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CN119569882A - 抗cd16a纳米抗体、含其的双特异性抗体及其应用 - Google Patents

抗cd16a纳米抗体、含其的双特异性抗体及其应用 Download PDF

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CN119569882A
CN119569882A CN202411733545.3A CN202411733545A CN119569882A CN 119569882 A CN119569882 A CN 119569882A CN 202411733545 A CN202411733545 A CN 202411733545A CN 119569882 A CN119569882 A CN 119569882A
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CN
China
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seq
amino acid
acid sequence
variable region
cancer
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CN202411733545.3A
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蔺利娟
王晋
郭翠翠
桂勋
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Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
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Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种抗CD16A纳米抗体、含其的双特异性抗体及其应用，所述纳米抗体至少包含一条VHH链，所述VHH链包含CDR1、CDR2、CDR3。本发明所开发的抗CD16A纳米抗体，具有较小的分子量、良好热稳定性等优点，适用于双特异性抗体的开发。本发明的纳米抗体、含其的双特异性抗体，在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。

Description

抗CD16A纳米抗体、含其的双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体药物领域，具体涉及一种抗CD16A纳米抗体、含其的双特异性抗体及应用。
背景技术
人的IgG Fc受体有三大类：FcγRI（CD64），FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16），CD16(FcγRIII)是一种低亲和力的Fc受体，与IgG抗体的Fc部分结合。研究发现CD16由两种不同的高度同源基因以细胞类型特异性方式编码，即FcγRIIIa（CD16a）和FcγRIIIb（CD16b），同源性高达94%，其中CD16A有F176和V176两个突变体，CD16A具有跨膜结构域和细胞质尾，表达于NK细胞、单核细胞和巨噬细胞表面，也少量表达于DC细胞表面，属于激活型受体，主要功能是介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，是与激活具有杀伤功能的先天免疫细胞（如NK细胞）最相关的受体。而CD16b则是糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的受体，在粒细胞上表达，并不触发肿瘤细胞的杀伤。
CD16分子就是NK细胞启动ADCC效应过程中不可或缺的条件，特别是单域抗体VHH片段因其具有较小的分子量、良好热稳定性等优点，更适合双特异性抗体的开发，因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了抗CD16A纳米抗体、含其的双特异性抗体及其应用。
具体而言，本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种抗CD16A纳米抗体，所述纳米抗体至少包含一条VHH链，所述VHH链包含CDR1、CDR2、CDR3，
其中，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 3所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；
或，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO: 11所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
在一些实施方案中，所述VHH链包含FR1、FR2、FR3和FR4，
所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；
或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示；
或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
在一些具体的实施方案中，所述VHH链包含如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9或SEQID NO: 17任一所示的氨基酸序列或其变体；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，且具有靶向靶向CD16A的功能。
本发明还提供了一种分离的核酸，所述核酸编码所述的抗CD16A纳米抗体。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述的核酸。
在一些实施方案中，所述重组表达载体选自：病毒载体和非病毒载体。
在一些实施方案中，所述非病毒载体选自：质粒、线性DNA片段和RNA。
在一些具体的实施方案中，所述重组表达载体为质粒，所述质粒的骨架例如为pcDNA3.4。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述的核酸或所述的重组表达载体。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；
在一些实施方案中，所述真核细胞为酵母细胞或哺乳动物细胞。
在一些具体的实施方案中，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。
本发明还提供了一种制备抗CD16A纳米抗体的方法，所述方法包含以下步骤：
在适宜所述的宿主细胞生长和发酵的条件下培养所述宿主细胞，从培养物中获得抗CD16A纳米抗体。
本发明还提供了一种融合蛋白，其特征在于，其包括所述的抗CD16A纳米抗体，以及：
源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区的Fc。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包括与所述融合蛋白可操作地连接的具有另一种抗原结合特性的抗原结合分子。
在一些具体的实施方案中，所述抗原结合分子连接在所述Fc的C端。
在一些实施方案中，所述连接通过linker实现。
在一些具体的实施方案中，所述linker为（G4S）n。
在一些具体的实施方案中，所述linker为（G4S）n，其中，n为1-3。
在一些具体的实施方案中，所述linker为（G4S）n，其中，n为3。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 43所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO: 45所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO: 47所示的HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 35所示的LCDR1，氨基酸序列为YA的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO: 39所示的LCDR3；
或，所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 50所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO: 52所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO: 54所示的HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 57所示的LCDR1，氨基酸序列为DA的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO: 60所示的LCDR3。
在一些具体的实施方案中，所述抗原结合分子选自以下：
（1）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 33所示的氨基酸序列；
（2）所述重链可变区包含与如SEQ ID NO: 41具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO: 33具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；
（3）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 55所示的氨基酸序列；
（4）所述重链可变区包含与如SEQ ID NO: 48具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO: 55具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO: 25-26或SEQ ID NO:28-29任一所示的氨基酸序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，且具有靶向靶向CD16A和“FAP或ROR1”的功能。
在上述一些实施方案，所列CDR的氨基酸序列按照IMGT定义规则确定的。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia (Chothia等人. (1989) Nature 342: 877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures ofimmunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) ，基于抗体序列可变性的Kabat (Kabat等人, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 第4版, U.S. Department of Health and Human Services, NationalInstitutes of Health (1987)), AbM (University of Bath), Contact (UniversityCollege London)，国际ImMunoGeneTics database (IMGT) (万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的NorthCDR定义。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区（例如可变区）的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区，或其他任何定义规则基于本发明的抗体界定出的互补决定区。
本发明还提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含（a）抗原结合结构域，其包括所述的抗CD16A纳米抗体或所述的融合蛋白。
在一些具体的实施方案中，所述嵌合抗原受体还包括：（b）铰链结构域；（c）跨膜结构域；（d）共刺激胞内结构域；（e）信号传导结构域和（f）信号肽中的一种或多种。
本发明还提供了一种基因修饰的细胞，所述基因修饰的细胞包括所述的嵌合抗原受体。
在一些具体的实施方案中，所述基因修饰的细胞的宿主为T细胞或NK细胞。
本发明还提供了一种抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物包含细胞毒性剂或标签，以及所述的抗CD16A纳米抗体或所述的融合蛋白。
本发明还提供了一种药物组合物或含其的药盒，所述药物组合物或含其的药盒包含所述的抗CD16A纳米抗体、所述的融合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞或所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的至少一种。
在一些具体的实施方案中，所述药物组合物或含其的药盒还含有由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的组中的一种或多种。
本发明还提供了所述的抗CD16A纳米抗体、所述的融合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞或所述的抗体药物偶联物或所述的药物组合物或含其的药盒在制备预防和/或治疗CD16A介导的相关疾病的药物中的应用。
在一些实施方案中，所述CD16A介导的相关疾病包括肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，所述肿瘤包括实体瘤和血液性肿瘤。
在一些具体的实施方案中，所述肿瘤选自血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎中的一种或多种。
本发明还提供了一种预防和/或治疗CD16A介导的相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的所述的抗CD16A纳米抗体、所述的融合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞或所述的抗体药物偶联物或所述的药物组合物或含其的药盒。
在一些实施方案中，所述CD16A介导的相关疾病包括肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，所述肿瘤包括实体瘤和血液性肿瘤。
在一些具体的实施方案中，所述肿瘤选自血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎中的一种或多种。
本发明还提供了所述的抗CD16A纳米抗体、所述的融合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的基因修饰的细胞或所述的抗体药物偶联物或所述的药物组合物或含其的药盒，用于预防和/或治疗CD16A介导的相关疾病。
在一些实施方案中，所述CD16A介导的相关疾病包括肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，所述肿瘤包括实体瘤和血液性肿瘤。
在一些具体的实施方案中，所述肿瘤选自血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的一种或多种。
在一些具体的实施方案中，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎中的一种或多种。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供了一系列新的具有特异性结合且亲和力高的抗CD16A纳米抗体，具有较小的分子量、良好热稳定性等优点，适用于双特异性抗体的开发，在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
附图说明
图1显示了ELISA检测CD16A单域抗体Fc融合蛋白对人CD16A（F176）的结合曲线。
图2显示了ELISA检测CD16A单域抗体Fc融合蛋白对人CD16A（V176）的结合曲线。
图3显示了ELISA检测CD16A单域抗体Fc融合蛋白对人CD16B的结合曲线。
图4显示了FACS检测CD16A单域抗体Fc融合蛋白对HEK293-huCD16A(F176)的结合曲线。
图5显示了FACS检测CD16A单域抗体Fc融合蛋白对HEK293-huCD16B的结合曲线。
图6显示了ELISA检测CD16A和FAP双特异性抗体对人CD16A（F176）的结合曲线。
图7显示了ELISA检测CD16A和ROR1双特异性抗体对人CD16A（F176）的结合曲线。
图8显示了ELISA检测CD16A和FAP双特异性抗体对人CD16A（V176）的结合曲线。
图9显示了ELISA检测CD16A和ROR1双特异性抗体对人CD16A（V176）的结合曲线。
图10显示了ELISA检测CD16A和FAP双特异性抗体对人CD16B的结合曲线。
图11显示了ELISA检测CD16A和ROR1双特异性抗体对人CD16B的结合曲线。
图12显示了ELISA检测CD16A和FAP双特异性抗体对人FAP的结合曲线。
图13显示了ELISA检测CD16A和ROR1双特异性抗体对人ROR1的结合曲线。
图14显示了FACS检测CD16A和FAP双特异性抗体对HEK293-huCD16A(F176)的结合曲线。
图15显示了FACS检测CD16A和ROR1双特异性抗体对HEK293-huCD16A(F176)的结合曲线。
图16显示了FACS检测CD16A和FAP双特异性抗体对HEK293-huCD16A(V176)的结合曲线。
图17显示了FACS检测CD16A和ROR1双特异性抗体对HEK293-huCD16A(V176)的结合曲线。
图18显示了FACS检测CD16A和FAP双特异性抗体对HEK293-huCD16B的结合曲线。
图19显示了FACS检测CD16A和ROR1双特异性抗体对HEK293-huCD16B的结合曲线。
图20显示了FACS检测CD16A和FAP双特异性抗体对CHO-K1-FAP的结合曲线。
图21显示了FACS检测CD16A和ROR1双特异性抗体对CHO-K1-ROR1的结合曲线。
具体实施方式
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“可变区”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的域。VH和VL各包含四个保守的框架区（FR）和三个互补决定区（CDR）。其中，术语“互补决定区”或“CDR”指可变结构域内主要促成与抗原结合的区域；“框架”或“FR”是指除CDR残基之外的可变结构域残基。VH包含3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3；VL包含3个CDR区：LCDR1、LCDR2和LCDR3。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本发明中，所述的scFv（single chain antibody fragment，单链抗体）VH结构域和VL结构域通过连接子（也称接头）连接形成的多肽链。其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988) 和Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)]。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G4S氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(G4S)4或(G4S)3接头，但也可使用其变体。
术语“表位”指能够与抗体特异性结合的抗原上的区域（area或region）。表位可以由连续氨基酸串（线性表位）形成或包含非连续氨基酸（构象表位），例如因抗原的折叠（即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠）而变成空间接近。构象表位和线性表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，抗体对构象表位的结合丧失。表位包含处于独特空间构象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10个氨基酸。筛选结合特定表位的抗体（即那些结合相同表位的）可以使用本领域例行方法来进行，例如但不限于丙氨酸扫描、肽印迹（见Meth. Mol.Biol. 248（2004）443-463）。
术语“特异性结合”是指抗体以比针对其他抗原或表位更高的亲和力结合至某个抗原或该抗原内的表位。通常，抗体以约1×10-7M或更小（例如约1×10-8M或更小、约1×10- 9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小，或者约1×10-12M或更小）的平衡解离常数（KD）结合抗原或抗原内的表位。在一些实施方式中，抗体与抗原结合的KD为该抗体结合至非特异性抗原（例如BSA、酪蛋白）的KD的10%，或1%。可使用标准程序来测量KD，例如通过BIACORE®表面等离子体共振测定法所测量的。然而，特异性结合至抗原或抗原内的表位的抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种（同源）（诸如人或猴，例如食蟹猕猴（Macaca fascicularis）（cynomolgus，cyno）、黑猩猩（Pan troglodytes）（chimpanzee，chimp））或狨猴（Callithrix jacchus）（commonmarmoset，marmoset）的相同抗原具有交叉反应性。
术语“亲和力”是指分子（例如，抗体）的单个结合部位与其结合配体（例如，抗原）之间非共价相互作用的总体的强度。除非另外指明，如本文所用，“亲和力”是指内部结合亲和力，其反映出结合对（例如，抗体与抗原）的成员之间1:1相互作用。分子X对其配体Y的亲和力通常可以由解离常数（KD）表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法（包括本文所述的那些）测量。术语“kassoc”或“ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所使用的术语“kdis”或“kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所使用的，术语“KD”指解离常数，其获得自kd与ka的比率（即kd/ka）并且表示为摩尔浓度（M）。可以使用本领域良好建立的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的方法包括使用生物传感系统例如系统测量表面等离子体共振，或通过溶液平衡滴定法（SET）测量溶液中的亲和力。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
术语“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。然而，也包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，其起到等同的功能。
术语“核酸分子”或“核酸”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。
术语“宿主细胞”在其中载体可以增殖并且其DNA可以表达的细胞，所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变，这类后代被包括在内。
术语“纯化”以及其语法上的变化用于表示完全或部分地去除包含蛋白质和一种或多种杂质的混合物中的至少一种杂质，降低该组合物中杂质的含量，从而提高组合物中蛋白质的纯化水平。
术语“抗人CD16A纳米抗体”、“特异结合人CD16A的抗体”是指能够以足够的亲和力结合人CD16A的抗体，使得该抗体可用作靶向人CD16A的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施例中，与人CD16A结合的抗体具有以下解离常数（KD）<约1 µM、<约100 nM、<约10 nM、<约1 nM、<约0.1 nM、<约0.01 nM或<约0.001 nM（例如10-8 M或更小、例如10-8 M至10-12 M、例如10-9M至10-10 M）。在某些实施例中，抗人CD16A纳米抗体结合来自不同物种的CD16A中保守的抗原表位。
本发明的抗体包括单克隆抗体（缩写mAb或Ab），指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1 针对CD16A的重链单域抗体的筛选
1.1酵母免疫库的构建
选取两只羊驼（alpaca）用CD16A蛋白（Acro cat: CD8-H52H4）进行免疫，分别采集四免、五免和六免之后的外周血50mL，按照淋巴细胞分离液使用说明分离 PBMC。使用RNA提取试剂盒（MN cat:740984）提取总RNA, 使用诺唯赞的试剂盒（cat:C112-02-AA）将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增纳米抗体，具体过程如下：第一轮PCR，以cDNA为模板，获得约700bp片段。
上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAAG（SEQ ID NO: 61）
下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTC（SEQ ID NO: 62）
第二轮PCR，以第一轮PCR产物为模板，获得约400bp的VHH片段。
上游引物：TCGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGG（SEQ ID NO: 63）
下游引物：ATAAGAATGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCC（SEQ ID NO: 64）
将回收的得重链单域抗体核酸片段和线性化的pYD2载体片段，通过电转进入酵母细胞EBY100中，复苏后进行梯度稀释铺板，计算库容的大小为4.45x108。
1.2 重链单域抗体的筛选
由于CD16A和CD16B同源性高达94%，为了得到特异性结合CD16A(F176)和(V176)的纳米抗体，我们进行了多次分选，第一轮进行磁珠和CD16B负分选，分别用300nM biotin-CD16B(Acro cat: CDB-H82Ea)和磁珠（Invitrogen Cat:11206D）进行孵育1小时，进行磁珠分选以去除结合CD16B的酵母细胞；第二轮进行正向分选，收集特异性结合CD16A的酵母细胞群：用300nM biotin-CD16A(F176) (Acro cat: CDA-H82E8)和300nM biotin-CD16A(V176) (Acro cat: CDA-H82E9)两个蛋白分别与SA-APC和SA-PE进行孵育后，按比例混合在一起，加入酵母库中孵育1小时，用Moflo XDP超速流式分选仪进行分选并收集双阳酵母细胞群；第三轮用300nM biotin-CD16B进行负分选，流式细胞仪分选收集与CD16B不结合的酵母细胞群；第四轮用100nM biotin-CD16A(V176)和300nM biotin-CD16B两个蛋白分别与SA-APC和SA-PE孵育1h，按比例混合在一起加入酵母库中再孵育1小时，然后流式分选收集CD16A阳性的酵母细胞群并进行涂板，单克隆培养送测序及流式鉴定，经过序列比对，最终共获得4条特异性结合人CD16A的纳米抗体。
实施例2. CD16A单域抗体FC融合蛋白的制备
将CD16A单域抗体分子的序列和公开发表的人单克隆抗体IgG1亚类的重链恒定区序列拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体中；使用聚乙烯亚胺（PEI）转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用protein A磁珠（金斯瑞 Cat: L00695）纯化得到抗人CD16A的重链单域抗体FC融合蛋白。
实施例3. 制备AFFIMED公司的CD16A抗体
从专利WO2016177846A1中获取AFFIMED公司的CD16A的抗体序列，用公开发表的人单克隆抗体IgG1亚类的重链或轻链恒定区序列，可变区和恒定区序列连接后构建到哺乳动物表达载体中制备质粒，进行HEK293细胞的瞬时转染表达，得到的AFFIMED公司抗CD16A抗体重新命名为Ref-Ab。
实施例4. ELISA检测单域抗体FC融合蛋白和人CD16A和CD16B的结合活性
将人CD16A(F176)(Acro cat: CDA-H82E8)、人CD16A(V176) (Acro cat: CDA-H82E9)、和人CD16B(Acro cat: CDB-H82Ea)三个蛋白分别用PBS缓冲液稀释至1ug/mL，每孔100µl包被于96孔板，4℃孵育过夜，次日PBST洗三遍，用PBST+1%BSA封闭，250ul/孔，37℃，1hr；将上述筛选到的CD16A单域抗体Fc融合蛋白进行稀释，起始浓度12.5nM，4倍梯度稀释，100ul/孔，37℃，1hr；加入1∶20000稀释的HRP-羊抗人IgG(Fcγ)，37℃，1hr；再经PBST洗板后加入TMB显色液，避光显色10-15min，加入2M HCL终止反应；通过MD酶标仪检测450nm吸光度。通过吸光值采用prism软件计算EC50。结果显示，4个CD16A单域抗体Fc融合蛋白与人CD16A (F176)和(V176)均具有较高的亲和力（图1，图2），其中NB465-20、14和10与人CD16B没有结合信号（图3），与Ref-Ab相比，NB465-20、14和10均与人CD16A具有特异性结合活性，并且与人CD16A亲和力显著高于对照分子Ref-Ab。
实施例5. 单域抗体FC融合蛋白的体外动力学结合实验
利用Fortebio(BLITZ pro1 .1 .0 .28)仪器，采用抗人抗体捕获法测定抗体亲和力。测定时将抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针浸泡于KB buffer 10min；将抗体样品稀释为200nM，200μl/孔，上样到AHC生物探针上，然后在KB buffer中平衡100s，进一步将AHC探针与四个CD16蛋白进行结合反应，分别是不同浓度的人CD16A(F176)、人CD16A(V176)、人CD16B和cyno CD16A，结合时间180s，之后将AHC探针转移至KB buffer中，进行解离反应，时间为360s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1:1 Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，结果见表1~4，NB465-20、14、10与人CD16A(F176)、人CD16A(V176)、cyno CD16A均具有特异性结合活性，与Ref-Ab相比，NB465-20分子的响应值更高；3个分子和Ref-Ab与CD16B均无结合信号，为后续实验提供依据。
表1：显示了CD16A单域抗体FC融合蛋白对人CD16A(F176)胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果
表2：显示了CD16A单域抗体FC融合蛋白对人CD16A(V176)胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果
表3：显示了CD16A单域抗体FC融合蛋白对猴CD16A胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果
表4：显示了CD16A单域抗体FC融合蛋白对人CD16B胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果
实施例6. 单域抗体FC融合蛋白的体外细胞结合实验
将人CD16A(F176)（序列号：P08637）和CD16B（序列号：O75015）的基因分别构建到哺乳动物表达载体中并制备质粒，通过PEI将质粒瞬转HEK293细胞进行表达，2天后收集细胞，100g室温离心5分钟，用含0.5%BSA的PBS洗涤细胞一次，100g室温离心5分钟，重悬细胞密度为每毫升2x106 个细胞，铺板50ul/孔，同时用空白的HEK293细胞作空白对照，然后将单域抗体FC融合蛋白从33nM的起始浓度开始3倍梯度依次稀释，共11个浓度点，各个浓度点的抗体各取50ul加入96孔板中。室温孵育1小时后，洗涤2次，加入1:2000稀释的APC荧光标记的羊抗人IgG二抗（Jackson Cat: 109-135-098）；继续于室温孵育1小时后，洗涤2次，用流式细胞仪分析细胞群的平均荧光读值，采用prism软件进行4参数拟合曲线。实验结果表明NB465-20、NB465-14、NB465-10和Ref-Ab均与细胞表面表达的人CD16A具有特异性结合活性(图4显示了NB465-14的结果)，与HEK293空白细胞均无非特异性结合信号，与Ref-Ab相比，NB465-14分子与细胞表面表达的人CD16B的结合信号弱于对照分子(图5)。
实施例7. 单域抗体的制备
制备单域抗体，在CD16A单域抗体的C端添加组氨酸标签，便于纯化抗体，同时生产无关对照NC-VHH-His，对照抗体Ref-Ab的重链可变区和轻链可变区由柔性肽连接为Scfv形式，然后构建到哺乳动物细胞表达载体中，使用聚乙烯亚胺（PEI）转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，利用镍柱纯化得到单域抗体VHH-His和对照抗体Ref-Ab-scfv-His。
实施例8. 单域抗体的体外动力学结合实验
利用Fortebio(BLITZ pro1 .1 .0 .28)仪器测定单域抗体的亲和力。测定时将抗SA sensor浸泡于KB buffer 10min；用KB buffer将四个生物素标记的蛋白CD16A(F176)、人CD16A(V176)、人CD16B和cyno CD16A分别稀释至300nM，上样到SA sensor生物探针上，然后在KB buffer中平衡100s，进一步将SA sensor与100nM的单域抗体进行结合反应，结合时间180s，之后将SA sensor探针转移至KB buffer中，进行解离反应，时间为360s。实验完毕，用Fortebio的Data analysis 10.0处理数据，结果见表5~8，NB465-20、14和10以及Ref-Ab均与人CD16A(F176)和人CD16A(V176)均有结合活性，NB465-20和Ref-Ab与cynoCD16A有结合活性，但是NB465-14和10与cynoCD16A没有结合信号，NB465-20、14和10与CD16B均无结合信号，但是Ref-Ab与CD16B有明显的结合信号，说明NB465-20、14和10分子比对照分子能更好的与CD16A特异性结合。
表5：显示了CD16A单域抗体对人CD16A(F176)胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果
表6：显示了CD16A单域抗体对人CD16A(V176)胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果
表7：显示了CD16A单域抗体对猴CD16A胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果
表8：显示了CD16A单域抗体对人CD16B胞外区结构域重组蛋白的亲和力分析结果
实施例9. 双特异性抗体的制备
选取抗CD16A的两个纳米抗体分子NB465-20和NB465-14分别与抗FAP的D27hz10（提案号：D2300027）和抗ROR1的N27hz20分子（提案号：D2300033）进行融合表达，分子形式为：VHH-hFC-3*G4S-Scfv，具体操作为：利用柔性多肽（GGGGS）3将抗CD16A的纳米抗体NB465-20-FC和NB465-14-FC分别与抗FAP的D27hz10和抗ROR1的N27hz20的Scfv连接，同时设置单抗对照，将所有抗体序列构建到哺乳动物细胞表达载体中；使用聚乙烯亚胺（PEI）转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用protein A磁珠（金斯瑞 Cat: L00695）纯化得抗体蛋白。
实施例10. ELISA检测双特异性抗体的结合活性
将人CD16A(F176)(Acro cat: CDA-H82E8)、人CD16A(V176) (Acro cat: CDA-H82E9)、人CD16B(Acro cat: CDB-H82Ea)、人FAP(Acro cat: FAP-H5244)和人ROR1(Acrocat:RO1-H522y)五个蛋白分别用PBS缓冲液稀释至1ug/mL，每孔100µl包被于96孔板，4℃孵育过夜，次日PBST洗三遍，用PBST+1%BSA封闭，250ul/孔，37℃，1hr；将制备的双特异性抗体进行稀释，起始浓度50nM，4倍梯度稀释，同时设置阴性对照SH-hIgG(LALA)，100ul/孔，37℃，1hr；加入1∶20000稀释的HRP-羊抗人IgG(Fcγ)，37℃，1hr；再经PBST洗板后加入TMB显色液，避光显色10-15min，加入2M HCL终止反应；通过MD酶标仪检测450nm吸光度。通过吸光值采用prism软件计算EC50（见图6-图13）。
结果显示（见图6-图13），抗CD16A和FAP的双抗分子与huCD16A的结合活性与单抗相当，但是对照抗体的双抗分子与huCD16A的结合活性明显低于单抗分子约10倍；仅NB465-14-Fc-D27hz10-Scfv双抗分子在高浓度时与huCD16B的有微弱的结合信号，其余分子均无结合信号，双抗分子与huFAP的结合信号低于单抗分子，且CD16A的单抗分子与FAP的抗原均无非特异性结合。
结果显示，抗CD16A和ROR1的双抗分子与huCD16A的结合活性比单抗略好，但是对照抗体的双抗分子与huCD16A的结合活性明显低于单抗分子；双抗分子与huCD16B均无结合信号；双抗分子与huROR1的结合信号略低于单抗分子； CD16A的单抗分子与ROR1的抗原均无非特异性结合。
实施例11. FACS检测双特异性抗体的结合活性
将人CD16A(F176)（序列号：P08637）、人CD16A(V176)（序列号：P08637）和CD16B（序列号：O75015）的基因分别构建到哺乳动物表达载体中并制备质粒，通过PEI将质粒瞬转HEK293细胞进行表达，2天后收集细胞，同时准备细胞表面高表达的人FAP和高表达的人ROR1的CH0 K1稳转细胞株，100g室温离心5分钟，用含0.5%BSA的PBS洗涤细胞一次，重悬细胞密度为每毫升2x106 个细胞，铺板50ul/孔，同时设置阴性对照SH-hIgG(LALA)，然后将双特异性抗体从100nM起始浓度开始3倍梯度依次稀释，共11个浓度点，各个浓度点的抗体各取50ul加入96孔板中。室温孵育1小时后，洗涤2次，加入1:2000稀释的APC荧光标记的羊抗人IgG二抗（Jackson Cat: 109-135-098）；继续于室温孵育1小时后，洗涤2次，用流式细胞仪分析细胞群的平均荧光读值，采用prism软件进行4参数拟合曲线。
实验结果(图14-图21)表明CD16A和FAP以及CD16和ROR1的双抗分子均与细胞表面表达的人CD16A具有特异性结合活性，其中NB465-20的双抗分子与人CD16A的结合活性高于对照分子和单抗分子，6个双抗分子与细胞表面表达的人CD16B在高浓度下有微弱的结合信号。
实施例12. 双特异性抗体的体外动力学结合实验
利用Fortebio(BLITZ pro1 .1 .0 .28)仪器，采用抗人抗体捕获法测定抗体亲和力。测定时将抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针浸泡于KB buffer 10min；将抗体样品稀释为200nM，200μl/孔，上样到AHC生物探针上，然后在KB buffer中平衡100s，进一步将AHC探针与5个抗原进行结合反应，分别是不同浓度的人CD16A(F176)、人CD16A(V176)、人CD16B、人FAP和人ROR1，结合时间180s，之后将AHC探针转移至KB buffer中，进行解离反应，时间为360s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1:1 Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，
结果见表9和表10，抗CD16A和FAP的双抗分子与人CD16A均具有特异性结合活性，且亲和力优于对照分子，所有分子均不结合人CD16B，双抗分子与人FAP均具有高结合活性高；抗CD16A和ROR的双抗分子与人CD16A具有特异性结合活性，且亲和力优于对照分子，而且不结合人CD16B，双抗分子与人ROR1具有高结合活性高。
表9：显示了CD16A和FAP的双特异性抗体的亲和力分析结果
表10：显示了CD16A和ROR1的双特异性抗体的亲和力分析结果
序列表（其中CDR定义是按照IMGT划分）
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (15)

1.一种抗CD16A纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体至少包含一条VHH链，所述VHH链包含CDR1、CDR2、CDR3，
其中，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；
或，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
2.如权利要求1所述的抗CD16A纳米抗体，其特征在于，所述VHH链包含FR1、FR2、FR3和FR4，
所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；
或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示；
或，所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
3.如权利要求1或2所述的抗CD16A纳米抗体，其特征在于，所述VHH链包含如SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 17任一所示的氨基酸序列或其变体；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80%的序列同一性，且具有靶向靶向CD16A的功能。
4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1-3任一项所述的抗CD16A纳米抗体。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求4所述的核酸；
优选地，所述重组表达载体选自：病毒载体和非病毒载体；
更优选地，所述非病毒载体选自：质粒、线性DNA片段和RNA；
所述重组表达载体例如为质粒，所述质粒的骨架例如为pcDNA3.4。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4的核酸或权利要求5所述的重组表达载体；
优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；
更优选地，所述真核细胞为酵母细胞或哺乳动物细胞；其中，所述哺乳动物细胞例如为HEK293细胞。
7.一种制备抗CD16A纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
在适宜如权利要求6所述的宿主细胞生长和发酵的条件下培养所述宿主细胞，从培养物中获得抗CD16A纳米抗体。
8.一种融合蛋白，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的抗CD16A纳米抗体，以及：
源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区的Fc；
较佳地，还包括与所述融合蛋白可操作地连接的具有另一种抗原结合特性的抗原结合分子；所述抗原结合分子优选连接在所述Fc的C端。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接通过linker实现，较佳地，所述linker为（G4S）n，其中，n优选为1-3，更优选为3。
10.如权利要求8或9所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗原结合分子包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区包含：氨基酸序列如SEQ ID NO: 43所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQID NO: 45所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO: 47所示的HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 35所示的LCDR1，氨基酸序列为YA的LCDR2和氨基酸序列如SEQID NO: 39所示的LCDR3；
或，所述重链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 50所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQID NO: 52所示的HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO: 54所示的HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 57所示的LCDR1，氨基酸序列为DA的LCDR2和氨基酸序列如SEQID NO: 60所示的LCDR3；
较佳地，
所述抗原结合分子选自以下：
（1）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 33所示的氨基酸序列；
（2）所述重链可变区包含与如SEQ ID NO: 41具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO: 33具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；
（3）所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 55所示的氨基酸序列；
（4）所述重链可变区包含与如SEQ ID NO: 48具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO: 55具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；
更佳地，
所述融合蛋白包含如SEQ ID NO: 25-26或SEQ ID NO: 28-29任一所示的氨基酸序列或其变体；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少80%的序列同一性，且具有靶向靶向CD16A和“FAP或ROR1”的功能。
11.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含（a）抗原结合结构域，其包括如权利要求1-3任一项所述的抗CD16A纳米抗体或如权利要求8或9所述的融合蛋白；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括：（b）铰链结构域；（c）跨膜结构域；（d）共刺激胞内结构域；（e）信号传导结构域和（f）信号肽中的一种或多种。
12.一种基因修饰的细胞，其特征在于，其包括如权利要求11所述的嵌合抗原受体；优选地，所述基因修饰的细胞的宿主为T细胞或NK细胞。
13.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物包含细胞毒性剂或标签，以及如权利要求1-3任一项所述的抗CD16A纳米抗体或如权利要求8-10任一项所述的融合蛋白。
14.一种药物组合物或含其的药盒，其特征在于，所述药物组合物或含其的药盒包含权利要求1-3任一项所述的抗CD16A纳米抗体、权利要求8-10任一项所述的融合蛋白、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的基因修饰的细胞或权利要求13所述的抗体药物偶联物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的至少一种；
优选地，所述药物组合物或含其的药盒还含有由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的组中的一种或多种。
15.权利要求1-3任一项所述的抗CD16A纳米抗体、权利要求8-10任一项所述的融合蛋白、权利要求11所述的嵌合抗原受体、权利要求12所述的基因修饰的细胞或权利要求13所述的抗体药物偶联物或权利要求14所述的药物组合物或含其的药盒在制备预防和/或治疗CD16A介导的相关疾病的药物中的应用；
较佳地，所述CD16A介导的相关疾病包括肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病；
更佳地，所述肿瘤包括实体瘤和血液性肿瘤，所述肿瘤优选自血管瘤、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的一种或多种；和/或
所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症和急性特发性多神经炎中的一种或多种。
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