CN119487078A

CN119487078A - 编码胰岛素融合蛋白的病毒载体基因组

Info

Publication number: CN119487078A
Application number: CN202380037720.2A
Authority: CN
Inventors: C·欣德尔; 窟内真; S·布斯菲尔德; M·J·威尔逊
Original assignee: Skotobio Corp; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Skotobio Corp; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2023-03-01
Publication date: 2025-02-18
Also published as: IL315248A; EP4486797A2; MX2024010711A; WO2023168293A2; AU2023228669A1; CL2024002586A1; JP2025508981A; WO2023168293A3; KR20240167720A

Abstract

提供了用于治疗犬或猫的糖尿病的组合物和方法。向受试者施用包括编码犬或猫胰岛素‑血清白蛋白融合多肽的多核苷酸的病毒颗粒。

Description

编码胰岛素融合蛋白的病毒载体基因组

电子序列表的引用

电子序列表(UPN-22-10022.PCT.xml；大小：111kb；以及创建日期：2023年3月1日)的内容通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及用于治疗犬或猫的糖尿病的组合物和方法。

背景技术

糖尿病是一种与长期高血糖症相关的综合征，所述长期高血糖症是由于胰腺β细胞的胰岛素分泌的损失或功能障碍、组织中胰岛素敏感性降低或两者兼而有之而导致的。在狗中，β细胞损失往往是快速和进行性的，并且通常是由于免疫介导的破坏、空泡变性或胰腺炎而导致的。在猫中，β细胞的损失或功能障碍是胰岛素抵抗、胰岛淀粉样变性或慢性淋巴浆细胞性胰腺炎的结果。

胰岛素是由胰岛的β细胞产生的内源性肽激素，并且被认为是身体的主要合成代谢激素。胰岛素是糖尿病狗和猫的疗法的主要药物。当前的护理标准是由狗或猫的护理人员每天注射两次胰岛素，连同频繁的兽医访视并进行昂贵、耗时和不方便的一次性诊断。

本公开提供了与经工程化以提供胰岛素的持续表达的病毒粒子相关的组合物和方法。

发明内容

在某些实施例中，提供了一种用于治疗伴侣动物的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子。所述rAAV病毒粒子包括AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包括包含编码融合蛋白的多核苷酸的表达盒，所述融合蛋白包括胰岛素原和血清白蛋白，所述表达盒侧接有5'反向末端重复序列(ITR)和3'ITR，其中所述胰岛素原是犬胰岛素原或猫胰岛素原。在某些实施例中，选择所述AAV衣壳是因为其在肌细胞中表达的能力。在某些实施例中，所述衣壳是AAVrh91衣壳。

在某些实施例中，所述胰岛素原是犬胰岛素原。在其它实施例中，所述胰岛素原是猫胰岛素原。合适地，所述犬胰岛素原或所述猫胰岛素原包括N末端信号肽。在某些实施例中，所述犬胰岛素的N末端信号肽是犬胰岛素信号肽。在某些实施例中，所述猫胰岛素的N末端信号肽是猫胰岛素信号肽。

在某些实施例中，与如SEQ ID NO:10中所示的参考多肽序列相比，所述犬胰岛素原是在一个或多个切割位点处具有突变的犬胰岛素原变体。在某些实施例中，所述胰岛素原是与犬血清白蛋白融合的犬胰岛素原。在某些实施例中，所述胰岛素原-血清白蛋白融合多核苷酸与SEQ ID NO:2共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。在某些实施例中，与如SEQ ID NO:10中所示的参考多肽序列相比，所述胰岛素原包括K29R、R31K和L62R突变。在某些实施例中，所述犬胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白包括与SEQ ID NO:8共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的接头。

在某些实施例中，与如SEQ ID NO:24中所示的参考多肽序列相比，所述猫胰岛素原是在一个或多个切割位点处具有突变的变体。在某些实施例中，所述胰岛素原是与猫血清白蛋白融合的猫胰岛素原。

在某些实施例中，所述猫胰岛素原-猫血清白蛋白融合多核苷酸与SEQ ID NO:33共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。与如SEQ ID NO:24中所示的参考多肽序列相比，所述猫胰岛素原可以包括K29R、R31K和L62R突变。

在某些实施例中，所述猫胰岛素原-猫血清白蛋白融合多核苷酸与SEQ ID NO:33共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。与如SEQ ID NO:24中所示的参考多肽序列相比，所述猫胰岛素原可以包括K29R、R31K和L62R突变。编码所述融合蛋白的所述多核苷酸与启动子可操作地连接。在某些实施例中，所述启动子是包括巨细胞病毒增强子和鸡b-肌动蛋白启动子的CB7启动子元件。在某些实施例中，所述表达盒包括编码同源定向修复(HDR)模板的多核苷酸序列，所述HDR模板被配置成插入到切割位点中。

在某些实施例中，提供了一种适用于治疗犬或猫的代谢疾病的药物组合物，所述药物组合物包括所述rAAV病毒粒子。所述rAAV病毒粒子或所述药物组合物可以在用于治疗患有代谢疾病，任选地糖尿病的犬或猫受试者的方法中使用。

某些实施例提供了rAAV病毒粒子或药物组合物的用途，其用于制备用于治疗患有代谢疾病，任选地糖尿病的犬或猫受试者的药物。某些实施例提供了组合物中的rAAV病毒粒子将被调配成以1x10⁹GC/kg至3x10¹³GC/kg的rAAV的剂量向所述犬或猫受试者施用，和/或其中所述rAAV是肌内递送的。

在某些实施例中，提供了一种治疗患有代谢疾病的犬或猫受试者的方法，所述方法包括向所述犬或猫受试者施用有效量的所述rAAV病毒粒子或所述药物组合物。在某些实施例中，所述方法用于治疗代谢疾病(例如，糖尿病)。在某些实施例中，所述糖尿病是1型糖尿病。在其它实施例中，所述糖尿病是2型糖尿病。在某些实施例中，所述有效量是肌内施用的。在某些实施例中，所述有效量为1x10⁹GC/kg至3x10¹³GC/kg的所述rAAV病毒粒子。在某些实施例中，所述有效量为1x10¹⁰GC/kg至3x10¹³GC/kg的所述rAAV病毒粒子。在某些实施例中，所述方法使得所述融合蛋白在所述受试者体内表达至少一周、至少两周、至少四周、至少6周、至少8周、至少10周、至少12周、至少16周、至少20周、至少30周、至少40周、至少50周或至少60周。在某些实施例中，所述方法使得所述融合蛋白在所述受试者体内以治疗有效浓度表达至少三个月、至少六个月或至少十二个月。在某些实施例中，所述方法将所述受试者的空腹血糖降低约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。

根据本发明的以下详细公开内容，本发明的仍另外的方面和优点将是显而易见的。

附图说明

图1A-1C示出了本公开的说明性犬胰岛素蛋白的示意图。所有三种蛋白质均并入天然信号肽(SP)和经修饰的弗林蛋白酶位点。图1A示出了说明性犬前胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白(cINS-Alb)的示意图。caINS-Alb蛋白具有将胰岛素的A链与犬血清白蛋白连接的甘氨酸/丝氨酸接头。图1B示出了说明性犬前胰岛素原-转铁蛋白融合蛋白(cINS-Tf)的示意图。caINS-Tf蛋白具有将胰岛素的A链与犬转铁蛋白连接的甘氨酸/丝氨酸接头。图1C示出了含有弗林蛋白酶位点修饰并充当对照(cINS-2-1)的说明性犬前胰岛素原蛋白的示意图。

图2示出了与对照胰岛素标准品相比，caINS-Alb和caINS-Tf的体外胰岛素生物活性。EC₅₀值列于图下方的表中。响应于经纯化的cINS-Alb和cINS-Tf浓度的增加，配体诱导的胰岛素受体激活。参考胰岛素标准品用作对照。相对效力表示为相对光单位。

图3A示出了施用含有犬胰岛素类似物或PBS对照的AAV病毒粒子的链脲佐菌素(STZ)NOD-SCID小鼠的血糖水平。观察到AAV-cINS类似物(cINS-Alb和cINS-Tf)在NOD-SCID糖尿病小鼠中的体内活性。在第0天肌内(IM)施用AAV候选物后，在研究的持续时间内监测空腹血糖。所示数据为队列(n＝7-10只/组)的平均值和标准偏差(SD)。

图3B示出了施用含有犬胰岛素类似物或PBS对照的AAV病毒粒子的STZ NOD-SCID小鼠的体重。观察到AAV-cINS类似物(cINS-Alb和cINS-Tf)在NOD-SCID糖尿病小鼠中的体内活性。在第0天肌内(IM)施用AAV候选物后，在研究的持续时间内监测体重。所示数据为队列(n＝7-10只/组)的平均值和标准偏差(SD)。

图3C和3D示出了施用含有犬胰岛素类似物或PBS对照的AAV病毒粒子的STZ NOD-SCID小鼠的离体血清胰岛素活性。观察到AAV-cINS类似物(cINS-Alb和cINS-Tf)在NOD-SCID糖尿病小鼠中的体内活性。在第0天肌内(IM)施用AAV候选物后，在第28天(图3C)和第56天(图3D)采集血清样品并测定胰岛素生物活性。相对胰岛素活性表示为相对光单位。所示数据为单独的小鼠的平均值和差值。在两个时间点处，在对照cINS-2-1与cINS-Alb之间示出统计学差异(用单向ANOVA分析)。

具体实施方式

如本文其它地方所描述的，本公开至少部分基于发明人的惊人发现，即编码胰岛素融合蛋白的病毒粒子在犬和猫中实现了胰岛素的持续表达。提供了制备和使用此类病毒粒子的方法。

通过与具有较长半衰期的蛋白质(例如，血清白蛋白)融合而被工程化以克服天然激素的短半衰期的胰岛素融合蛋白是用于治疗糖尿病的治疗进展。已经开发了用于犬科动物和猫科动物的长效胰岛素融合蛋白表达构建体。所述表达构建体包括分泌信号肽以及旨在延长所得融合蛋白的循环时间的融合结构域。

通过转导病毒颗粒(如AAV颗粒)和体内表达经编码的胰岛素融合蛋白，将表达构建体递送到有需要的受试者。还提供了用于在治疗兽医受试者的1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)或代谢综合征的方案中使用这些构建体并增加受试者体内的胰岛素半衰期的方法。

本发明涵盖包括具有胰岛素活性的治疗蛋白的胰岛素-白蛋白融合蛋白。本发明还涵盖多核苷酸，所述多核苷酸包括编码具有胰岛素活性的治疗蛋白的核酸分子或可替代地由其组成，所述治疗蛋白与白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体融合。白蛋白可以与具有胰岛素活性的治疗蛋白的N末端、C末端或两个末端融合。在一些实施例中，白蛋白与胰岛素原的C末端融合。本发明还涵盖多核苷酸，所述多核苷酸包括编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质包括与白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体融合的具有胰岛素活性的治疗蛋白，所述治疗蛋白足以延长其体内活性。

前导序列

在一个实施例中，胰岛素蛋白包括前导序列，所述前导序列可以包括分泌信号肽。如本文所使用的，术语“前导序列”是指多肽的任何N末端序列。在一个实施例中，本文所描述的犬或猫胰岛素蛋白包括前导物或信号序列和胰岛素原。在一个实施例中，前导序列是天然序列(犬或猫胰岛素)前导物。在另一个实施例中，前导序列是异源序列，即源自除犬或猫胰岛素之外的另一种蛋白质。

在一个实施例中，前导物是犬IL-2序列。在一些实施例中，IL-2前导物包括与SEQID NO:12共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

SEQ ID NO:12：MYKMQLLSCIALTLVLVANS

在另一个实施例中，前导物是天然犬胰岛素序列。在一个实施例中，犬前导物包括与SEQ ID NO:7共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

SEQ ID NO:7：MALWMRLLPLLALLALWAPAPTRA

在一个实施例中，前导序列是猫IL-2序列。在一些实施例中，IL-2前导物包括与SEQ ID NO:13共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

SEQ ID NO:13：MYKIQLLSCIALTLILVTNS

在另一个实施例中，前导物是天然猫胰岛素序列。在一个实施例中，犬前导物包括与SEQ ID NO:9共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

SEQ ID NO:9：MAPWTRLLPLLALLSLWIPAPTRA

前导序列可以源自最终意图施用的相同物种，即，犬科动物或猫科动物。如本文所使用的，术语“源性”或“源自”意指序列或蛋白质来源于特定受试者物种或与来源于特定受试者物种的蛋白质或序列共享同一序列。例如，“源自”犬或猫的前导序列与如在犬或猫中表达的相同前导序列共享同一序列(或其变体，如本文所定义的)。然而，指定核酸或氨基酸实际上不需要来源于犬或猫。本领域已知能够产生期望序列的各种技术，包含诱变类似蛋白质(例如，同源物)或人工产生核酸或氨基酸序列。“衍生的”核酸或氨基酸在其“所衍生”的物种中保留相同核酸或氨基酸的功能，而不管衍生序列的实际来源。

胰岛素

胰岛素参与调节体内葡萄糖的利用。身体不能合成胰岛素或对胰岛素具有抗性的细胞导致糖尿病，所述糖尿病的特征在于慢性高血糖症。前胰岛素原被转录为具有N末端信号肽的110个氨基酸链。从其N末端去除信号肽会产生胰岛素原。A链与B链组分之间二硫键的形成，以及中间C链的去除产生了包括51个氨基酸的生物活性胰岛素分子，所述生物活性胰岛素分子的大小小于原始翻译产物的一半。

除非另有说明，否则术语“胰岛素”是指提供期望胰岛素样活性的生物活性胰岛素分子或其功能片段，以及这些分子的氨基酸序列变体。本公开提供了包括犬胰岛素或猫胰岛素的蛋白质，以及编码此类蛋白质的多核苷酸和表达载体。在一些实施例中，胰岛素蛋白包括编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包括(a)分泌信号肽、(b)胰岛素原多肽、(c)任选的接头和(d)任选的融合配偶体。

在一个实施例中，蛋白质包括犬IL2信号肽和犬胰岛素原。在另一个实施例中，蛋白质包括犬胰岛素信号肽和犬胰岛素原。天然犬胰岛素原的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中示出。在另一个实施例中，蛋白质包括猫IL2信号肽和猫胰岛素原。在另一个实施例中，蛋白质包括猫胰岛素信号肽和猫胰岛素原。天然猫胰岛素原的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中示出。

在一些实施例中，犬或猫胰岛素包含变体，所述变体可以包含与本文所述的或本领域已知的胰岛素核酸或氨基酸序列至多约10％变化，所述变体保留野生型序列的功能。如本文所使用的，“保留功能”意指核酸或氨基酸以与野生型序列相同的方式起作用，尽管不一定在同一表达或活性水平下。例如，在一个实施例中，与野生型序列相比，功能变体具有增加的表达或活性。在另一个实施例中，与野生型序列相比，功能变体具有降低的表达或活性。在一个实施例中，与野生型序列[SEQ ID NO:24]相比，功能变体的表达或活性增加或减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。

在一个实施例中，与天然序列相比，犬胰岛素原序列含有一个或多个突变。在一些实施例中，这些突变位于介于B/C链与C/A链之间的切割位点中。在一个实施例中，切割位点中的一个或多个切割位点发生突变以在现有的蛋白酶切割位点处并入至少一个弗林蛋白酶切割位点。在一个实施例中，胰岛素原序列具有K29R突变。在另一个实施例中，胰岛素原序列具有R31K突变。在另一个实施例中，胰岛素原序列具有L62R突变。在另一个实施例中，胰岛素原序列具有K29R和R31K突变两者。在另一个实施例中，胰岛素原序列具有K29R和L62R突变两者。在另一个实施例中，胰岛素原序列具有R31K和L62R突变两者。在另一个实施例中，胰岛素原序列具有K29R、R31K和L62R突变。

在一个实施例中，犬胰岛素原序列是与SEQ ID NO:1、3、10或14共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，猫胰岛素原序列是与SEQ ID NO:15、25或33共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

当期望胰岛素原序列的变体或片段时，可以使用野生型核酸序列的定点诱变来产生这些肽的编码序列。可替代地或另外，基于网络的或可商购获得的计算机程序以及基于服务的公司可以用于将氨基酸序列反向翻译为核酸编码序列，包含RNA和/或cDNA两者。参见例如，EMBOSS的backtranseq；Gene Infinity；和/或ExPasy。在一个实施例中，RNA和/或cDNA编码序列被设计成在最终意图施用的受试者物种(即，犬或猫)中进行最佳表达。

融合结构域

本公开提供了包括融合结构域的融合蛋白。通过将胰岛素与具有较长半衰期的融合结构域融合，胰岛素融合蛋白克服了天然激素的短半衰期。在一些实施例中，融合结构域包括以下中的任一种：(i)犬血清白蛋白或其功能变体、(ii)犬IgG Fc或其功能变体或(iii)犬转铁蛋白或其功能变体。在一些实施例中，融合结构域包括犬血清白蛋白。

在一些实施例中，融合结构域包括以下中的任一种：(i)猫血清白蛋白或其功能变体、(ii)猫IgG Fc或其功能变体或(iii)猫转铁蛋白或其功能变体。在一些实施例中，融合结构域包括猫血清白蛋白。

在一些实施例中，融合结构域是犬血清白蛋白，所述犬血清白蛋白包括与SEQ IDNO:16共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施例中，融合结构域是犬转铁蛋白，所述犬转铁蛋白包括与SEQ ID NO:17共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施例中，融合结构域是猫血清白蛋白，所述猫血清白蛋白包括与SEQ IDNO:18共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

胰岛素融合蛋白

本公开提供了包括胰岛素原的一个或多个拷贝的融合蛋白，以及编码此类融合蛋白的多核苷酸和表达载体。在一些实施例中，融合蛋白包括编码融合蛋白的多核苷酸序列，所述融合蛋白包括以下中的任一种的的融合结构域：(a)包括分泌信号肽的前导序列、(b)胰岛素原和(c)包括(i)IgG Fc或其功能变体、(ii)白蛋白或其功能变体或(iii)转铁蛋白或其功能变体。在一个实施例中，融合蛋白包括凝血酶前导序列、胰岛素原以及IgG Fc或其功能变体。在另一个实施例中，融合蛋白包括凝血酶前导序列、胰岛素原以及白蛋白或其功能变体。

在一些实施例中，融合蛋白包括犬胰岛素前导序列、犬胰岛素原(相对于SEQ IDNO:10的编号，K29R、R31K和L62R)、甘氨酸/丝氨酸接头和犬血清白蛋白。在一实施例中，融合蛋白包括与SEQ ID NO:1共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施例中，融合蛋白包括犬胰岛素前导序列、犬胰岛素原(相对于SEQ IDNO:10的编号，K29R、R31K和L62R)、甘氨酸/丝氨酸接头和犬转铁蛋白。在一实施例中，融合蛋白包括与SEQ ID NO:3共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施例中，融合蛋白包括犬胰岛素前导序列和犬胰岛素原(相对于SEQ IDNO:10的编号，K29R、R31K和L62R)。在一实施例中，融合蛋白包括与SEQ ID NO:5共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施例中，融合蛋白包括猫胰岛素前导序列、猫胰岛素原(相对于SEQ IDNO:24的编号，K29R、R31K和L62R)、甘氨酸/丝氨酸接头和猫血清白蛋白。在一实施例中，融合蛋白包括与SEQ ID NO:24或25共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，融合蛋白包括胰岛素前导序列、胰岛素原以及白蛋白或其功能变体。在一个实施例中，融合蛋白包括胰岛素前导序列、胰岛素原以及转铁蛋白或其功能变体。

在一个实施例中，融合蛋白包括IL2前导序列、胰岛素原以及白蛋白或其功能变体。在一个实施例中，融合蛋白包括IL2前导序列、胰岛素原以及转铁蛋白或其功能变体。

除了本文所提供的前导序列、胰岛素原和胰岛素多肽外，还提供了编码这些多肽的核酸序列(与“多核苷酸”可互换地使用)。在一个实施例中，提供了编码本文所描述的胰岛素原-血清白蛋白融合多肽的核酸序列。在一些实施例中，编码犬胰岛素原-血清白蛋白融合物的核酸序列包括与SEQ ID NO:2共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

在一些实施例中，编码犬胰岛素原-转铁蛋白融合物的核酸序列包括与SEQ IDNO:4共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

本公开的融合蛋白的体内功能和稳定性可以通过添加小肽接头来优化，例如，以防止潜在地不想要的结构域相互作用或出于其它原因。进一步地，富含甘氨酸的接头可以提供一些结构柔性，使得胰岛素原部分可以与靶细胞上的胰岛素受体有效地相互作用。因此，在一个实施例中，胰岛素原的C末端和融合蛋白的融合结构域的N末端通过接头融合。在一些实施例中，接头包含具有序列(GGGGS)n的富含G的肽接头的1个、2个、3个或n个重复序列。在一个实施例中，接头包含具有序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:19)的富含G的肽接头的1个、1.5个或2个重复序列。在一个实施例中，接头包含具有序列GGGGSGGGGSGGGS(SEQID NO:8)的富含G的肽接头的重复序列。

载体基因组

载体基因组可以包括单顺反子或多顺反子转录物。在一些实施例中，本公开的病毒颗粒包括按5'至3'编码以下的多核苷酸序列：

(a)CB7启动子元件，其包括巨细胞病毒(CMV)增强子和鸡b-肌动蛋白启动子；

(b)犬胰岛素信号肽；

(c)犬胰岛素原(K29R、R31K和L62R)；

(d)Gly/Ser接头；以及

(e)犬血清白蛋白。

在某些实施例中，重组AAV载体(颗粒)包括AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包括：5'AAV ITR、启动子、增强子、任选的内含子、开放阅读框，所述开放阅读框是编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包括犬胰岛素信号肽、犬胰岛素原、接头和犬血清白蛋白、polyA和3'AAV ITR。在某些实施例中，犬胰岛素原是经工程化的犬胰岛素原(K29R、R31K和L62R)。

在某些实施例中，重组AAV载体(颗粒)包括AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包括：5′AAV ITR、启动子、增强子、任选的内含子、开放阅读框，所述开放阅读框是编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包括猫胰岛素信号肽、猫胰岛素原、接头和猫血清白蛋白、polyA和3'AAV ITR。在某些实施例中，猫胰岛素原是经工程化的猫胰岛素原(K29R、R31K和L62R)。

在一些实施例中，病毒颗粒包括与SEQ ID NO:26(CB7.CI.cINS2-1_3xGSsp.ALB.rBG)或28(CB7.CI.cINS2-1_3xGSsp.Tf.rBG)共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的核酸序列。

在某些实施例中，生产质粒的载体基因组包含130个碱基对的缩短的5'和/或3'AAV ITR，其中外部A元件缺失。在某些实施例中，在使用内部A元件作为模板的载体DNA扩增期间，缩短的ITR恢复到具有145个碱基对的野生型长度。因此，由包括缩短的ITR的生产质粒产生的最终病毒颗粒含有全长145个ITR(通过向载体基因组的最3'端添加15个核苷酸和/或向最5'端添加15个核苷酸)。在其它实施例中，使用了全长AAV 5′ITR和3′ITR。选择ITR，使得其在产生期间(例如，在反式质粒中)被经表达的rep蛋白反式补充。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一个AAV来源的情况下，所得rAAV可以被称为假型的。然而，这些元件的其它构型可以是合适的。

腺相关病毒(AAV)

一方面，提供了包括编码如本文所述的前导序列、胰岛素原和胰岛素多肽的多核苷酸的病毒粒子。在本文所描述的病毒粒子的某些实施例中，病毒粒子是腺相关病毒(AAV)或重组AAV(rAAV)。如本文所使用的，术语“重组AAV”或“rAAV”是指天然存在的腺相关病毒、本领域技术人员可获得的和/或鉴于本文所描述的组合物和方法可获得的腺相关病毒以及人工AAV。腺相关病毒(AAV)病毒粒子是具有AAV蛋白衣壳的AAV DNA酶抗性病毒颗粒，其中包装有侧接AAV反向末端重复序列(ITR)(一起称为“载体基因组”)的用于递送到靶细胞的表达盒。

AAV衣壳由60个衣壳(cap)蛋白亚基VP1、VP2和VP3构成，其以二十面体对称布置，比率为大约1:1:10至1:1:20，取决于所选择的AAV。可以选择各种AAV作为如上文所鉴定的AAV病毒颗粒的衣壳的来源。在一个实施例中，AAV衣壳是AAVrh91衣壳或其变体。参见例如，WO2020/223232(关于AAVrh91预测的氨基酸序列和组装的AAVrh91衣壳的脱酰胺模式)和WO2022/036220。在某些实施例中，衣壳蛋白由rAAV病毒粒子名称中的术语“AAV”之后的数字或数字和字母的组合指定。除非另有说明，否则本文所描述的AAV衣壳、ITR和其它所选择的AAV组分可以容易地选自任何AAV，所述AAV包含但不限于鉴定为以下的AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVhu37、AAVrh32.33、AAVAnc80、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh74、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAVhu37、AAVrh64R1和AAVhu68。

说明性AAV病毒粒子描述于例如以下中：美国公开专利申请第2007-0036760-A1号、美国公开专利申请第2009-0197338-A1、EP 1310571、WO 2003/042397(AAV7和其它猿猴AAV)、美国专利7790449、美国专利7282199(AAV8)、WO 2005/033321、US 7,906,111(AAV9)、WO 2006/110689、WO 2003/042397(rh10)、WO 2005/033321、WO 2018/160582(AAVhu68)，所述文献通过引用并入本文。

其它合适的AAV可以包含但不限于AAVrh90、AAVrh91、AAVrh92、AAVrh93、AAVrh91.93。其它合适的AAV包含于2020年10月20日提交的国际专利申请第PCT/US20/56511号中描述的AAV3B变体，所述文献描述了AAV3B.AR2.01、AAV3B.AR2.02、AAV3B.AR2.03、AAV3B.AR2.04、AAV3B.AR2.05、AAV3B.AR2.06、AAV3B.AR2.07、AAV3B.AR2.08、AAV3B.AR2.10、AAV3B.AR2.11、AAV3B.AR2.12、AAV3B.AR2.13、AAV3B.AR2.14、AAV3B.AR2.15、AAV3B.AR2.16或AAV3B.AR2.17，所述文献均通过引用并入本文。这些文档还描述了可以选择用于产生rAAV的其它AAV衣壳，并且通过引用并入。

如本文所使用的，关于AAV，术语“变体”意指源自已知AAV序列的任何AAV序列，所述已知AAV序列包含具有保守氨基酸置换的AAV序列以及与氨基酸或核酸序列共享至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更高序列同一性的AAV序列。在另一个实施例中，AAV衣壳包含变体，所述变体可以包含与任何所描述或已知的AAV衣壳序列至多约10％变化。也就是说，AAV衣壳与本文所提供的和/或本领域已知的AAV衣壳共享约90％同一性至约99.9％同一性、约95％至约99％同一性或约97％至约98％同一性。在一个实施例中，AAV衣壳与AAV衣壳共享至少95％同一性。当确定AAV衣壳的同一性百分比时，可以对任何可变蛋白质(例如，vp1、vp2或vp3)进行比较。

在一个实施例中，病毒粒子是具有AAVrh91的衣壳或其功能变体的rAAV。在一个实施例中，病毒粒子是具有AAV3.AR.2.12的衣壳或其功能变体的rAAV。在一个实施例中，病毒粒子是具有AAV8的衣壳或其功能变体的rAAV。在一个实施例中，病毒粒子是具有选自以下的衣壳的rAAV：AAV9、AAVrh64R1、AAVhu37或AAVrh10。在一个实施例中，病毒粒子是具有AAVhu68的衣壳或其功能变体的rAAV。

在某些实施例中，病毒载体具有AAVrh91衣壳。在SEQ ID NO:21中提供了编码AAVrh91衣壳的核酸序列，并且在SEQ ID NO:22中提供了经编码的氨基酸序列。本文提供了一种rAAV，其包括AAVrh91(SEQ ID NO:22)的vp1、vp2和vp3中的至少一个。本文还提供了rAAV，其包括由AAVrh91(SEQ ID NO:21)的vp1、vp2和vp3中的至少一个编码的AAV衣壳。在又另一个实施例中，在SEQ ID NO:22中提供了编码AAVrh91氨基酸序列的核酸序列，并且在SEQ ID NO:22中提供了经编码的氨基酸序列。本文还提供了rAAV，其包括由AAVrh91eng(SEQ ID NO:23)的vp1、vp2和vp3中的至少一个编码的AAV衣壳。在某些实施例中，vp1、vp2和/或vp3是AAVrh91(SEQ ID NO:22)的全长衣壳蛋白。在其它实施例中，vp1、vp2和/或vp3具有N末端和/或C末端截短(例如，约1个至约10个氨基酸的截短)。

在某些实施例中，AAVrh91衣壳的特征在于以下中的一种或多种：(1)AAVrh91衣壳蛋白，其包括：选自以下的AAVrh91 vp1蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO:22的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的vp1蛋白，由SEQ ID NO:21产生的vp1蛋白，或由与编码SEQ ID NO:22的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:21至少70％相同的核酸序列产生的vp1蛋白，选自以下的AAVrh91 vp2蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的vp2蛋白，由包括SEQID NO:21的至少核苷酸412至2208的序列产生的vp2蛋白，或由与编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:21的至少核苷酸412至2208至少70％相同的核酸序列产生的vp2蛋白，选自以下的AAVrh91 vp3蛋白的异质群体：通过由编码SEQID NO:22的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的vp3蛋白，由包括SEQ ID NO:21的至少核苷酸607至2208的序列产生的vp3蛋白，或由与编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:21的至少核苷酸607至2208至少70％相同的核酸序列产生的vp3蛋白；和/或(2)为编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群体，为编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群体，以及为编码SEQ ID NO:22的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群体，其中：所述vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体，所述氨基酸修饰包括SEQ ID NO:22中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)，并且任选地进一步包括包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群体，其中脱酰胺化引起氨基酸变化；以及(B)AAVrh91衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括核酸分子，所述核酸分子包括AAV反向末端重复序列和非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列编码与引导产物在宿主细胞中的表达的序列可操作地连接的产物。

在某些实施例中，AAVrh91衣壳的特征在于以下中的一种或多种：(1)AAVrh91衣壳蛋白，其包括：选自以下的AAVrh91 vp1蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO:22的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的vp1蛋白，由SEQ ID NO:21产生的vp1蛋白，或由与编码SEQ ID NO:22的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:21至少70％相同的核酸序列产生的vp1蛋白，选自以下的AAVrh91 vp2蛋白的异质群体：通过由编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的vp2蛋白，由包括SEQID NO:21的至少核苷酸412至2208的序列产生的vp2蛋白，或由与编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:21的至少核苷酸412至2208至少70％相同的核酸序列产生的vp2蛋白，选自以下的AAVrh91 vp3蛋白的异质群体：通过由编码SEQID NO:22的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的vp3蛋白，由包括SEQ ID NO:21的至少核苷酸607至2208的序列产生的vp3蛋白，或由与编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:21的至少核苷酸607至2208至少70％相同的核酸序列产生的vp3蛋白；和/或(2)为编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群体，为编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群体，以及为编码SEQ IDNO:22的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群体，其中：所述vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体，所述氨基酸修饰包括SEQ ID NO:22中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)，并且任选地进一步包括包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群体，其中脱酰胺化引起氨基酸变化；以及(B)AAVrh91衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括核酸分子，所述核酸分子包括AAV反向末端重复序列和非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列编码与引导产物在宿主细胞中的表达的序列可操作地连接的产物。

在某些实施例中，AAVrh91 vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体，所述氨基酸修饰包括SEQ ID NO:22中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)，并且任选地进一步包括包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群体，其中脱酰胺化引起氨基酸变化。相对于SEQ ID NO:22的编号，在N-G对N57、N383和/或N512处观察到高水平的脱酰胺化。在其它残基中已经观察到脱酰胺化。在某些实施例中，AAVrh91可以具有其它脱酰胺化的残基，例如通常小于10％，和/或可以具有其它修饰，所述其它修饰包含磷酸化(例如，在存在的情况下，在约2％至约30％、或约2％至约20％、或约2％至约10％的范围内)(例如，在S149处)或氧化(例如，在约W22、约M211、W247、M403、M435、M471、W478、W503、约M537、约M541、约M559、约M599、M635和/或W695中的一个或多个处)。任选地，W可以氧化成犬尿氨酸。

表A-AAVrh91脱酰胺化

基于VP1编号的AAVrh91脱酰胺化	脱酰胺化％
		N57+脱酰胺化	65-90、70-95、80-95、75-100、80-100或90-100
N94+脱酰胺化	2-15或2-5
		N303+脱酰胺化	2-15或5-10
N383+脱酰胺化	65-90、70-95、80-95、75-100、80-100或90-100
		N497+脱酰胺化	2-15或5-10
N512+脱酰胺化	65-90、70-95、80-95、75-100、80-100或90-100
		约N691+脱酰胺化	2-15、2-10或5-10

在某些实施例中，在所提供的如使用胰蛋白酶使用质谱所确定的范围内，在前述表中鉴定的位置中的一个或多个位置中修饰AAVrh91衣壳。在某些实施例中，如本文所描述的修饰位置中的一个或多个位置或N之后的甘氨酸。残基数量基于本文所提供的AAVrh91序列。参见，SEQ ID NO:22。

在某些实施例中，AAVrh91衣壳包括：为编码SEQ ID NO:22的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群体，为编码SEQ ID NO:22的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群体，以及为编码SEQ ID NO:22的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群体。

在某些实施例中，经修饰的AAVrh91核酸序列用于产生具有比天然AAVrh91衣壳脱酰胺化程度更低的衣壳的突变体rAAV。此类突变体rAAV可以具有降低的免疫原性和/或增加储存时的稳定性，特别是以悬浮液形式储存时的稳定性。

在某些实施例中，AAV68衣壳的另外的特征在于以下中的一种或多种。AAV hu68衣壳蛋白，其包括：通过由编码SEQ ID NO:37的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的AAVhu68 vp1蛋白，由SEQ ID NO:35或36产生的vp1蛋白，或由与编码SEQ ID NO:37的1至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:35或36至少70％相同的核酸序列产生的vp1蛋白；通过由编码SEQ ID NO:37的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的AAVhu68 vp2蛋白，由包括SEQ ID NO:35或36的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或由与编码SEQ ID NO:37的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:35或36的至少核苷酸412至2211至少70％相同的核酸序列产生的vp2蛋白，和/或通过由编码SEQ ID NO:37的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达产生的AAVhu68 vp3蛋白，由包括SEQ ID NO:35或36的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或由与编码SEQ ID NO:37的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的SEQ ID NO:35或36的至少核苷酸607至2211至少70％相同的核酸序列产生的vp3蛋白。

另外或可替代地，提供了一种AAV衣壳，其包括任选地包括在位置157处的缬氨酸的vp1蛋白的异质群体、任选地包括在位置157处的缬氨酸的vp2蛋白的异质群体以及vp3蛋白的异质群体，其中基于SEQ ID NO:37的vp1衣壳的编号，vp1和vp2蛋白的至少一个亚群体包括在位置157处的缬氨酸并且任选地进一步包括在位置67处的谷氨酸。另外或可替代地，提供了一种AAVhu68衣壳，其包括：为编码SEQ ID NO:37的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群体，为编码SEQ ID NO:37的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群体，以及为编码SEQ ID NO:37的至少氨基酸203至736的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群体，其中：所述vp1、vp2和vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体。

AAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白通常表示为由编码SEQ ID NO:37的全长vp1氨基酸序列(氨基酸1至736)的相同核酸序列编码的替代剪接变体。任选地，单独使用vp1编码序列来表达vp1、vp2和vp3蛋白。可替代地，此序列可以与以下中的一个或多个共表达：编码SEQ IDNO:37的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203至736)的核酸序列，所述氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1至约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1至约aa 202)或与其互补的链，即对应的mRNA或tRNA(SEQ ID NO:35或36的约nt607至约nt 2211)或与编码SEQ ID NO:37的aa 203至736的SEQ ID NO:35或36至少70％至至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的序列。另外或可替代地，vp1编码和/或vp2编码序列可以与以下中的一个或多个共表达：编码SEQ ID NO:37的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138至736)的核酸序列，所述氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1至约137)或与其互补的链，即对应的mRNA或tRNA(SEQ ID NO:35或36的nt 412至2212)或与编码SEQ ID NO:37的约aa138至736的SEQ ID NO:35或36至少70％至至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的序列。

如本文所描述的，rAAVhu68具有在从编码SEQ ID NO:37的vp1氨基酸序列的AAVhu68核酸中表达衣壳的产生系统中产生的rAAVhu68衣壳，以及任选地例如编码不含vp1和/或vp2独特区的vp3蛋白的另外的核酸序列。使用单个核酸序列vp1从生产中产生的rAAVhu68产生vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白的异质群体。更具体地，AAVhu68衣壳含有具有来自SEQ ID NO:37中的预测氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，天冬酰胺-甘氨酸对中的天冬酰胺是高度脱酰胺化的。

在一个实施例中，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO:35或36的序列或与其互补的链，例如对应的mRNA或tRNA。在某些实施例中，vp2和/或vp3蛋白可以另外地或可替代地由不同于vp1的核酸序列表达，例如以改变所选择的表达系统中的vp蛋白的比率。在某些实施例中，还提供了编码SEQ ID NO:37的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203至736)的核酸序列，所述氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1至约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1至约aa202)或与其互补的链，即对应的mRNA或tRNA(SEQ ID NO:35或36的约nt 607至约nt 2211)。在某些实施例中，还提供了编码SEQ ID NO:37的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138至736)的核酸序列，所述氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1至约137)或与其互补的链，即对应的mRNA或tRNA(SEQ ID NO:35或36的nt 412至2211)。

然而，可以选择编码SEQ ID NO:37的氨基酸序列的其它核酸序列用于产生rAAVhu68衣壳。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:35或36的核酸序列或与编码SEQID NO:37的SEQ ID NO:35或36至少70％至99％相同、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ IDNO:35或36的核酸序列或与编码SEQ ID NO:37的vp2衣壳蛋白(约aa 138至736)的SEQ IDNO:35或36的约nt 412至约nt 2211至少70％至99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ IDNO:35或36的约nt 607至约nt 2211的核酸序列或与编码SEQ ID NO:37的vp3衣壳蛋白(约aa 203至736)的nt SEQ ID NO:35或36至少70％至99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列。

在某些实施例中，AAVhu68衣壳的特征在于具有衣壳蛋白，其中基于SEQ ID NO:37的氨基酸序列的编号，至少45％的N残基在位置N57、N329、N452和/或N512中的至少一个位置处脱酰胺化。在某些实施例中，在这些N-G位置(即，基于SEQ ID NO:37的氨基酸序列的编号，N57、N329、N452和/或N512)中的一个或多个位置处的N残基的至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％脱酰胺化。在这些和其它实施例中，AAVhu68衣壳的另外的特征在于具有蛋白质群体，其中N残基的约1％至约20％在以下位置中的一个或多个位置处具有脱酰胺化：基于SEQ ID NO:37的氨基酸序列的编号，N94、N253、N270、N304、N409、N477和/或Q599。在某些实施例中，AAVhu68包括vp1、vp2和/或vp3蛋白的至少一个亚群体，基于SEQ IDNO:37的氨基酸序列的编号或其组合，所述蛋白在以下位置中的一个或多个位置处脱酰胺化：N35、N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709、N735。在某些实施例中，衣壳蛋白可以具有一个或多个酰胺化的氨基酸。

在另一个实施例中，提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其具有AAVhu68衣壳和载体基因组，其中(a)AAV hu68衣壳包括AAVhu68 vp1蛋白的异质群体、AAVhu68 vp2蛋白的异质群体；以及AAVhu68 vp3蛋白的异质群体，其中所述异质AAVhu68 vp1、AAVhu68 vp2和AAVhu68 vp3蛋白含有具有氨基酸修饰的亚群体，所述氨基酸修饰包括如使用质谱法确定的SEQ ID NO:37的N57、N329、N452、N512中的两个或更多个中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个天冬酰胺(N)中50％至100％的脱酰胺化，并且任选地进一步包括包含其它脱酰胺化的氨基酸的亚群体，其中脱酰胺化导致氨基酸变化，其中脱酰胺化的天冬酰胺脱酰胺化为天冬氨酸、异天冬氨酸、相互转化的天冬氨酸/异天冬氨酸对或其组合，其中所述AAVhu68衣壳进一步包括具有以下中的一种或多种的亚群体：

(a)所述vp1蛋白的基于SEQ ID NO:37的编号定位于位置N57处的天冬酰胺-甘氨酸对中的脱酰胺化的至少65％的天冬酰胺(N)；

(b)所述vp1、v2和vp3蛋白的基于SEQ ID NO:37的氨基酸序列的残基编号位于位置N329中的天冬酰胺-甘氨酸对中的脱酰胺化的至少75％的N，

(c)所述vp1、v2和vp3蛋白的基于SEQ ID NO:37的氨基酸序列的残基编号位于位置N452中的天冬酰胺-甘氨酸对中的脱酰胺化的至少50％的N；和/或

(d)所述vp1、v2和vp3蛋白的基于SEQ ID NO:37的氨基酸序列的残基编号位于位置N512中的天冬酰胺-甘氨酸对中的脱酰胺化的至少75％的N，以及

所述AAVhu68衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括核酸分子，所述核酸分子包括AAV反向末端重复序列和非AAV核酸序列，所述非AAV核酸序列编码如本文所描述的与序列可操作地连接的PTH融合物，所述序列引导PTH融合物在靶细胞中表达。

一方面，提供了一种重组AAV(rAAV)。所述rAAV包含来自腺相关病毒rh91的AAV衣壳和包装在所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括AAV反向末端重复序列(ITR)、SEQ ID NO:1的犬胰岛素原-血清白蛋白融合物的编码序列以及引导犬胰岛素原融合物的表达的调控序列。

在另一个实施例中，rAAV包含来自腺相关病毒rh91的AAV衣壳和包装在所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括AAV反向末端重复序列(ITR)、SEQ ID NO:3的犬胰岛素原-转铁蛋白融合物的编码序列以及引导犬胰岛素原融合物的表达的调控序列。

在另一个实施例中，rAAV包含来自腺相关病毒rh91的AAV衣壳和包装在所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括AAV反向末端重复序列(ITR)、SEQ ID NO:32的猫胰岛素原-血清白蛋白融合物的编码序列以及引导猫胰岛素原融合物的表达的调控序列。

一方面，提供了一种重组AAV(rAAV)。所述rAAV包含来自腺相关病毒hu68的AAV衣壳和包装在所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括AAV反向末端重复序列(ITR)、SEQ ID NO:1的犬胰岛素原-血清白蛋白融合物的编码序列以及引导犬胰岛素原融合物的表达的调控序列。

在另一个实施例中，rAAV包含来自腺相关病毒hu68的AAV衣壳和包装在所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括AAV反向末端重复序列(ITR)、SEQ ID NO:3的犬胰岛素原-转铁蛋白融合物的编码序列以及引导犬胰岛素原融合物的表达的调控序列。

在另一个实施例中，rAAV包含来自腺相关病毒hu68的AAV衣壳和包装在所述AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括AAV反向末端重复序列(ITR)、SEQ ID NO:32的猫胰岛素原-血清白蛋白融合物的编码序列以及引导猫胰岛素原融合物的表达的调控序列。

在一个实施例中，编码本文所描述的胰岛素原融合构建体的核酸序列被工程化到任何合适的遗传元件中，例如，裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、RNA分子(例如，mRNA)、附加体等，所述遗传元件将其上携带的胰岛素原融合序列转移至宿主细胞，例如，用于在包装宿主细胞中产生携带DNA或RNA的纳米颗粒、病毒粒子和/或用于递送到受试者体内的宿主细胞。在一个实施例中，遗传元件是质粒。所选择的基因元件可以通过任何合适的方法递送，所述方法包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合。用于制备此类构建体的方法对于核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程化、重组工程化以及合成技术。参见例如，Green和Sambrook,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,纽约市冷泉港的冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)(2012)。

在一些实施例中，本文所描述的胰岛素原融合构建体可以通过除rAAV之外的病毒粒子递送。此类其它病毒粒子可以包含可以使用的适于基因疗法的任何病毒，所述病毒包含但不限于腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒等。合适地，在产生这些其它病毒粒子中的一种病毒粒子时，其产生为复制缺陷型病毒粒子。

“复制缺陷型病毒”或“病毒粒子”是指其中含有所关注的基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，所述合成或人工病毒颗粒不能产生子代病毒粒子但保留感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒粒子的基因组不包含编码复制所需的酶的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有侧接扩增和包装人工基因组所需的信号的所关注的转基因)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。

表达盒

在一些实施例中，表达盒是指核酸分子，所述核酸分子包括胰岛素原融合构建体编码序列、启动子，并且可以包含用于其的其它调控序列。表达盒可以被工程化成遗传元件和/或被包装到病毒粒子(例如，病毒颗粒)的衣壳中。通常，用于产生病毒粒子的此类表达盒含有本文所描述的胰岛素原融合构建体，所述胰岛素原融合构建体侧接病毒基因组的包装信号和其它表达控制序列，如本文所描述的序列。可以使用本领域已知的技术针对特定物种优化任何表达控制序列，所述技术包含例如密码子优化，如本文所描述的。

表达盒通常含有作为表达控制序列的一部分的启动子序列。在一个实施例中，使用组成型启动子。在本文所描述的质粒和表达载体中，可以使用CB7启动子。CB7是具有巨细胞病毒增强子元件的鸡B-肌动蛋白启动子。可替代地，可以使用肝脏特异性启动子，包含但不限于α1抗胰蛋白酶(A1AT)、人白蛋白(Miyatake等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》71:512432(1997))[humAlb]；乙型肝炎病毒核心启动子(Sandig等人,《基因疗法(Gene Ther.)》3:1002 9(1996))、TTR最小增强子/启动子、α-抗胰蛋白酶启动子或肝脏特异性启动子(LSP)(Wu等人,《分子疗法(Mol Ther.)》16:280-289(2008))。在一个实施例中，使用了肝脏特异性启动子甲状腺素结合球蛋白(TBG)。如病毒启动子、组成型启动子、可调控启动子(参见例如，WO 2011/126808和WO 2013/04943)等其它启动子或对生理学线索有应答的启动子可以用于本文所描述的表达载体中。

在一个实施例中，提供了一种表达盒，其包括CB7启动子、鸡β肌动蛋白内含子、具有通过接头与猫白蛋白融合的犬胰岛素前导物的犬突变体前胰岛素以及兔β珠蛋白poly，例如在SEQ ID NO:26中。SEQ ID NO:27展示了包括缩短的AAV 5′ITR、间隔子序列、SEQ IDNO:27、间隔子序列和缩短的AAV 3′ITR的载体基因组。

在另一个实施例中，提供了一种表达盒，其包括CB7启动子、鸡β肌动蛋白内含子、具有通过接头与猫转铁蛋白融合的犬胰岛素前导物的犬突变体前胰岛素以及兔β珠蛋白poly，例如在SEQ ID NO:28中。SEQ ID NO:29展示了包括缩短的AAV 5′ITR、间隔子序列、SEQ ID NO:28、间隔子序列和缩短的AAV 3′ITR的载体基因组。

在另一个实施例中，使用诱导型启动子。可用于本文的诱导型启动子的实例包含于2022年2月3日出版的题为“用于基因疗法应用的犬和猫诱导型表达构建体(Canine andFeline Inducible Expression Constructs for Gene Therapy Applications)”的国际专利申请第PCT/US2021/043219号中所描述的诱导型启动子，所述国际专利申请通过引用并入本文。简而言之，诱导型启动子包括启动子；激活结构域，其包括犬或猫的反式激活结构域和犬或猫FKBP12-雷帕霉素相关蛋白(rapamycin-associated protein，FRAP)的FKBP12-雷帕霉素结合(FRB)结构域；DNA结合结构域，其包括锌指同源结构域(ZFHD)和一个、两个或三个FK506结合蛋白结构域(FKBP)亚基基因；以及ZFHD结合位点(8XZFHD)的至少8个拷贝，随后是最小IL2启动子。有效量的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的存在诱导转基因在宿主细胞中的表达。

除了启动子之外，表达盒和/或表达载体还可以含有其它适当的转录起始、终止、增强子序列、如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号等的有效RNA加工信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在期望时，增强经编码的产物的分泌的序列。合适的polyA序列的说明性实例包含，例如兔β珠蛋白、SV40、牛生长激素(bGH)和TK polyA。

合适的增强子的说明性实例包含例如α-胎蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP(TH结合球蛋白启动子/α1微球蛋白/双库尼茨抑制剂增强子(bikunin enhancer))等。在一个实施例中，polyA是兔珠蛋白polyA。在一个实施例中，polyA具有由SEQ ID NO:20的序列。

这些控制序列与胰岛素原融合构建体序列“可操作地连接”。如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指与所关注的基因邻接的表达控制序列以及以反式或远距离起作用以控制所关注的基因的表达控制序列两者。

在一个实施例中，提供了rAAV，其包含5'ITR、CB7启动子、鸡β-肌动蛋白内含子、SEQ ID NO:1的蛋白的编码序列、兔珠蛋白poly A和3'ITR。在一个实施例中，提供了rAAV，其包含5'ITR、CB7启动子、鸡β-肌动蛋白内含子、SEQ ID NO:3的蛋白的编码序列、兔珠蛋白poly A和3'ITR。在一个实施例中，提供了rAAV，其包含5'ITR、CB7启动子、鸡β-肌动蛋白内含子、SEQ ID NO:3的蛋白的编码序列、兔珠蛋白poly A和3′ITR。

将表达盒包装到AAV病毒颗粒中所需的最小序列是与衣壳具有相同AAV起源或具有不同AAV起源(以产生AAV假型)的AAV 5′和3'ITR。

为了将表达盒包装到AAV衣壳中以形成病毒粒子(即，rAAV载体或rAAV颗粒)，ITR是在与基因相同的构建体中需要呈顺式的唯一AAV组分。在一个实施例中，用于复制(rep)和/或衣壳(cap)的编码序列从AAV基因组中移除并以反式供应或由包装细胞系供应，以产生AAV病毒粒子。例如，如上文所描述的，假型AAV可以含有来自与AAV衣壳的来源不同的来源的ITR。在一个实施例中，可以利用嵌合AAV衣壳。可以选择仍其它的AAV组分。此类AAV序列的来源在本文中有所描述并且还可以从学术、商业或公共来源分离或获得(例如，维吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection,Manassas,VA))。AAV序列可以通过合成或其它合适的方式通过参考公所开的序列(如在文献中或在如例如GenBank、PubMed等数据库中可获得的公开的序列)而获得。

用于产生和分离适于向受试者递送的AAV病毒粒子的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利7,790,449；美国专利7,282,199；WO 2003/042397；WO 2005/033321；WO2006/110689；以及US 7,588,772。在一个系统中，用编码侧接ITR的转基因的构建体和编码rep和cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在第二系统中，用编码侧接ITR的转基因的构建体瞬时转染稳定供应rep和cap的包装细胞系。在这些系统的每个系统中，响应于用辅助腺病毒或疱疹病毒感染而产生AAV病毒粒子，从而需要从污染病毒中分离rAAV。最近，已开发了不需要用辅助病毒感染来回收AAV的系统—通过所述系统还反式地供应所需辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29，以及疱疹病毒聚合酶)。在这些系统中，可以通过用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染细胞来供应辅助功能，或者所述细胞可以被工程化成稳定地含有编码辅助功能的基因，所述基因的表达可以被控制在转录水平或转录后水平下。在另一个系统中，通过用基于杆状病毒的表达载体进行感染来将侧接ITR的转基因和rep/cap基因引入到昆虫细胞中。关于这些产生系统的综述，通常参见例如Zhang等人,2009,“用于大规模重组腺相关病毒产生的腺病毒-腺相关病毒杂合体(Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production)”《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》20:922-929，所述文献中的每一个的内容通过引用以其整体并入本文。制备和使用这些和其它AAV产生系统的方法还描述于以下美国专利中，所述美国专利中的每一个的内容通过引用以其整体并入本文：US 5,139,941；US 5,741,683；US 6,057,152；US 6,204,059；US 6,268,213；US 6,491,907；US 6,660,514；US 6,951,753；US 7,094,604；US 7,172,893；US 7,201,898；US7,229,823和US 7,439,065。通常参见，例如，Grieger和Samulski,2005,《生物化学工程技术进展(Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.)》99:119-145；Buning等人,2008,《基因医学杂志(J.Gene Med.)》10:717-733；以及下文所引用的参考文献，这些参考文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。用于构建本发明的任何实施例的方法对于核酸操纵技术人员是已知的并且包含遗传工程化、重组工程化以及合成技术。

类似地，产生rAAV病毒粒子的方法是熟知的，并且对合适的方法的选择不是对本发明的限制。参见例如，K.Fisher等人,(1993)《病毒学杂志》,70:520-532和美国专利第5,478,745号。

本文所描述的rAAV包括具有包装在内部的载体基因组的所选择的衣壳。载体基因组(或rAAV基因组)包括5'和3'AAV反向末端重复序列(ITR)、编码胰岛素蛋白的多核苷酸序列以及引导编码胰岛素蛋白的多核苷酸序列插入宿主细胞的基因组的调控序列。

用所公开的组合物治疗受试者的方法

还提供了包含本文所描述的病毒粒子构建体的组合物。本文所描述的药物组合物被设计成通过任何合适的途径或不同途径的组合递送到有需要的犬或猫受试者。直接递送到肝脏(任选地通过静脉内、通过肝动脉或通过移植)、直接递送到胰腺、口服施用途径、吸入施用途径、鼻内施用途径、气管内施用途径、动脉内施用途径、眼内施用途径、静脉内施用途径、肌内施用途径、皮下施用途径、皮内施用途径以及其它母体施用途径。本文所描述的病毒粒子可以以单一组合物或多种组合物的形式递送。任选地，可以递送两种或更多种不同的AAV，或多种病毒[参见例如，WO 2011/126808和WO 2013/049493]。

在一些实施例中，本文所描述的药物组合物被设计成通过肌内施用递送到有需要的犬或猫受试者。

在另一个实施例中，多种病毒可以含有不同的复制缺陷型病毒(例如，AAV和腺病毒)。在一个实施例中，施用是肌内进行的。在另一个实施例中，施用是静脉内进行的。

在一些实施例中，治疗过程可以涉及重复施用相同的病毒粒子(例如，AAVrh91病毒粒子)或不同的病毒粒子(例如，AAVrh91和AAV3B.AR2.12)。可以使用本文所描述的病毒粒子来选择仍其它组合。在一些实施例中，本文所描述的组合物可以组合在涉及其它糖尿病药物或基于蛋白质的疗法(包含例如胰岛素类似物、胰岛素、口服抗高血糖药物(磺酰脲类、双胍类、噻唑烷二酮类和α-葡糖苷酶抑制剂))的方案中。在一些实施例中，本文所描述的组合物可以组合在涉及生活方式变化的方案中，所述生活方式包含饮食和锻炼方案。

如本文所使用的，术语“胰岛素原构建体”、“胰岛素原表达构建体”和同义词包含如本文所描述的胰岛素原序列与前导物的组合(无论是天然的还是异源的)。术语“胰岛素原构建体”、“胰岛素原表达构建体”和同义词可以用于指编码胰岛素原融合蛋白或其表达产物的核酸序列。在本说明书中，具有前导物的胰岛素原序列也被称为“前胰岛素原”。在某些实施例中，“胰岛素原构建体”还可以涵盖本文所描述的融合蛋白。

复制缺陷型病毒可以与生理上可接受的载剂一起调配，用于基因转移和基因疗法应用。在AAV病毒粒子的情况下，基因组拷贝(“GC”或“gc”)的定量可以用作制剂中所含有的剂量的量度。可以使用本领域已知的任何方法来确定本发明的复制缺陷型病毒组合物的基因组拷贝(GC)数量。用于进行AAV GC数量滴定的一种方法如下：经纯化的AAV载体基因组样品首先用DNA酶进行处理，以消除来自产生过程的未衣壳化的AAV基因组DNA或污染质粒DNA。然后使核酸酶抗性颗粒经受热处理，以从衣壳中释放基因组。然后使用靶向病毒基因组特定区(通常为poly A信号)的引物/探针组通过实时PCR来定量经释放的基因组。用于确定基因组拷贝的另一种合适的方法是定量PCR(qPCR)，特别是经优化的qPCR或数字液滴PCR。

此外，复制缺陷型病毒组合物可以以一定剂量单位调配以含有在约1.0x10⁹GC至约1.0x10¹⁵GC的范围内的复制缺陷型病毒量。在另一个实施例中，此量的病毒基因组可以以分剂量的形式递送。在一个实施例中，对于约5-10kg的平均犬或猫受试者，剂量为约1.0x10¹⁰GC至约3.0x10¹³GC。在另一个实施例中，剂量为约1x10⁹GC。例如，AAV病毒的剂量可以为约1x10¹⁰GC、1x10¹¹GC、约5x10¹¹GC、约1x10¹²GC、约5x10¹²GC或约1x10¹³GC。在另一个实施例中，对于犬或猫受试者，剂量为约1.0x10⁹GC/kg至约3.0x10¹³GC/kg身体质量。在另一个实施例中，剂量约1x10⁹GC/kg。在另一个实施例中，剂量约1x10¹⁰GC/kg。在另一个实施例中，剂量约1x10¹¹GC/kg。例如，AAV病毒的剂量可以为约1x10¹⁰GC/kg、1x10¹¹GC/kg、约5x10¹¹GC/kg、约1x10¹²GC/kg、约5x10¹²GC/kg或约1x10¹³GC/kg。

另一方面，提供了一种在犬或猫受试者体内持续表达胰岛素原融合蛋白的方法。所述方法包含向有需要的受试者施用如本文所描述的组合物。在一个实施例中，组合物包含含有胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白表达盒的病毒粒子，如本文所描述的。在一些实施例中，本文所提供的方法使得胰岛素原融合蛋白在受试者体内表达至少一周、至少两周、至少四周、至少6周、至少8周、至少10周、至少12周、至少16周、至少20周、至少30周、至少40周、至少50周或至少60周。在一些实施例中，本文所提供的方法使得胰岛素原融合蛋白在受试者体内表达至少八周。在一些实施例中，本文所提供的方法使得胰岛素原融合蛋白在受试者体内以治疗有效浓度表达至少一个月、至少三个月、至少六个月或至少十二个月。

在一个实施例中，对于兽医受试者，构建体可以以1μL至约100mL的体积递送。参见例如，Diehl等人,《应用毒理学杂志(J.Applied Toxicology)》,21:15-23(2001)的对用于向各种兽类动物施用物质的良好实践的讨论。此文档通过引用并入本文。如本文所使用的，术语“剂量”可以指在治疗过程中向受试者递送的总剂量或以单次(或多次)施用递送的量。

在一个实施例中，组合物与有效量的胰岛素组合施用。各种可商购获得的胰岛素产品是本领域已知的，所述胰岛素产品包含但不限于鱼精蛋白锌重组人胰岛素猪胰岛素锌悬浮液和甘精胰岛素在一些实施例中，与用AAV病毒粒子进行治疗之前相比，本文所描述的rAAV与胰岛素的组合降低了受试者的胰岛素剂量要求。此类剂量要求可以降低10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、或90％或更多。治疗医师可以确定受试者所需的胰岛素的正确剂量。例如，可以使用胰岛素或其它疗法来治疗受试者，所述治疗医师可以在施用AAV病毒粒子后继续进行治疗。此类胰岛素或其它共同疗法可以随后根据需要继续、减少或中断。

在一个实施例中，将包括表达盒、载体基因组、rAAV的组合物或本文所描述的用于基因疗法的其它组合物以单剂量/受试者递送。在一个实施例中，向受试者递送治疗有效量的本文所描述的组合物。如本文所使用的，“治疗有效量”是指表达盒或病毒粒子或其组合在靶细胞中递送和表达足以达到治疗目标的胰岛素原-血清白蛋白的量的量。在某些实施例中，治疗目标是改善或治疗I型糖尿病、II型糖尿病或代谢综合征的症状中的一种或多种症状。治疗有效量可以基于动物模型而不是犬或猫受试者来确定。在另一个实施例中，治疗目标是缓解受试者的代谢疾病。

可以根据所公开的方法将上文所描述的重组AAV病毒粒子递送到宿主细胞。可以将优选地悬浮于生理上相容的载剂中的rAAV向包含犬在内的期望的受试者施用。鉴于转移病毒所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载剂。例如，一种合适的载剂包含盐水，其可以用多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)调配。其它示例性载剂包含无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。对载剂的选择不是对本发明的限制。

在一些实施例中，除了rAAV和/或变体以及载剂之外，本发明的组合物还可以含有其它常规药物成分(如防腐剂或化学稳定剂)。说明性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚以及对氯苯酚。说明性化学稳定剂包含明胶和白蛋白。

本文所描述的重组病毒粒子和构建体可以用于制备药物，所述药物用于将胰岛素原融合蛋白构建体递送到有需要的受试者，将具有增加的半衰期的胰岛素供应到受试者，和/或用于治疗受试者的I型糖尿病、II型糖尿病或代谢综合征。

一方面，提供了一种治疗糖尿病的方法。所述方法包含向有需要的犬或猫受试者施用如本文所描述的组合物。在一个实施例中，组合物包含含有胰岛素原融合蛋白表达盒的病毒粒子，如本文所描述的。

在另一个实施例中，提供了一种用于治疗犬或猫的2型糖尿病的方法。所述方法包含施用病毒粒子，所述病毒粒子包括核酸分子，所述核酸分子包括编码如本文所描述的胰岛素原融合蛋白的序列。

在另一个实施例中，提供了一种用于治疗犬或猫的1型糖尿病的方法。所述方法包含施用病毒粒子，所述病毒粒子包括核酸分子，所述核酸分子包括编码如本文所描述的胰岛素原融合蛋白的序列。

在另一方面，提供了一种治疗犬或猫的代谢疾病的方法。所述方法包含向有需要的犬或猫受试者施用如本文所描述的组合物。在一个实施例中，组合物包含含有胰岛素原融合蛋白表达盒的病毒粒子，如本文所描述的。在一个实施例中，代谢疾病是I型糖尿病。在一个实施例中，代谢疾病是II型糖尿病。在一个实施例中，代谢疾病是代谢综合征。

在另一个实施例中，提供了一种用于治疗犬或猫的糖尿病的方法。所述方法包含施用病毒粒子，所述病毒粒子包括核酸分子，所述核酸分子包括编码如本文所描述的胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白的序列，其中所述病毒粒子在向受试者施用胰岛素后施用。在一些实施例中，在向受试者施用胰岛素后至少1天、至少3天、至少5天、至少一周、至少2周、至少3周或至少4周施用病毒粒子。

在另一个实施例中，提供了一种预防糖尿病犬或猫的白内障形成的方法。所述方法包含施用病毒粒子，所述病毒粒子包括核酸分子，所述核酸分子包括编码如本文所描述的胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白的序列。在一些实施例中，在向受试者施用胰岛素后施用病毒粒子。

在另一个实施例中，提供了一种降低糖尿病犬或猫的血糖浓度的方法。所述方法包含施用病毒粒子，所述病毒粒子包括核酸分子，所述核酸分子包括编码如本文所描述的胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白的序列。

如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”被定义为涵盖出于改善I型糖尿病、II型糖尿病(T2DM)或代谢综合征的一种或多种症状的目的向受试者施用本文所描述的一种或多种化合物或组合物。因此，“治疗”可以包含以下的一种或多种：降低给定受试者的I型糖尿病、II型糖尿病或代谢综合征的进展、降低给定受试者的症状的严重程度、去除给定受试者的疾病症状、延迟给定受试者的疾病的进展或增加给定受试者的疗法功效中。

如本文所使用的，术语“缓解”是指当猫或狗不再表现出糖尿病的临床体征并且具有正常血糖水平时停止胰岛素治疗的能力。

在另一个实施例中，提供了一种用于治疗猫或犬的T2DM的方法。所述方法包含施用病毒粒子，所述病毒粒子包括核酸分子，所述核酸分子包括编码如本文所描述的融合蛋白的序列。

另一方面，提供了一种治疗猫或犬的代谢疾病的方法。所述方法包含向有需要的猫或犬受试者施用如本文所描述的组合物。在一个实施例中，组合物包含含有胰岛素原融合蛋白表达盒的病毒粒子，如本文所描述的。

另一方面，提供了一种降低犬或猫受试者的空腹血糖的方法。所述方法包含向有需要的受试者施用如本文所描述的组合物。在一个实施例中，组合物包含含有胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白表达盒的病毒粒子，如本文所描述的。在一些实施例中，本文所提供的方法将受试者的空腹血糖降低了至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％。在一些实施例中，本文所提供的方法将受试者的空腹血糖降低了约20％。在一些实施例中，本文所提供的方法将受试者的空腹血糖降低了约30％。在一些实施例中，本文所提供的方法将受试者的空腹血糖降低了约40％。

除非另有定义，否则本文所使用的所有术语(包含技术术语和科学术语)具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。将进一步理解的是，术语，如在常用字典中所定义的那些术语，应被解释为具有与其在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且除非在本文中明确如此定义，否则不应被解释为理想化或过正式意义。说明书中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不旨在是限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体并入本文。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。

在描述实施例时对“一个实施例”或“另一个实施例”的引用并不意味着所引用的实施例与另一个实施例(例如，在所引用实施例之前描述的实施例)相互排斥，除非另有明确规定。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区之上针对最大对应性进行比较和比对时，在指定区之上与参考序列共享至少约80％同一性，例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，如使用以下序列比较算法或通过手动比对和视觉检查测量的)的两个或更多个序列或子序列。此类序列然后被称为“基本上相同”。此定义还指测试序列的补体。在一些实施例中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区上，例如，存在于长度为50个、100个、200个、300个、400个氨基酸或核苷酸的区上，或存在于全长的参考序列上。

为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，随后指定坐标(如有必要)，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代性参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。在一些实施例中，使用BLAST和BLAST 2.0算法以及默认参数。

在氨基酸序列的上下文中，术语“同一性百分比(％)”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同百分比”是指两个序列中的残基在比对以获得对应性时是相同的。可以容易地确定全长的蛋白质、多肽、约70个氨基酸至约100个氨基酸或其肽片段或对应的核酸序列编码序列上的氨基酸序列的同一性百分比。合适的氨基酸片段的长度可以为至少约8个氨基酸并且可以为至多约150个氨基酸。通常，当提及两种不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“类似性”时，参考“所比对的”序列来确定“同一性”、“同源性”或“类似性”。

“所比对的”序列或“比对”是指与参考序列相比，通常含有对丢失的或另外的碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序中的任一种进行比对。序列比对程序可用于氨基酸序列，例如，“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，以默认设置使用这些程序中的任何程序，尽管本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，所述算法或程序提供至少与通过参考算法和程序所提供的同一性或比对水平相同的同一性或比对。

术语“氨基酸取代”和其同义词旨在涵盖通过用另一个取代氨基酸置换一个氨基酸来修饰氨基酸序列。取代可以是保守取代。所述取代还可以是非保守取代。关于两个氨基酸，术语保守旨在意指氨基酸共享本领域技术人员公认的共同性质。例如，具有疏水性非酸性侧链的氨基酸、具有疏水性酸性侧链的氨基酸、具有亲水性非酸性侧链的氨基酸、具有亲水性酸性侧链的氨基酸以及具有亲水性碱性侧链的氨基酸。共同性质还可以是具有疏水性侧链的氨基酸、具有脂肪族疏水性侧链的氨基酸、具有芳香族疏水性侧链的氨基酸、具有极性中性侧链的氨基酸、具有带电侧链的氨基酸、具有带电酸性侧链的氨基酸以及具有带电碱性侧链的氨基酸。天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸两者在本领域中都是已知的并且可以在实施例中用作取代氨基酸。用于置换氨基酸的方法是本领域技术人员熟知的，并且包含但不限于编码氨基酸序列的核苷酸序列的突变。在本文中提及“一个或多个”旨在涵盖例如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个的单独的实施例。

可以使用密码子优化将编码序列设计成用于最佳表达。经密码子优化的编码区可以通过各种不同的方法来设计。可以使用在线可获得的方法、所公开的方法或提供密码子优化服务的公司来进行此优化。例如在国际专利申请公开第WO 2015/012924号中描述了一种密码子优化方法，所述国际专利申请公开通过引用并入本文。简而言之，用同义密码子序列修饰编码产物的核酸序列。合适地，对产物的开放阅读框(ORF)的整个长度进行修饰。然而，在一些实施例中，仅ORF的片段可以被改变。通过使用这些方法中的一种方法，可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并且产生编码多肽的经密码子优化的编码区的核酸片段。

在一实施例中，胰岛素-血清白蛋白融合物被犬科化或猫科化。

“犬科化”意指融合蛋白包括与犬相容的氨基酸序列，使得所述氨基酸序列不太可能被犬受试者的免疫系统视为外来物。在本公开中，前缀为“ca”的多肽术语是指人多肽的变体，其中人融合结构域被所述融合结构域的犬同源物置换，并且当胰岛素原是人蛋白质的片段或变体时，胰岛素原被所述片段或变体的犬同源物置换。

“猫科化”意指融合蛋白包括与猫相容的氨基酸序列，使得所述氨基酸序列不太可能被猫受试者的免疫系统视为外来物。在本公开中，前缀为“fe”的多肽术语是指人多肽的变体，其中人融合结构域被所述融合结构域的猫同源物置换，并且当胰岛素原是人蛋白质的片段或变体时，胰岛素原被所述片段或变体的猫同源物置换。

如本文其它地方所述，本公开扩展到与除犬或猫以外的物种相容的融合蛋白。在此上下文中，融合蛋白可以被称为“特异化”，是指分子将被施用的靶物种。

在一些实施例中，本文所描述的组合物和方法旨在用于猫科动物。术语猫(猫科(family Felidae))是指37种猫物种中的任一种，所述猫物种包含猎豹、美洲狮、美洲豹、豹、狮子、猞猁、老虎和家猫等。在一实施例中，受试者是家猫。在一些实施例中，本文所描述的组合物和方法旨在用于犬科动物中。术语犬是指犬科(Canidae family)中的任何物种，所述物种包含家犬(domestic dog)、狼和狐狸等。在一实施例中，受试者是家犬，也称为家犬(Canis lupus familiaris)或家犬(Canis familiaris)。

如在对本发明和所附权利要求书的描述中所使用的，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”也旨在包含复数形式，除非上下文另外明确指示。

还如本文所使用的，“和/或(and/or)”指代并涵盖相关联的所列项中的一个或多个所列项的任何和所有可能组合，以及在替代方案(或)中解释时组合的缺乏。

如本文所使用的，短语“基本上由…组成”是指在方法或组合物中所引用的活性药剂的属或物种，并且可以进一步包含其本身对于所引用的指征或目的不具有实质性活性的其它药剂。

词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被解释为是包含性的而不是排他性的。词语“由…组成(consist)”、“由…组成(consisting)”和其变体将被解释为是排他性的而不是包含性的。虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在其它情况下，也旨在使用“由…组成”或“基本上由…组成”的语言来解释和描述相关实施例。

如本文所使用的，除非另有说明，否则术语“约”意指相对于给定参考的10％的变化性。

如本文所使用的，术语“调控”或其变型是指组合物抑制生物通路的一个或多个组分的能力。

如本文所使用的，“疾病”、“病症”和“病状”可互换地用于指示受试者的异常状态。

术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换地指代哺乳动物、人或非人灵长类动物、家养哺乳动物(例如，犬或猫)、实验室哺乳动物和农业哺乳动物。在各个实施例中，受试者可以是人(例如，成年男性、成年女性、青春期男性、青春期女性、男性儿童、女性儿童)。在各个实施例中，受试者是伴侣动物。说明性伴侣动物包含但不限于狗、猫、马、兔、雪貂、鸟和豚鼠。在各个实施例中，受试者是犬。在各个实施例中，受试者是猫。在各个实施例中，受试者是哺乳动物。

如本文所使用的，术语“病毒颗粒”或“病毒粒子”是指能够将外来核酸分子递送到与另一种药剂无关的细胞中的大分子复合物。病毒的独立颗粒，“病毒颗粒”或“病毒粒子”，由遗传物质(即，编码转基因的DNA或RNA)和衣壳组成。颗粒可以是病毒颗粒或非病毒颗粒。病毒颗粒包含逆转录病毒颗粒、慢病毒颗粒和腺相关病毒颗粒。术语“腺相关病毒颗粒”可以与“重组腺相关病毒(rAAV)载体”可互换地使用，并指示存在核酸酶抗性AAV衣壳，所述核酸酶抗性AAV衣壳中包装有复制缺陷型载体基因组。非病毒颗粒限于脂质体、纳米颗粒和用于将多核苷酸递送到细胞中的其它包封系统。

术语“转基因”是指转移的核酸本身。转基因可以是裸核酸分子(如质粒)或RNA。转基因可以包含编码一种或多种多肽(例如，胰岛素融合蛋白)的多核苷酸。转基因可以包含编码一种或多种异源蛋白(例如，胰岛素融合蛋白)的多核苷酸、一种或多种衣壳蛋白以及将多核苷酸转导到靶细胞中所需的其它蛋白质。

术语“转导”是指通过颗粒(例如，腺相关病毒颗粒)将核酸引入到细胞或宿主生物体中。因此，通过病毒颗粒将转基因引入到细胞中可以被称为细胞的“转导”。转基因可以或可以不被整合到经转导的细胞的基因组核酸中。如果所引入的转基因变为整合到接受者细胞或生物体的核酸(基因组DNA)中，则所述转基因可以在所述细胞中稳定地维持。可替代地，所引入的转基因可以染色体外地或仅短暂地存在于接受者细胞或宿主生物体中。因此，“经转导的细胞”是指通过转导的方式将转基因引入到其中的细胞。因此，“经转导的”细胞是被引入到多核苷酸中的细胞。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”可以指包装细胞系，其中由生产质粒产生病毒粒子(例如，重组AAV或rAAV)。在替代方案中，术语“宿主细胞”可以指期望表达本文所描述的基因产物的任何靶细胞。因此，“宿主细胞”是指原核或真核细胞(例如，细菌细胞、人类细胞或昆虫细胞)，所述原核或真核细胞含有通过任何方式(例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合)引入到细胞中的外源性或异源DNA。在本文中的某些实施例中，术语“宿主细胞”是指用于体外评估本文所描述的组合物的各种哺乳动物物种的细胞的培养物。在本文中的其它实施例中，术语“宿主细胞”是指用于产生和包装病毒粒子或重组病毒的细胞。在一另外的实施例中，术语“宿主细胞”是肠细胞、小肠细胞、胰细胞、肝脏细胞。

如本文所使用的，术语“靶细胞”是指期望表达异源核酸序列或蛋白质的任何靶细胞。在某些实施例中，靶细胞是肝脏细胞。在一些实施例中，靶细胞是肌细胞。

如本文所使用的，“表达盒”或“载体基因组”是指包括生物学上有用的核酸序列(例如，编码蛋白质、酶或其它有用的基因产物的基因cDNA、mRNA等)和与其可操作地连接的调控序列的核酸分子，所述调控序列引导或调节核酸序列和其基因产物的转录、翻译和/或表达。如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包含与核酸序列邻接或非邻接的调控序列(也称为元件)以及以反式或顺式核酸序列起作用的调控序列两者。此类调控序列通常包含例如以下中的一个或多个：启动子、增强子、转录因子、转录终止子、内含子、增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)、有效的RNA加工信号(如切片和聚腺苷酸化序列)、稳定细胞质mRNA的序列(例如，土拨鼠肝炎病毒(WHP)翻译后调控元件(WPRE))和TATA信号。表达盒可以含有基因序列上游(5'处)的调控序列，例如，启动子、增强子、内含子等中的一个或多个以及增强子，或基因序列下游(3'处)的调控序列中的一个或多个，例如，包括聚腺苷酸化位点的3'非翻译区(3'UTR)，以及其它元件。在某些实施例中，调控序列与基因产物的核酸序列可操作地连接，其中调控序列通过中间核酸序列，即5'-非翻译区(5'UTR)与基因产物的核酸序列分离。在某些实施例中，表达盒包括基因产物中的一种或多种基因产物的核酸序列。在一些实施例中，表达盒可以是单顺反子表达盒或双顺反子表达盒。在其它实施例中，术语“转基因”是指来自外源性来源的插入到靶细胞中的一个或多个DNA序列。通常，此类表达盒可以用于产生病毒粒子，并且含有本文所描述的基因产物的侧接病毒基因组的包装信号的编码序列和其它表达控制序列，如本文所描述的序列。在某些实施例中，载体基因组可以含有两个或更多个表达盒。

如本文所使用的，“施用”是指局部和全身施用，例如，包含肠内施用、肠胃外施用、肺部施用和局部/经皮施用。在本文所描述的方法中使用的药物成分(例如，病毒粒子)的施用途径包含，例如，口服(经口(P.O.))施用、鼻施用或吸入施用、栓剂形式的施用、局部接触、经皮递送(例如，通过经皮贴片)、鞘内(IT)施用、静脉内(“iv”)施用、腹膜内(“ip”)施用、肌内(“im”)施用、病灶内施用或皮下(“sc”)施用，或将缓释装置(例如，微渗透泵、储库制剂等)植入到受试者体内。肠胃外施用包含例如静脉内、肌内、动脉内、肾内、尿道内、心内、冠状动脉内、心肌内、皮肤内、硬膜外、皮下、腹膜内、心室内、离子导入和颅内。

术语“全身施用”和“全身施用的”是指将药物成分或组合物向哺乳动物施用，使得药物成分或组合物通过循环系统递送到体内的部位(包含药物作用的目标部位)的方法。全身施用包含但不限于口服施用、鼻内施用、直肠施用和肠胃外施用(例如，除通过消化道外，如肌内、静脉内、动脉内、经皮和皮下)施用。

术语“有效量”或“药学有效量”是指产生期望的结果所需的一种或多种药物成分(例如，病毒粒子)的量和/或剂量和/或剂量方案。

如本文所使用的，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指延迟所述术语适用的疾病或病状或此类疾病或病状的一种或多种症状的发作、延缓或逆转所述疾病或病状或其症状的进展、降低所述疾病或病状或其症状的严重程度或减轻或预防所述疾病或病状或其症状。术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还包含预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转疾病或病状的一种或多种症状。

术语“减轻”是指减少或消除病理或疾病的一种或多种症状，和/或降低病理或疾病的一种或多种症状的发作率或延迟发作或减轻其严重程度和/或预防所述病理或疾病。在一些实施例中，病理或疾病的一种或多种症状的减少或消除可以包含，例如，空腹血糖的可测量且持续的减少。

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本文所提及的所有出版物和专利都特此通过引用以其整体并入，就好像每个单独的出版物或专利都被具体地且单独地指出通过引用并入。在冲突的情况下，以包含本文中的任何定义的本申请为准。然而，对本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为并且不应当被视为对其构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。

本文所使用的章节标题仅出于组织目的，并且不应被解释为对所描述的主题进行限制。

尽管已经说明和描述了说明性实施例，但是应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在其中进行各种改变。

实例

提出以下实例以便于向本领域的普通技术人员提供对本文所描述的组合物和方法可以如何使用、制备和评价的描述，并且旨在对本发明是单纯说明性的并且不旨在限制关于本发明的范围。

实例1：半衰期延长的犬胰岛素-血清白蛋白融合物的产生和犬胰岛素融合蛋白的体外效力的评估

已经开发了一种被设计成通过AAV病毒粒子施用的犬胰岛素-血清白蛋白融合蛋白，以管理狗的高血糖症和高血糖症相关糖尿病临床体征。

通过构建含有以下元件的融合多肽来产生犬前胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白(cINS-Alb)(图1A)(SEQ ID NO:1)：

·天然犬胰岛素信号肽(SP)

·犬胰岛素原，其中天然序列在3个氨基酸位置(K29R、R31K和L62R)处被修饰，以在现有蛋白酶切割位点(B链、C肽、A链)处并入2个弗林蛋白酶切割位点

·14aa Gly/Ser接头，其包括序列GGGGSGGGGSGGGS(SEQ ID NO:8)

·犬血清白蛋白

除了用犬转铁蛋白(cINS-Tf)置换犬血清白蛋白序列外，用与上述相同的元件制备犬前胰岛素原融合蛋白(图1B)(SEQ ID NO:3)。SEQ ID NO:26中提供了白蛋白融合物的表达盒，并且生产质粒的载体基因组在SEQ ID NO:27中。在作为对照(cINS-2-1)(图1C)的AAV病毒粒子中也产生了具有3个氨基酸修饰(K29R、R31K和L62R)的对照犬前胰岛素原序列(无融合物)(SEQ ID NO:5；对照的表达盒在SEQ ID NO:30中，并且载体基因组在SEQ IDNO:31中)。生产质粒的载体基因组全部含有缩短的AAV 5′和3′ITR。SEQ ID NO:28提供了犬胰岛素原-转铁蛋白融合蛋白的表达盒。在SEQ ID NO:29中提供了载体基因组。

进行了一项研究，以评估两种融合蛋白(cINS-Alb和cINS-Tf)的体外效力，在瞬时转染含有编码相应蛋白质的cDNA的表达质粒后，在哺乳动物细胞中产生了每种蛋白质的C末端组氨酸标记的版本。通过镍亲和色谱法从细胞上清液中纯化蛋白质，并按照试剂盒说明使用胰岛素生物测定试剂盒(Eurofins^TMDiscoverX Products有限公司(Eurofins^TMDiscoverX Products,LLC))测定胰岛素生物活性。将试剂盒中所提供的标准胰岛素用作参考对照。cINS-Alb和cINS-Tf在此测定中均显示出生物活性(图2)。如通过EC₅₀值的变化所指示的，对两种融合蛋白中的胰岛素分子进行的修饰导致效力略有损失。

实例2：包括犬胰岛素融合蛋白转基因的AAV病毒粒子的产生和体内功效的评估

为了产生AAV病毒粒子，将经密码子优化的转基因克隆到含有CB7启动子元件(包括杂合巨细胞病毒增强子和鸡b-肌动蛋白启动子)的质粒中，所述经密码子优化的转基因编码具有3个氨基酸修饰但没有融合配偶体的对照(AAVrh91.cIns.2-1)和两种胰岛素融合蛋白(SEQ ID NO:1、3和5)。表达构建体侧接质粒中的缩短的130bp 5′和3'AAV反向末端重复序列(ITR)，并通过用表达AAVrh91衣壳的反式质粒和表达复制和生产所需的腺病毒辅助功能的辅助质粒进行三重转染，将所述表达构建体包装在AAV血清型rh91衣壳(AAVrh91)病毒粒子中，表达E1腺病毒功能的HEK 293包装细胞不提供腺病毒辅助功能。在复制和包装期间，5′和3'ITR恢复到完整的野生型145bp ITR长度。随后通过Taqman^TM定量PCR滴定碘克沙醇梯度纯化来纯化AAV病毒粒子。

进行了一项研究，以评估三种AAV递送的犬胰岛素融合蛋白在糖尿病小鼠模型中的体内功效。已用链脲佐菌素处理以诱导糖尿病的NOD-SCID小鼠被分配到下表1中所示的四组中的一组。包含第5组的非糖尿病NOD-SCID小鼠作为对照。

表1：研究组

组别	数量	STZ诱导的糖尿病？	载体基因组	剂量(GC/小鼠)
					1	7	是	PBS	-
2	8	是	AAVrh91.cIns-Alb	1x10¹¹
					3	8	是	AAVrh91.cIns-Tf	1x10¹¹
4	8	是	AAVrh91.cIns.2-1(对照)	1x10¹¹
					5	10	否	PBS	-

通过肌内(IM)注射向小鼠施用病毒粒子(1x10¹¹GC/小鼠)。在空腹血糖采样前6小时，每周两次从笼子里取出食物。由于低血糖症，来自第2组的两只小鼠被实施安乐死(分别在第45天和第52天)。由于身体状况评分差和血糖高，来自第3组的一只小鼠在第28天被实施安乐死。通过血糖仪测量空腹血糖，所述空腹血糖的上限为600mg/dL。

与对照组1相比，接受含有对照cINS-2-1(第4组)和cINS-Alb(第2组)转基因的AAV病毒粒子的动物的血糖水平显著降低(图3A)。与含有对照cINS-2-1的AAV(第4组)相比，接受含有cINS-Alb融合物的AAV的小鼠(第2组)表现出空腹血糖水平下降更明显和更快。到第32天，第2组的血糖水平已经归一化，并且与非糖尿病小鼠队列(第5组)中观察到的血糖水平类似。与接受含有cINS-Alb融合物的AAV的动物(第2组)中所观察到的血糖水平显著降低相反，在施用含有cINS-Tf融合物的AAV的动物队列(第3组)中未观察到血糖降低。

小鼠的体重变化在图3B中示出。施用含有cINS-Alb融合物的AAV的小鼠往往比其它组中的糖尿病动物体重增加更多，尽管这在统计学上并不显著。

为了检查经表达的犬胰岛素蛋白的相对生物学效力，如上文详细描述的，在胰岛素生物测定试剂盒中测试了第28天和第56天采集的小鼠的血清。如图3C所示，在第28天和第56天，施用含有cINS-Alb融合物的AAV的动物的循环强效胰岛素水平显著高于其它队列中的动物的循环强效胰岛素水平。令人惊讶的是，尽管cINS-Tf蛋白在体外测定中示出中等活性，但在体内未观察到胰岛素转铁蛋白融合蛋白的活性或功效的证据。此数据示出，cINS-Alb表现出比cINS-Tf更高的生物活性，并且含有cINS-All融合物的AAV表现出比含有cINS-Tf融合物的AAV更高的体内功效。

实例3：AAV-caINS-Alb在健康犬受试者体内的评估

将进行一项研究，以评估在健康狗中施用表达caINS-Alb的AAVrh91病毒粒子后的表达、免疫原性和对血糖的影响。两组称重为大约10kg至15kg的健康狗将以1x10¹¹或1x10¹²GC/kg的剂量肌内给药施用AAV-caINS-Alb。在施用AAV-caINS-Alb之前，将进行一系列包含兽医检查、血清果糖胺分析以及血液学、临床化学分析和尿液分析的健康筛查措施。然后每周收集血清样品，持续至多8周，以使用如下文所描述的夹心ELISA方案确定循环caINS-Alb蛋白的水平。

通过在桥接测定中测量抗caINS-Alb抗体，将确定caINS-Alb的潜在免疫原性。每天将测量两次血糖水平，并使用连续葡萄糖监测系统(FreeStyle Libre^TM，雅培公司(Abbott))以规律的间隔记录间质葡萄糖浓度。每天观察动物是否有过敏、嗜睡和低血糖症的体征。

为了测量caINS-Alb的血清浓度，使用了夹心ELISA。将ELISA板用0.2μg/ml的小鼠抗人胰岛素(克隆7F8，生命技术公司)包被，并用PBS/0.05％吐温20/1％酪蛋白阻断。将经包被的孔在室温下与100μL适当稀释的血清样品一起温育1小时，所述血清样品在PBS/0.05％吐温20/1％酪蛋白中稀释。使用在200ng/ml至0.19ng/ml范围内的经纯化的caINS-Alb标准品来建立标准曲线。洗涤后，将板与1/2000稀释的山羊抗狗白蛋白(贝瑟尔实验室(Bethyl Laboratories))在PBS/0.05％吐温20/1％酪蛋白中温育1小时。然后将板用PBS/0.05％吐温20洗涤五次，并通过添加四甲基联苯胺(TMB)底物进行显影。通过添加2M H₂SO₄停止显影，并在450nm处读取吸光度。

实例4：AAV-caINS-Alb在犬链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型中的功效的评估

在一项非随机、非盲法的实验室研究中，将评估六只正在接受稳定糖尿病处理方案的患有化学诱导型糖尿病的比格犬的单次施用表达caINS-Alb的AAVrh91病毒粒子以充分维持糖尿病狗的血糖水平的功效。

将评估低剂量(1x10¹¹gc/kg，N＝3)表达caINS-Alb的AAVrh91病毒粒子和高剂量(1x10¹²gc/kg，N＝3)表达caINS-Alb的AAVrh91病毒粒子。在施用AAV-caINS-Alb之前，将进行一系列包含兽医检查、血清果糖胺分析以及血液学、临床化学分析和尿液分析的健康筛查措施。在整个研究过程中，将通过血糖仪进行每日3次血糖测量和每日2次临床观察。在第-1天，受试者将适应连续血糖监测仪的放置，并每日3次收集间质葡萄糖浓度。

在研究过程中，除了在基线时开始的每日程序外，还将每14天进行一次果糖胺分析、血液学和临床化学的血液采集，直到第42天，并在第63天再进行一次。在整个研究过程中，将定期收集用于测定循环caINS-Alb蛋白和抗caINS-Alb抗体的血液采集，并且每7天测量一次体重。所需的补充胰岛素剂量水平、体重增加和血糖控制将用于评估测试产品在个体受试者体内测试的两种剂量下的功效。

实例5：AAV-caINS-Alb在犬糖尿病模型中的功效的评估

将进行一项研究，以评估单次施用表达caINS-Alb的AAVrh91病毒粒子对糖尿病狗充分维持血糖水平的功效。

先前诊断为患有糖尿病、接受稳定胰岛素处理且血糖控制在中度至良好的狗将用安慰剂或AAV-caINS-Alb(肌内施用)进行处理。新诊断为患有糖尿病的狗将用安慰剂或AAV-caINS-Alb(肌内施用)进行处理。在施用AAV-caINS-Alb之前，将进行一系列包含兽医检查、血清果糖胺分析以及血液学、临床化学分析和尿液分析的健康筛查措施。在AAV施用前和在整个研究过程中，将通过使用连续葡萄糖监测仪连续测量间质葡萄糖浓度或使用血糖仪每日两次测量间质葡萄糖浓度来评估血糖控制。在整个研究过程中，向狗喂食一致的饮食，并监测体重。在研究过程中，除了血糖监测外，还将定期分析用于果糖胺分析、血液学、临床化学和循环caINS-Alb蛋白的血液采集。使用定制的夹心ELISA测量caINS-Alb的血清水平。补充胰岛素、胰岛素剂量、体重和血糖控制以及临床体征改善的要求将用于评估测试产品的功效。

实例6：AAV-feINS-Alb在猫糖尿病模型中的功效的评估

将进行一项研究，以评估单次施用表达feINS-Alb的AAVrh91病毒粒子对糖尿病猫充分维持血糖水平的功效。

先前诊断为患有糖尿病、接受稳定胰岛素处理且血糖控制在中度至良好的猫将用安慰剂或AAV-feINS-Alb(肌内施用)进行处理。新诊断为患有糖尿病的猫将用安慰剂或AAV-feINS-Alb(肌内施用)进行处理。在施用AAV-feINS-Alb之前，将进行一系列包含兽医检查、血清果糖胺分析以及血液学、临床化学分析和尿液分析的健康筛查措施。在施用前和在整个研究过程中，将通过使用连续葡萄糖监测仪连续测量间质葡萄糖浓度或使用血糖仪每日两次测量间质葡萄糖浓度来评估血糖控制。在整个研究过程中，将向猫喂食一致的饮食，并将监测体重。在研究过程中，除了血糖监测外，还将定期分析用于果糖胺分析、血液学、临床化学和循环feINS-Alb蛋白的血液采集。将使用定制的夹心ELISA测量feINS-Alb的血清水平。补充胰岛素、胰岛素剂量、体重和血糖控制以及临床体征改善和缓解速率和缓解时间的要求将用于评估测试产品的功效。

为测量feINS-Alb的血清浓度，将使用如下所示的定制的夹心ELISA。将ELISA板用0.2μg/ml的小鼠抗人胰岛素(克隆7F8，生命技术公司)包被，并用PBS/0.05％吐温20/1％酪蛋白阻断。将经包被的孔在室温下与100μL适当稀释的血清样品一起温育1小时，所述血清样品在PBS/0.05％吐温20/1％酪蛋白中稀释。使用在200ng/ml至0.19ng/ml范围内的经纯化的feINS-Alb标准品来建立标准曲线。洗涤后，将板与1/2000稀释的山羊抗猫白蛋白(贝瑟尔实验室)在PBS/0.05％吐温20/1％酪蛋白中温育1小时。然后将板用PBS/0.05％吐温20洗涤五次，并通过添加TMB底物进行显影。通过添加2M H₂SO₄停止显影，并在450nm处读取吸光度。

本说明书中引用的所有出版物均通过引用并入本文。于2022年3月1日提交的美国临时专利申请第63/315,252号通过引用以其整体并入本文。虽然已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下可以进行修改。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于治疗伴侣动物的重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，所述rAAV病毒粒子包括AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包括包含编码融合蛋白的多核苷酸的表达盒，所述融合蛋白包括胰岛素原和血清白蛋白，所述表达盒侧接有5'反向末端重复序列(ITR)和3'ITR，其中所述胰岛素原是犬胰岛素原或猫胰岛素原。

2.根据权利要求1所述的rAAV病毒粒子，其中所述AAV衣壳包括AAVrh91衣壳。

3.根据权利要求2所述的rAAV病毒粒子，其中所述AAVrh91衣壳包括60种AAVrh91衣壳蛋白，所述AAVrh91衣壳蛋白与SEQ ID NO:22的氨基酸203至736包括至少99％或至少100％同一性。

4.根据权利要求1所述的rAAV病毒粒子，其中胰岛素原是犬胰岛素原。

5.根据权利要求4所述的rAAV病毒粒子，其中犬胰岛素原序列与SEQ ID NO:14至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同。

6.根据权利要求1所述的rAAV病毒粒子，其中胰岛素原是猫胰岛素原。

7.根据权利要求6所述的rAAV病毒粒子，其中猫胰岛素原序列与SEQ ID NO:15共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。

8.根据权利要求1或权利要求2所述的rAAV病毒粒子，其中所述融合蛋白包括与SEQ IDNO:1共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的多肽。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中所述融合蛋白包括N末端信号肽。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中所述信号肽是犬胰岛素信号肽。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的rAAV病毒粒子，其中所述信号肽包括与MALWMRLLPLLALLALWAPAPTRA(SEQ ID NO:7)共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

12.根据权利要求1至5中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中与如SEQ ID NO:10中所示的参考多肽序列相比，所述犬胰岛素原是在一个或多个切割位点处具有突变的犬胰岛素原变体。

13.根据权利要求1至5、11或12中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中所述胰岛素原是与犬血清白蛋白融合的犬胰岛素原。

14.根据权利要求1至5或8至13中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中犬胰岛素原-血清白蛋白融合多核苷酸与SEQ ID NO:2共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。

15.根据权利要求1至5或8至14中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中与如SEQ ID NO:10中所示的参考多肽序列相比，所述犬胰岛素原包括K29R、R31K和L62R突变。

16.根据权利要求1至5或8至15中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中犬胰岛素原-血清白蛋白融合蛋白包括与SEQ ID NO:8共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的接头。

17.根据权利要求1至3、6或7中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中所述融合蛋白包括猫N末端信号肽。

18.根据权利要求17所述的rAAV病毒粒子，其中所述信号肽包括与SEQ ID NO:9共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的序列。

19.根据权利要求1至3、6、7、17或18中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中与如SEQ IDNO:24中所示的参考多肽序列相比，所述猫胰岛素原是在一个或多个切割位点处具有突变的猫胰岛素原变体。

20.根据权利要求1至3、6、7或18中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中所述胰岛素原是与猫血清白蛋白融合的猫胰岛素原。

21.根据权利要求1至3、6、7、17至20中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中猫胰岛素原-猫血清白蛋白融合多核苷酸与SEQ ID NO:33共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。

22.根据权利要求1至5或8至134中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中与如SEQ ID NO:24中所示的参考多肽序列相比，所述猫胰岛素原包括K29R、R31K和L62R突变。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中编码所述融合蛋白的所述多核苷酸与启动子可操作地连接。

24.根据权利要求23所述的rAAV病毒粒子，其中所述启动子是包括巨细胞病毒增强子和鸡b-肌动蛋白启动子的CB7启动子元件。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中所述表达盒包括编码同源定向修复(HDR)模板的多核苷酸序列，所述HDR模板被配置成插入到切割位点中。

26.一种适用于治疗犬或猫的代谢疾病的药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1至25中任一项所述的rAAV病毒粒子。

27.根据权利要求1至25中任一项所述的rAAV病毒粒子或根据权利要求26所述的药物组合物，其在用于治疗患有代谢疾病，任选地糖尿病的犬或猫受试者的方法中使用。

28.一种根据权利要求1至25中任一项所述的rAAV病毒粒子或根据权利要求26所述的药物组合物的用途，其用于制备用于治疗患有代谢疾病，任选地糖尿病的犬或猫受试者的药物。

29.根据权利要求1至26中任一项所述的rAAV病毒粒子，其中病毒粒子组合物被调配成以1x 10⁹GC/kg至3x 10¹³GC/kg的rAAV的剂量向所述犬或猫受试者施用，和/或其中所述rAAV是肌内递送的。

30.一种治疗患有代谢疾病的犬或猫受试者的方法，所述方法包括向所述犬或猫受试者施用有效量的根据权利要求1至25中任一项所述的rAAV病毒粒子或根据权利要求26所述的药物组合物。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述代谢疾病是糖尿病。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。

34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述有效量是肌内施用的。

35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述有效量为1x 10⁹GC/kg至3x10¹³GC/kg的所述rAAV病毒粒子。

36.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述有效量为1x 10¹⁰GC/kg至3x10¹³GC/kg的所述rAAV病毒粒子。

37.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述融合蛋白在所述受试者体内表达至少一周、至少两周、至少四周、至少6周、至少8周、至少10周、至少12周、至少16周、至少20周、至少30周、至少40周、至少50周或至少60周。

38.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述融合蛋白在所述受试者体内以治疗有效浓度表达至少三个月、至少六个月或至少十二个月。

39.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述方法将所述受试者的空腹血糖降低约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。