CN119563108A - 用于减轻癌症相关恶病质的hnf4a的重表达 - Google Patents

Abstract

提供预测患有癌症的对象的临床结果的方法、检测对象的非肝脏癌症的方法以及治疗或预防癌症或癌症相关恶病质的方法。还提供包封编码HNF4A的mRNA的合成脂质纳米颗粒和包含其的组合物。

Description

用于减轻癌症相关恶病质的HNF4A的重表达

电子序列表的引用

电子序列表(YEDA-TECH-P-025-PCT.xml；大小：55,530个字节；和创建日期：2023年4月30日)的内容通过引用以其整体并入本文。

相关申请的交叉引用

本申请要求2022年5月1日提交的美国临时专利申请号63/337,113和2023年1月24日提交的美国临时专利申请号63/440,723的优先权，这两件申请的标题均为“用于减轻癌症相关恶病质的HNF4A的重表达(REEXPRESSION OF HNF4A TO ALLEVIATE CANCER-ASSOCIATED CACHEXIA)”，其内容通过引用以其整体全都并入本文。

技术领域

本发明属于癌症以及癌症相关恶病质治疗领域。

背景技术

肝脏直接通过信使分子或间接通过免疫系统与我们身体的所有器官以及肿瘤进行联系。值得注意的是，肝脏也是一个含有多种驻留免疫细胞的免疫原性器官，这些细胞可通过产生急性期蛋白、补体组分、细胞因子和趋化因子对系统性或组织特异性免疫相关脆弱做出反应。尽管目的是防护性的，但近期工作表明，免疫系统也能够施加选择性压力，促进正常组织驻留细胞的癌变特征。因此，已确立的致癌作用标志如系统性炎症、肿瘤微环境和宿主都可能促进致癌作用。

癌症的无限制生长需要葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的永久供应。这些营养需求获自癌症介导的肿瘤及其微环境中代谢的重编程。弄清楚这些相互作用的结果就是将化学疗法与靶向肿瘤与微环境之间的代谢依赖的药物组合的协同疗法。除肿瘤微环境外，肿瘤还通过神经、血液和淋巴管网络与宿主相连，并将其作用从微环境扩展到肝脏等外部器官。因此，肿瘤会使组织特异性代谢失调并诱发全身代谢重新连线(metabolic rewiring)，从而可能导致癌症表现。

由于肝脏是维持身体稳态所必需的中枢代谢器官，因此其通过促进保持系统平衡的组织特异性适应来感知和响应系统营养水平波动。在细胞水平上，肝细胞在碳水化合物、蛋白质、氨基酸和脂质代谢中发挥重要作用。这些代谢反应中的一些主要是肝脏特异的，如完全尿素循环(UC)——通过将过量的氮转化为尿素，以氨的形式将其处理掉。已有报道称，携带4T1乳腺癌小鼠的肝脏和癌症患儿的血浆中的UC活性降低，这支持肝外肿瘤与肝脏之间的潜在代谢联系。

伴随癌症而来的主要代谢现象是癌症相关恶病质(CAC)。80％的癌症患者在疾病晚期出现CAC，表现为重量减轻、骨骼肌消耗和脂肪组织萎缩，估计是导致至少20％的癌症患者死亡的临床恶化的直接原因。具体地，CAC在胰腺癌中高度流行，影响超过70％的患者。CAC分为3个连续的临床分期：恶病质前期、恶病质和难治性恶病质。恶病质前期的定义是体重减轻不到5％，而恶病质患者体重减轻超过5％。难治性恶病质期按低WHO表现状态评分和少于3个月的生存期确定。目前，没有用于恶病质前期鉴定的特异性生物标志物，因此，大多数患者在诊断时处于恶病质期或处于不可治愈的难治性恶病质期。非常需要确定癌症时的代谢变化和恶病质发作的诊断方法，以及靶向这些代谢变化及防止恶病质进展的疗法。

发明内容

本发明提供预测患有癌症的对象的临床结果的方法、检测对象的非肝脏癌症的方法以及治疗或预防癌症或癌症相关恶病质的方法。还提供包封编码HNF4A的mRNA的合成脂质纳米颗粒和包含其的组合物。

根据第一方面，提供预测患有癌症的对象的临床结果的方法，其中癌症是非肝癌症，方法包括测量对象中尿素循环的功能，其中与健康对照中的尿素循环功能相比尿素循环功能降低指示与尿素循环功能未降低的对象相比更差的临床结果，从而预测对象的临床结果。

根据一些实施方式，非肝癌症选自乳腺癌和胰腺癌，不包括可检测到的肝转移或两项兼有。

根据一些实施方式，测量尿素循环的功能包括下列中的至少一项：

a.测量对象的肝脏中选自下列的至少一种尿素循环酶的表达：精氨琥珀酸合成酶1(ASS1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)、氨甲酰磷酸合成酶-1(CPS1)和鸟氨酸移位酶(ORNT1/SLC25A15)；

b.测量对象的血液或肝脏中尿素与谷氨酰胺之比或尿素与谷氨酸之比；

c.测量对象的血液或肝脏中的谷氨酸、天冬氨酸或富马酸水平；

d.测量对象的血液中的氨水平；

e.测量对象的尿液中的尿素水平；

f.测量对象的肝脏中肝细胞核因子4α(HNF4A)表达；

g.测量对象的血液中选自下列的至少一种肝脏酶的水平：天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALK-P/ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)；

h.测量来自对象的血液的凝血酶原时间国际标准化比值(internationalnormalized ratio,INR)；和

i.测量对象的血液或肝脏中的白蛋白。

根据一些实施方式，

a.至少一种尿素循环酶的表达减少；

b.尿素与谷氨酰胺之比或尿素与谷氨酸之比降低；

c.谷氨酸或天冬氨酸增加；

d.富马酸减少；

e.氨增加；

f.尿素减少；

g.HNF4A减少；

h.至少一种肝脏酶的水平升高；

i.INR降低；

j.白蛋白减少；或

k.其任意组合

指示对象中尿素循环功能降低。

根据一些实施方式，测量功能包括产生肝脏功能评分，并且其中超过预定阈值的肝脏功能评分指示尿素循环功能降低。

根据一些实施方式，肝脏功能评分是来自对象的血液样品中AST、ALT、ALP和白蛋白的归一化水平与INR的加权和。

根据一些实施方式，评分的标准化是从0到1，预定阈值是0.6，并且其中在预定阈值以上的评分指示尿素循环功能降低。

根据一些实施方式，临床结果是癌症相关恶病质的发展，并且其中尿素循环功能降低预测发展癌症相关恶病质的风险增加。

根据一些实施方式，临床结果是总生存期，并且其中超过预定阈值的肝脏功能评分指示总生存期缩短。

根据另一方面，提供检测有需要的对象的非肝癌症的方法，方法包括从对象接收血液样品并基于血液样品测量对象中尿素循环的功能，其中与健康对照中的尿素循环功能相比尿素循环功能降低指示对象患有非肝脏癌症，从而检测对象的非肝癌症。

根据一些实施方式，非肝癌症选自乳腺癌和胰腺癌，不包括可检测到的肝转移或两项兼有。

根据一些实施方式，测量尿素循环的功能包括下列中的至少一项：

a.测量血液样品中谷氨酰胺与谷氨酸之比；

b.测量血液样品中的谷氨酸、天冬氨酸或富马酸水平；

c.测量血液样品中的氨水平；

d.测量血液样品中的天冬氨酸转氨酶(AST)水平；和

e.测量血液样品中的白蛋白水平。

根据一些实施方式，

a.谷氨酰胺与谷氨酸之比降低；

b.谷氨酸或天冬氨酸增加；

c.富马酸减少；

d.氨增加；

e.AST水平升高；

f.白蛋白水平降低；或

g.其任意组合

指示对象中尿素循环功能降低。

根据一些实施方式，方法进一步包括向临床结果更差或被确定患有非肝癌症的对象施用选自下列的至少一种治疗剂：抗IL6阻断抗体、ERK抑制剂、STAT3抑制剂和能够增加对象的肝脏中HNF4A的表达的用剂。

根据另一方面，提供合成脂质纳米颗粒(LNP)，其包括包封于其中的编码HNF4A的mRNA，其中：

a.脂质纳米颗粒包括SM-102脂质、胆固醇、DOPE和DMG-PEG；

b.mRNA包括下列或由下列组成：SEQ ID NO:10或12的序列或包括与其至少85％同一性且编码HNF4A和聚A尾的序列；或

c.两项兼有。

根据一些实施方式，mRNA包括5’帽和聚A尾。

根据一些实施方式，编码HNF4A的mRNA包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的mRNA编码序列或具有与其至少85％同一性的编码HNF4A的序列。

根据一些实施方式，脂质纳米颗粒靶向肝脏细胞。

根据一些实施方式，脂质纳米颗粒包括约50mol％的SM-102、38.5mol％的胆固醇、10mol％的DOPE和1.5mol％的DMG-PEG200。

根据另一方面，提供药物组合物，其包括本发明的合成LNP和药学上可接受的载剂、赋形剂或佐剂。

根据另一方面，提供治疗有需要的对象的非肝癌症的方法，方法包括向对象施用能够增加对象的肝脏中HNF4A的表达的用剂，从而治疗对象的非肝癌症。

根据另一方面，提供治疗或预防有需要的对象的癌症相关恶病质的方法，方法包括向对象施用包括选自下列的至少一种用剂的组合物：抗IL6阻断抗体、ERK抑制剂、STAT3抑制剂和能够增加对象的肝脏中HNF4A的表达的用剂，从而治疗或预防对象的癌症相关恶病质。

根据一些实施方式，用剂包括编码HNF4A的核酸分子。

根据一些实施方式，核酸分子被包含在腺相关病毒(AAV)内。

根据一些实施方式，核酸分子是mRNA。

根据一些实施方式，mRNA包括5’帽和聚A尾。

根据一些实施方式，核酸分子包括下列或由下列组成：SEQ ID NO:10或12或包括与其至少85％同一性且编码HNF4A。

根据一些实施方式，用剂是本发明的合成LNP。

根据一些实施方式，对象患有早期癌症、癌前病变或处于发展癌症的风险中。

根据一些实施方式，通过本发明的方法确定对象患有非肝癌症。

根据一些实施方式，通过本发明的方法确定对象有发展癌症相关恶病质的增加的风险。

通过下文给出的详细描述，本发明的其它实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应理解的是，详细描述和具体示例虽然指示了本发明的优选实施方式，但仅以举例说明的方式给出，因为通过此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说都将变得显而易见。

附图说明

图1A-图1L：乳腺癌在早期致癌作用过程中诱发肝脏代谢变化。(1A)携带乳腺癌(BC)小鼠肝脏RT-PCR表明UC酶的RNA表达随癌症进展而降低(n＝5，学生T检验)。第4天，P＝0.003，第14天，P＝0.033、0.01、0.028(分别)，第21天，P＝0.0002、0.019、0.0002、0.013、0.007(分别)。(1B)左图-蛋白质印迹表明，与WT-PBS注射小鼠相比，携带BC小鼠的肝脏中ASS1和OTC的蛋白表达水平降低(n＝5，学生T检验)。右图-条带强度定量，ASS1，P＝0.002。OTC，P＝0.011。(1C)与WT小鼠肝脏相比，14周龄携带癌症小鼠MMTV-PyMT肝脏RT-PCR表明UC酶的RNA表达减少(WT n＝5，MMTV-PyMT n＝3)，P＝0.033、3.14E-05、0.038(分别)。(1D)向携带4T1 BC小鼠或PBS注射小鼠输注谷氨酰胺¹⁵N₂后血浆和肝脏中UC相关代谢物的测量。左图：携带4T1 BC小鼠的血浆中尿素与谷氨酰胺和谷氨酸m+1同位素体(isotopologues)之比降低(WT n＝5，4T1 n＝7，学生T检验)，P＝0.019、0.042(分别)。右图：携带4T1 BC小鼠中谷氨酸水平(AUC/内标/干重)升高，而在携带4T1 BC小鼠中输注后尿素与谷氨酸之比降低，这支持UC功能失常(n＝7，学生T检验)P＝0.016、0.048。(1E)与WT-PBS注射小鼠肝脏相比，携带BC小鼠肝脏(上图)和血浆(下图)中天冬氨酸、谷氨酸水平升高，富马酸水平降低。用气相色谱-质谱法(GC-MS)、氨基酸分析仪(AAA)和液相色谱-质谱法(LC-MS)(GC-MS，n＝5，AAAWT n＝5，4T1 n＝4，LCMS n＝5，学生T检验)测量UC中间体水平，肝脏P值：Asp＝0.027，Glu＝0.049，Fum＝0.045。血浆P值：Asp＝0.004，Glu＝0.0005。(1F)左图-使用氨测定试剂盒测量与WT-PBS注射小鼠相比携带BC小鼠血浆中的氨水平(WT n＝4，异常值–IQR法，4T1 n＝5，学生T检验)。右图-与WT-PBS注射小鼠相比携带BC小鼠尿液中的尿素水平。P＝0.033。(1G)左图：与输注¹⁵N₂谷氨酰胺后血浆和肝脏中的水平相比携带4T1 BC小鼠肿瘤中m+1标记的天冬氨酸水平降低(n＝8，血浆n＝7，双因素ANOVA)P值：血浆vs.肿瘤＝0.041，肝脏vs.肿瘤＝0.007。右图：携带4T1 BC小鼠肿瘤中m+1尿嘧啶与天冬氨酸m+1同位素体之比增加(n＝8，血浆n＝7，双因素ANOVA)P值：血浆vs.肿瘤＝0.042，肝脏vs.肿瘤＝0.008。(1H)对培养基补充UC中间体后对4T1癌细胞增殖的XTT测定(n＝3，双因素ANOVA)P值：24h：Asp–ns，Amn＝0.007，Glu和Fum<0.0001。所有测量48和72<0.0001。按下列浓度补充代谢物浓度：氨-按公开值为0.75mM[49]、天冬氨酸0.25mM、富马酸0.35mM、谷氨酰胺0.25mM.(1I)补充1mM氨后对CD8+脾细胞的细胞存活(左)和活化(右)的离体FACS分析[58](测量的血浆氨水平1.34mM)，(n＝5，学生T检验)P＝0.011、0.043(分别)。(1J)肝细胞中差异基因表达的热图显示4T1 BC小鼠肝脏中第21天时与第4天相比的独特模式。(1K)4T1 d21 vs.4T1 d4通路富集分析。每个条都显示出特定通路的倍数富集。(1L)左图-AST血浆测量表明与WT-PBS注射小鼠相比携带BC小鼠中的水平显著升高(n＝5，学生T检验)P＝0.011。右图-未发现ALT有显著变化。

图2A-图2I：先天免疫细胞在早期乳腺致癌作用过程中浸润宿主的肝脏。(2A)肝脏切片H&E染色表明注射BC细胞后免疫细胞随时间进程浸润增加。放大倍数-10X和40X，详见图中所示。(2B)将经单细胞RNA测序分析注释的细胞类型投射到3UMAP上，指示哪些细胞在哪个时间点出现。箭头标记的是WT小鼠肝脏中不存在并在肝脏中逐渐累积直至第21天的嗜中性粒细胞和单核细胞亚群。(2C-2E)肝脏和血液CD45+群体的CyTOF-tSNE分析(2C、2E)和(2D)定量显示与WT-PBS注射小鼠相比BC小鼠肝脏(2C)和血液(2E)中先天免疫细胞水平升高，淋巴细胞减少(WT n＝3，4T1＝5，学生T检验)。血液P值<0.0001。肝脏P值：B细胞＝0.013，T细胞＝0.0014，嗜中性粒细胞＝0.0001。(2F)多重(Multiplex)ELISA免疫测定表明，从癌细胞注射后第4天到第21天，携带BC小鼠中IL-6水平(左)和TNFα水平(右)升高(n＝5，学生T检验)。IL-6的P值：第4天＝0.024，第14天<0.0001，第21天＝0.0009。TNFα的P值：第4天＝0.05，第14天和第21天<0.0001(2G)携带BC小鼠血浆、肝脏、脾脏和肺中CCL2水平的ELISA测量(n＝5，学生T检验)P值：血浆＝0.0005，肝脏＝0.017，脾脏＝0.04。(2H)ELISA测定表明，相对于WT-PBS注射小鼠，癌细胞注射后的时间与BC小鼠肝脏中CCL2升高之间存在显著的相互作用效应(n＝5，双因素ANOVA)P＝0.0034。(2I)来自scRNAseq实验的CCR2在免疫细胞中的表达在UMAP上的投射表明CCR2主要表达于单核细胞亚群中。

图3A-图3I：活化的浸润肝脏的髓样细胞通过HNF4α耗竭扰动肝脏代谢。(3A)与第4天相比，第21天时携带BC小鼠的肝细胞的DE基因通路富集分析。条显示特定通路的Z评分。(3B)免疫荧光染色表明携带BC小鼠肝脏中CD45+细胞的pERK水平升高。(3C)CD45+细胞中pERK的平均荧光强度(MFI)表明与WT-PBS注射小鼠相比BC小鼠肝脏中pERK特异性增加(左图)，而血液中CD45+pERK的染色无显著差异(中图)(n＝4，学生T检验)。定量示于右图。P<0.0001。(3D)第4天和第21天时肝细胞上表达的3种整联蛋白-结合物的归一化RNA Seq计数。P<0.0001、0.001、0.027(分别)。(3E)嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和肝细胞中整联蛋白(左图–Itga4，中图–Itgal，右图–Itgam)的归一化RNA表达计数。(3F)蛋白质印迹表明与WT-PBS注射小鼠肝脏相比携带BC小鼠肝脏中pSTAT3的蛋白表达水平升高，HNF4α的表达减少(n＝5，学生T检验)。(3G)携带BC小鼠肝脏RT-PCR表明miR-24水平升高(n＝5，学生T检验)，P＝0.005。(3H)携带BC小鼠肝脏RT-PCR表明HNF4α水平显著降低(n＝5，学生T检验)P＝0.005。(3I)原代肝细胞RT-PCR表明补充IL-6后CCL2的RNA表达增加(n＝3，学生T检验，两个独立生物学重复的代表性实验)，P＝0.009。

图4A-图4J：IL-6-STAT3-HNF4α信号传导在BC致癌作用过程中引起肝脏代谢变化。(4A)与第4天相比，第21天时BC小鼠肝脏中由HNF4α调控的基因的DE通路富集分析。条显示特定通路的Z评分。(4B)左图-血浆白蛋白测量表明与WT-PBS注射小鼠相比携带BC小鼠中的水平降低(n＝5，学生T检验)P＝0.002。右图-第4天和第21天时肝细胞中白蛋白表达的归一化RNA Seq分析。P＝0.013。(4C)原代肝细胞RT-PCR表明补充IL-6后OTC的RNA表达水平降低(n＝3，学生T检验，两个独立生物学重复的代表性实验)P＝0.0002。(4D)STAT3抑制剂HJCO152即使在IL-6存在的情况下也会恢复OTC水平(n＝3，学生T检验)P<0.0001——CTRL+DMSO vs IL-6+DMSO以及STAT3抑制剂vs STAT3抑制剂+IL-6。(4E)蛋白质印迹(左图)表明与用媒剂处理的BC小鼠肝脏相比用ERK抑制剂处理的BC小鼠中HNF4α的表达水平升高(媒剂n＝4，曲美替尼(Trametinib)n＝3，学生T检验)。右图为条带强度定量。P＝0.024。(4F)用ERK抑制剂处理后第8天和第14天时肿瘤重量的测量(第8天n＝5，第14天n＝4，学生T检验)P值：第8天＝0.007，第14天＝0.014。(4G)与AAV8-GFP处理的携带BC小鼠相比用AAV8-HNF4α处理的携带BC小鼠肝脏RT-PCR表明HNF4α、UC酶和白蛋白的RNA表达增加(AAV8-GFP＝4，AAV8-HNF4αn＝7，学生T检验)P＝0.004、0.004、0.002、0.001(分别)。(4H)与AAV-HNF4α相比AAV-GFP注射后4T1肿瘤生长显著更高(AAV8-GFP＝12，AAV8-HNF4αn＝13，学生T检验)P＝0.049。(4I)左图-蛋白质印迹表明与用GFP处理的小鼠相比用HNF4α处理的携带BC小鼠的肿瘤中PCNA水平降低。右图-相对于肌动蛋白的条带强度定量。P＝0.003。(4J)用AAV8-HNF4α处理的携带BC小鼠肝脏和肿瘤RT-PCR表明肝脏中病毒HNF4α的RNA表达(BGH聚腺苷酸化信号)显著增加(n＝7，学生T检验)P<0.0001。

图5A-图5M：先天免疫细胞在KPC小鼠肝脏中诱发类似转录和代谢变化。(5A)携带PC小鼠肝脏RT-PCR表明，在癌症注射后的第一周，OTC酶的RNA表达减少(n＝6，双因素ANOVA)P＝0.01。(5B)携带PC小鼠肝脏中天冬氨酸和谷氨酸水平升高，富马酸水平降低。用GC-MS以及氨基酸分析仪(AAA)测量UC中间体水平(n＝4，谷氨酸-异常值–IQR法)。富马酸–WT n＝5，KPC n＝7，学生T检验)P值：Asp＝0.001，Glu＝0.019，Fum＝0.0001。(5C)肝脏切片H&E染色表明注射PC细胞后免疫细胞浸润增加。放大倍数为10X，详见图中所示。(5D)左图-肝脏和血液CD45+群体FACS分析定量显示与WT-PBS注射小鼠相比携带PC小鼠肝脏和血液中先天免疫细胞水平升高，淋巴细胞减少(n＝8，肝脏WT＝7，学生T检验)P值：血液：B细胞＝0.003，单核细胞＝0.0002，嗜中性粒细胞＝0.006。肝脏：B细胞＝0.004，T细胞＝0.05，单核细胞<0.0001，嗜中性粒细胞＝0.004。右图-MFI＝0.0001。携带KPC PC小鼠血液和肝脏中活免疫细胞被门控为CD45+、CD11b、CD3、CD19 Ly-6G和Ly-6C。平均荧光强度是在Ly-6C高单核细胞上完成的。(5E)ELISA测定表明携带PC小鼠的IL-6水平升高(n＝5，学生T检验)P＝0.011、0.01(分别)。(5F)蛋白质印迹表明与WT-PBS注射小鼠相比携带PC小鼠肝脏中pSTAT3的蛋白表达水平升高(n＝6)。(5G)携带胰腺癌小鼠肝脏RT-PCR表明HNF4αRNA表达水平随肿瘤进展而显著降低，而在WT-PBS注射小鼠中保持不变(WT n＝3，KPC n＝4，学生T检验)P＝0.0012。(5H)携带PC小鼠肝脏RT-PCR表明白蛋白RNA水平显著降低(WT n＝4，KPC n＝5，学生T检验)，P＝0.0009。(5I)用IL-6抗体处理PC小鼠保持白蛋白的血浆水平(Ctrl IgG＝8，IL-6Ab＝5，学生T检验)P＝0.011。(5J)与WT对照相比，在肿瘤发展的22天里，PC小鼠重量测量未显示PC小鼠重量减轻。(5K)体内NMR实验的功效分析(Power analysis)。Y轴显示HNF4α-注射vs.对照GFP注射的小鼠之间重量变化差异的Wilcoxon秩和P值，而X轴显示针对检验所考虑的每次实验中每个条件的样品大小。在本实验中，我们有两个条件(HNF4α-注射vs.对照GFP注射)和2次重复实验，因此实验总数是X轴中所示数字的4倍，平均样品大小是7。对于每个小于7的样品大小，随机选取小鼠进行统计检验，并且每个框显示P值的平均值和标准差，须(wisker)显示P值的上下10个百分点。(5L)与注射AAV-GFP小鼠相比(相对于第0天)，注射PC AAV-HNF4α小鼠重量测量和核磁共振(NMR)身体组成分析表明重量减轻(左图)、脂肪组织增加(中图)和游离流体减少(右图)显著减少；(n＝7)。(5M)癌细胞注射后4周对KPC-AAV-HNF4α和KPC-AAV-GFP注射小鼠的腓肠肌切片进行层粘连蛋白免疫荧光染色。对于每张载玻片，沿组织的不同区域拍摄五张照片。使用Fiji-ImageJ计算纤维面积(μm²)。使用五张图片的平均面积计算每只小鼠的纤维平均面积。使用200μm²的下截止值(lowercutoff)消除伪影(artifacts)。(AAV-GFP n＝9，AAV-HNF4An＝10，双因素ANOVA)。P＝0.008。

图6A-图6J：CCR2 KO小鼠和HNF4α挽救PC小鼠中肝脏代谢的早期变化。(6A)携带CCR2-/-PC和PC小鼠肝脏H&E染色表明与WT PC小鼠肝脏相比CCR2-/-肝脏的免疫细胞浸润减少。PC小鼠是注射KPC的小鼠。放大倍数-10X、20X和40X，详见图中所示。(6B)ELISA测定表明，相对于PC-WT小鼠，携带PC-CCR2-/-小鼠血浆中IL-6水平降低(PC WT n＝7，CCR2-/-n＝6，学生T检验)P＝0.0125。(6C)携带CCR2-/-PC小鼠肝脏RT-PCR表明ASS1、OTC、白蛋白和HNF4α的RNA表达水平得以保持——相比于WT PC肝脏中这些基因的表达水平降低(PC WT n＝5，CCR2-/-n＝6，学生T检验，学生T检验)，P＝0.019、0.011和0.002(分别)。(6D)携带PC-CCR 2-/-小鼠肝脏中天冬氨酸和谷氨酸水平降低。用气相色谱-质谱法(GC-MS)测量UC中间体水平(n＝7，学生T检验)，P＝0.011、0.029(分别)。(6E)与第21天时WT PC相比(相对于第0天)，携带CCR2-/-PC小鼠重量测量和核磁共振(NMR)身体组成分析表明重量减轻(左图)、脂肪组织增加(中图)和游离流体减少(右图)显著减少；(每组n＝7，学生T检验)P＝0.014、0.006、0.004(分别)。(6F)与WT-PC相比胰腺癌CCR2-/-小鼠中处死当天测量的肿瘤重量明显更低(n＝7，学生T检验)。P＝0.009。(6G)与AAV-HNF4α相比注射AAV-GFP的小鼠中PC肿瘤生长明显更显著(AAV-GFP n＝4，AAV-HNF4αn＝9，学生T检验)P＝0.006。(6H)与PC-AAV-GFP小鼠相比注射AAV-HNF4α的PC小鼠显示生存期显著延长(对数秩(Mantel-Cox)检验)，P＝0.02。(6I)与注射AAV-GFP的胰腺癌小鼠相比注射AAV-HNF4α的PC小鼠在CAC期间维持重量(AAV-GFP n＝8，AAV-HNF4αn＝9，双因素ANOVA)，P＝0.05。(6J)与注射AAV-GFP的PC小鼠相比注射AAV-HNF4α的胰腺癌小鼠NMR身体组成分析表明脂肪组织损失更少(左图)且游离流体累积减少(右图)(AAV-GFP n＝5，AAV-HNF4αn＝6，学生T检验)P＝0.007、0.012(分别)。

图7A-图7I：常规肝脏测试预测PDAC患者重量减轻。(7A)对Clalit Health Care数据库进行的肝脏生化测试分析表明与生存期较长的患者相比生存期较短的非转移性PDAC病患者在诊断时存在肝脏参数异常。(PDAC；n＝2037-生存期<0.5y，n＝659-生存期0.5-1y，n＝342，生存期1-1.5y；**p<0.01，***p<0.001。(7B)来自Clalit数据库(左)和来自Sheba与Souraski医学中心(右)的PDAC患者的K.M.生存期曲线表明肝脏功能评分高的PDAC患者生存期缩短。P＝0.0003和P<0.0001(分别)。(7C-7D)对来自Sheba与Sourasky医学中心的数据的分析。(7C)肝脏评分与胰腺癌疾病分期(stage)无关。LA-局部晚期，MTX-转移性疾病。(7D)PDAC期间来自Sheba与Sourasky医学中心的PDAC患者的高(红)和低(蓝)肝脏评分的重量减轻相关性，按诊断时疾病分期箱块表示(binned)。(线性回归P＝0.02)。(7E-7F)与生存期较长的患者相比生存期较短的非转移性BC患者在诊断时(7E)和诊断前一年(7F)存在肝脏参数异常(BC；n＝4732-生存期<2y，n＝4086-生存期2-5y，n＝3984，生存期5-10y；*P<0.05，***P<0.01，***P<0.001)。(7G)与重量减轻较少患者(黄色)相比早期重量减轻较大患者(蓝色)显示生存期缩短(对数秩P<0.0051)——即使是在控制了年龄和性别时(cox风险比＝1.21，P<0.0084)。(7H)来自用于训练模型的初始(n＝50)数据集的肝脏功能评分高和低的PC患者的K.M.生存期曲线。计算详见“方法”部分。(7I)肝脏功能评分高和低的PC患者的K.M.生存期曲线上图-Sourasky数据。对于可切除肿瘤，n＝255，对于局部和远端扩散，n＝362。下图-Sheba数据，对于1-2期，n＝82。对于3-4期，n＝169。(左-诊断时1-2期可切除肿瘤患者，右-诊断时3-4期局部和远端扩散患者)，P值：可切除＝0.0255，生存期LA ＝0.0007，生存期3-4期＝0.005。

图8：对这些发现的图形汇总，提出了癌症患者以及携带癌症小鼠的肝脏中可导致CAC的肿瘤诱发全身代谢变化的机制。

图9A-图9H：(9A)施用H4-LNP或SM-LNP小鼠肝脏和脾脏的荧光的照片。仅在接受SM-LNP的肝脏中才能检测到荧光。(9B)与SM-LNP接触的THLE-2中HNF4A表达的蛋白质印迹。肌动蛋白作为负载对照进行测量。(9C-9H)先给予胰腺癌细胞(第0天)然后在第21天施用(9C-9E)治疗剂量的HNF4A-LNP或在第7天施用(9F-9H)预防剂量的HNF4A-LNP的小鼠中(9C、9F)重量、(9D、9G)脂肪和(9E、9H)游离流体百分比变化的线图。

具体实施方式

本发明在一些实施方式中提供通过测量患有癌症的对象中尿素循环的功能来预测对象的临床结果的方法。还提供通过测量对象中尿素循环的功能来检测对象中非肝脏癌症的方法。还提供治疗或预防癌症或治疗或预防癌症相关恶病质的方法。还提供包封编码HNF4A的mRNA的合成脂质纳米颗粒和包括其的组合物。

本发明至少部分基于下列令人惊讶的发现：虽然在健康肝脏中暴露于外来分子会导致受调控的炎症，但在致癌作用和免疫浸润后，肝脏通过分泌增加量的CCL2来募集先天免疫细胞。pERK阳性的活化免疫细胞和升高的IL-6水平导致肝脏中代谢酶的表达发生转录变化。肿瘤诱发的IL-6已表明会损害肝脏生酮反应。在此，我们证明肝脏代谢通过IL-6-pSTAT3免疫-肝轴(immune-hepatic axis)广泛重新连线，导致肝脏代谢的主调节子HNF4α耗竭。因此，全身代谢存在变化，从而增大促进癌症生长的底物的可利用性并促成重量减轻等全身表现和恶病质等身体组成变化(图8)。

此外，我们还提出生化肝脏评分，其包括白蛋白并且能够预测生存期和重量减轻而与癌症分期无关。在治疗上，我们的数据表明，在癌症早期向有风险的已鉴定患者给予临床上可用的药物如ERK抑制剂、STAT抑制剂或抗IL-6阻断抗体能够保留肝脏代谢并限制癌症进展。此外，外源性HNF4α还能够用于维持肝脏代谢和限制全身表现。这是通过既用HNF4α-AAV，又用包括经优化的HNF4A mRNA的新型肝脏靶向LNP实现的(图10C-10H)，它们不仅能够缩小癌症，还能预防和治疗恶病质。

第一方面，提供检测对象的癌症的方法，方法包括测量对象中尿素循环的功能，从而检测癌症。

第一方面，提供预测对象的临床结果的方法，方法包括测量对象中尿素循环的功能，从而预测临床结果。

在一些实施方式中，方法是体外方法。在一些实施方式中，方法是离体方法。在一些实施方式中，方法是诊断方法。在一些实施方式中，方法是预后方法。在一些实施方式中，方法是治疗方法。在一些实施方式中，方法是检测恶病质的方法。在一些实施方式中，方法是预测恶病质的发展的方法。在一些实施方式中，方法是预测发展恶病质的风险的方法。在一些实施方式中，方法是预测总生存期的方法。在一些实施方式中，方法是预测死亡率的方法。在一些实施方式中，方法是预测生存年数的方法。在一些实施方式中，预测是在疾病表现之前至少1个月。在一些实施方式中，预测是在疾病表现之前至少3个月。在一些实施方式中，预测是在疾病表现之前至少6个月。在一些实施方式中，预测是在疾病表现前至少1年。在一些实施方式中，预测是在疾病表现之前至少2年。在一些实施方式中，疾病是癌症。在一些实施方式中，疾病是恶病质。

在一些实施方式中，对象是哺乳动物。在一些实施方式中，对象是人。在一些实施方式中，对象需要本发明的方法。在一些实施方式中，对象患有癌症。在一些实施方式中，对象处于发展癌症的风险中。在一些实施方式中，对象患有恶病质。在一些实施方式中，对象处于发展恶病质的风险中。在一些实施方式中，通过本发明的方法确定或预测风险。在一些实施方式中，通过本发明的方法检测癌症。在一些实施方式中，通过本发明的方法预测癌症。在一些实施方式中，通过本发明的方法检测恶病质。在一些实施方式中，通过本发明的方法预测恶病质。

如本文所用，“癌症”或“恶性前期病变”是指与失控的细胞增殖有关的疾病。在一些实施方式中，癌症不是肝脏癌症。在一些实施方式中，癌症是非肝脏癌症。在一些实施方式中，癌症不包括向肝脏的转移。在一些实施方式中，转移是可检测的转移。在一些实施方式中，癌症是实体癌症。在一些实施方式中，癌症是血液学癌症。在一些实施方式中，癌症是肿瘤。在一些实施方式中，癌症选自肝胆癌、宫颈癌、泌尿生殖癌、睾丸癌、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、神经系统癌、眼癌、肺癌、软组织癌、骨癌、胰腺癌、膀胱癌、皮肤癌、肠癌、肝癌、直肠癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、胃食管癌、乳腺癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、白血病和淋巴瘤。在一些实施方式中，癌症不是肝癌。在一些实施方式中，癌症不是白血病或淋巴瘤。在一些实施方式中，癌症是乳腺癌。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。

在一些实施方式中，癌症处于任意期。在一些实施方式中，癌症是早期癌症。在一些实施方式中，癌症是晚期癌症。在一些实施方式中，癌症是I期癌症。在一些实施方式中，癌症是II期癌症。在一些实施方式中，癌症是III期癌症。在一些实施方式中，癌症是IV期癌症。在一些实施方式中，癌症是癌前恶性肿瘤。在一些实施方式中，恶性肿瘤是恶性病变。在一些实施方式中，方法与癌症或癌症前期无关。在一些实施方式中，方法与癌症类型——除了非肝癌症外——无关。

如本文所用，术语“恶病质”是指导致骨骼肌和脂肪损失的衰竭综合征。在一些实施方式中，恶病质进一步包括增加的游离流体。在一些实施方式中，通过测量脂肪损失、肌肉损失、游离流体增加或其任意组合来确定或诊断恶病质。在一些实施方式中，恶病质是癌症相关恶病质。在一些实施方式中，癌症相关恶病质是癌症引起的恶病质。恶病质包括三个连续的临床分期：恶病质前期、恶病质和难治性恶病质。恶病质前期被定义为体重减轻少于5％。恶病质被定义为患者体重减轻超过5％。难治性恶病质期按低WHO表现状态评分和少于3个月的生存期确定。在一些实施方式中，恶病质是恶病质前期。在一些实施方式中，恶病质是二期恶病质。在一些实施方式中，恶病质不是难治性恶病质。在一些实施方式中，恶病质是难治性恶病质。

在一些实施方式中，测量对象中尿素循环的功能。在一些实施方式中，测量来自对象的样品中尿素循环的功能。在一些实施方式中，测量对象的肝脏功能。在一些实施方式中，测量来自对象的样品中的肝脏功能。在一些实施方式中，方法还包括从对象接收样品。在一些实施方式中，样品不是癌症样品。在一些实施方式中，测量是癌症外部的测量。在一些实施方式中，测量在对象的肝脏中。在一些实施方式中，样品是肝脏活检。在一些实施方式中，测量在对象的血液中。在一些实施方式中，样品是血液样品。在一些实施方式中，血液样品是全血样品。在一些实施方式中，血液样品是血浆样品。在一些实施方式中，血液样品是血清样品。在一些实施方式中，样品是尿液样品。在一些实施方式中，测量功能基于血液样品。在一些实施方式中，检测或确定基于来自样品的数据。在一些实施方式中，接收来自样品的数据。

在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量至少一种尿素循环酶的表达。在一些实施方式中，测量肝脏功能包括测量至少一种尿素循环酶的表达。在一些实施方式中，测量肝脏功能包括测量至少一种肝脏酶的表达。在一些实施方式中，表达是蛋白质表达。在一些实施方式中，表达是mRNA表达。在一些实施方式中，表达在对象的肝脏中。在一些实施方式中，表达在来自对象的肝脏样品中。在一些实施方式中，表达在对象的肝细胞中。在一些实施方式中，表达在对象的血液中。测量mRNA和蛋白质水平的方法是公知的，并且可使用任意这样的方法。这些方法包括例如PCR、RT-PCR、qRT-PCR、RNA测序、蛋白质印迹、ELISA、免疫染色、蛋白质阵列等。用于执行此测量的商业试剂和试剂盒是可获得的。

在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶是精氨琥珀酸合成酶1(ASS1)。在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶是鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)。在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶是精氨琥珀酸裂解酶(ASL)。在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶是氨甲酰磷酸合成酶-1(CPS1)。在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶是鸟氨酸移位酶(ORNT1/SLC25A15)。在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶选自ASS1、OTC、ASL、CPS1和ORNT1。在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶选自ASS1、OTC、ASL和ORNT1。在一些实施方式中，测量OTC。在一些实施方式中，OTC变化是尿素循环功能的最早生物标志物。在一些实施方式中，测量至少一种尿素循环酶的mRNA水平。在一些实施方式中，测量至少一种尿素循环酶的蛋白质水平。表1中提供用于测量这些酶及其它的mRNA表达的示例性引物。用于检测这些靶标的示例性抗体如下：p97(Thermo Fisher Scientific PA5-22257)；ASS1(Abcamab124465)；OTC(Abcam ab203859)；肌动蛋白(Sigma-Aldrich A5441)；TFAM(CellSignaling#8076)；pSTAT3(Cell Signaling#9145)；STAT3(Cell Signaling#12640)；HNF4α(Abcam ab181604)；PCNA(Cell Signaling#13110)；CAD(Cell Signaling#11933)；pCAD(Cell Signaling#12662)。

表1：引物

在一些实施方式中，至少一种肝脏酶是天冬氨酸转氨酶(AST)。在一些实施方式中，至少一种肝脏酶是丙氨酸转氨酶(ALT)。在一些实施方式中，至少一种肝脏酶是碱性磷酸酶(ALK-P/ALP)。在一些实施方式中，至少一种肝脏酶是乳酸脱氢酶(LDH)。在一些实施方式中，LDH是LDHA。在一些实施方式中，LDH是LDHB。在一些实施方式中，LDH是LDHA和LDHB。在一些实施方式中，至少一种肝脏酶选自AST、ALT、ALP和LDH。在一些实施方式中，至少一种肝脏酶选自ALP和LDH。在一些实施方式中，至少一种肝脏酶选自ALP、ALT和AST。

在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量尿素循环底物。在一些实施方式中，底物是谷氨酸。在一些实施方式中，底物是天冬氨酸。在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量尿素水平。在一些实施方式中，尿素水平是尿液中的水平。在一些实施方式中，尿素水平是血液中的水平。在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量尿素与谷氨酰胺之比。在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量尿素与谷氨酰胺之比。在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量尿素循环代谢物。在一些实施方式中，代谢物是产物。在一些实施方式中，代谢物是富马酸。在一些实施方式中，测量在肝脏中。在一些实施方式中，测量在血液中。

在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量氨水平。在一些实施方式中，氨水平在血液中。在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量白蛋白水平。在一些实施方式中，白蛋白水平在血液中。

在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量肝细胞核因子4α(HNF4A)表达。在一些实施方式中，表达是mRNA表达。在一些实施方式中，表达是蛋白质表达。在一些实施方式中，表达是在肝脏中的表达。在一些实施方式中，表达是在肝细胞中的表达。上文提供用于检测HNF4A的示例性引物和抗体。

在一些实施方式中，测量尿素循环功能包括测量凝血酶原。在一些实施方式中，测量凝血酶原是测量凝血酶原时间。在一些实施方式中，凝血酶原时间是国际标准化比值(INR)。在一些实施方式中，INR是血液的INR。在一些实施方式中，测量在血液中。在一些实施方式中，血液是血液样品。凝血酶原时间测试是公知临床测定并且其执行是本领域技术人员已知的标准方案。

在一些实施方式中，尿素循环功能降低指示临床结果不佳。在一些实施方式中，尿素循环功能降低指示癌症存在。在一些实施方式中，尿素循环功能降低指示对象患有癌症。在一些实施方式中，肝脏功能降低指示临床结果不佳。在一些实施方式中，肝脏功能降低指示癌症存在。在一些实施方式中，肝脏功能降低指示对象患有癌症。在一些实施方式中，降低是被降低到预定阈值以下。在一些实施方式中，降低是与对照相比。在一些实施方式中，预定阈值是对照中的水平/表达/值。在一些实施方式中，健康对照是健康对照样品。在一些实施方式中，使样品或对照与来自对象的样品或对象匹配。也就是说，本领域技术人员将理解，如果样品是血液样品，则对照也将是血液样品，而如果测量在肝脏中，则对照将在肝脏中测量。在一些实施方式中，对照是健康对照。在一些实施方式中，不佳的临床结果是更差的临床结果。在一些实施方式中，更差是与尿素循环功能未降低的对象相比。在一些实施方式中，更差是与肝脏功能未降低的对象相比。在一些实施方式中，更差是与功能未降低的匹配对照相比。也就是说，如果对象患有癌症，而匹配对照患有相同的癌症。而如果对象有恶性肿瘤前期，则匹配对照也有恶性肿瘤前期。

在一些实施方式中，降低包括至少降低5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、92、95、97 99或100％的降低。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，降低是至少25％的降低。在一些实施方式中，降低是至少50％的降低。在一些实施方式中，降低是可检测的降低。在一些实施方式中，降低是显著的降低。在一些实施方式中，显著是统计上显著。

在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶的表达减少指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，至少一种尿素循环酶的表达减少指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，至少一种肝脏酶的表达减少指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，尿素循环底物水平降低指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，尿素循环底物水平降低指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，尿素循环代谢物水平升高指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，尿素循环代谢物水平升高指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，尿素水平降低指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，尿素水平降低指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，尿素与谷氨酰胺之比降低指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，尿素与谷氨酰胺之比降低指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，尿素与谷氨酸之比降低指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，尿素与谷氨酸之比降低指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，富马酸水平升高指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，富马酸水平升高指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，氨水平升高指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，氨水平升高指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，白蛋白水平降低指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，白蛋白水平降低指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，HNF4A表达降低指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，HNF4A表达降低指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，INR降低指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，INR降低指示肝脏功能降低。

在一些实施方式中，测量肝脏功能包括产生肝脏功能评分。在一些实施方式中，肝脏功能评分是上文提供的肝脏功能的度量(measures)的和。在一些实施方式中，和是加权和。在一些实施方式中，度量被归一化。在一些实施方式中，和是AST、ALT和ALP中至少两个的水平的和。在一些实施方式中，将所有三个水平加和。在一些实施方式中，和是AST、ALT和ALP中至少一个的水平与白蛋白的水平的和。在一些实施方式中，和是AST、ALT和ALP中至少两个的水平与白蛋白的水平的和。在一些实施方式中，和是AST、ALT、ALP和白蛋白的水平的和。在一些实施方式中，和是AST、ALT和ALP中至少一个的水平与测量INR的和。在一些实施方式中，和是白蛋白的水平与测量INR的和。在一些实施方式中，和是AST、ALT和ALP中至少一个的水平、白蛋白的水平以及测量INR的和。在一些实施方式中，和是AST、ALT和ALP中至少两个的水平、白蛋白的水平以及测量INR的和。在一些实施方式中，和是AST、ALT、ALP和白蛋白的水平与测量INR的和。

在一些实施方式中，至少一个是至少两个。在一些实施方式中，至少一个是多个。在一些实施方式中，至少一个是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，至少一个是其中的全部。

在一些实施方式中，超过预定阈值的评分指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，超过预定阈值的评分指示肝脏功能降低。在一些实施方式中，尿素循环功能是肝脏功能。在一些实施方式中，肝脏功能包括尿素循环功能。在一些实施方式中，高评分指示功能降低，而低评分指示功能正常。在一些实施方式中，超过是以上。在一些实施方式中，超过是以下。在一些实施方式中，评分的标准化是从0到1。在一些实施方式中，评分是以从0到1的标度(scale)或等效形式(equivalent)计的。在一些实施方式中，预定阈值以从0到1的标度计是0.6。在一些实施方式中，0.6以上的评分指示尿素循环功能降低。在一些实施方式中，0.6以上的评分指示肝脏功能降低。

在一些实施方式中，临床结果是发展恶病质。在一些实施方式中，尿素循环功能降低预测发展恶病质的风险增加。在一些实施方式中，尿素循环功能降低预测对象将会发展恶病质。在一些实施方式中，肝脏功能降低预测发展恶病质的风险增加。在一些实施方式中，肝脏功能降低预测对象将会发展恶病质。在一些实施方式中，增加与功能未降低对象相比是增加的。在一些实施方式中，增加与评分不超过预定阈值的对象相比是增加的。在一些实施方式中，增加是与无癌症、癌前病变或发展癌症的风险增加的对象相比。在一些实施方式中，增加包括增加至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500％。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，增加是至少增加20％。在一些实施方式中，增加是至少增加50％。在一些实施方式中，增加是至少增加100％。

在一些实施方式中，临床结果是生存期。在一些实施方式中，生存期是总生存期。在一些实施方式中，尿素循环功能降低预测生存期缩短。在一些实施方式中，肝脏功能降低预测生存期缩短。在一些实施方式中，超过预定阈值的评分预测生存期缩短。在一些实施方式中，缩短是与功能未降低的对象相比。在一些实施方式中，缩短是与评分在预定阈值内的对象相比。在一些实施方式中，生存期缩短是预测少于一年的生存期。在一些实施方式中，生存期缩短是预测小于2年的生存期。在一些实施方式中，生存期缩短是预测2-5年的生存期。在一些实施方式中，生存期是未来1年生存期。在一些实施方式中，生存期是未来2年生存期。在一些实施方式中，生存期是未来5年生存期。在一些实施方式中，生存期是未来12年生存期。在一些实施方式中，生存期是未来13年生存期。在一些实施方式中，生存期是来自诊断的生存期。在一些实施方式中，生存期是来自本发明方法的执行的生存期。在一些实施方式中，生存期是诊断时当癌症可切除时的生存期。在一些实施方式中，生存期是诊断时当癌症转移时的生存期。在一些实施方式中，生存期是诊断时当癌症是I-II期时的生存期。在一些实施方式中，生存期是诊断时当癌症是III-IV期时的生存期。

在一些实施方式中，方法还包括对确定患有癌症的对象施用抗癌治疗。抗癌治疗的示例包括但不限于手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法(例如，免疫检查点抑制剂)和靶向抗体疗法。在一些实施方式中，方法还包括对确定具有更差的临床结果的对象施用抗癌治疗。在一些实施方式中，抗癌治疗是治疗剂。在一些实施方式中，抗癌治疗包括施用治疗剂。

在一些实施方式中，抗癌疗法是抗IL6疗法。在一些实施方式中，治疗剂是抗IL6疗法。在一些实施方式中，抗IL-6疗法包括施用IL-6阻断或中和抗体。抗IL6抗体的示例包括但不限于司妥昔单抗(Siltuximab)、奥洛组单抗(Olokizumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、克拉扎珠单抗(Clazakizumab)、吉瑞利单抗(Gerilimzumab)、EBI-031和西鲁库单抗(Sirukumab)。在一些实施方式中，抗IL6疗法包括施用IL-6受体(IL-6R)阻断或中和抗体。抗IL6R抗体的示例包括但不限于BCD-089、托珠单抗(Tocilizumab)、LusiNEX、沙利鲁单抗(Sarilumab)和沃巴利珠单抗(Vobarilizumab)。由于抗IL-6和IL-6R抗体在本领域中是公知的，因此该种属中有足够数量的成员代表该种属整体。

如本文所用，术语“抗体”是指包括至少一个结合结构域的多肽或多肽组，该至少一个结合结构域由具有三维结合空间的多肽链的折叠形成，该三维结合空间具有与抗原的抗原决定簇的特征互补的内表面形状和电荷分布。抗体一般具有四聚体形式，包括两对相同的多肽链，每对有一条“轻”链和一条“重”链。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。抗体可以是寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、骆驼化(camelised)抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化性抗体、人源化抗体、完全人抗体、抗独特型抗体和能够以可溶性形式或结合形式标记的抗体以及片段，包括单独地或与其它氨基酸序列组合的表位结合片段、其变体或衍生物。抗体可来自任何物种。术语抗体还包括结合片段，包括但不限于Fv、Fab、Fab'、F(ab')2单链抗体(svFC)、二聚体可变区(双抗体)和二硫化物连接的可变区(disulphide-linked variable region,dsFv)。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有抗原结合位点的分子。抗体片段可以与或可以不与另一个免疫球蛋白结构域融合，该另一个免疫球蛋白结构域包括但不限于Fc区或其片段。技术人员将进一步理解，可以生成其它融合产物，包括但不限于scFv-Fc融合体、可变区(例如，VL和VH)～Fc融合体和scFv-scFv-Fc融合体。

免疫球蛋白分子可以是任意类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。

在一些实施方式中，抗癌疗法是ERK抑制。在一些实施方式中，治疗剂是ERK抑制剂。在一些实施方式中，抗癌疗法包括施用ERK抑制剂。ERK抑制剂的示例包括但不限于CAS1049738-54-6(ERK抑制剂)、曲美替尼、PD98059、SCH772984、牛熊去氧胆酸盐、帕曲妥单抗(patritumab)、优立替尼(ulixertinib)、reavoxertinib、黄芪甲苷IV(astragalosideIV)、牛熊去氧胆酸钠、荜拔酰胺、temuterkib、利多卡因、BIX02189、FR180204、XMD8-92和MK-8353ERK等。抑制剂的其它示例可在medchemexpress.com/Targets/ERK找到，其内容特此通过引用以其整体并入。

在一些实施方式中，抗癌疗法是STAT抑制。在一些实施方式中，治疗剂是STAT抑制剂。在一些实施方式中，STAT是信号转导和转录激活因子3(signal transducer andactivator of transcription 3,STAT3)。在一些实施方式中，抗癌疗法包括施用STAT抑制剂。STAT3抑制剂的示例包括但不限于Stattic、AG490、青蒿酯、氯硝柳胺、西仑吉肽(cilengitide)、STX-0119、STAT3-IN-15、高三尖杉酯碱、C188-9、TPCA-1、纳帕布卡辛(napabucasin)、隐丹参酮、WP1066、NSC74859、SD-36、黄芩素苷、虾黄质和匹莫齐特等。STAT3抑制剂的其它示例可在medchemexpress.com/Targets/STAT/stat3找到，其内容特此通过引用以其整体并入。

在一些实施方式中，抑制剂是特异性抑制剂。在一些实施方式中，特异性抑制剂不大幅地(substantially)抑制除靶标(例如，ERK或STAT)外的任何蛋白质。在一些实施方式中，大幅地是显著地。在一些实施方式中，大幅地是可检测地。在一些实施方式中，抑制剂或抗体被提供在药物组合物中。在一些实施方式中，组合物包括治疗有效的载剂、赋形剂或佐剂。

在一些实施方式中，抗癌疗法包括施用增加HNF4A的表达的用剂。在一些实施方式中，治疗剂增加HNF4A的表达。在一些实施方式中，增加是在对象肝脏内增加。在一些实施方式中，在肝脏内是在肝脏细胞内。在一些实施方式中，在肝脏内是在肝细胞内。在一些实施方式中，用剂是本发明的脂质纳米颗粒(LNP)。

在一些实施方式中，用剂包括核酸分子。在一些实施方式中，用剂是核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子编码HNF4A。在一些实施方式中，核酸分子包括编码HNF4A的编码区。在一些实施方式中，核酸分子包括编码HNF4A的开放阅读框。

术语“核酸”在本领域是公知的。如本文所用的“核酸”将通常指代包括核碱基的DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(即，链)。核碱基包括，例如，存在于DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)中的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。

术语“核酸分子”包括但不限于单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、小RNA(如miRNA、siRNA和其它短干扰核酸)、snoRNA、snRNA、tRNA、piRNA、tnRNA、小rRNA、hnRNA、循环核酸、基因组DNA或RNA片段、降解核酸、核酶、病毒RNA或DNA、感染源核酸、扩增产物、修饰核酸、细胞质或细胞器核酸以及人工核酸(如寡核苷酸)。

肝细胞核因子4α(HNF4A)也被称为NR2A1、HNF4、TCF14、核受体亚家族2A组成员1(Nuclear Receptor Subfamily 2group A member 1)、转录因子HNF-4和转录因子14以及本领域已知的其它名称。在一些实施方式中，HNF4A是哺乳动物HNF4A。在一些实施方式中，HNF4A是啮齿类动物HNF4A。在一些实施方式中，啮齿动物是小鼠。在一些实施方式中，HNF4A是人HNF4A。小鼠HNF4A基因可在Entrez#15378处找到。小鼠HNF4A蛋白序列可在Uniprot IDP49698处找到。小鼠HNF4A的RefSeq mRNA序列可在NM_008261、NM_001312906和NM_001312907中找到。小鼠HNF4A的RefSeq蛋白序列可在NP_032287、NP_001299835和NP_001299836中找到。人HNF4A基因可在Entrez#3172处找到。人HNF4A蛋白序列可在UniprotID P41235处找到。人HNF4A的RefSeq mRNA序列可在NM_000457、NM_001030003、NM_001030004、NM_001258355和NM_001287182中找到。人HNF4A的RefSeq蛋白序列可在NP_000448、NP_001025174、NP_001025175、NP_001245284和NP_001274111中找到。

在一些实施方式中，小鼠HNF4A cDNA编码序列包括atgcgactctctaaaacccttgccggcatggatatggccgactacagcgctgccctggacccagcctacaccaccctggagtttgaaaatgtgcaggtgttgaccatgggcaatgacacgtccccatctgaaggtgccaacctcaattcatccaacagcctgggcgtcagtgccctgtgcgccatctgtggcgaccgggccaccggcaaacactacggagcctcgagctgtgacggctgcaaggggttcttcaggaggagcgtgaggaagaaccacatgtactcctgcaggtttagccgacaatgtgtggtagacaaagataagaggaaccagtgtcgttactgcaggcttaagaagtgcttccgggctggcatgaagaaggaagctgtccaaaatgagcgggaccggatcagcacgcggaggtcaagctacgaggacagcagcctgccctccatcaacgcgctcctgcaggcagaggttctgtcccagcagatcacctctcccatctctgggatcaatggcgacattcgggcaaagaagattgccaacatcacagacgtgtgtgagtctatgaaggagcagctgctggtcctggtcgagtgggccaagtacatcccggccttctgcgaactccttctggatgaccaggtggcgctgctcagggcccacgccggtgagcatctgctgcttggagccaccaagaggtccatggtgtttaaggacgtgctgctcctaggcaatgactacatcgtccctcggcactgtccagagctagcggagatgagccgtgtgtccatccgcatcctcgatgagctggtcctgcccttccaagagctgcagattgatgacaatgaatatgcctgcctcaaagccatcatcttctttgatccagatgccaaggggctgagtgacccgggcaagatcaagcggctgcggtcacaggtgcaagtgagcctggaggattacatcaacgaccggcagtacgactctcggggccgctttggagagctgctgctgctgttgcccacgctgcagagcatcacctggcagatgatcgaacagatccagttcatcaagctcttcggcatggccaagattgacaacctgctgcaggagatgcttctcggagggtctgccagtgatgcaccccacacccaccaccccctgcaccctcacctgatgcaagaacacatgggcaccaatgtcattgttgctaacacgatgccctctcacctcagcaatggacagatgtgtgagtggccccgacccagggggcaggcagccactcccgagactccacagccatcaccaccaagtggctcgggatctgaatcctacaagctcctgccaggagccatcaccaccatcgtcaagcctccctctgccattccccagccaacgatcaccaagcaagaagccatc(SEQ ID NO:1)。在一些实施方式中，小鼠HNF4A cDNA编码序列由SEQ ID NO:1组成。在一些实施方式中，核酸分子包括小鼠cDNA序列。在一些实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:1或具有与其至少85％同源性的编码HNF4A的序列。在一些实施方式中，同源性是同一性。在一些实施方式中，至少85％是至少90％、92％、95％、97％或99％。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，核酸分子包括与至少一个转录调控元件可操作地连接的SEQ ID NO:1。在一些实施方式中，编码序列的RNA序列包括SEQ ID NO:2。在一些实施方式中，编码序列的RNA序列由SEQ ID NO:2组成。在一些实施方式中，核酸分子包括小鼠mRNA编码序列。在一些实施方式中，核酸分子包括SEQID NO:2或具有与其至少85％同源性的编码HNF4A的序列。

在一些实施方式中，小鼠HNF4A蛋白包括MRLSKTLAGMDMADYSAALDPAYTTLEFENVQVLTMGNDTSPSEGANLNSSNSLGVSALCAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKKCFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLPSINALLQAEVLSQQITSPISGINGDIRAKKIANITDVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELLLDDQVALLRAHAGEHLLLGATKRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHCPELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYACLKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSITWQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLGGSASDAPHTHHPLHPHLMQEHMGTNVIVANTMPSHLSNGQMCEWPRPRGQAATPETPQPSPPSGSGSESYKLLPGAITTIVKPPSAIPQPTITKQEAI(SEQ ID NO:3)。在一些实施方式中，小鼠HNF4A蛋白由SEQ ID NO:3组成。在一些实施方式中，编码区编码SEQID NO:3。在一些实施方式中，HNF4A蛋白是具有与SEQ ID NO:3至少85％同源性的蛋白质。

在一些实施方式中，人HNF4A cDNA编码序列包括atgcgactctccaaaaccctcgtcgacatggacatggccgactacagtgctgcactggacccagcctacaccaccctggaatttgagaatgtgcaggtgttgacgatgggcaatgacacgtccccatcagaaggcaccaacctcaacgcgcccaacagcctgggtgtcagcgccctgtgtgccatctgcggggaccgggccacgggcaaacactacggtgcctcgagctgtgacggctgcaagggcttcttccggaggagcgtgcggaagaaccacatgtactcctgcagatttagccggcagtgcgtggtggacaaagacaagaggaaccagtgccgctactgcaggctcaagaaatgcttccgggctggcatgaagaaggaagccgtccagaatgagcgggaccggatcagcactcgaaggtcaagctatgaggacagcagcctgccctccatcaatgcgctcctgcaggcggaggtcctgtcccgacagatcacctcccccgtctccgggatcaacggcgacattcgggcgaagaagattgccagcatcgcagatgtgtgtgagtccatgaaggagcagctgctggttctcgttgagtgggccaagtacatcccagctttctgcgagctccccctggacgaccaggtggccctgctcagagcccatgctggcgagcacctgctgctcggagccaccaagagatccatggtgttcaaggacgtgctgctcctaggcaatgactacattgtccctcggcactgcccggagctggcggagatgagccgggtgtccatacgcatccttgacgagctggtgctgcccttccaggagctgcagatcgatgacaatgagtatgcctacctcaaagccatcatcttctttgacccagatgccaaggggctgagcgatccagggaagatcaagcggctgcgttcccaggtgcaggtgagcttggaggactacatcaacgaccgccagtatgactcgcgtggccgctttggagagctgctgctgctgctgcccaccttgcagagcatcacctggcagatgatcgagcagatccagttcatcaagctcttcggcatggccaagattgacaacctgttgcaggagatgctgctgggagggtcccccagcgatgcaccccatgcccaccaccccctgcaccctcacctgatgcaggaacatatgggaaccaacgtcatcgttgccaacacaatgcccactcacctcagcaacggacagatgtccacccctgagaccccacagccctcaccgccaggtggctcagggtctgagccctataagctcctgccgggagccgtcgccacaatcgtcaagcccctctctgccatcccccagccgaccatcaccaagcaggaagttatc(SEQID NO:4)。在一些实施方式中，人HNF4AcDNA编码序列由SEQ ID NO:4组成。在一些实施方式中，核酸分子包括人cDNA序列。在一些实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:4或具有与其至少85％同源性的编码HNF4A的序列。在一些实施方式中，同源性是同一性。在一些实施方式中，至少85％是至少90％、92％、95％、97％或99％。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，核酸分子包括与至少一个转录调控元件可操作地连接的SEQ IDNO:4。在一些实施方式中，编码序列的RNA序列包括SEQ ID NO:5。在一些实施方式中，编码序列的RNA序列由SEQ ID NO:5组成。在一些实施方式中，核酸分子包括人mRNA编码序列。在一些实施方式中，核酸分子包括SEQ ID NO:5或具有与其至少85％同源性的编码HNF4A的序列。

在一些实施方式中，人HNF4A蛋白包括MRLSKTLVDMDMADYSAALDPAYTTLEFENVQVLTMGNDTSPSEGTNLNAPNSLGVSALCAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKKCFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLPSINALLQAEVLSRQITSPVSGINGDIRAKKIASIADVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELPLDDQVALLRAHAGEHLLLGATKRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHCPELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYAYLKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSITWQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLGGSPSDAPHAHHPLHPHLMQEHMGTNVIVANTMPTHLSNGQMSTPETPQPSPPGGSGSEPYKLLPGAVATIVKPLSAIPQPTITKQEVI(SEQ ID NO:6)。在一些实施方式中，人HNF4A蛋白由SEQ ID NO:6组成。在一些实施方式中，编码区编码SEQ ID NO:6。在一些实施方式中，HNF4A蛋白是具有与SEQ ID NO:6至少85％同源性的蛋白质。

在一些实施方式中，核酸分子是载体。在一些实施方式中，载体是表达载体。在一些实施方式中，载体包括至少一个与本发明的核酸分子可操作地连接的调控元件。在一些实施方式中，载体包括至少一个与编码本发明抗原结合分子的开放阅读框可操作地连接的调控元件。在一些实施方式中，至少一个调控元件是启动子。

术语“可操作地连接(operably linked)”和“可操作地连接(operativelylinked)”在本文可互换地使用并且意指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列(例如，在体外转录/翻译系统中或当将载体导入宿主细胞时在宿主细胞中)表达的方式与一个或多个调控元件连接。

如本文所用的术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。因此，核酸分子的表达可指代核酸片段的转录(例如，产生mRNA或其它功能性RNA的转录)和/或将RNA翻译成前体或成熟蛋白(多肽)。

基因在细胞内的表达是本领域技术人员公知的。其可通过转染、病毒感染或直接改变细胞的基因组等多种方法实施。在一些实施方式中，基因在表达载体如质粒或病毒载体中。

载体核酸序列总体上包含用于在细胞中繁殖的至少一个复制起点以及任选地另外的元件，如异源多核苷酸序列、表达控制元件(例如，启动子、增强子)、选择标记(例如，抗生素抗性)、聚腺嘌呤序列。

载体可以是经由非病毒方法或经由病毒方法递送的DNA质粒。病毒载体可以是逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体。在一些实施方式中，载体是AAV载体。启动子在哺乳动物细胞中可具有活性。启动子可以是病毒启动子。在一些实施方式中，启动子是人启动子。在一些实施方式中，启动子是肝细胞启动子。

在一些实施方式中，HNF4A编码区与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列(例如，当将载体导入宿主细胞时在宿主细胞中)表达的方式与一个或多个调控元件连接。

在一些实施方式中，载体通过标准方法被导入细胞中，包括电穿孔(例如，如Frometal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5824(1985)中描述的)、热激、病毒载体的感染、通过在小珠或小颗粒阵列内或表面上具有核酸的小颗粒的高速弹道穿透(Klein et al.,Nature 327.70-73(1987))和/或类似方法。

如本文所用的术语“启动子”是指一组转录控制模块，它们聚集在RNA聚合酶(即RNA聚合酶II)的起始位点周围。启动子由离散的功能模块组成，每个功能模块由大约7-20bp的DNA组成，并包含一个或多个转录激活因子或阻遏蛋白的识别位点。

在一些实施方式中，核酸序列由RNA聚合酶II(RNAP II和Pol II)转录。RNAP II是存在于在真核细胞中的酶。它催化DNA的转录以合成mRNA的前体以及大多数snRNA和微小RNA。

在一些实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于：可购自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(±)、pGL3、pZeoSV2(±)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81；可购自Promega的pCI；可购自Strategene的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV；可购自Clontech的pTRES，以及它们的衍生物。

在一些实施方式中，本发明使用包含来自真核病毒(如逆转录病毒)的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方式中，衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，以及衍生自埃巴病毒的载体包括pHEBO，以及p2O5。其它示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它的在真核细胞中显示有效表达的启动子的指导下允许蛋白质表达的载体。

在一些实施方式中，提供诸如横向感染和靶向特异性的优点的重组病毒载体用于体内表达。在一个实施方式中，横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，并且是单个感染细胞产生多个子代病毒体的过程，该子代病毒体萌发并感染相邻的细胞。在一个实施方式中，结果是大面积被迅速感染，其中大部分最初并未被原始病毒颗粒感染。在一个实施方式中，产生不能横向扩散的病毒载体。在一个实施方式中，如果期望的目的是仅将特定基因导入局部数量的靶细胞中，则此特性会是有用的。

可使用各种方法将本发明的表达载体导入细胞中。这样的方法在Sambrook etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,NewYork(1989,1992),in Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang et al.,Somatic Gene Therapy,CRCPress,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega et al.,Gene Targeting,CRC Press,Ann ArborMich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)and Gilboa et at.[Biotechniques 4(6):504-512,1986]中进行了大致的描述，并且包括例如稳定转染或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，参见美国专利号5,464,764和5,487,992的阳性-阴性选择法。

将理解的是，除了包含所插入的编码序列(其编码多肽)的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可包括经工程改造以优化所表达多肽的稳定性、产量、纯化、产率或活性的序列。

在一些实施方式中，核酸分子是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方式中，核酸分子被包含在AAV内。在一些实施方式中，用剂是包括核酸分子的AAV。

在一些实施方式中，核酸分子是mRNA。在一些实施方式中，mRNA包括5’帽。在一些实施方式中，mRNA包括5’非翻译区(UTR)。在一些实施方式中，5’UTR包括核糖体结合位点。在一些实施方式中，5’UTR包括Kozak序列(ACC)的5’端。在一些实施方式中，5’UTR包括Kozak序列(GCCACC)的5’端。在一些实施方式中，ACC是5’UTR的3’端。在一些实施方式中，5’UTR包括T7 RNA启动子。在一些实施方式中，T7 RNA启动子包括核苷酸序列UAAUACGACUCACUAUA(SEQ ID NO:46)。在一些实施方式中，T7 RNA启动子由SEQ ID NO:46组成。在一些实施方式中，mRNA的5’端是T7 RNA启动子。T7 RNA启动子常用于体外转录反应。在一些实施方式中，5’UTR包括人α珠蛋白mRNA5’UTR。在一些实施方式中，人α珠蛋白5’UTR包括核苷酸序列GAAUAAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:47)。在一些实施方式中，5’UTR包括序列UAAUACGACUCACUAUAAGGGAGACCCAAGCUGGCUAGCGUUUAAACUUAAGCUUGAAUAAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAAGGGAGACUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCACC(SEQ ID NO:7)。在一些实施方式中，5’UTR由SEQ IDNO:7组成。在一些实施方式中，5’UTR包括具有与SEQ ID NO:7至少85％同源性的序列。在一些实施方式中，序列保留核糖体结合位点。在一些实施方式中，序列在其3’端保留Kozak序列的5’端。

在一些实施方式中，mRNA包括3’UTR。在一些实施方式中，3’UTR增强mRNA的稳定性。在一些实施方式中，3’UTR衍生自线粒体rRAN 3’UTR序列。在一些实施方式中，3’UTR在用于LNP形成的温度下产生热力学稳定的二级结构。在一些实施方式中，温度约为37摄氏度。在一些实施方式中，温度在50与70摄氏度之间。在一些实施方式中，3’UTR包括序列GCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO:8)。在一些实施方式中，3’UTR由SEQ IDNO:8组成。在一些实施方式中，3’UTR包括具有与SEQ ID NO:8至少85％同源性的序列。在一些实施方式中，核酸分子包括位于编码区3’端的终止密码子。在一些实施方式中，编码HNF4A的区域在其3’端包括终止密码子。在一些实施方式中，终止密码子将编码区与3’UTR隔开。在一些实施方式中，mRNA是聚腺苷酸化的。在一些实施方式中，mRNA包括聚A尾。在一些实施方式中，聚A尾是3’至3’UTR。

在一些实施方式中，mRNA包括编码小鼠HNF4A的序列并且包括SEQ ID NO:9。在一些实施方式中，mRNA包括编码小鼠HNF4A的序列并且由SEQ ID NO:9组成。SEQ ID NO:9提供mRNA序列的DNA对应物。在一些实施方式中，mRNA包括编码小鼠HNF4A的序列并且包括SEQID NO:10。在一些实施方式中，mRNA包括编码小鼠HNF4A的序列并且由SEQ ID NO:10组成。在一些实施方式中，mRNA包括编码人HNF4A的序列并且包括SEQ ID NO:11。在一些实施方式中，mRNA包括编码人HNF4A的序列并且由SEQ ID NO:11组成。SEQ ID NO:11提供mRNA序列的DNA对应物。在一些实施方式中，mRNA包括编码人HNF4A的序列并且包括SEQ ID NO:12。在一些实施方式中，mRNA包括编码人HNF4A的序列并且由SEQ ID NO:12组成。

在一些实施方式中，核酸分子包括化学修饰的主链。在一些实施方式中，RNA包括化学修饰的主链。已知主链的化学修饰增强半衰期和稳定性。在一些实施方式中，化学修饰的主链包括：磷酸-核糖主链、磷酸-脱氧核糖主链、硫代磷酸-脱氧核糖主链、2’-O-甲基硫代磷酸主链、磷酰二胺吗啉代主链(phosphorodiamidate morpholino backbone)、肽核酸主链、2-甲氧基乙基硫代磷酸主链、交替锁定核酸主链(alternating locked nucleicacid backbone)、硫代磷酸主链、N3’-P5’氨基磷酸、2’-脱氧-2’-氟-β-d-阿拉伯核酸(2′-deoxy-2′-fluoro-β-d-arabino nucleic acid)、环己烯核酸主链核酸、三环DNA(tcDNA)核酸主链及其任意组合。

在一些实施方式中，核酸分子被包封在纳米颗粒中。在一些实施方式中，纳米颗粒是本发明的纳米颗粒。

另一方面，提供核酸分子，其编码HNF4A。

另一方面，提供纳米颗粒，其靶向对象的肝脏。

在一些实施方式中，当向对象全身地施用时，纳米颗粒靶向肝脏。在一些实施方式中，全身地是静脉内地。在一些实施方式中，靶向肝脏包括靶向肝细胞。在一些实施方式中，纳米颗粒靶向哺乳动物肝脏。在一些实施方式中，纳米颗粒靶向小鼠肝脏。在一些实施方式中，纳米颗粒靶向人肝脏。

在一些实施方式中，纳米颗粒包括用剂。在一些实施方式中，纳米颗粒包括核酸分子。在一些实施方式中，纳米颗粒包括mRNA。在一些实施方式中，包括是包封。在一些实施方式中，纳米颗粒包括水性核。在一些实施方式中，用剂/核酸分子/mRNA在水性核中。在一些实施方式中，在其中是溶解在其中。

如本文所用，“纳米颗粒”是指能够运输核酸分子的纳米级载剂。在一些实施方式中，纳米颗粒包括至多750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、175、150、140、135、130、125、120、115、110、105、100、90、80、75、70、60或50纳米(nm)的平均直径。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，纳米颗粒包括至多250nm的直径。在一些实施方式中，纳米颗粒包括至多140nm的直径。在一些实施方式中，纳米颗粒包括至多125nm的直径。在一些实施方式中，纳米颗粒包括至多100nm的直径。在一些实施方式中，纳米颗粒包括至多50nm的直径。在一些实施方式中，平均直径为至少20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300nm。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，平均直径为至少50nm。在一些实施方式中，平均直径为至少90nm。在一些实施方式中，平均直径为至少100nm。在一些实施方式中，平均直径介于50-700、50-650、50-600、50-550、50-500、50-450、50-400、50-350、50-300、50-250、50-200、50-150、50-140、50-130、50-120、50-110、50-100、90-700、90-650、90-600、90-550、90-500、90-450、90-400、90-350、90-300、90-250、90-200、90-150、90-140、90-130、90-120、90-110、90-100、100-700、100-650、100-600、100-550、100-500、100-450、100-400、100-350、100-300、100-250、100-200、100-150、100-140、100-130、100-120、100-110、150-700、150-650、150-600、150-550、150-500、150-450、150-400、150-350、150-300、150-250、150-200、200-700、200-650、200-600、200-550、200-500、200-450、200-400、200-350、200-300、200-250、250-700、250-650、250-600、250-550、250-500、250-450、250-400、250-350或250-300nm。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，平均直径在150与500nm之间。在一些实施方式中，平均直径在50与500nm之间。

在一些实施方式中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒(LNP)。如本文所用，短语“脂质纳米颗粒”是指包括一种或多种脂质(例如，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG修饰脂质)的转移媒剂。在一些实施方式中，LNP是脂质体。在一些实施方式中，LNP是胶束。在一些实施方式中，纳米颗粒是合成纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒是人造纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒不是天然存在的纳米颗粒。在一些实施方式中，LNP不是外泌体。在一些实施方式中，LNP不是天然分泌的囊泡。

优选地，脂质纳米颗粒被配制为将一种或多种用剂(即，核酸分子)递送至肝脏/肝细胞。合适的脂质的示例包括例如磷脂酰化合物(例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂)。还考虑到使用聚合物作为转移媒剂，不管是单用还是与其它转移媒剂组合。合适的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、树枝状大分子和聚乙烯亚胺。在一个实施方式中，转移媒剂的选择基于其促进核酸转染至靶细胞的能力。

本发明考虑到使用脂质纳米颗粒作为转移媒剂，其包括阳离子脂质以包封和/或增强核酸向靶细胞中的递送。如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在选定pH(如生理pH)下携带净正电荷的多种脂质种类(species)中的任意种。可通过包括采用一种或多种阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG修饰脂质的不同比例的多组分脂质混合物来制备脂质纳米颗粒。文献中描述了几种阳离子脂质，其中很多都是可商购的。

用于本发明的组合物和方法的合适的阳离子脂质包括通过引用并入本文的国际专利公开WO 2010/053572中描述的那些。在某些实施方式中，本发明的组合物和方法采用包括可离子化阳离子脂质的脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，使用阳离子脂质N-(1-(2,3-二油烯基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”(美国专利号4,897,355)。DOTMA可单独配制，也可与中性脂质即二油酰磷脂酰乙醇胺或“DOPE”或其它阳离子或非阳离子脂质组合成脂质体转移媒剂或脂质纳米颗粒，并且这种脂质体可用于增强将核酸递送至靶细胞中。其它合适的阳离子脂质包括，例如，5-羧基鲸蜡基甘氨酸双十八烷基酰胺(5-carboxyspermylglycinedioctadecylamide)或“DOGS”、2,3-二油烯基氧-N-[2-(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵(2,3-dioleyloxy-N-[2(spermine-carboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-pr-opanaminium)或“DOSPA”(美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)、1,2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”、1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”。考虑到的阳离子脂质还包括1,2-二硬脂酰氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”、1,2-二油烯基氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、1,2-二亚油烯基氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethyl-3-aminopropane)或“DLinDMA”、1,2-二亚油烯基氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”、N-(1,2-二肉豆蔻基氧丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧丁烷-4-氧)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧)丙烷(3-dimethylamino-2-(cholest-5-en-3-beta-oxybutan-4-oxy)-1-(cis,cis-9,12-oc-tadecadienoxy)propane)或“CLinDMA”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧)-3'-氧杂戊氧)-3-二甲基l-l-(顺,顺-9',l-2'-十八碳二烯氧)丙烷(2-[5'-(cholest-5-en-3-beta-oxy)-3'-oxapentoxy)-3-dimethy1-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxy)propane)或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧苄胺或“DMOBA”、1,2-N,N′-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亚油酰氧-N,N-二甲基丙胺或“DLinDAP”、1,2-N,N'-二亚油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”、1,2-二亚油酰氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-DMA”、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-XTC2-DMA”和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二-甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(参见WO 2010/042877；Semple et al.,NatureBiotech.28:172-176(2010))，或其混合物(Heyes,J.,et al.,J Controlled Release107:276-287(2005)；Morrissey,D V.,et al.,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公开WO2005/121348A1)。

本发明还考虑到使用胆固醇基阳离子脂质。此类胆固醇基阳离子脂质可以单独使用，也可与其它阳离子或非阳离子脂质组合使用。合适的胆固醇基阳离子脂质包括，例如，DC-Chol(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇(N,N-dimethyl-N-ethylcarboxamidocholesterol))、1,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao,etal.Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf et al.BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。在一些实施方式中，LNP包括胆固醇。

本发明还考虑到单独或优选与其它脂质(包括脂质纳米颗粒)一起组合的聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和诸如衍生神经酰胺(PEG-CER)的衍生脂质(包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺))的应用。这种组分的添加可防止复合物聚集并且还可提供增加循环寿命和增加向靶细胞递送脂质-核酸组合物的手段(Klibanov et al.(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或者其可被选择以在体内快速地交换出制剂(参见美国专利号5,885,613)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG修饰磷脂和衍生脂质可占脂质体转移媒剂中存在的总脂质的约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％的摩尔比。在一些实施方式中，LNP包括PEG化脂质。在一些实施方式中，PEG化脂质是PEG化肉豆蔻酰甘油二酯(DMG-PEG)。

本发明还考虑到使用非阳离子脂质。如本文所用，短语“非阳离子脂质”指代任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”指代在选定pH(如生理pH)下携带净负电荷的多种脂质种类中的任意种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。这种非阳离子脂质可单独使用，但优选与其它赋形剂(例如，阳离子脂质)组合使用。当与阳离子脂质组合使用时，非阳离子脂质可占转移媒剂中存在的总脂质的5％至约90％，或优选约10％至约70％的摩尔比。

在一些实施方式中，非阳离子脂质是可离子化脂质。在一些实施方式中，可离子化脂质是合成氨基脂质。可离子化脂质的示例包括但不限于ALC-0315、SM-102、脂质5、DLin-DMA、D-Lin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、YSK05、AA3-DLin、SSPalmM、SSPamO-Phe、脂质A9、L319、CL4H6、DODMA、CL1、BP脂质308、ATX-100、80-O16B、93-O17S、(3-O17O和NT1等。在一些实施方式中，LNP包括SM-102。

在一些实施方式中，通过组合多种脂质和/或聚合物组分制备脂质纳米颗粒。构成脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG修饰脂质的选择以及此类脂质彼此之间的相对摩尔比基于选择的脂质(一种或多种)的特性及其将核酸分子(即，mRNA)靶向肝脏的能力。另外的考虑包括，例如，烷基链的饱和度以及选择的脂质(一种或多种)的大小、电荷、pH、pKa、融合性(fusogenicity)和毒性。

用于本发明组合物的LNP可通过目前在本领域内已知的各种技术制备。可通过常规技术制备多层囊泡(MLV)，例如，通过将选择的脂质沉积在合适的容器或器皿的壁的内侧上——通过将脂质溶解在适当的溶剂中，然后将溶剂蒸发以在器皿内侧上留下薄膜，或通过喷雾干燥。然后可利用涡旋运动(其导致MLV的形成)将水相添加到器皿中。然后可通过均质、超声处理或挤出多层囊泡形成单层囊泡(ULV)。另外，还可通过洗涤剂去除技术形成单层囊泡。在一些实施方式中，通过乙醇注射生产LNP。

在一些实施方式中，LNP包括SM-102和胆固醇。在一些实施方式中，LNP包括SM-102和PEG化脂质。在一些实施方式中，PEG化脂质是DMG-PEG。在一些实施方式中，LNP包括SM-102和阳离子脂质。在一些实施方式中，阳离子脂质DOPE。在一些实施方式中，LNP包括SM-102、胆固醇和DOPE。在一些实施方式中，LNP包括SM-102、胆固醇和DMG-PEG。在一些实施方式中，LNP包括SM-102、DOPE和DMG-PEG。在一些实施方式中，LNP包括SM-102、胆固醇、DOPE和DMG-PEG。在一些实施方式中，PEG是PEG200。在一些实施方式中，PEG是低分子量PEG。

在一些实施方式中，LNP包括40-60mol％的SM-102。在一些实施方式中，LNP包括45-55mol％的SM-102。在一些实施方式中，LNP包括约50mol％的SM-102。在一些实施方式中，LNP包括30-50mol％的胆固醇。在一些实施方式中，LNP包括35-45mol％的胆固醇。在一些实施方式中，LNP包括33.5-43.5mol％的胆固醇。在一些实施方式中，LNP包括约40mol％的胆固醇。在一些实施方式中，LNP包括约38.5mol％的胆固醇。在一些实施方式中，LNP包括5-15mol％的DOPE。在一些实施方式中，LNP包括7.5-12.5mol％的DOPE。在一些实施方式中，LNP包括约10％的DOPE。在一些实施方式中，LNP包括0.5-2.5mol％的DMG-PEG。在一些实施方式中，LNP包括1-2mol％的DMG-PEG。在一些实施方式中，LNP包括约1.5mol％的DMG-PEG。在一些实施方式中，LNP包括约50mol％的SM-102、38.5mol％的胆固醇、10mol％的DOPE和1.5mol％的DMG-PEG200。

如本文和本领域所用，摩尔百分比(“％mol”)指代基于构成纳米颗粒的组分或化合物的总摩尔数的特定组分或化合物的百分比。例如，如果纳米颗粒含有3摩尔的化合物A和1摩尔的化合物B，则化合物A占混合物的75mol％，化合物B占25mol％。

另一方面，提供组合物，其包括本发明的纳米颗粒。

在一些实施方式中，组合物是治疗组合物。在一些实施方式中，组合物是药物组合物。在一些实施方式中，组合物还包括药学上可接受的载剂、赋形剂或佐剂。

如本文所用，术语“载剂”、“赋形剂”或“佐剂”是指药物组合物的不是活性剂的任何组分。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指无毒的惰性固体、半固体、液体填料、稀释剂、包封材料、任意类型的配制辅料(auxiliary)，或者只是无菌水性介质，如盐水。可充当药学上可接受的载剂的材料的一些示例是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖，淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉，纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽、明胶、滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯、琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水、林格氏溶液；乙醇溶液和磷酸盐缓冲溶液，以及药物制剂中使用的其它无毒相容性物质。在本文中可充当载剂的物质的一些非限制性示例包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、粉末状黄芪胶、麦芽、明胶、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硫酸钙、植物油、多元醇类、海藻酸、无热原水、等渗盐水、磷酸盐缓冲溶液、可可脂(栓剂基质)、乳化剂，以及用于其它药物制剂中的其它无毒药学上相容性物质。也可存在润湿剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠，以及着色剂、调味剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。任何无毒、惰性且有效的载剂均可用于配制本文考虑的组合物。在这方面，适合的药学上可接受的载剂、赋形剂和稀释剂是本领域技术人员公知的，诸如在The Merck Index,第十三版,Budavari et al.,Eds.,Merck&Co.,Inc.,Rahway,N.J.(2001)；the CTFA(Cosmetic,Toiletry,and FragranceAssociation)International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook,第十版(2004)；and the“Inactive Ingredient Guide,”U.S.Food and Drug Administration(FDA)Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Office of Management(其全部内容特此通过引用以其整体并入)中描述的那些。用于本组合物中的药学上可接受的赋形剂、载剂和稀释剂的示例包括蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、Hank’s溶液和DMSO。这些另外的非活性组分以及有效的制剂和施用程序是本领域公知的，并在标准教科书中进行了描述，如Goodman and Gillman’s:The Pharmacological Bases ofTherapeutics,8th Ed.,Gilman et al.Eds.Pergamon Press(1990)；Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)；andRemington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,(2005)(其每一个均通过引用以其整体并入本文)。本文描述的组合物也可被包含在人工创建的结构如脂质体、ISCOMS、缓慢释放颗粒和其它增加血清中肽或多肽半衰期的媒剂中。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层状层等。与本文描述的肽一起使用的脂质体由标准的形成囊泡的脂质形成，这种脂质通常包括中性和带负电的磷脂和固醇，如胆固醇。脂质的选择通常取决于诸如血液中脂质体大小和稳定性的考虑。例如，Coligan,J.E.et al,Current Protocols in ProteinScience,1999,John Wiley&Sons,Inc.,New York综述了可用于制备脂质体的各种方法，以及还参见美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。

载剂可总共占本文提出的药物组合物重量的约0.1％至约99.99999％。

在一些实施方式中，组合物被配制用于全身施用。在一些实施方式中，组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施方式中，组合物被配制用于向肝脏施用。在一些实施方式中，组合物被配制用于肝施用。在一些实施方式中，组合物被配制向对象施用。在一些实施方式中，组合物被配制向人施用。

如本文所用，术语“施用(administering)”、“施用(administration)”和类似术语是指在合理的医疗实践中以提供治疗效果的方式将含有活性剂的组合物递送至对象的任何方法。本主题的一个方面提供将治疗有效量的本主题组合物静脉内施用于有需要的患者。其它合适的施用途径可包括肠胃外、皮下、肝内、肌内或腹膜内。

施用剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、同时治疗的类型(如有)、治疗频率和所需效果的性质。

另一方面，提供治疗有需要的对象的癌症的方法，方法包括向对象施用能够增加对象中HNF4A的表达的用剂，从而治疗对象的癌症。

另一方面，提供治疗有需要的对象的恶病质的方法，方法包括向对象施用包括至少一种选自下列的用剂的组合物：抗IL6阻断抗体、ERK抑制剂、STAT3抑制剂和能够增加对象中HNF4A的表达的用剂，从而治疗对象的恶病质。

另一方面，提供预防有需要的对象的恶病质的方法，方法包括向对象施用包括至少一种选自下列的用剂的组合物：抗IL6阻断抗体、ERK抑制剂、STAT3抑制剂和能够增加对象中HNF4A的表达的用剂，从而预防对象中的恶病质。

在一些实施方式中，用剂增加HNF4A在对象的肝脏中的表达。在一些实施方式中，用剂增加HNF4A在对象的肝细胞中的表达。在一些实施方式中，表达是蛋白质表达。在一些实施方式中，增加表达包括将HNF4A递送至肝脏或肝细胞。在一些实施方式中，用剂是本发明的纳米颗粒。

在一些实施方式中，组合物是药物组合物。在一些实施方式中，组合物是本发明的组合物。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的纳米颗粒。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的LNP。在一些实施方式中，方法包括施用本发明的组合物。

另一方面，提供用于治疗癌症的本发明的纳米颗粒。另一方面，提供用于生产治疗癌症的药物的本发明的纳米颗粒。

另一方面，提供用于治疗恶病质的本发明的纳米颗粒。另一方面，提供用于生产治疗恶病质的药物的本发明的纳米颗粒。

在一些实施方式中，癌症是非肝癌症。在一些实施方式中，恶病质是癌症相关恶病质。在一些实施方式中，对象患有癌症。在一些实施方式中，癌症是早期癌症。在一些实施方式中，对象患有癌前病变。在一些实施方式中，对象处于发展癌症的风险中。在一些实施方式中，对象处于发展恶病质的风险中。在一些实施方式中，通过本发明的方法对象已经确定患有癌症。在一些实施方式中，通过本发明的方法对象已经诊断有癌症。在一些实施方式中，通过本发明的方法确定对象有恶病质。在一些实施方式中，通过本发明的方法确定对象处于发展恶病质的风险中。在一些实施方式中，方法还包括确定对象中尿素循环功能降低的存在。在一些实施方式中，在确认尿素循环功能降低的对象中进行治疗。在一些实施方式中，方法还包括确定对象中肝脏功能降低的存在。在一些实施方式中，在确认肝脏功能降低的对象中进行治疗。在一些实施方式中，通过本发明的方法确定功能降低。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病、障碍或状况涵盖减轻其至少一种症状、降低其严重性或抑制其进展。治疗不一定意味着疾病、障碍或状况被完全治愈。为了有效治疗，本文有用的组合物或方法只需降低疾病、障碍或状况的严重性、降低与其相关的症状的严重性或提供对患者或对象的生活质量的改善。

在一些实施方式中，治疗包括减小肿瘤的大小。在一些实施方式中，治疗包括减少肿瘤的生长。在一些实施方式中，减少是停止。在一些实施方式中，治疗包括减少恶病质的至少一种症状。在一些实施方式中，治疗包括减少恶病质的肌肉损失。在一些实施方式中，治疗包括减少恶病质的脂肪损失。在一些实施方式中，治疗包括减少恶病质的游离流体。在一些实施方式中，治疗包括增加脂肪、增加肌肉和减少游离流体中的至少一项。在一些实施方式中，治疗包括延长生存期。在一些实施方式中，治疗包括延长发展恶病质前的时间。在一些实施方式中，治疗包括延长生存期超过1年。在一些实施方式中，治疗包括延长生存期超过2年。在一些实施方式中，治疗包括延长生存期超过5年。在一些实施方式中，治疗包括延长生存期超过10年。

如本文所用，术语“约”当与值组合时，是指参考值的正负10％。例如，约1000纳米(nm)的长度是指1000nm+-100nm的长度。

应注意，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“多核苷酸”的提及包括多个这样的多核苷酸，而对“多肽”的提及包括对本领域技术人员已知的一个或多个多肽及其等同物的提及，以此类推。还应注意，权利要求可撰写为排除任意任选的要素。由此，此声明旨在充当诸如“仅仅”、“只有”等排他性术语与权利要求要素的限定结合使用，或“负”限制的使用的先行基础。

在那些使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定(convention)的情况下，这样的结构通常意图是在本领域技术人员会理解该约定的意义上(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、具有A和B一起、具有A和C一起、具有B和C一起和/或具有A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个可选术语的任何反意连接词和/或短语都应理解为考虑了包括这些术语中的一个、这些术语中的任一个或这两个术语的可能。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能。

应当理解，为清楚起见，在单独的实施方式的环境下描述的本发明的某些特征也可在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的环境下描述的本发明的各种特征也可单独地或以任意适合的子组合来提供。与本发明有关的实施方式的所有组合都被本发明具体地涵盖并在本文中公开，就像每一个组合都被单独地并且明确地公开一样。另外，各种实施方式及其要素的所有子组合也被本发明具体地涵盖并在本文中被公开，就像每一个这样的子组合在本文中被单独地并且明确地公开一样。

如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另有明确指出。术语“一”(或“一个/种”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”可互换使用。

此外，“和/或”应被视为具体公开两个指定特征或组分中的每一个——在另一个存在或是不存在的情况下。因此，在短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”意在包括A和B、A或B、A(单独)和B(单独)。同样，在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意在包括A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

无论何时以用语“包括”描述实施方式，就“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的类似实施方式都被包括在内。

在考查以下实施例后，本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见，而这些实施例并非旨在进行限制。另外，如上文所述和如以下权利要求部分中所要求保护的，本发明的各种实施方式和方面中的每一个在以下实施例中均得到实验支持。

如上文所述和如以下权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中均得到实验支持。

实施例

总体上，本文所用的命名法和本发明中所用的实验室程序包括分子、生化、微生物学和重组DNA技术。文献中对这样的技术进行了详尽的说明。参见，例如，"MolecularCloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"第I-III卷Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"CurrentProtocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:ALaboratory Manual Series",第1-4卷,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中列出的方法；"Cell Biology:A LaboratoryHandbook",第I-III卷Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-AManual ofBasic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；"Current Protocolsin Immunology"第I-III卷Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic andClinical Immunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell andShiigi(eds),"Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些均通过引用并入。贯穿本文件提供了其它一般参考文献。

材料与方法

体内动物研究：动物实验是由Weizmann Institute Animal Care and UseCommittee遵照U.S.National Institute of Health、European Commission和Israeliguidelines批准的。为了产生同基因小鼠癌症模型，从Envigo购买8-12周龄C57BL/6或BALB/c雄性和雌性小鼠并将其随机分配到实验组。对于BC模型，对8周龄BALB/c雌性小鼠的乳脂垫(mammary fat pad)注射1x10⁶个4T1 BC细胞(在PBS中)。对于PC模型，对12周龄C57BL/6雄性小鼠和CCR2-RFP敲除小鼠的胰尾注射0.3-0.4x10⁶个KPC PC细胞(在DMEM50％基质胶(matrigel)中)。处死后，将肝脏、脾脏、骨髓和肺从小鼠中取出，并采集血液，通过定量PCR、蛋白质印迹和免疫组织化学进行进一步分析。

细胞系：源自小鼠乳腺癌细胞的4T1-荧光素酶细胞由Department of BiologicalRegulation,Weizmann Institute of Science的Yossi Yarden教授提供。源自小鼠实体PDAC的KrasG12D/Trp53R172H/Pdx-1-Cre(KPC)-荧光素酶细胞由Department of Plantand Environmental Sciences,Weizmann Institute of Science的Avigdor Scherz教授提供。使用支原体EZ-PCR测试试剂盒(#20-700-20,Biological Industries,Kibbutz BeitHa'emek)对所有细胞进行支原体常规测试。

蛋白质印迹：在RIPA(Sigma-Aldrich)和1％蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)、1％磷酸酶抑制剂混合物(P5726,Sigma-Aldrich)中研磨并裂解组织。离心后，收集上清液，并通过Bradford测定或BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher Scientific,cat#23225)评估蛋白质含量。将还原条件下各个样品中的20-50μg装载入每条泳道中，并在10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳进行分离。电泳后，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(Tamar,以色列)。通过在室温下与含5％脱脂乳的TBST(10mM Tris–HCl(pH 8.0),150mM NaCl,0.1％吐温20)温育1h阻断非特异性结合。随后用抗体(WB抗体列表)对膜进行温育。

使用过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)和增强化学发光蛋白质印迹检测试剂(EZ-Gel,Biological Industries)检测抗体。通过Gel Doc XR+(BioRad)对凝胶定量并通过ImageLab 5.1软件(BioRad)分析。通过将比条带强度除以获自负载对照的值来计算每个条带的相对强度。

肝脏灌注和肝细胞解离：对麻醉后的小鼠的肝脏灌注，并进行特定调整。用27G注射器插入腔静脉，固定在灌注管路上。通过腔静脉灌注10ml预先温热至42℃的PPML缓冲液，之后灌注25ml预先温热至42℃的含Liberase(Roche,cat#05401127001)的PM缓冲液。在灌注开始时，立即切断门静脉。灌注25ml PM缓冲液和Liberase溶液后，将肝脏收获到含10ml预先温热的PM缓冲液的培养皿中，并用镊子切碎。收集解离的肝脏细胞并通过倾斜的100um细胞滤器过滤。在4℃下使细胞于30g下旋转3min得到富集肝细胞的沉淀。将沉淀重悬于25ul冷PM缓冲液中。为了富集活肝细胞，向细胞中加入21.6ml与+2.4ml DPBSX10+CaCl2+MgCl2混合的冷Percoll(G.E.Healthcare#17-0891-01)。在4℃下以600rpm离心细胞10分钟。抽吸含死细胞的上清液，并将细胞重悬于25ml冷Williams E+Glutamx-TM-1(Gibco,cat#32551,1％青链霉素,10FBS,1％ L-谷氨酰胺)中。在4℃下以600rpm将细胞离心5分钟。抽吸上清液并将细胞重悬于3ml冷Williams E+Glutamx-TM-1中。

原代肝细胞培养：灌注后，将1x10⁶个分离的肝细胞接种于6孔板中的3mlWilliams E+Glutamx-TM-1中。四小时后，抽吸培养基，并用PBS洗涤细胞并与2ml WilliamsE+Glutamx-TM-1温育过夜。用10μM的HJC0152 STAT3抑制剂(Selleckchem#S8561)处理细胞30分钟，然后用10ng/ml重组小鼠IL-6(R&D#406-ML-005)处理细胞48h。

组织病理学和免疫组织化学染色分析：注射4T1 BC细胞4、14和21天后，以及注射KPC PC细胞7、14和21天后，将PFA固定的肝脏和肺组织包埋在石蜡块中。将块切成4μm，并将组织切片置于37℃下过夜。根据标准方案进行H&E染色，包括下列步骤：脱蜡(de-paraffinization)、再水合、苏木精和曙红染色，之后脱水。用二甲苯清洗载玻片并固定。

免疫荧光：注射4T1 BC细胞21天后，收集肝脏，固定于4％多聚甲醛中，包埋于石蜡中并制成4μm切片。对载玻片脱蜡并使用柠檬酸PH＝6完成抗原收回。使用20％正常马血清(Normal Horse Serum,NHS)、PBS中的0.1％ Triton阻断非特异性结合。将大鼠抗CD45(BioRad#MCA1031G)和小鼠抗pERK 1:100(Sigma#M8159)稀释于2％ NHS和0.1％Triton中并温育过夜。然后将载玻片与生物素化驴抗大鼠1:100(Jackson Immunoresearch#712-065-153)和HRP缀合的山羊抗小鼠1:100(Perkin Elmer#NEF822001EA)稀释的2％NHS温育1.5hr。然后将载玻片与1:500OPAL 690(Akoya Biosciences#FP1497001KT)和链霉亲和素Cy3(016-160-084-Jackson immunoresearch)温育。使用配备电动载物台和Leica DFC365FX照相机的Leica Mi8显微镜对载玻片成像。平铺单张放大倍数x20的图像以接收肿瘤切片的完整扫描。使用ImageJ对用pERK染色的肝脏切片进行定量。

RNA处理和定量PCR：使用QIAzol裂解试剂(根据手册)或通过Direct-zol^TMMiniPrep Plus试剂盒(Zymo Research ZR-R2070)从肝脏组织提取RNA。对于肝细胞RNA测序，从解离的肝细胞中提取RNA。如前所述肝脏灌注后，将肝细胞重悬于QIAzol中并冷冻于-80℃下。使用QIAzol裂解试剂提取RNA。使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGENe#74104)从培养的原代肝细胞中提取RNA。为了评估mtDNA拷贝数，使用DNA纯化试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kits Qiagen#69504)分离总DNA。使用qScript cDNA合成试剂盒(Quanta#95749)，由1μg RNA合成cDNA。使用Syber Green FAST mix Perfect CT(Quantabio#95073)和所需引物(qPCR引物列表-表1)进行cDNA检测。

灌注以供CyTOF和FACS测定：对于血液采集，麻醉后就对小鼠的左心室注射10μl肝素，并使用涂有肝素的1ml注射器的27G针头通过对右心室心脏穿刺抽取约700μl血液，或通过使用肝素化微量血细胞比容毛细管(micro hematocrit capillary tubes)经由眶后取血程序抽取血液，用于免疫细胞分离。对小鼠心内灌注冰冷的PBS。这些测定在4T1 BC细胞和对照PBS注射后14天和KPC PC细胞和对照PBS注射后21天进行。

血液免疫细胞分离：灌注后，抽出血液并移入15ml管中。加入5ml红细胞裂解缓冲液(ThermoFisher,ACK裂解缓冲液,A104920)并在R.T.下温育5-10min。然后在4℃下以300g将血液离心5分钟。抽吸上清液，并将沉淀重悬于剩余体积中。用5ml冰冷的FACS缓冲液(不含Ca/Mg2的PBS+2mM EDTA+0.5％BSA或5％ FCS)洗涤细胞并在4℃下以300g离心5分钟。抽吸上清液，并将沉淀重悬于剩余体积中。

肝脏免疫细胞分离：灌注后，取出肝脏并转移至培养皿中。然后将肝脏切碎成约1mm块。将3ml DMEM-F12(ThermoFisher,31330038)加入冰上15ml管中。加入3ml的胶原酶(Worthington,LS004188)混合物(1mg/ml胶原酶IV+0.2mg/ml DNAse I+DMEM/gF12中的20％ FBS)并在37℃下将组织匀浆温育60分钟——以250rpm振荡，每15分钟短暂涡旋一次。用40um滤器将细胞悬液过滤到50ml管中并用20ml冰冷的FACS缓冲液洗涤。然后在4℃下以600g离心细胞5分钟。抽吸上清液并将沉淀重悬于5ml红细胞裂解缓冲液中。温育结束时，加入15ml冰冷的FACS缓冲液，并在4℃下以600g对样品离心5分钟。根据Percoll梯度进行白细胞富集。制备等渗Percoll(9份Percoll，1份无菌10x PBS)、80％Percoll(8份等渗Percoll，2份1x PBS)和40％ Percoll(5份80％ Percoll，5份DMEM-F12)溶液。将沉淀重悬于8ml的40％ Percoll溶液中并小心移入15ml含5ml 80％ Percoll的溶液中。在4℃下以1500g将细胞离心30分钟(加速5/制动0)。收集含免疫细胞的中间层并移入一个新的15ml管中，管内盛有5ml冰冷的PBS缓冲液。用冰冷的PBS将体积匀至10ml并在4℃下以600g离心细胞5分钟。抽吸上清液，并将沉淀重悬于剩余体积中。

脾脏免疫细胞分离：灌注后，用70um滤器压挤脾脏并用10ml FACS缓冲液过滤。在4℃下以400g离心细胞5分钟。抽吸上清液，并将细胞重悬于1ml红细胞裂解缓冲液中。在R.T.下温育5分钟后，加入10ml冰冷的PBS并在4℃下以300g将细胞离心5分钟。抽吸上清液并将沉淀重悬于剩余体积中。

骨髓免疫细胞分离：灌注后，将股骨脱位并移入含冰冷的PBS的培养皿中。去除髁状突、髌骨和骨骺以暴露干骺端。在70um滤器上用2ml培养基冲洗骨髓(B.M.)。用注射器柱塞打碎B.M.并用10ml的RPMI+10％ FBS+2mM EDTA洗涤过滤器。在4℃下以400g离心细胞5分钟。抽吸上清液并将沉淀重悬于1ml红细胞裂解缓冲液中，置于R.T.中5分钟。加入10ml的RPMI+10％ FBS+2mM EDTA并在R.T.下以400g离心5min。

流式细胞术：根据制造商的说明，用冰冷的PBS洗涤免疫细胞并用LIVE/DEAD^TMFixable Aqua Dead(Thermo Fisher)染色。Fc阻断(Biolegend,BLG-101320)后，对细胞进行表面抗原染色。在CytoFLEX(Beckman Coulter)上获取流式细胞术数据并使用FlowJo软件进行分析。在每个实验中，使用相关的阴性、单染色和荧光减一对照来鉴定感兴趣的群体。

质谱流式细胞术：每个肝脏样品3x 10⁶个细胞，以及所有血液来源的免疫细胞经染色以供质谱流式细胞术分析。用钯金属同位素对样品进行条形码编码(barcoding)之前，使用顺铂成活力染色。简而言之，将单个样品与人TruStain FcX^TM(BioLegend)一起温育30min，之后在室温(R.T)下用一组抗体(CyTOF抗体列表-补充表S6)进行染色，用5ml的细胞染色缓冲液洗涤，用Fix I缓冲液固定并用Barcode Perm缓冲液透化。然后将样品与其各自的条形码在R.T.下温育45min，之后用Barcode Perm缓冲液将其洗涤并合并成复合样品。洗涤后，将混合样品与4％甲醛在4℃下温育过夜。在Helios^TMII系统中获取之前，用铱将样品染色以检测细胞并用细胞染色缓冲液和质谱流式细胞术级水洗涤。采用基于Cytobank云的平台、FlowJo软件(Tree Star,Inc)和R(R CoreTeam,2017)分析多维数据集。

基于算法的高维分析：用6.7版Fluidigm CyTOF软件对质谱流式细胞术数据归一化和解码(debarcoded)。使用Cytobank手动门控单个样品以排除归一化珠、细胞碎片和死细胞。下游分析仅使用CD45+细胞。对CyTOF数据的所有分析都是在标志物表达反双曲正弦(辅因子＝5)转化后进行的。使用CyTOF工作流包进行聚类、数据可视化和降维(UMAP)。所有图均使用ggplot2或GraphPad Prism(8.0.1版)绘制。

L-谷氨酰胺-15N2输注：在正交各向异性肿瘤接种后x周进行同位素输注实验。小鼠禁食4小时，之后输注L-谷氨酰胺-15N2(Sigma)5小时。在盐水中制备含每kg体重1.725克L-谷氨酰胺-15N2的输注溶液。在加热垫上将小鼠麻醉，并将与输注溶液相连的导管插入尾侧静脉。最初向每只小鼠输注150μl/min的推注量(bolus)1min，之后连续输注2.5μl/min达5小时。在整个输注过程中，小鼠在单独的输注笼中保持清醒。输注结束时，将小鼠麻醉并将血液采集到肝素管中。收获器官并在液氮中速冻。

气相色谱-质谱法(GC-MS)：通过在4℃下以1000rcf离心15分钟从血液样品中采集血浆。将20μl血浆重悬于冰冷的MeOH/H2O混合物(与Ribitol以8:1混合)中，在冰上孵育20分钟并以15,000rpm离心10分钟。将上清液真空干燥过夜，并将干燥后的样品与20μl甲氧胺盐酸盐溶液(20mg ml-1，溶于吡啶)在37℃下温育90min，之后与40ul含1％叔丁基二甲基氯硅烷的N-叔丁基二甲基硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(Sigma)在60℃下温育60分钟。

将约5-25mg的组织样品真空干燥，并在冷冻研磨仪(cryomill)(Retscht)上使用2个3.2mm不锈钢球制粉。用甲醇和核糖醇作为内标将粉末状组织重悬并超声处理20分钟。加入1体积水和0.5体积氯仿后提取极性代谢物。将混合物涡旋并在4℃下以15,000RPM离心15分钟。将样品的上清液干燥过夜，之后在37℃下用40ul甲氧胺盐酸盐溶液(20mg ml-1，溶于吡啶)衍生化(dervitization)90min同时振荡，之后在37℃下与70ml N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(Sigma)再温育30min。

以无分流(splitless)或1:25分流(split)模式注入1ul样品，所用入口温度为270℃，使GC烘箱在100℃下保持3min，然后以3℃min-1的梯度升温至300℃，之后在315℃下运行5min。MS系统在70eV电子碰撞电离下运行并扫描100–650amu的质量范围。用MassHunter软件(Agilent Technologies)分析所得的色谱图。使用IsoCor软件对代谢物的同位素体分布进行天然存在的同位素校正。

氨基酸分析仪：将冷冻肝脏样品冻干并磨成粉，用50％甲醇提取，在冰冷的水中超声处理10分钟后在子弹搅拌机(bullet blunder)中匀浆。将样品以15,000×g离心15min并再次冻干，如GCMS部分所述。将样品重悬于锂负载缓冲液(Biochrom)中并通过添加(v/v)冷的5％5-磺基水杨酸(SSA)溶液——补充有500μmol/L的正亮氨酸作为内标——使蛋白质沉淀。以15,000×g离心15min后，将混合物在4℃下温育30min。通过0.22μm大小的过滤器过滤上清液，随后注射到具有锂加速阳离子交换柱(200X 4.6)的Biochrom 30系列氨基酸分析仪(Biochrom Ltd.,Cambridge Science Park,英格兰)上。对已知浓度的氨基酸的混合物(Calibration standards,Biochrom)补充谷氨酰胺并用作标准品。用茚三酮试剂对氨基酸柱后衍生化并在440nm(脯氨酸和羟脯氨酸)或570nm(所有其它氨基酸)下进行吸光度检测。

尿液和血浆中极性代谢物的提取：为了从尿液(20～100uL)样品中提取极性代谢物，在含有生物样品的Eppendorf管中分别加入1mL甲醇(以标记的氨基酸为内标)。然后，将所得混合物涡流并超声处理15min，再次涡流，并以14000rpm离心10min。将液相转移到新管中并冻干。然后使用150uL DDW-甲醇(1:1)将沉淀溶解，离心两次去除可能的沉淀物，并注入LC-MS系统。

LC-MS极性代谢物分析：简而言之，使用Acquity I类UPLC系统结合以负电离模式运行的质谱仪(Thermo Exactive Plus Orbitrap)进行分析。使用具有SeQuant保护柱(20mm×2.1mm)的SeQuant Zic-pHilic(150mm×2.1mm)(Merck)进行L.C.分离。流动相A：乙腈以及流动相B：20mM碳酸铵+0.1％氢氧化氨水溶液。流速保持在200μl min-1且梯度如下：0-2min 75％ B，17min 12.5％ B，17.1min 25％ B，19min 25％ B，19.1min 75％ B，19min75％ B。

极性代谢物数据分析：使用TraceFinder Thermo Fisher软件进行数据处理。通过保留时间和碎片鉴定所检测的化合物并使用内置(in-house)质谱库进行验证。尿液代谢物按肌酐峰面积归一化。

细胞因子检测：根据制造商说明，通过ProcartaPlex免疫测定(ThermoFisherProcartaPlex^TMPanel)或IL-6ELISA试剂盒(ThermoFisher 88-7064-22)测量细胞因子水平。

CCL2和氨水平：根据制造商说明，分别通过CCL2 ELISA试剂盒(R&D系统#MJE00B)和氨测定试剂盒(Abcam ab83360)测量CCL2和氨水平。

小鼠脾脏T细胞的活化：处死10周龄WT雌性Balb/c小鼠并将脾收获到冰上的冷PBS中。用注射器柱塞通过70uM滤器使脾脏匀浆并用PBS洗涤。以1200rpm离心5min后，根据制造商的说明，用RBC裂解缓冲液处理沉淀。以2x10⁶个细胞/ml将细胞重悬于补充有6,000IU/mLIL-2(Chiron,rhIL2)的脾细胞培养基(补充有50Mβ-巯基乙醇、10％丙酮酸钠和非必需氨基酸的完全RPMI培养基)中并接种于预包被CD3(BLG#100302)的24孔板中。72h后，收集细胞，以1200rpm离心5min，用脾细胞培养基X2洗涤，并使用CytoFLEX(Beckman Coulter)FACS分析仪分析。

癌细胞的增殖：将20x10⁴个4T1细胞接种于100ul完全RPMI培养基中。第二天，用PBS洗涤细胞并用不含谷氨酰胺的DMEM培养基(Biological Industries#01-057-1A)——补充有氨(0.75mM)、天冬氨酸(0.25mM)、富马酸(0.35mM)或谷氨酰胺(0.25mM)——更换培养基。代谢物补充后24、48和72hr，根据制造商的说明使用增殖测定(XTT细胞增殖试剂盒Biological Industries#20-300-1000)。

呼吸链复合物活性的测量：在37℃下通过标准分光光度法测量呼吸链复合物的酶活性。简而言之，复合物I是作为鱼藤酮敏感NADH-CoQ还原酶在辅酶Q1的存在下监测340nm下NADH的氧化来测量的。复合物II是作为琥珀酸脱氢酶(SDH)基于600nm下琥珀酸介导的对二氯靛酚的吩嗪硫酸甲酯还原来测量的。复合物II+III是作为琥珀酸细胞色素c还原酶在550nm下对氧化后的细胞色素c还原后来测量的。复合物IV(细胞色素c氧化酶)是通过在550nm下跟踪对还原后的细胞色素c氧化来测量的。柠檬酸合成酶(C.S.)是一种普遍存在的线粒体基质酶，在乙酰辅酶A和草酰乙酸的存在下、通过在412nm下监测与5′,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)偶联的辅酶ASH的释放进行测量。蛋白质浓度通过Lowry法确定并根据牛血清白蛋白(BSA)标准曲线计算。

体内Erk抑制：注射4T1 BC细胞24h后，向小鼠I.P.注射4％ DMSO玉米油中的1mg/kg ERK抑制剂曲美替尼GSK1120212(Selleckchem#S2673)或只注射4％DMSO玉米油，一周6次。肿瘤注射后8或14天处死小鼠。

体内IL-6抑制：注射KPC细胞4天后，每2天向小鼠I.P.注射200μg/小鼠的IL-6Ab(InVivoMab抗小鼠IL-6(Bio X细胞)#BE0046)或对照IgG(InVivoMab大鼠IgG1同型对照(抗HRP)(Bio X细胞)#BE0088)。肿瘤注射后21天处死小鼠。

rAAV-HNF4α：细胞-在37℃下、以5％ CO2在补充有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养低传代HEK293T。rAAV的产生-为了产生rAAV8，采用三重共转染程序以1:1:1的摩尔比导入rAAV载体质粒(pAAV-CMV-mHNF4α或pAAV-CMV-GFP)连同pXR8、携带AAVrep和cap基因的AAV8辅助质粒以及pXX6-80、Ad辅助质粒。

简而言之，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293T细胞(线性；分子量[M.W.]，25,000)(Poly-sciences,Inc.,Warrington,PA)，并在转染后18h更换培养基。在转染后72h收获细胞，进行3轮冻融，然后用100U/ml Benzonase(EMD Millipore,Billerica,MA)在37℃下消化1h。通过碘克沙醇(Serumwerk Bernburg AG,德国)梯度超速离心纯化病毒载体，之后使用Amicon ultra-15 100K(100,000分子量截留值(cutoff)，Merck Millipore,爱尔兰)进一步浓缩并用磷酸盐缓冲盐水(PBS-/-)洗涤。rAAV8颗粒的最终浓度为2.78E+10vg/微升(AAV-CMV-mHNF4α)和2.35E+10vg/微升(pAAV-CMV-GFP)。接种癌细胞后48hr，通过尾静脉向小鼠注射5E11 vg。

RNA-seq：将总RNA片段化，之后逆转录和第二链cDNA合成。对双链cDNA进行末端修复、碱基添加、衔接子连接和PCR扩增以创建文库。通过Qubit和TapeStation评估文库。使用条形码构建测序文库以实现在Illumina HiSeq 2500V4仪的一条泳道上对12个样品进行多重检测(multiplexing)，每个样品产生约2300万个单端60bp读序(reads)。生物信息学：使用cutadapt[doi:10.14806/ej.17.1.200]从读序中修剪聚A/T延伸(stretches)和Illumina衔接子；所得短于30bp的读序被丢弃。使用STAR将读序映射到M.musculus参考基因组GRCm38，其提供有从Ensembl下载的基因注释(选项EndToEnd和outFilterMismatchNoverLmax设置为0.04)。使用上述gtf，用htseq-count对各个基因的表达水平定量。使用DESeq2鉴定差异表达的基因，同时将betaPrior、cooksCutoff和independentFiltering参数设置为False。使用Benjamini和Hochberg程序对原始P值进行多重测试调整。这条管线是用snakemake搭建的。

对1,000个最易变基因的DESeq2方差稳定转化值进行主组分分析(使用R Stats包)。图描绘了散点图中第一主组分vs第二主组分。第一PC解释73％以及第二PC解释9％的数据方差。对在任意比较结果(第4天和第21天时携带4T1乳腺小鼠和CTRL WT小鼠)中都呈显著的总共2829个基因进行热图分析并示出。如果某个基因的绝对倍数变化在1.5以上，FDR在0.05以下，并且该基因在其中至少一个样品中至少占30，则该基因被视为显著。log 2归一化计数经标准化使得每个基因具有零均值和单位标准差。使用Gap Statistic估测聚类数。对标准化值进行K均值聚类。表达谱(expression profile)附带彩色条，指示标准化log 2归一化计数。对于通路富集分析，我们采用QIAGEN的通路分析。鉴定受HNF4α调控的基因-计算第21天与第4天4T1肝细胞之间的差异表达基因并在两个时间点相当于对照小鼠归一化(|logFC|>＝1.5且FDR<0.05)。与第4天相比，1914个基因在第21天时间点上调，514个基因在此时间点下调。使下调基因列表与来自Harmonizome工具(https://maayanlab.cloud/Harmonizome/gene_set/HNF4A/ENCODE+Transcription+Factor+Targets)的HNF4α转录因子的靶基因列表交叉，上述工具是使用来自ENCODE转录因子靶标数据集的ChIP-seq数据集构建的。最终列表包含149个基因。本公开中讨论的RNA-Seq数据已保存在NCBI的基因表达数据库(Gene Expression Omnibus)中并且可通过GEO系列登录号GSE 212113(ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE212113)访问。

采用Chromium10x基因组学平台的单细胞RNA-seq：对于肝脏的NPC富集，如上文先前所述，对注射PBS或4T1 BC细胞后4天和21天的小鼠的肝脏灌注。离心3min后，收集30g上清液并以300g离心5min。根据制造商的说明，用红细胞裂解缓冲液(ThermoFisher,ACKLysing Buffer#A104920)处理细胞沉淀。采用铬单细胞RNA-seq平台(10x基因组学)制备单细胞RNA-seq文库。计数细胞并在补充有0.04％ BSA的PBS中稀释至最终浓度。将细胞悬液装载到靶向肝脏非实质细胞的Next GEM Chip G上，然后在Chromium Controller仪上运行生成GEM乳剂(10x基因组学)。根据制造商的方案生成单细胞3'RNA-seq文库(10x基因组学Chromium Single Cell 3'Reagent Kit User Guide v3Chemistry)。使用NEBNextLibrary Quant Kit for Illumina(NEB)和高灵敏度D1000TapeStation(Agilent)对最终文库进行定量。根据靶向的细胞数将文库合并，目标是每个细胞约50,000个读序。使用SP100循环试剂盒(Illumina)，在NovaSeq 6000仪上对合并后的文库测序。本公开讨论的scRNA-Seq数据已保存在NCBI的基因表达数据库中并且可通过GEO系列登录号GSE223835(ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE223835)访问。

单细胞RNA分析：元细胞管线-元细胞管线36用于导出信息基因和计算细胞间相似性、计算k-NN图覆盖并导出RNA在细胞(或元细胞)的内聚组(cohesive groups)中的分布以及利用自引分析和对重采样数据的图覆盖计算导出强分离聚类。我们去除了具体的线粒体基因、免疫球蛋白基因和与支持性差的转录模型相关的基因(用前缀“Rp-”注释)。采用归一化变量/均值(var/mean)阈值(Tvm)＝0.3和最小总UMI计数>50来选择基因特征。我们随后对元细胞之间的相关矩阵进行层次聚类并将它们分组成代表细胞类型和状态的聚类。我们使用K＝100,500自引迭代和其它标准参数。嗜中性粒细胞亚群分析-根据成熟评分和趋化评分以及颗粒鉴定来鉴定嗜中性粒细胞的亚群。通路分析–G.O.-为了评估DEG富集通路，我们对巨噬细胞中与第0天相比第21天时差异上调的基因以及对肝细胞中第21天与第4天之间差异下调的基因中HNF4α调控的基因使用G.O.基因本体37,38,39。统计学分析-采用Mann-Whitney U检验同时FDR校正，对被中位UMI计数除后的UMI——进行差异基因表达分析。

来自Clalit Healthcare的人类数据：对来自Clalit Healthcare环境的数据分析获得赫尔辛基第195-17COM2号批准。乳腺癌队列定义-2002-2019年间诊断为乳腺癌的女性患者(所有分期，右乳房和左乳房，所有象限，所有组织学亚型)均被纳入乳腺癌队列中。队列1：自诊断起生存期小于2年的乳腺癌患者，N＝4732。队列2：自诊断起生存期2至5年的乳腺癌患者，N＝4086。队列3：自诊断起生存期5至10年的乳腺癌患者，N＝3984。队列4：诊断一年内(诊断前-365天至诊断后365天)CBC测试指示嗜中性粒细胞百分比高于80％或淋巴细胞百分比低于10％的乳腺癌患者。N＝10556。队列5：诊断一年内(诊断前-365天至诊断后365天)CBC测试指示嗜中性粒细胞百分比低于80％且淋巴细胞百分比高于10％的乳腺癌患者，N＝35723。胰腺癌队列定义-2002-2019年间诊断为胰腺癌的男性患者(所有分期，胰腺中的所有位置，所有组织学亚型)均被纳入胰腺癌队列中。队列1：自诊断起生存期小于半年的胰腺癌患者，N＝2037。队列2：自诊断起生存期半年至1年的胰腺癌患者，N＝659。队列3：自诊断起生存期1-1.5年的胰腺癌患者，N＝342。队列4：诊断一年内(诊断前-365天至诊断后365天)CBC测试指示嗜中性粒细胞百分比高于80％或淋巴细胞百分比低于10％的胰腺癌患者。N＝4238。队列5：诊断后一年内(诊断前-365天至诊断后365天)CBC测试指示嗜中性粒细胞百分比低于80％且淋巴细胞百分比高于10％的胰腺癌患者，N＝4218。肝脏功能实验室数据-对于每种癌症类型的队列1-3(如有)，获得年龄在60-70岁之间的每名患者在2个时间点(诊断前一年和诊断时)所选变量的实验室测试结果。肝脏功能变量：AST(天冬氨酸转氨酶)、ALT(丙氨酸转氨酶)、白蛋白、ALK-P(碱性磷酸酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、PT-SEC。生存期分析-对于每种癌症类型的队列4-5，计算每年年底存活患者的pct(0＝诊断时间)并创建生存期曲线——即为每年存活患者％的X-Y图。

胰腺患者数据中的肝脏功能评分：Sheba和Souraski医学中心关于参与者人口统计数据、既往手术程序、血液测试值和生存期的数据摘自受IRB批准的患者医疗记录(4474&5073-18&0551-17-TLV)。在研究入组(study enrollment)前，获得了所有患者的书面知情同意。方案获得Sheba与Sourasky医学中心Institutional Review Board的批准，并且研究是根据Good Clinical Practice指南和Declaration of Helsinki进行的。排除有肝转移或腹水的胰腺癌患者以进行非肝脏癌症数据分析。Souraski：N＝732(可切除组N＝255，LA组N和MTX组N＝362)。Sheba：N＝252(1+2期N＝82，3+4期N＝170)。然后，对于每个样品，我们确定其肝脏功能评分，肝脏功能评分是5种肝脏酶和基于功能的分子的归一化表达、在胰腺癌患者中归一化为平均值和std(从该队列研究得出的)以及基于每个值与随机小队列(50名患者)的生存期的相关性所定义的权重的加权和，即2*|ALT(IU/I)-25.5|19.5+2*|AST(IU/I)-25|15+5*|INR-1.025|0.175+|ALKP(IU/I)-79.5|35.5+7*|4.46-白蛋白(g/dL)|0.8617，其中基因的名称表示它们的实验室结果值。将使高评分与低评分分开的截断值设定为截断值＝0.6，其中大约66％的患者取得高分，而33％的患者取得低分。对于高评分患者和低评分患者，绘制所有癌症分期(诊断时分期)患者的K.M.(Kaplan-Meier)生存期曲线并按分期分层。

重量减轻分析：对于重量减轻分析，我们排除接受惠普尔(Whipple)或胰体尾切除术(Distal Pancreatectomy)的患者并对病程中至少有过2次重量测量的患者进行随访。N＝369。通过控制肿瘤分期和患者年龄的线性回归分析评估肝脏酶评分与BMI变化之间的相关性。BMI变化，ΔBMI被定义为(第二BMI-第一BMI)/第一BMI。线性回归遵循下列形式，ΔBMI＝评分+分期+年龄，其中评分代表肝脏酶评分。

统计学分析：除非另有规定，所有统计学分析均采用双因素ANOVA、学生t检验或多组或两组Wilcoxon秩和检验，必要时采用Dunnett校正。样品大小是根据所描述实验的常见实践预先选择的并且每个实验都有所提及。除非另有规定，每个实验均采用生物学重复和技术重复来进行且至少重复三次。结果以平均值±标准差的形式呈现。所有误差棒均表示标准差。所有分析均认为p<0.05具有显著性(*表示p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005，****p<0.0001)。

数据可用性：由于隐私法规，所有数据分析都是在Clalit Healthcare环境内一台安全、经过身份验证的专用服务器上进行的。

实施例1：非肝脏癌症在致癌作用期间诱发肝脏的早期代谢变化

为评估非肝脏癌症致癌作用期间肝脏代谢变化，我们采用罕有向肝脏转移的原位4T1-荧光素酶乳腺癌(BC)模型。利用这种方法，我们能够区分原发肿瘤诱发的肝脏代谢变化与转移引发的肝脏代谢变化。为控制因原位注射癌细胞而产生的潜在副作用，我们向小鼠注射假盐水(sham saline)，此外，我们还使用MMTV-PyMT小鼠，这是一种固有BC遗传模型。我们分析了UC酶和中间体——即为致癌作用前3周期间宿主肝脏特异性代谢变化的读出。我们从我们的分析中排除精氨酸酶I以准确区分UC与NO代谢。此外，一名经认证的病理学家在所有实验时间点分析并排除肝转移的存在。

在4T1 BC模型中，早在原位注射后第4天开始，我们就发现宿主的肝脏中UC酶的表达减少。UC酶的表达减少在3周过程中是动态的，减少的幅度和涉及的酶的数量均增加(图1A-图1B)。有趣的是，与对照相比，遗传性MMTV-PyMT BC模型也降低UC酶的表达水平，从而排除注射导致UC表达水平变化的可能(图1C)。为验证UC表达结果对UC功能的意义，我们用1¹⁵N₂标记的谷氨酰胺进行活体输注并测量标记的尿素与谷氨酰胺和谷氨酸之比。我们发现这两个比在携带乳腺癌小鼠的血浆中均降低，此外，在肝脏中，当总谷氨酸升高时，4T1小鼠中标记的尿素与谷氨酸之比降低，从而证实UC功能失常(图1D)。此外，我们还测量4T1的血浆和肝脏中UC相关上游底物即谷氨酸和天冬氨酸以及下游代谢物即富马酸。正如对功能异常UC的预期，我们发现UC底物水平升高，而UC产物富马酸水平降低(图1E)。我们进一步发现血浆氨水平升高并且尿液中尿素水平降低，从而证实UC失效(failing)(图1F)。值得注意的是，虽然肿瘤中¹⁵N₂标记的天冬氨酸的水平与其在血浆和肝脏中的水平相比更低，但肿瘤中自天冬氨酸合成的下游代谢物即标记的尿嘧啶的比例更高，表明使用天冬氨酸合成核苷酸(图1G)。实际上，宿主肝脏中UC功能衰竭导致的高水平UC底物和降低水平UC产物直接增强癌细胞增殖(图1H)。有趣的是，离体补充氨降低从野生型(WT)小鼠切下的T细胞脾细胞的存活和活化(图1I)。因此，在致癌作用期间，肝脏UC的重新连线可能会通过增加肿瘤生长的底物可利用性和通过减少全身免疫反应而益于癌症生长。

为广泛评估体内癌症是否影响除UC以外的肝脏特异性代谢通路，我们在癌细胞注射后第4天和第21天对从WT和携带4T1癌症小鼠的灌注肝脏分离的肝细胞进行RNA测序。为确证我们之前的发现，我们发现第21天时UC酶精氨琥珀酸合成酶(ASS1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)和氨甲酰磷酸合成酶I(CPS1)的表达减少，并且有显著且独特的关于疾病的基因表达特征(图1J)。在这一特征中，我们发现参与中心代谢通路的多种其它酶的表达减少，这支持致癌作用期间肝细胞代谢发生一般性重编程(图1K)。对肝细胞RNAseq的进一步分析表明，并非所有肝脏基因的表达都发生变化，这支持代谢基因变化有特异性。有趣的是，肝脏代谢的广泛变化与AST水平的显著升高有关(图1L)。

由于我们发现改变的其中几种代谢通路(包括UC)都依赖于功能充分发挥的线粒体，因此我们评估致癌作用后线粒体功能或数量是否减少。在分离的线粒体中，我们发现包括线粒体DNA(mtDNA)编码的亚单位(I、II-III、IV)在内的呼吸链复合物的活性相对于完全由核编码的琥珀酸脱氢酶(SDH，复合物II)有所降低。在携带BC小鼠中观察到肝脏mtDNA水平降低确证了这一发现。为进一步了解线粒体代谢中的扰动，我们分析调控mtDNA水平和转录的线粒体转录因子A(TFAM)的蛋白质和RNA水平，并发现其在携带BC小鼠肝脏中显著下调。然而，按肝脏匀浆中柠檬酸合成酶活性估测的线粒体总量未改变。因此，很可能是转录变化导致观察到的代谢变化，而不是mtDNA耗竭。

总之，这一数据表明，在BC小鼠模型中，存在代谢酶表达的早期转录改变，这些改变在通路和细胞器水平上引起肝脏代谢的整体变化。

实施例2：先天免疫细胞在早期致癌作用期间浸润宿主的肝脏

为了解导致这种早期且广泛的代谢重新连线的潜在原因，我们首先检查原位注射BC细胞后肝脏的形态学变化。有趣的是，我们发现了免疫细胞浸润肝脏的证据——早在BC细胞注射后第4天就开始并且顺沿病程增加(图2A)。FACS分析进一步证实，在第0天至第21天，携带BC小鼠肝脏中的肝脏免疫细胞(CD45+)群逐渐增加。值得注意的是，与WT小鼠的肝脏相比，MMTV-PyMT遗传BC模型的肝脏组织学切片也显示免疫细胞浸润，这支持肝脏免疫浸润不是由注射反应引起的。

为鉴定哪些免疫细胞浸润肝脏，我们对肝脏中的非肝实质细胞进行单细胞RNA测序(scRNA)分析。我们通过飞行时间流式细胞术(Cytometry Time Of Flight,CyTOF)在蛋白质水平上对这些结果作补充。使用这两项技术，我们发现淋巴细胞浸润显著减少，而浸润肝脏的先天免疫细胞即嗜中性粒细胞和单核细胞增加(图2B-图2D)。由于对升高的氨水平高度敏感(图2E)，肝脏淋巴细胞的减少可能由血液淋巴细胞减少引起，这可能是对升高的氨水平敏感所致(图1I)。相反，先天免疫细胞向肝脏的浸润增加已在转移前微环境(pre-metastatic niches)的形成过程中得到描述，也可能是炎症来源髓外造血的一部分。我们排除髓外造血的选项，因为我们在肝脏中未发现红细胞、巨核细胞和年轻粒细胞。相反，我们发现成熟嗜中性粒细胞(CXCR2+)数量显著增加，而CXCR2-嗜中性粒细胞减少。此外，FACS分析排除骨髓衰竭并且表明嗜中性粒细胞广泛成熟，与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的血浆水平显著升高相关。

可能是致癌作用期间免疫细胞的肝脏浸润增加肝脏对晚期转移形成的易感性。尽管如此，我们的数据表明，在此早期阶段肝脏受累(involvement)更可能是全身炎性反应的一部分。

我们的scRNA数据表明，肝脏中的嗜中性粒细胞可基于基因表达顺沿致癌作用的时间进程的显著差异被聚类成四个亚组。基于成熟和趋化基因、颗粒基因和升高的炎性标志物IL1β的高表达水平，第4天时存在于肝脏中的嗜中性粒细胞亚群1很可能代表的是未成熟嗜中性粒细胞。致癌作用三周后，我们发现肝脏中大量积聚更成熟的嗜中性粒细胞(亚群2-4)。此外，对携带BC小鼠血浆中细胞因子水平的测量显示IL-6和TNF-α显著增加，这支持致瘤诱发涉及肝脏的全身炎性反应的观点(图2F)。由于在体内样品的scRNA中检测分泌的细胞因子的RNA水平直接升高通常很有挑战，因此我们分析其下游靶标的RNA升高的数据。令人鼓舞的是，我们发现第21天时巨噬细胞中ANXA1的表达——已知是由IL-6驱动的——显著升高。

趋化因子CCL2及其主要受体CCR2与炎症和癌症的发病机制有关。实际上，我们发现在癌细胞注射后的第一周，BC小鼠的肝脏、血浆和脾脏中的CCL2水平升高，而肺中的水平降低(图2G)。值得注意的是，尽管与健康小鼠相比，携带BC小鼠中血浆CCL2水平升高保持不变，但在癌症进程中，携带BC小鼠的肝脏中CCL2的相对升高持续增加(图2H)。此外，我们还发现浸润肝脏的单核细胞中CCR2+细胞增加以及参与迁移通路的基因的表达上调(图2I)。

因此，致癌作用后，存在对全身免疫反应的早期诱发，其中免疫组织(如肝脏)分泌的CCL2水平升高，导致免疫细胞浸润至不同的器官。

实施例3：髓样细胞中pERK活化导致HNF4α从肝细胞耗竭

除我们在代谢通路中发现的改变外，我们对BC小鼠的分离的肝细胞进行的批量(bulk)RNA测序分析还表明信号传导通路上调(图3A)。IL-6、NFκβ和ERK——我们在我们的scRNA通路分析中发现它们升高——在前文被描述成作为信号传导通路一起参与。此外，IL-6还显示下调TFAM，并且我们发现其在4T1小鼠血浆中的水平升高(图2F)。因此，我们进一步评估肝脏中ERK-IL-6通路的激活状态。对携带BC小鼠肝脏中的磷酸化ERK(pERK)和CD45细胞进行免疫染色和FACS分析揭示出浸润肝脏细胞中pERK和CD45+共染色增加(图3B-图3C)。值得注意的是，我们未在BC小鼠的血细胞中发现pERK活化，这表明活化发生在肝脏中(图3C)。

在整联蛋白与其它细胞相互作用后，其可诱发pERK活化。因此，我们对浸润肝脏的免疫细胞的scRNA数据进行配体-受体相互作用分析，同时对肝细胞进行批量RNA测序。我们找到了对免疫细胞与肝细胞之间的细胞间串扰(crosstalk)通过的是可以稳定其肝定位的整联蛋白及其受体的支持(图3D-图3E)。活化的ERK表明会导致髓样细胞分泌IL-6，同时对其它细胞有多重影响，其中之一就是pSTAT3水平随之升高。通过mir-24升高的pSTAT3引起肝脏代谢的主调节子HNF4α的下调。实际上，我们在携带BC肿瘤小鼠的肝脏中发现pSTAT3和miR-24水平显著升高，同时在RNA和蛋白质这两个水平上发现HNF4α完全耗竭(图3F-图3H)。值得注意的是，用IL-6补充原代肝细胞会升高CCL2 RNA水平(图3I)。因此，癌症诱发的炎症至少部分通过CCL2向肝脏募集先天免疫细胞。随后的免疫活化和IL-6的分泌使肝细胞中的pSTAT3活化，从而导致HNF4α耗竭和肝脏代谢扰动。

实施例4：HNF4α耗竭在肝外致癌作用期间破坏肝脏代谢

对来自BC小鼠肝脏的RNA测序数据的进一步分析证实，我们发现的失调并且导致受扰动的代谢和信号传导通路的其中很多基因确实受HNF4α调控(图4A)。由于白蛋白是HNF4α的一个已确立的下游靶标，我们证实它在4T1小鼠的肝脏和血浆中在RNA和蛋白质这两个水平上都分别降低(图4B)。

为验证由免疫细胞启动的信号传导级联与随后携带癌症小鼠肝脏中代谢变化之间的因果关系，我们测量UC酶OTC——一个已知的HNF4α靶基因——在分离的原代肝细胞中的表达水平。我们发现，补充IL-6会降低OTC的表达水平，而STAT3抑制剂HJCO152能够挽救这一效应(图4C-图4D)。尽管曲美替尼(MEK-ERK抑制剂)可能具有溶瘤效应，但用曲美替尼处理4T1小鼠会维持HNF4α和肝脏UC酶的表达水平并减小肿瘤大小，这进一步支持所提出的信号传导级联(图4E-图4F)。

最后，HNF4α通过病毒转导在BC小鼠体内的重表达会升高肝脏HNF4α水平，逆转UC酶表达的变化，并限制BC肿瘤生长(图4G-图4H)。此外，经HNF4α处理的BC小鼠的肿瘤具有更低的PCNA水平和更低的pCAD，这表明通过重表达HNF4α来保留肝脏代谢会通过限制增殖来减少肿瘤生长(图4I)。HNF4α注射降低肝脏、血浆和肿瘤中的谷氨酸和天冬氨酸水平，这表明保留的肝脏UC代谢限制肿瘤生长。值得注意的是，HNF4α-AAV注射增加病毒HNF4α在肝脏中的表达，但不升高病毒HNF4α在肿瘤中的水平，这支持AAV-HNF4的肝脏特异性(图4J)。因此，pERK活化的浸润肝脏的免疫细胞分泌IL-6，从而活化肝细胞中的pSTAT3，导致HNF4α耗竭以及随后导致携带BC小鼠肝脏的代谢扰动。重要的是，重表达HNF4α限制肝脏代谢的变化。

实施例5：胰腺癌(PC)小鼠中通过HNF4α发生类似的肝脏代谢变化

为评估我们在另一个癌症小鼠模型中的结果，我们使用KrasG12D/Trp53R172H/Pdx-1-Cre胰腺癌(KPC)原位小鼠。此小鼠也是一个已知的癌症诱发恶病质模型。令人鼓舞的是，我们发现在4T1 BC模型中证明的早期代谢发现发生在胰腺癌(PC)模型中。实际上，我们发现，在PC模型中，OTC——即HNF4α的直接靶标——的水平在注射KPC细胞后的第一周就已经显著降低，以及在第21天时UC底物增加并且UC产物水平降低(图5A-图5B)。此外，我们在PC小鼠中还发现，在致瘤前3周期间，免疫细胞向肝脏的浸润逐渐增加(图5C)。FACS分析证实，浸润肝脏的免疫细胞主要是先天免疫并且与CCR2+单核细胞增加和淋巴细胞耗竭有关(图5D)。与我们在BC模型中的发现一致，我们在KPC模型中的结果与IL-6血浆水平的升高、pSTAT3蛋白水平的升高、HNF4αRNA水平的降低以及随之白蛋白水平的降低有关(图5E-图5H)。为进一步提供支持，用抗IL-6抗体处理KPC小鼠挽救白蛋白水平(图5I)。值得注意的是，当KPC小鼠的重量没有变化时(图5J)以及当经认证的病理学家排除肝脏转移时，出现肝脏代谢的这些变化。因此，KPC小鼠模型表明肝脏代谢的变化与我们在BC小鼠模型中描述的变化类似。

实施例6：CCR2 KO和HNF4α重表达挽救PC小鼠致癌作用期间肝脏早期代谢变化

为进一步证实CCL2驱动向肝脏免疫浸润并导致我们发现的代谢变化，我们将KPC细胞原位注射到C57/Bl6野生型和CCR2^-/-敲除小鼠中，这些小鼠不表达CCL2的受体，也无法募集CCL2+免疫细胞。与KPC CCR2^+/+小鼠相比，我们发现KPC CCR2^-/-小鼠发展PC，但未表现出免疫细胞对肝脏的浸润(图6A)。因此，我们发现PC CCR2^-/-小鼠的血浆中IL-6水平降低(图6B)，而UC酶、白蛋白和HNF4α的表达水平得以保留(图6C)。值得注意的是，CCR2^-/-小鼠的肝脏中UC底物水平降低并且未发展与致癌作用相关的全身代谢表现如重量减轻和身体组成变化，与白蛋白水平的保留相关。重要的是，CCR2-/-小鼠的肿瘤生长显著减少(图6D-图6F)。

最后，为评估我们的这些发现的潜在治疗关联，我们将AAV8-HNF4α病毒注入KPC小鼠。AAV8-HNF4α病毒显著限制PC肿瘤生长(图6G)并改善生存期(图6H)。

值得注意的是，重表达HNF4α还减少CAC表型如重量减轻(图6I)，脂肪损失减少(图6J)，并限制体液的累积(图6J)——通过NMR(5K-5M)进行的身体组成分析证明如此。

因此，通过防止CCL2+免疫细胞浸润或通过重表达HNF4α来保持肝脏的HNF4α的水平减轻致瘤的全身表现，如重量减轻和身体组成的变化。

实施例7：基于常规测试的生化肝脏评分能够预测BC和PDAC患者(包括恶病质)的结果

为了解我们的这些发现在癌症患者肝脏代谢上的平移关联(translationalrelevance)，我们对Clalit健康维护组织(health maintenance organization,HMO)数据集进行分析，这一数据集涵盖500万以色列对象18年的数字健康数据。我们发现，诊断当天肝脏参数异常的非转移性BC和胰腺导管腺癌(PDAC)患者的生存期短于肝脏参数正常的患者(图7A、图7E)。值得注意的是，即使在诊断前一年，仍可在BC患者血浆中明显检测到这其中的某些肝脏变化(如LDH和ALP)并预测结果(图7F)。

此外，我们还具体分析了来自以色列两个独立医学中心——Sheba和Souraski医学中心(以色列最大的两个肿瘤学中心)的PDAC患者的数据集。我们首先证实，这一队列的表现与文献中公布的一致并且显示出生存期缩短与重量减轻之间的相关性(图7G)。与我们之前关于UC酶表达产生的评分类似(参见Lee et al.,“Urea cycledysregulationgenerates clinically relevant genomic and biochemical signatures”,Cell.2018Sep 6；174(6):1559–1570.e22，其通过引用以其整体并入本文)，我们现在开发出“肝脏评分”——其基于肝脏生化和功能参数(AST、ALT、ALP、白蛋白、INR)的测量水平——并用小数据集对其训练(图7H)。我们接下来在Clalit和这些医院的数据集中测试我们的评分与生存期的相关性潜力。我们发现，在所有三个队列中，我们的“肝脏评分”与PDAC患者生存期缩短相关(图7B)。有趣的是，肝脏评分与疾病分期无关，但与重量减轻相关(图7C-图7D、图7I)。

HNF4α的耗竭能够引发级联事件，通过降低白蛋白水平导致CAC中肌肉蛋白分解。对Sheba医学中心和Souraski医学中心数据的分析表明，控制了肿瘤分期和患者年龄后，PC患者的BMI变化就与肝脏酶评分显著相关。因此，我们的肝脏评分所预测的生存期缩短与癌症发展(包括恶病质)诱发的全身表现一致。

总之，我们证明在肝外致癌作用早期，甚至在有临床表现之前，肝脏中就会发生分子和功能性全身代谢变化。这些代谢变化由先天免疫细胞介导，导致pERK信号传导活化，导致肝细胞中HNF4α即主代谢调节子耗竭。多种肝脏代谢通路的扰动促成致癌作用、免疫逃避，并最终导致CAC的发展(图8)。

Goldman等人“Early infiltration of innate immune cells to the liverdepletes HNF4αand promotes extra-hepatic carcinogenesis”,2023,CancerDiscov.2023Mar 27；CD-22-1062(其通过引用以其整体并入本文)也提供进一步的支持。

实施例8.LNP将HNF4α特异性递送至肝脏细胞既治疗又预防CAC

尽管HNF4α的AAV递送能够预防CAC症状的发展，但向人类直接递送AAV是不可行的。由此，脂质纳米颗粒(LNP)被设计用于将HNF4αmRNA递送至肝脏。第一种LNP，本文称为SM-LNP，具有下列组成：50mol％SM-102、38.5mol％胆固醇、10mol％DOPE和1.5mol％DMG-PEG200。第二种LNP，本文称为H4-LNP，其组成与第一种LNP相同，但使用不同的可离子化脂质(不是SM-102)。将脂质溶于乙醇中并通过乙醇注射生成LNP。以(脂质头部基团中的)氮与(RNA中的)磷酸之比(N:P)约为8将乙醇与含mRNA的水溶液(pH 5.2)混合(比例为1:3)。LNP——其用来自emGFP的mRNA编码生成——被用于测试LNP的生物分布。尽管预测两种LNP均靶向肝脏，但只有SM-LNP在肝脏中产生荧光，而H4-LNP未产生(图9A)。两种LNP组合物在脾脏中均未产生可检测的表达。SM-LNP因其对肝脏的高选择性而被选择用于进一步实验。

设计一种编码HNF4A的mRNA包含在LNP中。使用小鼠剪接的mRNA编码序列(SEQ IDNO:2)，但也可使用人序列(SEQ ID NO:5)。5’UTR(SEQ ID NO:7)和聚腺苷酸化3’UTR(SEQID NO:8)中包括加帽结构域和核糖体结合结构域。5’UTR被设计成实现高表达，并且正是在5’端包括T7 RNA启动子序列(SEQ ID NO:46)，以及包括来自人α珠蛋白mRNA(HBA1)的5’UTR的包括Kozak共有序列的序列。选择来自线粒体rRNA序列的3’UTR(SEQ ID NO:8)，因为它在LNP形成温度条件下(ΔG＝-85.3kcal/摩尔——使用UNAFold进行二态折叠来计算)具有高热力学稳定的二级结构。将mRNA装载入SM-LNP后，检测其在肝细胞中诱发HNF4A蛋白表达的能力。将THLE-2人肝细胞细胞系的细胞与浓度增加的LNP一起温育，并在16小时后将细胞裂解并进行HNF4A的蛋白质印迹。在细胞中观察到稳健的剂量依赖性HNF4A表达(图9B)，表明mRNA在肝细胞中具有功能。

在PC小鼠模型中测试LNP对恶病质的治疗和预防潜力。在第0天将KPC细胞原位注入小鼠的胰腺中并使肿瘤发展。在没有干预的情况下，到第21天，小鼠中明显观察到CAC的症状，包括重量减轻、脂肪损失和游离流体增加(图9C-图9E，对照组)。在处理组中，6.5mcg的LNP于第21天被静脉内施用于尾静脉中，并且到第24天就已观察到恶病质变化的停止/减缓(图9C-图9E，HNF4A组)。如上所述，代谢变化能够在癌症进展的早期，在恶病质发展之前就被检测到。这允许肝脏中HNF4A表达的预防性恢复，将会抢先于恶病质的发展。在预防组中，在能够观察到恶病质的症状之前(但在代谢变化已经开始之后，参见图1A和图5A)于第7天施用LNP。这种预防性处理完全消除恶病质症状的发展，因为截止至癌症施用后第25天，重量、脂肪或游离流体未显著减少(图9F-图9H)。这些结果证明向肝脏递送HNF4A有治疗和预防功效。

尽管结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但显然多种可选方案、修改和变型对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的可选方案、修改和变型。

Claims (31)

1.预测患有癌症的对象的临床结果的方法，其中所述癌症是非肝癌症，所述方法包括测量所述对象中尿素循环的功能，其中与健康对照中的尿素循环功能相比尿素循环功能降低指示与尿素循环功能未降低的对象相比更差的临床结果，从而预测对象的临床结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非肝癌症选自乳腺癌和胰腺癌，不包括可检测到的肝转移或两项兼有。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中测量所述尿素循环的功能包括下列中的至少一项：

a.测量所述对象的肝脏中选自下列的至少一种尿素循环酶的表达：精氨琥珀酸合成酶1(ASS1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)、氨甲酰磷酸合成酶-1(CPS1)和鸟氨酸移位酶(ORNT1/SLC25A15)；

b.测量所述对象的血液或肝脏中尿素与谷氨酰胺之比或尿素与谷氨酸之比；

c.测量所述对象的血液或肝脏中的谷氨酸、天冬氨酸或富马酸水平；

d.测量所述对象的血液中的氨水平；

e.测量所述对象的尿液中的尿素水平；

f.测量所述对象的肝脏中肝细胞核因子4α(HNF4A)表达；

g.测量所述对象的血液中选自下列的至少一种肝脏酶的水平：天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALK-P/ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)；

h.测量来自所述对象的血液的凝血酶原时间国际标准化比值(INR)；和

i.测量所述对象的血液或肝脏中的白蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其中

a.所述至少一种尿素循环酶的表达减少；

b.尿素与谷氨酰胺之比或尿素与谷氨酸之比降低；

c.谷氨酸或天冬氨酸增加；

d.富马酸减少；

e.氨增加；

f.尿素减少；

g.HNF4A减少；

h.所述至少一种肝脏酶的水平升高；

i.INR降低；

j.白蛋白减少；或

k.其任意组合

指示所述对象中尿素循环功能降低。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述测量功能包括产生肝脏功能评分，并且其中超过预定阈值的肝脏功能评分指示尿素循环功能降低。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述肝脏功能评分是来自所述对象的血液样品中AST、ALT、ALP和白蛋白的归一化水平与INR的加权和。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述评分的标准化是从0到1，所述预定阈值是0.6，并且其中在所述预定阈值以上的评分指示尿素循环功能降低。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述临床结果是癌症相关恶病质的发展，并且其中尿素循环功能降低预测发展所述癌症相关恶病质的风险增加。

9.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述临床结果是总生存期，并且其中超过预定阈值的肝脏功能评分指示总生存期缩短。

10.检测有需要的对象的非肝癌症的方法，所述方法包括从所述对象接收血液样品并基于所述血液样品测量所述对象中尿素循环的功能，其中与健康对照中的尿素循环功能相比尿素循环功能降低指示所述对象患有非肝脏癌症，从而检测所述对象的非肝癌症。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述非肝癌症选自乳腺癌和胰腺癌，不包括可检测到的肝转移或两项兼有。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中测量所述尿素循环的功能包括下列中的至少一项：

a.测量所述血液样品中谷氨酰胺与谷氨酸之比；

b.测量所述血液样品中的谷氨酸、天冬氨酸或富马酸水平；

c.测量所述血液样品中的氨水平；

d.测量所述血液样品中的天冬氨酸转氨酶(AST)水平；和

e.测量所述血液样品中的白蛋白水平。

13.根据权利要求12所述的方法，其中

a.谷氨酰胺与谷氨酸之比降低；

b.谷氨酸或天冬氨酸增加；

c.富马酸减少；

d.氨增加；

e.AST水平升高；

f.白蛋白水平降低；或

g.其任意组合

指示所述对象中尿素循环功能降低。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其进一步包括向临床结果更差或被确定患有非肝癌症的对象施用选自下列的至少一种治疗剂：抗IL6阻断抗体、ERK抑制剂、STAT3抑制剂和能够增加所述对象的肝脏中HNF4A的表达的用剂。

15.合成脂质纳米颗粒(LNP)，其包括包封于其中的编码HNF4A的mRNA，其中：

a.所述脂质纳米颗粒包括SM-102脂质、胆固醇、DOPE和DMG-PEG；

b.所述mRNA包括下列或由下列组成：SEQ ID NO:10或12的序列或包括与其至少85％同一性且编码HNF4A和聚A尾的序列；或

c.两项兼有。

16.根据权利要求15所述的合成LNP，其中所述mRNA包括5’帽和聚A尾。

17.根据权利要求15或16所述的合成LNP，其中所述编码HNF4A的mRNA包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的mRNA编码序列或具有与其至少85％同一性的编码HNF4A的序列。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的合成LNP，其中所述脂质纳米颗粒靶向肝脏细胞。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的合成LNP，其中所述脂质纳米颗粒包括约50mol％的SM-102、38.5mol％的胆固醇、10mol％的DOPE和1.5mol％的DMG-PEG200。

20.药物组合物，其包括权利要求15至19中任一项所述的合成LNP和药学上可接受的载剂、赋形剂或佐剂。

21.治疗有需要的对象的非肝癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用能够增加所述对象的肝脏中HNF4A的表达的用剂，从而治疗对象的所述非肝癌症。

22.治疗或预防有需要的对象的癌症相关恶病质的方法，所述方法包括向所述对象施用包括选自下列的至少一种用剂的组合物：抗IL6阻断抗体、ERK抑制剂、STAT3抑制剂和能够增加所述对象的肝脏中HNF4A表达的用剂，从而治疗或预防对象的癌症相关恶病质。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述用剂包括编码所述HNF4A的核酸分子。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述核酸分子被包含在腺相关病毒(AAV)内。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述核酸分子是mRNA。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述mRNA包括5’帽和聚A尾。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述核酸分子包括下列或由下列组成：SEQID NO:10或12的序列或包括与其至少85％同一性且编码HNF4A的序列。

28.根据权利要求14和21至27中任一项所述的方法，其中所述用剂是权利要求15至19中任一项的合成LNP。

29.根据权利要求22至28中任一项所述的方法，其中所述对象患有早期癌症、癌前病变或处于发展癌症的风险中。

30.根据权利要求21和23至28中任一项所述的方法，其中通过权利要求11至14中任一项的方法确定所述对象患有所述非肝癌症。

31.根据权利要求22至29中任一项所述的方法，其中通过权利要求8的方法确定所述对象有发展所述癌症相关恶病质的增加的风险。