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CN119592595B - 一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法 - Google Patents

一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法

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CN119592595B CN202411771010.5A CN202411771010A CN119592595B CN 119592595 B CN119592595 B CN 119592595B CN 202411771010 A CN202411771010 A CN 202411771010A CN 119592595 B CN119592595 B CN 119592595B
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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe‑Fe]氢化酶耐氧性的方法，属于酶催化技术领域。该方法包括如下步骤：构建能够在大肠杆菌中表达[Fe‑Fe]氢化酶和引导蛋白及[Fe‑Fe]氢化酶的促成熟蛋白的两个质粒；将两个质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，进行预培养；将预培养物转移至新培养基中，进行有氧培养，培养一段时间后，测定其OD600值，将培养物转移至厌氧手套箱中，厌氧培养，离心，得到含有巨型细胞器的大肠杆菌。本发明提供一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe‑Fe]氢化酶耐氧性的方法，通过在大肠杆菌中构建巨型细胞器，有效地增强了[Fe‑Fe]氢化酶的耐氧性和稳定性，为氢气的生产提供了一种新的可持续方法。

Description

一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性 的方法
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法。
背景技术
氢气作为一种清洁能源，在应对气候变化、减少温室气体排放以及推动低碳经济发展中扮演着重要角色。当前，氢气生产主要依赖于化石燃料，尤其是通过甲烷制氢和煤制氢等方法，这些方法的碳足迹较高。为了实现氢气的可持续生产，发展新型清洁的制氢方法变得尤为重要，其中光驱动水分解系统因其潜力而备受关注。
尽管贵金属光/电催化剂(如Pt和Pd)能有效降低反应过电位并加速氢气生成，但这些材料成本高昂且资源有限，限制了其大规模应用的可行性。相比之下，天然存在的氢化酶因其在生物系统中高效、选择性强的催化特性而受到关注。氢化酶能在低过电位下催化生成氢气，并在自然条件下表现出良好的稳定性，因此在光驱动制氢的研究中显示出巨大潜力。然而，氢化酶对氧气高度敏感，暴露在氧气中会导致活性显著降低甚至完全失活，且提取和纯化过程复杂且成本较高，增加了其应用难度。
为了保护氢化酶在有氧条件下的活性，研究人员尝试通过仿生策略设计蛋白笼、羧酶体和有机框架等微区室封装氢化酶。然而，现有的天然蛋白质自组装体(如铁蛋白、病毒外壳)通常直径在20至100纳米之间，其封装能力和隔氧效果以及结构稳定性有限，难以满足氢化酶在氧气存在下的高效稳定需求。此外，设计人工细菌聚集体通过氧代谢活动形成局部低氧微环境，虽然可以维持氢化酶活性，但这可能会增加系统的复杂性。这表明单一结构设计难以满足增强氢化酶抵御氧气能力的要求，因此优化对氢化酶的仿生封装策略显得尤为重要。
发明内容
本发明旨在提供一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，通过在大肠杆菌中构建巨型细胞器，有效地增强了[Fe-Fe]氢化酶的耐氧性和稳定性，为氢气的生产提供了一种新的可持续方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，包括如下步骤：
S1、构建能够在大肠杆菌中表达[Fe-Fe]氢化酶和引导蛋白及[Fe-Fe]氢化酶的促成熟蛋白的两个表达质粒；
S2、将S1中得到的两个质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将其在3毫升Luria Bertani培养基中预培养6h，得到预培养物；
S3、将S2中得到的预培养物以1:50转移至新的Luria Bertani培养基中，进行有氧培养，培养一段时间后，测定其OD600值，将培养物转移至厌氧手套箱中，加入诱导剂，在厌氧条件25℃下振荡培养20h，离心，得到含有巨型细胞器的大肠杆菌。
优选的，S1中所述[Fe-Fe]氢化酶为HydA1，引导蛋白为CipA；[Fe-Fe]氢化酶的促成熟蛋白包括：HydE、HydF和HydG。
优选的，所述两个表达质粒为：pETDuet-1/HydE+HydA-CipA和pCDFDuet-1/HydF+HydG。
优选的，S2中预培养条件为37℃，200rpm下有氧培养。
优选的，S2中在Luria Bertani培养基中补充100μg/mL氨苄青霉素和40μg/mL链霉素。
优选的，S3中有氧培养条件为37℃，200rpm。
优选的，S3中，当OD600达到0.4-0.6时，将培养物转移至厌氧手套箱中。
优选的，S3中，所述诱导剂由2.5mmol/L富马酸钠、2mmol/LL-半胱氨酸、250μg/mL柠檬酸铁铵及0.1mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷组成。
优选的，其特征在于，S3中离心工艺参数具体为5000rpm/min，离心时间为5min。
技术方案的原理：利用基因工程技术改造大肠杆菌，分别选取模型酶和引导蛋白：[Fe-Fe]氢化酶(HydA1)和引导蛋白(CipA)。经诱导后，在大肠杆菌细胞质形成具有产氢活性的巨型细胞器。引导蛋白之间通过强氢键和疏水作用，使得与其融合表达的[Fe-Fe]氢化酶发生自组装形成巨型细胞器。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明公开了一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，通过基因工程手段，将[Fe-Fe]氢化酶和引导蛋白(CipA)融合表达，构建[Fe-Fe]氢化酶巨型细胞器，显著增强了[Fe-Fe]氢化酶在氧气氛围下的耐氧性和稳定性。通过引导蛋白之间的疏水和氢键相互作用形成致密的球性蛋白质纳米颗粒，对氧气渗透形成物理屏障，并且CipA蛋白质上有独特的氧气结合位点，实现了[Fe-Fe]氢化酶在有氧条件下的氢气产生。此外，巨型细胞器与光敏剂结合可作为光驱动制氢平台，展示了在高氧气浓度下保持电子传递和一定的光催化活性，具有良好的抗氧性和稳定性。这一技术不仅提高了[Fe-Fe]氢化酶的催化效率和稳定性，还降低了提取和纯化的成本，为氢气的生产提供了一种新的、可持续的方法，有助于推动低碳经济的发展。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的含有巨型细胞器的大肠杆菌的结构示意图；
图2为实施例1提供的两个质粒的示意图，其中，图2中的a为由空质粒pETDuet-1构建表达质粒pETDuet-1/HydE+HydA-CipA的示意图，图2中的b为为由空质粒pCDFDuet-1构建表达质粒pCDFDuet-1/HydF+HydG的示意图；
图3为实施例1提供的含有巨型细胞器的大肠杆菌的表征结果，其中，图3中的a为含有巨型细胞器的大肠杆菌的光学显微结果，标尺为5μm，图3中的b为巨型细胞器的光学显微结果，标尺为5μm，图3中的c为巨型细胞器的透射电子显微结果，标尺为1μm，图3中的d为巨型细胞器的平均直径统计图；
图4为实施例1提供的含有巨型细胞器的大肠杆菌对[Fe-Fe]氢化酶的催化活性评估结果，其中，图4中的a为巨型细胞器中[Fe-Fe]氢化酶活性评估示意图，图4中的b为[Fe-Fe]氢化酶在不同温度条件下酶活性统计图，图4中的c为[Fe-Fe]氢化酶在不同pH条件下酶活性统计图，图4中的d为[Fe-Fe]氢化酶氢气生成速率统计图；
图5为巨型细胞器的[Fe-Fe]氢化酶暴露在空气中不同时间的酶活保有量；
图6为分子动力学模拟试验结果，其中，图6中的a为氧气分子与引导蛋白CipA的结合位点，图6中的b为引导蛋白CipA的82位赖氨酸与99位半胱氨酸形成氧气的结合口袋，图6中的c为引导蛋白CipA的39位的缬氨酸与58位天冬酰胺形成氧气的结合口袋；
图7为巨型细胞器可作为半人工光合系统的构建平台，其中图7中的a为EY与巨型细胞器耦合构建半人工光合系统的示意图，图7中的b为EY与巨型细胞器结合的光学显微结果，标尺为5μm，图7中的c为EY与巨型细胞器结合的荧光显微结果，标尺为5μm，图7中的d为在不同氧气氛围下，半人工光合系统在光照下随时间的产氢量。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
质粒pETDuet-1和pCDFDuet-1的合成和购买于生工生物。其余试剂购买于阿拉丁。
在本发明中，若无特殊说明，其他试验材料及仪器设备均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1
S1、由空质粒pETDuet-1和pCDFDuet-1分别构建能够在大肠杆菌中表达[Fe-Fe]氢化酶HydA1和引导蛋白CipA及[Fe-Fe]氢化酶的促成熟蛋白HydE、HydF和HydG的两个质粒：pETDuet-1/HydE+HydA-CipA和pCDFDuet-1/HydF+HydG；
S2、将S1中得到的两个质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，命名为FdH-CipA。将其在3毫升Luria Bertani培养基中预培养6h，培养基中补充100μg/mL氨苄青霉素和40μg/mL链霉素，预培养条件为37℃，200rpm下有氧培养，得到预培养物；
S3、将S2中得到的预培养物以1:50转移至新的Luria Bertani培养基中，在37℃，200rpm条件下，进行有氧培养，培养一段时间后，测定其OD600值，当OD600达到0.6，将培养物转移至厌氧手套箱中，在厌氧条件25℃下振荡培养20h，加入2.5mmol/L富马酸钠、2mmol/L L-半胱氨酸、250μg/mL柠檬酸铁铵及0.1mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷作为诱导剂，5000rpm/min下离心5min后，得到含有巨型细胞器的大肠杆菌。
对比例1同实施例1，区别之处在于：构建能够在大肠杆菌中表达[Fe-Fe]氢化酶HydA1及[Fe-Fe]氢化酶的促成熟蛋白HydE、HydF和HydG的两个质粒pETDuet-1和pCDFDuet-1；命名为FdH，其不表达引导蛋白CipA，得到不含[Fe-Fe]氢化酶巨型细胞器。
通过以下试验对实施例1和对比例1进行效果验证：
如图2的质粒构建示意图所示，[Fe-Fe]氢化酶HydA1和引导蛋白CipA及[Fe-Fe]氢化酶的促成熟蛋白HydE、HydF和HydG的分别转入两个质粒pETDuet-1和pCDFDuet-1，构建质粒pETDuet-1/HydE+HydA-CipA和pCDFDuet-1/HydF+HydG。并按照图1所示，将两个质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)。经预培养和扩大培养后，进行厌氧诱导得到含有巨型细胞器的大肠杆菌。
1.通过显微镜对实施例1提供的大肠杆菌进行表征，结果如图3。
由图3中的a可知，实施例1内含有蛋白质结晶包涵体，其折射率与大肠杆菌内其他成分存在差异，在显微镜下观察到细菌两极的明显阴影现象，表明含有[Fe-Fe]氢化酶的巨型细胞器成功表达。为进一步确认巨型细胞器的存在，采用超声波破碎法裂解大肠杆菌，释放出胞内的巨型细胞器，由图3中的b可知，巨型细胞器呈规则的球形结构。由图3中的c和图3中的d可知，透射电子显微镜下，观察到具有圆形纳米颗粒特征的巨型细胞器，并且表现出明显的电子不透过性，这些细胞器的平均直径为725.59±9.92nm。
2.对[Fe-Fe]氢化酶进行催化活性评估，试验方案如下：在厌氧手套箱中，取适量的巨型细胞器溶液，保证各处理组的巨型细胞器浓度一致，加入5mM的MV2+和20mM的连二亚硫酸(NaDT)，放入不同温度的恒温培养箱中进行反应。结果如图4。
由图4中的a可知，连二亚硫酸能够有效地将甲基紫精(MV2+)还原为MV+，为[Fe-Fe]氢化酶制氢反应提供所需的电子，结果表明CipA介导的巨型人工细胞器显著增强了封装[Fe-Fe]氢化酶的热稳定性。
如图4中的b所示，[Fe-Fe]氢化酶在35℃的最适温度下，实施例1封装于巨型细胞器中的酶活性达到了2024.21±63.31nmol H2mg-1min-1。且在35℃到60℃的温度范围内，酶活性保持稳定。相比之下，对比例1游离[Fe-Fe]氢化酶在60℃加热60min后，活性几乎丧失(下降了97.65％)。而实施例1FdH-CipA封装的[Fe-Fe]氢化酶在相同条件下仍保留了28.29％的活性，表明巨型细胞器能够有效保护[Fe-Fe]氢化酶缓解高温的影响。
由图4中的c可知，在pH稳定性方面，[Fe-Fe]氢化酶的最适pH为7.5。实验结果显示，在弱酸性pH条件下，实施例1封装[Fe-Fe]氢化酶的活性与对比例1未封装[Fe-Fe]氢化酶的活性差异不显著。然而，在碱性环境中，特别是在pH 11的强碱性条件下，实施例1中封装[Fe-Fe]氢化酶的产氢活性仍保持在29.81％。
由图4中的d可知，实施例1[Fe-Fe]氢化酶巨型细胞器在pH 7.5和35℃条件下最大氢气生成速率为4577.75±352.82nmol mg-1min-1。在5mM的MV下测量的人工细胞器产生的氢气量随时间线性增加，表明这一过程具有催化性质。与对比例1游离[Fe-Fe]氢化酶相比，实施例1显著提高了氢气生产的效率，说明其在增强[Fe-Fe]氢化酶催化活性方面表现出明显的优势。这种提升的催化活性与巨型细胞器内特殊的微环境有关，有助于提高[Fe-Fe]氢化酶的稳定性和反应速率。
3.验证实施例1含有巨型细胞器的大肠杆菌对[Fe-Fe]氢化酶氧气抵抗作用，试验方案如下：将一定量的巨型细胞器溶液，放置在空气氛围中，静置放置20，40，80，160，320min。随后移入厌氧手套箱除氧气，加入5mM的MV2+和20mM连二亚硫酸钠反应90min，结果如图5。
由图5可知，在暴露于环境空气320min后，实施例1巨型细胞器的催化活性仍保持在18.89％，而对比例1游离[Fe-Fe]氢化酶在数分钟后几乎完全丧失活性。这表明巨型细胞器能够有效地保护[Fe-Fe]氢化酶免受氧气的氧化损害，显著提高其在实际应用中的稳定性与耐用性。此前有研究指出，酶催化反应中的氧化损伤往往限制了酶的使用寿命，而封装在细胞器中的酶能够有效避免氧气的损害，从而提高催化效率和稳定性。
4.分子动力学模拟试验，试验方案如下，使用分子动力学软件GROMACS对氧气和CipA结合进行模拟，CipA蛋白质结构基于实验获得的晶体结构(PDB ID:7XHS)建模。20个氧气分子(0.035M，远高于水中饱和溶解氧的浓度)自由分布在整个模拟系统中，与CipA蛋白无约束地相互作用。所有能量最小化和分子动力学模拟均使用AMBER99SB-ILDN protein,nucleicABBER94力场，在周期性边界条件下进。由于所有使用的分子均未包含极化力场参数，因此未使用极化力场。模拟系统的温度通过双Nosé-Hoover温控器维持在300K，压力通过Andersen-Hoover压控器维持在1.0atm。结果如图6。
由图6可知，CipA能有效结合氧气，延缓了其进入蛋白质内部的速度，从而减缓[Fe-Fe]氢化酶失活的过程。为了进一步揭示氧气结合的机制，分析显示氧气在CipA的结合口袋内停留时间较长，并且识别出了两种主要的结合模式。第一种结合模式是“赖氨酸-半胱氨酸”口袋，其中82位赖氨酸和99位半胱氨酸通过空间排列形成一个氧气结合的口袋。赖氨酸和半胱氨酸的侧链带有极性基团，赖氨酸的氨基和半胱氨酸的硫醇基能够与氧气形成氢键或极性相互作用，这有助于稳定氧气在口袋内。此外，赖氨酸和半胱氨酸的空间排列适合氧气分子的尺寸，使氧气较为稳定地位于口袋内。第二种结合模式出现在缬氨酸-天冬酰胺口袋中，即39位缬氨酸与58位天冬酰胺通过空间结构形成口袋与氧气相互作用。缬氨酸是疏水性氨基酸，而天冬酰胺则带有酰胺基团，可以形成氢键。缬氨酸的疏水性有助于排斥水分子，为氧气创造了一个稳定的疏水微环境，而天冬酰胺的酰胺基团则为氧气提供了弱的极性相互作用，增强了其稳定性。
5.研究在不同氧气环境下，对实施例1提供的含有巨型细胞器的大肠杆菌在光催化制氢中的表现。使用含有100μM曙红Y(EY)作为光敏剂和100mM三乙醇胺(TEOA)作为电子供体的水溶液，结合含[Fe-Fe]氢化酶的巨型细胞器，研究了体系在无氧化还原介质和有氧气的情况下的光驱动制氢性能。结果如图7。
由图7中的a可知，EY可以与巨型细胞器发生静电相互作用形成杂化体，使其具备荧光性质。同时巨型细胞器赋予了半人工光合系统耐氧性质。
由图7中的b可知，EY成功嵌入或附着在巨型细胞器的表面或内部(EY@FdH-CipA)，显现出明亮的绿色荧光。光催化结果显示该EY@FdH-CipA能够在没有可溶性氧化还原介质的情况下实现高效光催化反应，氢气生成速率为0.64±0.09μmol H2 hour-1，并且由图7中的c可知，在前2小时内表现出接近线性的产氢趋势。这一结果表明，在稳定的光照条件下，体系能够维持持续的电子转移效率，促进有效的氢气生成。随着氧气浓度的增加，光催化活性明显下降。然而，即使在21％氧气浓度的环境下，体系仍然保留了一定的光催化活性，相当于无氧条件下活性的6.34±2.53％。这一结果表明，EY@FdH-CipA仍能在高氧气浓度下保持电子传递和一定的光催化活性，展示了其良好的抗氧性和稳定性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建能够在大肠杆菌中表达[Fe-Fe]氢化酶和引导蛋白、[Fe-Fe]氢化酶的促成熟蛋白的两个表达质粒；
S2、将S1中得到的两个质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将其在3毫升Luria Bertani培养基中预培养6h，得到预培养物；
S3、将S2中得到的预培养物以1:50转移至新的Luria Bertani培养基中，进行有氧培养，培养一段时间后，测定其OD600值，将培养物转移至厌氧手套箱中，加入诱导剂，在厌氧条件25℃下振荡培养20h，离心，得到含有巨型细胞器的大肠杆菌；
S1中所述[Fe-Fe]氢化酶为HydA1，引导蛋白为CipA；[Fe-Fe]氢化酶的促成熟蛋白包括：HydE、HydF和HydG；
S3中，所述诱导剂由2.5mmol/L富马酸钠、2mmol/L L-半胱氨酸、250μg/mL柠檬酸铁铵及0.1mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷组成；
S1、由空质粒pETDuet-1和pCDFDuet-1分别构建能够在大肠杆菌中表达[Fe-Fe]氢化酶HydA1和引导蛋白CipA及[Fe-Fe]氢化酶的促成熟蛋白HydE、HydF和HydG的两个质粒：pETDuet-1/HydE+HydA-CipA和pCDFDuet-1/HydF+HydG。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，其特征在于，S2中预培养条件为37℃，200rpm下有氧培养。
3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，其特征在于，S2中在Luria Bertani培养基中补充100μg/mL氨苄青霉素和40μg/mL链霉素。
4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，其特征在于，S3中有氧培养条件为37℃，200rpm。
5.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，其特征在于，S3中，当OD600达到0.4-0.6时，将培养物转移至厌氧手套箱中。
6.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌中构建巨型细胞器增强[Fe-Fe]氢化酶耐氧性的方法，其特征在于，S3中离心工艺参数具体为5000rpm/min，离心时间为5min。
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