之外，另有研究表明，LTα1β2和LIGHT配体在T细胞等免疫细胞中表达，NK细胞或DC可能与肿瘤细胞上的LTβR结合，从而引发抗肿瘤细胞毒性。然而，这些研究中的肿瘤细胞死亡是由重组配体和/或LTβR激动剂抗体诱导的，这可能无法反映免疫细胞表面表达的配体的生理水平和活性。重组配体或激动剂抗体体外诱导的LTβR激活和下游信号通路可能取决于受体寡聚化的持续时间和程度尽管如此，LTβR介导的肿瘤抑制作用，无论是通过激动剂mAb，或过继转移的肿瘤特异性CTL，被提出作为一种治疗方法来阻止肿瘤生长并克服结肠癌和软组织肉瘤化疗和放疗的耐药性。

LTβ蛋白由较短的N端CD、TMD和C端ECD组成，LTα缺乏TMD。因此，当在缺乏LTβ的情况下表达时，LTα形成可溶性LTα3同源三聚体，主要通过疏水侧链和芳香侧链之间的相互作用来稳定，当LTα与LTβ一起表达时，这些蛋白质会寡聚化，产生细胞表面LTα1β2异三聚体。LTα2β1异三聚体也可以形成，但这些异三聚体只在体外可检测到，占总LTαβ异三聚体的10％以下。LTα亚基主要对异三聚体的构象作出贡献，而LTβ亚基为LTα1β2提供膜锚，并赋予LTβR结合特异性淋巴细胞中的LTB表达是组成性的，但LTA表达不是，但两者都是由细胞刺激诱导的。小鼠LTαcDNA编码202个氨基酸(aa)的分泌性可溶性蛋白，具有33个aa信号序列。成熟小鼠LTα与人类LTα具有75％的aa序列同一性。小鼠LTβcDNA编码306aa的II型膜蛋白，具有27aa的N端胞质结构域、21aa的跨膜区和258aa的胞外结构域。它与人类LTβ在其胞外结构域的共同区域内具有73％的aa序列同一性。分泌的LTα组装成可溶性同型三聚体LTα3。此外，分泌的LTα还与膜相关LTβ复合，生成两种异型三聚体，LTα1/β2和LTα2/β1。可溶性LTα3可与TNFRI(p55)和TNFRII(p75)结合。相反，主要的膜结合异三聚体LTα1/β2仅与淋巴毒素β受体(LTβR)结合。LTα2/β1能够与LTβR、TNFRI(p55)和TNFRII(p75)结合。LT在正常淋巴器官发生中发挥作用。

尽管目前市面上的商品化LTα1β2在其功能和应用方面表现出色，然而，其高昂的价格限制了广大研究人员的使用。这使得许多实验室和研究机构无法充分利用该试剂进行创新研究和开展相关实验，尤其对于体内动物实验，所需LTα1β2剂量更大，成本更高，极大限制实验的顺利开展。因此，有必要提供一种降低LTα1β2成本同时保持优良的性能的LTα1β2体外表达生产方法。

发明内容

针对这一问题，本专利提供了一种经济高效的替代方法，旨在降低LTα1β2成本同时保持优良的性能。通过采用本专利所揭示的新技术，研究人员可以在更经济的条件下获得高品质的LTα1β2，从而有效推动科学研究的进展。因此，本专利的优点在于弥补了现有商品化LTα1β2的价格限制，为研究人员提供了更加经济可行的选择，同时不降低LTα1β2的质量和性能。

本发明的目的在于提供一种LTα1β2的简单高效、低成本、高活性的生产方法。以降低淋巴组织发育及相关疾病，包括各种癌症肿瘤的研究成本。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种细胞因子LTα1β2体外表达生产方法，所述方法包括以下步骤：

S1、构建pPIC9K-mLTα1β2-His质粒：删除LTα氨基酸序列的信号肽序列，同时删除LTβ的跨膜结构域，用G4S柔性连接子将一个LTα和两个LTβ连接，并在C端加上6×His标签，获得mLTα1β2-His片段，将编码mLTα1β2-His片段的核苷酸序列构建到pPIC9K质粒中，获得pPIC9K-mLTα1β2-His质粒，并对密码子进行优化；

S2、去除pPIC9K-mLTα1β2-His质粒的内毒素；

S3、将S2获得的pPIC9K-mLTα1β2-His质粒通过SalⅠ单酶切线性化，并胶回收；

S4、制备毕赤酵母感受态细胞；

S5、将S3获得的线性化pPIC9K-mLTα1β2-His质粒电转入毕赤酵母感受态细胞；

S6、通过MD培养基和G418固体培养基，筛选出电转阳性，且高拷贝的菌株；

S7、提取酵母基因组DNA；

S8、QRT-PCR检测并选出拷贝数相对较高的菌株送测序，选择测序结果正确菌株，用作后续表达酵母株；

S9、对S8筛选出的菌株进行发酵，收集菌液上清；

S10、镍柱纯化，对镍柱洗脱液进行超滤透析，获得LTα1β2。

进一步的，S1所述LTα氨基酸序列的信号肽序列位于SEQ ID NO.1所示LTα氨基酸序列的1-58位，所述LTβ的跨膜结构域位于SEQ ID NO.2所示LTβ氨基酸序列的1-152位。

编码S1所述LTα的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，信号肽序列位于LTα核苷酸序列的1-174位；编码所述LTβ的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，跨膜结构域位于SEQ IDNO.6所示LTβ核苷酸序列的1-456位。

进一步的，S1所述编码mLTα1β2-His片段的核苷酸序列构建到pPIC9K质粒的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点之间。

进一步的，S1所述mLTα1β2-His片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，S1所述编码mLTα1β2-His片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(SEQID NO.4所示序列的终止密码子后的8个碱基为是酶切位点)。

进一步的，S4所述毕赤氏酵母为GS115。

进一步的，S9所述发酵为将菌株接种于BMGY培养基，28℃，250rpm摇菌至OD600＝5，4℃，1500g离心3min，使用100ml BMMY培养基重悬至OD600＝1，每24h添加甲醇使甲醇终浓度为1％，发酵96小时后，将菌液进行离心，4℃，12000rpm离心10min，收集菌液上清。

进一步的，S10所述超滤的分子截留量为10KD。

进一步的，所述方法还包括S11、活性检测。

本发明有益效果在于：

本发明首次公开了一种分泌型LTα1β2细胞因子的体外表达纯化的方法，并成功表达出具有高活性的LTα1β2细胞因子，大大减轻关于次级淋巴器官发育、非经典信号通路、及相关肿瘤疾病等研究的成本。

附图说明

图1是pPIC9K-mLTα1β2-His质粒构建图谱；

图2是多拷贝菌株测序结果；

图3是纯化LTα1β2的western blot结果(his标签抗体)；

图4是不同浓度LTα1β2刺激CT-26、Bend.3和MEF细胞24h后p100/p52的westernblot结果，其中，图4A是CT-26细胞，图4B是Bend.3细胞，图4C是MEF细胞；

图5是不同浓度LTα1β2刺激Bend.3细胞24h后MAdCAM-1的mRNA表达量的Q-PCR结果；

图6是不同浓度LTα1β2刺激Bend.3细胞48h后MAdCAM-1的流式分析结果；

图7是不同浓度LTα1β2刺激Bend.3细胞48h后LTβR的流式分析结果。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

1、质粒构建(酵母密码子优化)

删除LTα的信号肽序列(SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的1-58位)，同时删除LTβ的信号肽序列和跨膜结构域(SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的1-152位)，用G4S柔性连接子将一个LTα和两个LTβ连接(共三个亚基)，使其同时表达，大大增加LTα1β2的组合概率，并在C端加上6×His标签，获得mLTα1β2-His的氨基酸片段(SEQ ID NO.3)。将编码mLTα1β2-His片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)构建到pPIC9K质粒的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点之间，并对密码子进行优化。质粒图谱如图1所示(该质粒含有毕赤酵母表达分泌蛋白所需信号肽)。将构建好的pPIC9K-mLTα1β2-His质粒送公司测序，检测其中mLTα1β2是否正确(见图2)

2、质粒去内毒素提取

此步骤涉及天根的内毒素质粒大提试剂盒(DP117)

(1)取100ml过夜培养的菌液加入离心管，室温8,000rpm离心3min。收集细菌沉淀。

(2)尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

(4)向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。

(5)向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8,000rpm离心5-10min，使白色沉淀离至管底(可适当增加离心时间)，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中。

(6)向吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液BL8,000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒，混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)。

(8)室温8,000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。

(9)向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW，8.000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(10)重复操作步骤9。

(11)向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇，室温8,000rpm离心2min，倒掉废液。

(12)将吸附柱CP6重新放回收集管中，8,000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(13)将吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml ddH₂O，室温放置5min，然后室温8,000rpm离心2min。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，-20℃保存，或直接进行下游实验。

3、pPIC9K-mLTα1β2-His质粒线性化

线性化体系：

pPIC9K质粒：20ug

SalⅠ：20ul

10X Buffer CutC：100ul

ddH₂O：补齐至1000ul

37℃酶切2h，以切胶回收试剂盒回收纯化线性化质粒，并进行浓度测定，取小部分酶切产物凝胶。分析，以确定酶切产物是否酶切完全。如酶切不完全，转化数及靶向效率都会降低。4、毕赤氏酵母GS115感受态细胞制备

(1)四区划线法涂板：接种环蘸取少许毕赤氏酵母GS115酵母，在含氨苄抗性的YPD固体培养基上，四区划线，以获得单克隆菌株。

(2)恒温培养：将划线平板倒置，28－30℃培养2天，以得到分散的单克隆(酵母培养温度不超过32℃)。

(3)从YPD平板上挑取单菌落于含20mL YPD的250mL三角瓶中，250r/min,30℃过夜；

(4)将上述毕赤酵母培养液取200ul菌液，加入100ml含双抗的YPD培养基的500ml锥形瓶中，250r/min,30℃摇床培养，直至OD600＝1.3-1.5；

(5)收取菌液，1500g，4℃离心5min；

(6)500ml预冷灭菌水重悬。4℃，1500g离心5min；

(7)250ml预冷灭菌水重悬，4℃，1500g离心5min；

(8)20ml预冷1M山梨醇重悬，4℃，1500g离心5min；

(9)200ul预冷1M山梨醇重悬，获得毕赤氏酵母GS115感受态细胞。

5、GS115毕赤酵母电转：

(1)取80uL上述毕赤氏酵母GS115感受态细胞与10ug线性化DNA混合，转入冰上预冷的0.2cm电转杯中；

(2)在冰上放置5min；

(3)将电转仪打开，以电容25μF，PC200hm，电压2000V，电阻200Ω进行电转；

6、通过MD和G418固体培养基，筛选出电转阳性，且高拷贝的菌株

(1)电转结束后，立即加入1mL预冷的1M山梨醇溶液至杯中，取出后于28℃摇床孵育1小时后，取200ul涂MD平板；

(2)在30℃孵育平板至菌落明显形成(大约3～4天)。

(3)将用无菌水将MD平板菌落刮下，1：1000稀释，取200ul涂在4mg/ml G418平板上。

(4)在30℃孵育平板至菌落明显形成(大约3～4天)，直至在4mg/ml G418平板上获得单克隆。

(5)在4mg/ml G418平板上挑取单菌落到5ml YPD(含氨苄和G418)的培养基中，摇菌过夜。

7、提取酵母基因组DNA

将菌液取样，采用酵母基因组DNA提取试剂盒，根据说明书提取酵母基因组，使用ddH₂O将DNA浓度稀释至50ng/ul。

8、QRT-PCR

QRT-PCR鉴定酵母中目的基因拷贝数，GAPDH作为内参，挑选拷贝数最高的送测序，测序结果正确后，用作后续表达酵母株。

9、发酵

(1)在7个250ml锥形瓶中分别加入25mlBMGY培养基并接种200ul菌种，28℃，250rpm摇菌至OD600＝5，4℃，1500g离心3min，使用100mlBMMY培养基重悬至OD600＝1，分别转入7个500ml锥形瓶中，每24h添加甲醇至终浓度的1％(用100％甲醇，加1ml)。

(2)表达96小时后，将菌液进行离心，4℃，12000rpm离心10min，收集菌液上清。

10、镍柱纯化、超滤透析

(1)4℃使用0.22um滤头对获得的菌液上清进行过滤，避免堵塞纯化柱。使用Ni-NTA亲和层析介质(GenScript，Cat.No.L00250)过柱纯化。

(2)使用10KD 15ml超滤管(millipore)对镍柱洗脱液进行超滤，并透析在1×PBS中，获得LTα1β2。

11、BCA法测浓度

(1)按下表制备标准品和待测样品(LTα1β2)

按上表在96孔板中配制相应标准品和待测样品稀释液，然后每孔加200ulReagent A和Reagent B混合液(其中Reagent A：Reagent B＝50:1)

(2)37℃孵育30min；

(3)酶标仪(562nm)测吸光度；

(4)制备标准曲线方程(R²>0.99)，将mLTα1β2吸光度代入方程计算得出mLTα1β2浓度；

11、取一部分进行SDS-PAGE或WB(His标签抗体)检测：

(1)取一定量的样品加入相应5×蛋白上样缓冲液，95℃煮5分钟；

(2)上样；

(3)浓缩胶：80V，50min左右；

(4)分离胶：120V，60min左右；

(5)转膜：100V 90min；

(6)封闭：5％奶粉，封闭1.5h(摇床速度40rpm)；

(7)1×TBST洗三次，每次8min(摇床速度90rpm)；

(8)孵育一抗：his标签抗体，4℃孵育过夜(摇床速度20rpm)；

(9)1×TBST洗三次，每次10min(摇床速度90rpm)；

(10)孵育二抗：室温孵育1.5h(摇床速度40rpm)；

(11)1×TBST洗三次，每次10min(摇床速度90rpm)；

(12)ECL显影。

纯化、超滤后的LTα1β2，取部分进行western blot验证是否得到相关蛋白，使用HIS标签抗体进行验证(见图3)。

11、活性检测

为确定本发明方法制备得到的LTα1β2的活力，进行活性检测实验。实验原理在于：CT-26、Bend.3和MEF含有LTβR受体，该受体接受LTα1β2刺激后，会激活非经典NF-κB信号通路，而非经典信号通路激活的特征之一，即p100部分加工为p52，但由于该受体亦能激活经典NF-κB信号通路，而经典信号通路激活后，进一步激活下游信号通路，促使细胞表达p100。因此，p100在接受刺激后可能不会发生减少，但p52的表达量会升高。同时，非经典信号通路激活后，会引起下游信号通路激活，进而促使MAdCAM-1表达升高，MAdCAM-1是细胞表面蛋白，亦可通过流式细胞术进行分析。此外LTβR受体，在接受LTα1β2刺激后，会发生内吞，因而也可通过流式细胞分析其表达量作为活性检测的指标。

试验例1：

将CT-26、Bend.3和MEF细胞铺至六孔板中，分别使用0ng/ml(对照)、10ng/ml、100ng/ml的LTα1β2刺激24h，将细胞收集，用RIPA裂解，收集总蛋白，并进行BCA法定量，通过western blot检测p100/p52表达。WB结果显示(见图4)，LTα1β2刺激后，p100会部分加工为p52，致使p52表达量升高。

试验例2：

将Bend.3细胞铺至六孔板中，分别使用0ng/ml(对照)、10ng/ml、100ng/ml的LTα1β2刺激24h，将细胞收集，通过RNA提取试剂盒收集总RNA,并通过逆转录试剂盒，将其逆转录为cDNA，通过Q-PCR检测MAdCAM-1mRNA表达水平。Q-PCR结果显示(见图5)，LTα1β2刺激后，MAdCAM-1mRNA表达水平升高，且浓度越高，表达水平越高。

试验例3：

将Bend.3细胞铺至六孔板中，分别使用0ng/ml(对照)、1ug/ml、10ug/ml的LTα1β2刺激48h，收集细胞，染色，通过流式分析显示(见图6、图7)LTα1β2刺激后，MAdCAM-1蛋白表达水平升高，且随着刺激浓度升高，MAdCAM-1蛋白表达水平也越高。同时LTβR受体随着LTα1β2刺激会内吞，致使其表面水平下降，且刺激浓度越高，LTβR受体下降水平越高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种细胞因子LTα1β2体外表达生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、构建pPIC9K-mLTα1β2-His质粒：删除LTα氨基酸序列的信号肽序列，同时删除LTβ的跨膜结构域，用G4S柔性连接子将一个删除信号肽序列的LTα和两个删除跨膜结构域的LTβ连接，并在C端加上6×His标签，获得mLTα1β2-His片段，将编码mLTα1β2-His片段的核苷酸序列构建到pPIC9K质粒中，获得pPIC9K-mLTα1β2-His质粒，并对密码子进行优化；

S2、去除pPIC9K-mLTα1β2-His质粒的内毒素；

S3、将S2获得的pPIC9K-mLTα1β2-His质粒通过SalⅠ单酶切线性化，并胶回收；

S4、制备毕赤酵母感受态细胞；

S5、将S3获得的线性化pPIC9K-mLTα1β2-His质粒电转入毕赤酵母感受态细胞；

S6、通过MD培养基和G418固体培养基，筛选出电转阳性，且高拷贝的菌株；

S7、提取酵母基因组DNA；

S8、QRT-PCR检测并选出拷贝数相对较高的菌株送测序，选择测序结果正确菌株，用作后续表达酵母株；

S9、对S8筛选出的菌株进行发酵，收集菌液上清；

S10、镍柱纯化，对镍柱洗脱液进行超滤透析，获得LTα1β2S1；

所述LTα氨基酸序列的信号肽序列位于SEQ ID NO.1所示LTα氨基酸序列的1-58位，所述LTβ的跨膜结构域位于SEQ ID NO.2所示LTβ氨基酸序列的1-152位。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述编码mLTα1β2-His片段的核苷酸序列构建到pPIC9K质粒的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点之间。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述mLTα1β2-His片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述编码mLTα1β2-His片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4所述毕赤氏酵母为GS115。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S9所述发酵为将菌株接种于BMGY培养基，28℃，250rpm摇菌至OD600=5，4℃，1500g离心3min，使用100ml BMMY培养基重悬至OD600=1，每24h添加甲醇使甲醇终浓度为1%，发酵96小时后，将菌液进行离心，4℃，12000rpm离心10min，收集菌液上清。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S10所述超滤的分子截留量为10KD。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括S11、活性检测。