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CN119591702A - 一种抗铁蛋白的抗体及其应用 - Google Patents

一种抗铁蛋白的抗体及其应用 Download PDF

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CN119591702A
CN119591702A CN202311164664.7A CN202311164664A CN119591702A CN 119591702 A CN119591702 A CN 119591702A CN 202311164664 A CN202311164664 A CN 202311164664A CN 119591702 A CN119591702 A CN 119591702A
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CN
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antibody
antigen
seq
binding fragment
amino acid
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CN202311164664.7A
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钟冬梅
孟媛
梁碧
唐丽娜
罗颖
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Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
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Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种抗铁蛋白的抗体及其应用，涉及抗体领域。本发明公开的抗铁蛋白抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为铁蛋白的检测提供了重要的原料来源，且具有良好的亲和力或活性。

Description

一种抗铁蛋白的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗铁蛋白的抗体及其应用。
背景技术
铁蛋白(Ferritin)是一种广泛存在于生物体内的一种储铁蛋白，分子量约450KDa，具水合氧化铁内核和围绕内核而成的蛋白质外壳，其外壳由24个亚基组成，每个亚基约含163个氨基酸残基。做为机体内铁的主要储存形式，机体铁蛋白含量水平与机体铁储存量成正相关，机体铁蛋白因此也成为医学检验中最常应用于评价体内铁储存状况及诊断缺铁性贫血的一个重要生物标志物。
铁蛋白，存在于身体内各种细胞中，尤其以肝脏及网状内皮系统细胞浓度最高；其主要功能是将细胞中过多的游离态铁质释放出来，以供身体使用。因此，铁蛋白为身体组织中主要贮存铁质的一种蛋白，是维持铁质平衡中不可缺少的一种重要蛋白。铁蛋白含量减少是机体缺铁性贫血的最重要的指标，但一般低于30ng/ml则有缺铁性贫血的倾向，需要相应的铁补充。缺铁性贫血是妇女和儿童常见的疾病。当血清铁蛋白含量大于300ng/ml时，则可能是肝细胞异常，由于正常情况下血清铁蛋白先在肝细胞中大量合成，而循环中的铁蛋白被肝细胞吸收清除，所以肝细胞异常会造成血清铁蛋白增高，另外，癌细胞合成的铁蛋白也会造成机体内铁蛋白的增加，故当检测到人体血清蛋白异常时当应考虑相应的措施和可能患有的疾病，并进行进一步的检查。
目前，定量检测铁蛋白的方法主要有酶联免疫法、层析法、化学发光法和胶乳比浊法。其中酶联免疫法的原理是1)使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性2)使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。
上述任何一种免疫学检测方法都需要针对铁蛋白的抗体。因此，本领域技术人员对于有良好性能的抗铁蛋白抗体存在着强烈需求。
发明内容
本申请提供一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，为铁蛋白的检测提供重要的原料来源，且有良好的活性或亲和力。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:17所示的重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:19所示的轻链可变区的三个互补决定区。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括如下互补决定区：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:17所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，包括重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其抗原结合片段。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其抗原结合片段或上述的抗体偶联物。
为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种检测铁蛋白的方法，包括：a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使上述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物，或者试剂或试剂盒与待检测样品中的铁蛋白接触形成免疫复合物；和b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述抗原的存在。
为了实现上述目的，根据本发明的第八个方面，提供了一种上述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒在制备检测铁蛋白产品中的用途。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种核酸、一种载体、一种细胞及一种制备上述抗体或其抗原结合片段的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Anti-FER 7G10 Rmb1的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
第一方面，本发明实施例提供了一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:17所示的重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:19所示的轻链可变区的三个互补决定区。
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。
CDR的定义方法是本领域公知的，CDR定义方法包括：Kabat定义、Chothia定义、IMGT定义、Contact定义和AbM定义。如本文所述，“Kabat定义”是指Kabat等，U.S.Dept.ofHealth and Human Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的定义系统。“Chothia定义”参见Chothia等，J Mol Biol 196：901-917(1987)。还有其他CDR定义方法可能不严格遵循上述方案之一，但仍会与Kabat定义的CDR区的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组的预测或实验结果可能会缩短或延长它们。示例性的定义的CDR列于下表1中,不同文献中的定义略有不同。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。需要说明的是，不限于表1中的其他方法定义的CDR也属于本公开的保护范围。
表1：CDR定义1
CDR Kabat AbM2 IMGT Chothia
HCDR1 H31～H353 H26～H353 H26～H33..55 H26～H32..344
HCDR2 H50～H65 H50～H58 H51～H57 H52～H56
HCDR3 H95～H102 H95～H102 H93～H102 H95～H102
LCDR1 L24～L34 L24～L34 L27～L32 L24～L34
LCDR2 L50～L56 L50～L56 L50～L51 L50～L56
LCDR3 L89～L97 L89～L97 L89～L97 L89～L97
1表1中所有CDR定义的编号是依据Kabat编号系统(参见下文)，重链上的氨基酸编号用“H+数字”表示，轻链上的氨基酸编号用“L+数字”表示。本领域普通技术人员可以明确地将该Kabat编号系统对应到任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所述，“Kabat编号”是指Kabat等，U.S.Dept.of Health and HumanServices，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的编号系统。
2如表1中使用的“AbM”具有小写“b”，是指通过Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
3如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在35位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在35A位；如果H35A和H35B同时存在，那么CDR-H1结束在35B位。
4如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在32位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在33位；如果H35A和H35B同时存在，那么CDR-H1结束在34位。
5如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在33位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在34位；如果H35A和H35B都存在时，那么CDR-H1结束在35位。
根据本发明的实施例，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2或LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Kabat系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Chothia系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由IMGT系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由AbM系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Contact系统定义。
在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact系统组合定义。
根据本发明的实施例，所述Kabat、Chothia、AbM或IMGT系统定义的HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2或LCDR3的氨基酸序列对应的Kabat编号位置如下：
CDR Kabat AbM IMGT Chothia
HCDR1 H31～H35A H26～H35A H26～H34 H26～H33
HCDR2 H50～H65 H50～H58 H51～H57 H52～H56
HCDR3 H95～H102 H95～H102 H93～H102 H95～H102
LCDR1 L24～L34 L24～L34 L27～L32 L24～L34
LCDR2 L50～L56 L50～L56 L50～L51 L50～L56
LCDR3 L89～L97 L89～L97 L89～L97 L89～L97
第二方面，本发明实施例提供了一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括如下互补决定区：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。
根据本发明的实施例，所述HCDRs和LCDRs由Kabat系统定义。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
在可选的实施方式中，第一方面或第二方面所述抗体或其抗原结合片段还具有HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的至少之一；
所述HFR1包括/如SEQ ID NO:7或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述HFR2包括/如SEQ ID NO:8或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述HFR3包括/如SEQ ID NO:9或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述HFR4包括/如SEQ ID NO:10或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述LFR1包括/如SEQ ID NO:11或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述LFR2包括/如SEQ ID NO:12或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述LFR3包括/如SEQ ID NO:13或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述LFR4包括/如SEQ ID NO:14或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段的各框架区氨基酸序列可以与上述对应框架区(SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13或14)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD＜2.79×10-9M的亲和力结合铁蛋白。
在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD≤10-7M、KD≤10-8M、KD≤10-9M、KD≤10-10M、KD≤10-11M或KD≤10-12M的亲和力结合铁蛋白。
在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD≤3.08×10-10M的亲和力结合铁蛋白。
抗体亲和力(KD)测定方法有很多种，根据检测原理可分为热力学检测方法、动力学检测方法和动态平衡检测方法。其中，热力学检测方法常见如等温滴定量热法(ITC)；动力学检测方法常见如表面等离子共振(SPR)及生物膜光干涉法(BLI)；动态平衡检测方法常见如酶联免疫吸附(ELISA)等。
在可选的实施方式中，KD的测定采用动力学检测方法；可选为，表面等离子共振，例如通过使用诸如系统的生物传感器系统。
第三方面，本发明实施例提供一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
在可选的实施方式中，上述第一方面、第二方面、第三方面所述的抗体或其抗原结合片段还包含恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的重链恒定区或多种恒定区区段的组合。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区包括IgG的CH1、IgG的铰链区、IgM的CH2、IgM的CH3和/或IgM的CH4。
在可选的实施方式中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在可选的实施方式中，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列(CH)如SEQ ID NO:15所示，所述轻链恒定区(CL)序列如SEQ ID NO:16所示。
需要说明的是，在其他的实施例中，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ IDNO:15或16)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab)2、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的抗原结合片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的抗原结合片段。
上述抗体的抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
第四方面，本发明提供一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，包括重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
第五方面，本发明提供一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其抗原结合片段。
在可选的实施方式中，上述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的生物素或生物素衍生物。
在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的标记物。
在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
在可选的实施方式中，所述胶体金属为胶体金。
在可选的实施方式中，上述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体。
在可选的实施方式中，所述固相载体选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中，所述固相载体包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
第六方面，本发明提供一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其抗原结合片段或上述的抗体偶联物。
如前所述，本发明一些实施方式或实施例中的抗体或其抗原结合片段能够有效与铁蛋白进行结合，因此，包含所述铁蛋白抗体或其抗原结合片段的试剂或试剂盒能够有效的对铁蛋白进行定性或定量检测。应用本发明提供的试剂或试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用铁蛋白和其抗体特异性结合性能的检测。如前所述，本发明一些实施方式或实施例中的抗体或其抗原结合片段具有与铁蛋白更高的结合活性或亲和力，因此包含所述抗体或其抗原结合片段的试剂或试剂盒具有更高的检测灵敏度或特异性。
第七方面，本发明提供一种检测铁蛋白的方法，包括：a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使上述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物，试剂或试剂盒与待检测样品中的铁蛋白接触形成免疫复合物；和b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述抗原的存在；
在可选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段结合。
在可选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与铁蛋白结合。
第八方面，本发明提供上述抗铁蛋白抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒在制备检测铁蛋白的产品中的用途。
第九方面，本发明提供一种编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
第十方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。
第十一方面，本发明提供含有上述载体的细胞。
第十二方面，本发明提供一种制备抗铁蛋白抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养如上所述的细胞。
在本发明公开了抗铁蛋白抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗铁蛋白抗体或其抗原结合片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其抗原结合片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗铁蛋白抗体或其抗原结合片段，其均属于本发明的保护范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1Anti-FER 7G10单克隆抗体的制备
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。分泌Anti-FER 7G10单克隆抗体的杂交瘤细胞株为本实验室制备的杂交瘤细胞株，复苏备用。
(1)抗体基因制备
从分泌Anti-FER 7G10单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。
(2)Anti-FER 7G10抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为321bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为354bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
(3)重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.70kb的Light Chain基因片段和1.42kb的Heavy Chain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2.重组抗体生产
提前复苏HEK293细胞，传代培养到200ml体系，使细胞密度达到3～5×106cells/ml细胞密度达到挑选抗体浓度及细胞，细胞活力>95％；离心清洗细胞，用培养基复溶，同时将细胞密度调整到2.9×106cells/ml洗细胞，用培养基复溶，同时，作为细胞稀释液。用培养基分别配制质粒DNA和转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入到质粒DNA稀释液中，混匀后室温静置放置15min；将该混合物在1min内缓慢加入细胞稀释液中，混匀后取样计数，记录并观察细胞转染后的活力，并将其放置于35℃恒温培养箱中培养，转速120rmp，CO2含量8％，13天后离心收样。将离心上清用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6ug层纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。
所得抗体命名为Anti-FER 7G10Rmb1，抗体Anti-FER 7G10Rmb1的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
实施例2抗体的性能检测
1.亲和力分析
提前稀释纯化抗体，同时对铁蛋白重组抗原(来自菲鹏生物)进行梯度稀释；利用已提前偶联羊抗鼠IgG的CM5芯片，在Biacore 8K+设备上测试抗原抗体的结合解离曲线，仪器自动拟合获得亲和力常数、结合速率、解离速率。(KD表示平衡解离常数即亲和力常数；ka表示结合速率；kd表示解离速率)
表2亲和力数据
样品名称 KD ka kd
对照 2.79E-09 5.31E+05 1.48E-03
Anti-FER 7G10Rmb1 3.08E-10 8.21E+06 2.53E-03
2.活性鉴定
包被液(主要成分NaHCO3)稀释羊抗鼠IgG 1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na2HPO4+Nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体，100uL/孔，37℃,60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释的铁蛋白重组抗原(来自菲鹏生物)，每孔100uL，37℃,40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记HRP的铁蛋白配对抗体(来自菲鹏生物，与纯化抗体能配对)，每孔100uL，37℃,30min；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。
备注：A液(主要成份柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)；B液(主要成份柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)；终止液(EDTA·2Na+浓H2SO4)
表3活性数据
浓度(ng/ml) 15.625 7.813 3.906 1.953 0.977 0.000
对照 1.395 0.801 0.463 0.195 0.042 0.016
Anti-FER 7G10Rmb1 2.005 1.216 0.705 0.338 0.169 0.017
3.稳定性考核
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表4为抗体Anti-FER 7G10Rmb1考核21天的酶免活性检测OD结果。
表4稳定性数据
样品浓度(ng/ml) 7.813 3.906 0.000
4℃，21天样品 1.225 0.725 0.037
-80℃，21天样品 1.237 0.731 0.039
37℃，21天样品 1.229 0.717 0.035
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本申请涉及的部分氨基酸序列如表5所示：

Claims (10)

1.一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:17所示的重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:19所示的轻链可变区的三个互补决定区。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述可变区的互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义。
3.一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括如下互补决定区：
HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；
HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；
LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；和
LCDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段还具有HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的至少之一；
所述HFR1包括SEQ ID NO:7或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述HFR2包括SEQ ID NO:8或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述HFR3包括SEQ ID NO:9或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述HFR4包括SEQ ID NO:10或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述LFR1包括SEQ ID NO:11或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述LFR2包括SEQ ID NO:12或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述LFR3包括SEQ ID NO:13或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
所述LFR4包括SEQ ID NO:14或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段以KD＜2.79×10-9M的亲和力结合铁蛋白。
4.一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和/或轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO:19所示；
可选地，所述抗体或其抗原结合片段还包含恒定区；
可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；
可选地，所述重链恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的重链恒定区或多种恒定区区段的组合；
可选地，所述重链恒定区包括IgG的CH1、IgG的铰链区、IgM的CH2、IgM的CH3和/或IgM的CH4；
可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；
可选地，所述恒定区的种属来源为小鼠；
可选地，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:15所示或与其具有至少80％同一性；
可选地，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:16所示或与其具有至少80％同一性；
可选地，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
5.一种抗铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，包括重链和/或轻链，其特征在于，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包括权利要求1至5任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的生物素或生物素衍生物；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的标记物；
可选地，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物；
可选地，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体。
7.一种试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1至5任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物。
8.一种检测铁蛋白的方法，其特征在于，包括：
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的抗体偶联物，或者权利要求7所述的试剂或试剂盒与待检测样品中的铁蛋白接触形成免疫复合物；和
b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述抗原的存在；
可选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段结合；
可选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与铁蛋白结合。
9.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的抗体偶联物，或者权利要求7所述的试剂或试剂盒在制备检测铁蛋白产品中的用途。
10.一种核酸、载体、细胞或制备权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述核酸编码权利要求1至5任一项所述的抗体或其抗原结合片段；所述载体含有编码权利要求1至5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸；所述细胞含有上述核酸或载体；所述方法包含上述细胞。
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