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CN119654333A - 使用病毒核衣壳基于可结晶蛋白产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的平台 - Google Patents

使用病毒核衣壳基于可结晶蛋白产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的平台 Download PDF

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CN119654333A
CN119654333A CN202380055824.6A CN202380055824A CN119654333A CN 119654333 A CN119654333 A CN 119654333A CN 202380055824 A CN202380055824 A CN 202380055824A CN 119654333 A CN119654333 A CN 119654333A
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CN
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protein
target protein
crystallizable
expression vector
fusion
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Application number
CN202380055824.6A
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孙明贤
朴成弦
韩在婉
金成宰
金承厚
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Vickers Diem Ltd
Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University
Original Assignee
Vickers Diem Ltd
Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University
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Publication date
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Abstract

本发明用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体包括编码作为靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸。此外，本发明产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的方法包括制造用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体，该表达载体包括编码靶蛋白以及作为该靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸；通过将用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的该表达载体引入宿主细胞中来产生转化体；以及培养该转化体。

Description

使用病毒核衣壳基于可结晶蛋白产生靶蛋白融合的自组装纳 米颗粒的平台
技术领域
本发明涉及使用病毒核衣壳基于可结晶蛋白产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的平台。更具体地，本发明涉及一种表达载体，该表达载体可以有效地产生自组装纳米颗粒，这些自组装纳米颗粒与靶蛋白、特别是在大肠杆菌中不溶性表达的难表达蛋白(DtEP)融合，并且使用作为融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳在宿主细胞、特别是大肠杆菌中将该靶蛋白例如以免疫学上有意义的结构呈递在表面上，本发明涉及用该表达载体转化的宿主细胞，以及使用该表达载体产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的方法。
背景技术
在用于应对传染病的疫苗技术中，最近开发了一种嵌合VLP(virus-likeparticle，病毒样颗粒)技术，该技术用于将外源致病性抗原引入很好地形成聚合物结构的病毒样颗粒(VLP)结构中，并且已经用于开发靶向各种病原体的疫苗。这种嵌合VLP将外源致病性抗原呈递在由另一种特定病毒的结构蛋白或自组装蛋白构成的基于VLP的结构的表面上。
使用化学缀合或基因融合方法将外源抗原引入基于VLP的结构中。化学缀合方法将单独制备的外源抗原化学融合到已经通过共价键合制备的基于VLP的结构上，但是具有抗原在特定方向上排列困难和呈递抗原的密度较低的缺点。另一方面，基因融合法具有如下优点：通过在DNA水平融合表达VLP结构形成蛋白的基因和靶抗原蛋白的基因，可以通过更简单的方法制备嵌合VLP。然而，该方法具有可引入的外源抗原受限的问题，特别是在大肠杆菌表达系统用于高效快速产生时，由于缺乏翻译后分子伴侣或加工，例如形成不溶性蛋白聚集体而导致的异常蛋白表达问题。因此，有必要开发技术来解决上述问题。
发明内容
技术问题
本发明旨在提供一种表达载体，该表达载体可以有效地产生自组装纳米颗粒，这些纳米颗粒与靶蛋白、特别是在大肠杆菌中不溶性表达的难表达蛋白(DtEP)融合，并且在宿主细胞、特别是大肠杆菌中将该靶蛋白例如以免疫学上有意义的结构呈递在表面上。
本发明还涉及提供一种宿主细胞，该宿主细胞用表达载体转化以有效地产生自组装纳米颗粒。
本发明还涉及提供一种使用表达载体和/或宿主细胞有效地产生自组装纳米颗粒的方法。
技术方案
本发明提供了一种用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体，该表达载体包括编码作为靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸。
本发明还提供一种宿主细胞，该宿主细胞用表达载体转化以产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒。
本发明还提供一种产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的方法，该方法包括制造用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体，该表达载体包括编码靶蛋白以及作为该靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸；通过将用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的该表达载体引入宿主细胞中来产生转化体；以及培养该转化体。
有益效果
根据本发明，可以在宿主细胞、特别是大肠杆菌中有效地产生自组装纳米颗粒，这些自组装纳米颗粒与靶蛋白、特别是在大肠杆菌中不溶性表达的难表达蛋白(DtEP)融合，并且将靶蛋白例如以免疫学上有意义的结构呈递在表面上。
附图说明
图1示出了作为可结晶蛋白的示例的肺结核分枝杆菌来源的包封蛋白的结构。
图2示出了根据本发明的一个实施方案的表达载体(T7，T7启动子；NC，病毒核衣壳编码位点；Enc，包封蛋白编码位点；靶点，靶蛋白编码位点；MCS，多克隆位点)。
图3示出了本发明的示意性概念。
图4示出了用于探索作为融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳(NC)的组合用于产生自组装纳米颗粒的适用性的融合蛋白构建体。
图5和图6分别示出了根据本发明的一个实施方案的表达载体中的融合蛋白构建体区域。
图7示出了证实图4的融合蛋白构建体在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果。
图8示出了通过透射电子显微镜(TEM)观察通过图4的融合蛋白构建体的表达获得的产物(自组装纳米颗粒)的结果。
图9示出了通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析通过图4的融合蛋白构建体的表达获得的产物(自组装纳米颗粒)的结果。
图10示出了通过冷冻电子显微镜(Cryo-EM)观察通过图4的融合蛋白构建体的表达获得的产物(自组装纳米颗粒)的结果。
图11示出了分析通过图4的融合蛋白构建体的表达获得的产物(自组装纳米颗粒)上的融合蛋白的N末端和C末端区域的位置的结果。
图12示出了证实图5的融合蛋白构建体在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果。
图13示出了通过TEM观察通过图5的融合蛋白构建体的表达获得的产物(自组装纳米颗粒)的结果。
图14示出了探索通过图5的融合蛋白构建体的表达获得的产物(自组装纳米颗粒)作为抗原的功能性的结果。
图15示出了证实图6的融合蛋白构建体在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果。
图16示出了通过TEM观察通过图6的融合蛋白构建体的表达获得的产物(自组装纳米颗粒)的结果。
具体实施方式
根据本发明的一个实施方案，提供了用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体，该表达载体包括编码作为靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸。
本文所用的术语“靶蛋白”是指由本领域普通技术人员大量产生的蛋白，包括在将编码该蛋白的多核苷酸插入重组载体中后可以在宿主细胞中表达的所有蛋白。
在本发明中，靶蛋白可以选自抗原、抗体、细胞受体、酶、结构蛋白、血清和细胞蛋白，但本发明不限于此。
本文所用的术语“表达载体”是用于表达编码感兴趣的多肽的多核苷酸的载体，该多核苷酸已被引入异源或同源宿主细胞中，并且是指环状或线性多核苷酸，例如DNA或RNA分子。表达载体可以包括启动子序列和/或终止子序列，并且还可以包括用于载体所需的组分，诸如复制起点、选择标记、聚腺苷酸化信号等。
本发明的表达载体可以是质粒、病毒载体、噬菌体颗粒或基因组插入物，并且可以在不考虑宿主细胞的基因组的情况下进行复制或在被引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中。
本发明的表达载体可以包括编码靶蛋白的多核苷酸，或将来可用于包括编码靶蛋白的多核苷酸。特别地，在后一种情况下，作为允许容易地包含编码靶蛋白的多核苷酸的组分，优选包含通常称为多克隆位点(multiple cloning site，MSC)的限制酶识别位点。
本发明基于以下新的研究成果：当将可结晶蛋白和病毒核衣壳用作靶蛋白的融合配偶体时，可以有效地表达靶蛋白(例如，当不使用融合配偶体时或当使用另一种现有的融合配偶体时不溶性表达的蛋白可以可溶性表达)；并且当将可结晶蛋白和病毒核衣壳用作靶蛋白的融合配偶体时，可以有效地产生其中靶蛋白自组装的纳米颗粒。
特别地，在本发明中用作融合配偶体的病毒核衣壳具有最小化对靶蛋白的干扰的优点，因为病毒核衣壳具有非常小的尺寸(短肽)。当使用这种融合配偶体时，存在产生具有提高的溶解度的靶蛋白的优点，并且通常，融合配偶体的尺寸越大，在增强靶蛋白的水溶性方面越有帮助。然而，由于融合配偶体的大小而增加的对相邻靶蛋白的结构干扰也可能阻碍生理活性结构的产生。因此，如果可能，发现尺寸虽小，但增加靶蛋白的溶解度和活性的融合配偶体是非常重要的。特别地，在本发明中，用作融合配偶体的病毒核衣壳具有非常小的尺寸(短肽)，因此其具有最小化对靶蛋白的结构干扰和最小化对靶蛋白单体的自组装(在本发明中，自组装成纳米颗粒)的结构干扰的优点。通常，为了避免这种结构干扰，常规技术需要在产生后通过用特异性切割酶处理融合蛋白来去除融合配偶体，因此，由于使用昂贵的酶和附加的切割而增加的生产成本以及纯化过程仍然是障碍。本发明可以在技术上显著地改善这个问题。
此外，根据本发明，存在利用病毒核衣壳的锌结合结构域的优点。例如，通过利用病毒核衣壳的锌结合结构域，例如锌亲和纯化方法，可容易地纯化融合蛋白，而无需用于纯化的单独组分，诸如组氨酸标签。
在本发明中，病毒核衣壳可以是常规已知的病毒核衣壳，并且它可以是病毒核衣壳的片段或变体，只要保留本发明的活性即可，换句话说，保留形成自组装纳米颗粒的活性，在这些自组装纳米颗粒中，病毒核衣壳与可结晶蛋白一起作为靶蛋白的融合配偶体，以允许该靶蛋白特别地在大肠杆菌中可溶性表达并特别地以免疫学上有意义的结构呈递在表面上。
在本发明中，病毒核衣壳可以是逆转录病毒(例如人免疫缺陷病毒-1(Humanimmunodeficiency virus-1，HIV-1)、SIV或MuLV)的核衣壳。
在本发明中，病毒核衣壳优选地是人免疫缺陷病毒(HIV)的核衣壳。
在本发明中，病毒核衣壳可以包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或者99％或更多序列同一性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸序列。病毒核衣壳优选地包括保留SEQ ID NO:1的氨基酸14、17、22和27、更优选地氨基酸14、17、22、27、35、38、43和48、甚至更优选地氨基酸6、9、10、13、14、17、19、22、25、27、28、31、32、33、35、37、38、40、43、46、48和51并且满足上述序列同一性的氨基酸序列。
在本发明中，编码病毒核衣壳的多核苷酸包括与SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列优选地具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或者99％或更多序列同一性的核苷酸序列，或者SEQID NO:2或3的核苷酸序列。编码病毒核衣壳的多核苷酸优选地包括编码优选地保留SEQ IDNO:1的氨基酸14、17、22和27、更优选地氨基酸14、17、22、27、35、38、43和48、甚至更优选地氨基酸6、9、10、13、14、17、19、22、25、27、28、31、32、33、35、37、38、40、43、46、48和51并且满足上述序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
本文所用的序列同一性是指氨基酸序列与参考氨基酸序列之间或者核苷酸序列与参考核苷酸序列之间的序列同一性。序列同一性可通过比较可以比对进行比较的序列的位置来确定。当比较序列的位置被相同的氨基酸或碱基占据时，分子在该位置处是相同的。氨基酸或核苷酸序列之间的同一性程度与相同氨基酸或核苷酸序列共有的每个位置处相同氨基酸或核苷酸的数量有关。例如，使用多种比对算法和/或程序，包括FASTA或BLAST，可以计算两个序列之间的同一性。
在本发明中，可以非限制地使用可结晶蛋白，只要每种蛋白是具有形成组装体(例如作为一个单元的笼形复合蛋白)的活性的蛋白即可。例如，作为可结晶蛋白，可以使用包封蛋白或铁蛋白。
在本发明中，可以使用常规已知的包封蛋白或铁蛋白以及包封蛋白或铁蛋白的片段，只要保持形成组装体(例如作为一个单元的笼形复合蛋白)的活性即可。
可以使用来源于生物体诸如肺结核分枝杆菌、海栖热袍菌、强烈火球菌或黄色粘球菌的包封蛋白，并且优选地，使用来源于肺结核分枝杆菌的包封蛋白。
在本发明中，可结晶蛋白优选地包括与SEQ ID NO:4或6的氨基酸序列具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或者99％或更多序列同一性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:4或6的氨基酸序列。
在本发明中，编码可结晶蛋白的多核苷酸优选地包括与SEQ ID NO:5或7的氨基酸序列具有50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或者99％或更多序列同一性的核苷酸序列，或者SEQID NO:5或7的核苷酸序列。
本发明的表达载体可用于在选自包括原核生物和真核生物的所有生物体，优选地埃希氏杆菌属微生物，更优选地大肠杆菌的细胞中产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒。
在本发明的表达载体中，编码可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸还可包括其他组分，例如，用于插入靶蛋白编码多核苷酸的克隆位点，诸如限制性酶识别位点，例如多克隆位点(MCS)；用于在靶蛋白和融合配偶体之间和/或在融合配偶体之间(在可结晶蛋白和病毒核衣壳之间)提供间隙的接头序列；标签序列，诸如组氨酸标签序列；和/或用于切割表达的融合蛋白的一部分的蛋白酶识别位点编码序列。如果需要的话，各部件可以各种方式布置，或者这些部件的数量可以变化。
在一个实施方案中，本发明的表达载体包括编码作为靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸，并且该多核苷酸编码可结晶蛋白和与该可结晶蛋白的N末端连接的病毒核衣壳，并且包括用于将靶蛋白连接到该可结晶蛋白的C末端的靶蛋白编码位点或克隆位点。根据这种形式，可以使得靶蛋白暴露在纳米颗粒的外部并且病毒核衣壳位于纳米颗粒的内部的方式产生自组装纳米颗粒，这在产生用于免疫应答的抗原呈递纳米颗粒中特别有效。作为实施方案的具体示例，多核苷酸包括构建体，其中启动子、病毒核衣壳编码位点、可结晶蛋白编码位点、靶蛋白编码位点或用于插入靶蛋白编码多核苷酸的克隆位点(例如，限制性酶识别位点，例如MCS)和终止子以5’至3’方向依次可操作地连接。
在另一个实施方案中，本发明的表达载体包括编码作为靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸，并且该多核苷酸编码可结晶蛋白和与该可结晶蛋白的N末端连接的病毒核衣壳，并且包括靶蛋白编码位点或用于在该可结晶蛋白和该病毒核衣壳之间连接靶蛋白的克隆位点。作为实施方案的具体示例，多核苷酸包括构建体，其中启动子、病毒核衣壳编码位点、靶蛋白编码位点或用于插入靶蛋白编码多核苷酸的克隆位点(例如限制性酶识别位点，例如MCS)、可结晶蛋白编码位点和终止子以5’至3’方向依次可操作地连接。
在另一个实施方案中，本发明的表达载体包括编码作为靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸，并且该多核苷酸编码可结晶蛋白和与该可结晶蛋白的N末端连接的病毒核衣壳，并且包括用于在该可结晶蛋白的C末端处以及该可结晶蛋白和该病毒核衣壳之间连接靶蛋白的克隆位点。在这种情况下，使用者可以选择将靶蛋白定位在可结晶蛋白的C末端还是N末端。作为实施方案的具体示例，多核苷酸包括构建体，其中启动子、病毒核衣壳编码位点、用于插入编码靶蛋白的多核苷酸的第一克隆位点(例如，限制性酶识别位点，例如，MCS)、可结晶蛋白编码位点、用于插入编码靶蛋白的多核苷酸的第二克隆位点(例如，限制性酶识别位点，例如，MCS)和终止子以5’至3’方向依次可操作地连接。
本发明的表达载体可以包括T7启动子和T7终止子，以通过噬菌体T7系统调节靶蛋白和融合配偶体编码DNA的转录。据此，本发明的表达载体可以更有效地在大肠杆菌中产生靶蛋白。
本发明的表达载体可以基于例如常规表达载体使用常规重组方法来制备。
根据本发明的另一个实施方案，提供了用表达载体转化的宿主细胞，该表达载体用于产生本发明的靶蛋白融合的自组装纳米颗粒。
本发明中的宿主细胞可选自包括原核生物和真核生物的所有生物体的细胞，优选地埃希氏杆菌属的微生物的细胞，更优选地大肠杆菌的细胞。
本文所用的术语“转化”或“引入”是指将多核苷酸引入宿主中，使得该多核苷酸可以作为染色体外元件或通过完成染色体整合而复制。利用根据本发明的表达载体的转化方法可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)法、氯化钙(CaCl2)法、显微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法或醋酸锂-DMSO法，但本发明不限于此。
根据本发明的另一个实施方案，作为在异源或同源宿主细胞中有效产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的方法，提供了一种产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的方法，该方法包括制造用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体，该表达载体包括编码靶蛋白以及作为该靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸；通过将用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的该表达载体引入宿主细胞中来产生转化体；以及该培养转化体。
这里，对于具体的细节，诸如关于表达载体的事项和关于表达载体的引入的事项，可以参考先前描述的事项。
为了培养转化体，可使用已知适合宿主细胞的任何培养方法。例如，当宿主是大肠杆菌时，可使用在16℃至37℃的Luria-Bertani(LB)培养基中培养的方法。如果在表达载体中存在抗生素选择标记的成分(例如，对抗生素氨苄青霉素有抗性的基因)，则此时，可通过向培养基中添加相应的抗生素(例如，氨苄青霉素)并培养细胞，来优先诱导含有表达载体的大肠杆菌的增殖。此外，当表达载体含有在表达载体中调节编码靶蛋白的DNA的转录和/或翻译的组分(例如，lac操纵子相关组分)时，可通过添加相关材料(诸如IPTG)来诱导靶蛋白的表达。
提供以下实施例是为了帮助理解本发明，并且以下内容不限制本发明的范围。
实施例
制备实施例1
为了探索作为融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳(NC)的组合用于产生自组装纳米颗粒的适用性，制造载体以使其以这样的形式表达：人类免疫缺陷病毒(HIV)的NC与可结晶蛋白的N末端连接，然后是包封蛋白和六个组氨酸标签，并且烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点存在于它们之间(图4)。
基于设计成通过T7启动子调节靶蛋白表达的pGEMEX-1(Promega)载体制造载体，并且SEQ ID NO:5的序列用作编码包封蛋白的序列，并且SEQ ID NO:2(或SEQ ID NO:3)的序列用作编码NC的序列。
所制造的载体中的构建体区域的序列与SEQ ID NO:8相同，并且预期表达融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:9相同。
实施例1
以如下形式制造用于产生融合蛋白的自组装纳米颗粒的载体：NC与可结晶蛋白包封蛋白的N末端连接，六个组氨酸和TEV蛋白酶切割位点存在于其间，并且作为COVID19受体结合结构域(RBD)的靶蛋白与包封蛋白的C末端连接(图5)。
制造方法与制备实施例1相同，但是将编码NC-6×His标签-TEV蛋白酶切割位点-包封蛋白-靶蛋白构建体的序列插入pGEMEX-1(Promega)载体的MCS中。
所制造的载体中的构建体区域的序列与SEQ ID NO:10相同，并且预期表达融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:11相同。
实施例2
以如下形式制造用于产生融合蛋白的自组装纳米颗粒的载体：靶蛋白流感抗原(H5N1 HA：H5gd)与可结晶蛋白铁蛋白的N末端连接，NC与该流感抗原的N末端连接，并且六个组氨酸标签和TEV蛋白酶切割位点存在于该NC和流感抗原之间(图6)。
制造方法与制备实施例1相同，但是将编码NC-6×His标签-TEV蛋白酶切割位点-靶蛋白-铁蛋白构建体的序列插入pGEMEX-1(Promega)载体的MCS中。
所制造的载体中的构建体区域的序列与SEQ ID NO:12相同，并且预期表达融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:13相同。
实验实施例
将制备实施例和实施例的载体转化到大肠杆菌SHuffle/T7(NEB)或SHuffle/T7/pLsS(NEB)中并培养。通过以下过程制得Shuffle/T7/pLysS：使用Mini-prep从BL21星形(DE3)pLysS One ShotTM感受态大肠杆菌(Invitrogen)中提取pLysS质粒，并将所提取的质粒引入Shuffle/T7(NEB)感受态大肠杆菌中，并利用氯霉素(CM)(pLysS中包括的抗生素标记)进行选择。所有转化的大肠杆菌在含有单独的50μg/mL氨苄青霉素或者50μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB培养基中培养。将培养温度设定为16℃至37℃。当大肠杆菌的OD600值变为0.5或更高时，以0μM至1mM的水平添加IPTG以活化T7启动子，并且在添加IPTG后于37℃培养3小时或于25℃培养5小时以充分产生蛋白质。将充分培养的大肠杆菌离心以除去上清液，然后储存。随后，将0.3mL的PBS添加到对应于5mL的LB培养基的大肠杆菌收获物中，并进行超声处理以获得裂解物。然后，将裂解液离心并分成可溶性级分和沉淀物级分，并通过SDS-PAGE分别对总裂解液、可溶性级分和沉淀物级分进行分析。
首先，作为通过将制备实施例1的载体引入大肠杆菌来诱导融合蛋白的表达的结果，如图7所示，高水平的融合蛋白正常表达，即具有预期的大小和溶解度。这表明包封蛋白和NC的组合具有被用作融合配偶体用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的潜力。
此外，作为通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)观察通过表达诱导获得的产物的结果，如图8所示，显示产物具有纳米颗粒的形式。
此外，作为对通过表达诱导获得的产物进行尺寸排阻色谱法(SEC)的结果，如图9所示，显示产物具有恒定的尺寸分布。
此外，作为通过Cryo-EM观察通过表达诱导获得的产物的结果，如图10所示，显示具有球形纳米颗粒的形式。此外，作为分析Cryo-EM后融合蛋白的N末端和C末端的位置的结果，如图11中所示，显示融合蛋白的N末端位于纳米颗粒内部，并且其C末端位于纳米颗粒外部。这些结果表明，当NC与包封蛋白的N末端连接并且作为靶蛋白的抗原蛋白与C末端连接时，抗原蛋白暴露于纳米颗粒的外部并且充当抗原，并且NC位于纳米颗粒内部，从而防止对免疫应答的不必要的干涉，并因此可以产生高效的抗原纳米颗粒。
首先，作为通过将实施例1的载体引入大肠杆菌来诱导融合蛋白的表达的结果，如图12所示，高水平的融合蛋白正常表达，即具有预期的大小和溶解度。
此外，作为通过透射电子显微镜(TEM)观察通过诱导实施例1的载体的表达获得的产物的结果，如图13所示，显示产物具有纳米颗粒的形式。
此外，将通过诱导实施例1的载体的表达获得的产物，即自组装的纳米颗粒以合适的剂量腹膜内(IP)或肌内(IM)注射到小鼠中，并且两周后，从眼眶采血获得血清，然后进行ELISA。注射以两周为间隔进行三次。结果，如图14所示，显示了IgG滴度。这表明，根据本发明的方法，可以制备自组装的纳米颗粒，其中在保持靶蛋白原有结构的同时将其融合。
首先，作为通过将实施例2的载体引入大肠杆菌来诱导融合蛋白的表达的结果，如图15所示，高水平的融合蛋白正常表达，即具有预期的大小和溶解度。
此外，作为通过透射电子显微镜(TEM)观察通过诱导实施例2的载体的表达获得的产物的结果，如图16所示，显示产物具有纳米颗粒的形式。
在上文中，参考实施方案描述了本发明。本领域普通技术人员将理解，本发明可以在不脱离本发明的基本特征的情况下以修改形式实施。因此，所公开的实施方案应从描述性角度而非限制性角度来考虑。本发明的范围在权利要求书中而不是在以上描述中示出，并且其等效范围内的所有差异都将被解释为包括在本发明中。
<序列表>
SEQ ID NO: 1
序列名称：HIV核衣壳的氨基酸序列
序列类型：AA
生物体名称：人免疫缺陷病毒
序列：
QRGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIAKNCRAPRKKGCWRCGREGHQ MKDCTERQAN
SEQ ID NO: 2
序列名称：编码HIV核衣壳的核苷酸序列
序列类型：DNA
生物体名称：人免疫缺陷病毒
序列：
CAGCGGGGAAACTTCAGGAACCAGAGAAAAACTGTGAAGTGCTTCAATTGCGGAAAGGAGGGCCACATCGCTAAGAACTGCCGCGCCCCCAGAAAGAAAGGCTGCTGGAGATGCGGCAGAGAGGGCCACCAGATGAAGGACTGCACAGAGAGACAGGCAAAC
SEQ ID NO:3
序列名称：编码HIV核衣壳的核苷酸序列
序列类型：DNA
生物体名称：合成构建体
序列：
CAGCGTGGTAACTTCCGTAACCAGCGTAAAACCGTTAAATGCTTCAACTGCGGCAAAGAAGGCCACATCGCGAAAAACTGCCGTGCGCCGCGTAAAAAAGGCTGCTGGCGTTGCGGCCGTGAAGGCCACCAGATGAAAGATTGCACCGAACGTCAGGCGAAC
SEQ ID NO: 4
序列名称：来自肺结核分枝杆菌的包封蛋白的氨基酸序列序列类型：AA
生物体名称：肺结核分枝杆菌
序列：
NNLYRDLAPVTEAAWAEIELEAARTFKRHIAGRRVVDVSDPGGPVTAAVSTGRLIDVKAPTNGVIAHLRASKPLVRLRVPFTLSRNEIDDVERGSKDSDWEPVKEAAKKLAFVEDRTIFEGYSAASIEGIRSASSNPALTLPEDPREIPDVISQALSELRLAGVDGPYSVLLSADVYTKVSETSDHGYPIREHLNRLVDGDIIWAPAIDGAFVLTTRGGDFDLQLGTDVAIGYASHDTDTVRLYLQETLTFLCYTAEASVALSH
SEQ ID NO:5
序列名称：编码来自肺结核分枝杆菌的包封蛋白的核苷酸序列序列类型：DNA
生物体名称：肺结核分枝杆菌
序列：
AATAACCTGTACCGGGACCTTGCACCAGTCACTGAGGCTGCGTGGGCCGAGATCGAGCTTGAGGCCGCACGTACGTTTAAGCGTCATATTGCGGGCCGTCGGGTTGTGGATGTATCAGATCCTGGAGGTCCTGTAACCGCTGCGGTATCGACAGGGCGTTTGATTGACGTAAAGGCTCCAACCAACGGTGTCATTGCCCACTTACGCGCCAGCAAGCCTTTAGTTCGTTTAAGAGTGCCCTTTACGTTAAGCCGGAACGAAATTGATGATGTGGAACGTGGGTCAAAGGACAGTGATTGGGAACCAGTGAAAGAGGCGGCGAAGAAGTTGGCCTTCGTCGAAGATCGTACCATATTTGAAGGCTACTCCGCTGCTTCCATAGAAGGGATTCGGTCCGCCTCCTCAAATCCAGCATTAACGCTGCCTGAAGACCCGCGCGAGATTCCTGATGTAATCTCACAGGCACTTTCGGAATTACGTTTGGCAGGGGTCGATGGACCATACAGTGTTCTTTTGAGTGCAGATGTATACACCAAGGTGAGCGAGACCAGTGATCACGGCTATCCAATACGGGAACACCTGAACAGACTTGTCGATGGCGACATAATCTGGGCGCCCGCAATTGACGGCGCATTCGTGTTGACCACCCGTGGTGGTGATTTTGATTTACAATTAGGCACCGATGTTGCGATTGGGTATGCGAGTCATGATACGGACACTGTACGTTTGTATCTTCAAGAGACGCTGACGTTCTTATGTTACACCGCTGAGGCGTCCGTGGCGCTTTCGCAT
SEQ ID NO:6
序列名称：来自大肠杆菌的铁蛋白的氨基酸序列
序列类型：AA
生物体名称：大肠杆菌
序列：
KGDTKVINYLNKLLGNELVAINQYFLHARMFKNWGLKRLNDVEYHESIDEMKHADRYIERILFLEGLPNLQDLGKLNIGEDVEEMLRSDLALELDGAKNLREAIGYADSVHDYVSRDMMIEILRDEEGHIDWLETELDLIQKMGLQNYLQAQIREEG
SEQ ID NO:7
序列名称：编码来自大肠杆菌的铁蛋白的核苷酸序列
序列类型：DNA
生物体名称：大肠杆菌
序列：
AAAGGTGATACTAAAGTTATAAATTATCTCAACAAACTGTTGGGAAATGAGCTTGTCGCAATCAATCAGTACTTTCTCCATGCCCGAATGTTTAAAAACTGGGGTCTCAAACGTCTCAATGATGTGGAGTATCATGAATCCATTGATGAGATGAAACACGCCGATCGTTATATTGAGCGCATTCTTTTTCTGGAAGGTCTTCCAAACTTACAGGACCTGGGCAAACTGAACATTGGTGAAGATGTTGAGGAAATGCTGCGTTCTGATCTGGCACTTGAGCTGGATGGCGCGAAGAATTTGCGTGAGGCAATTGGTTATGCCGATAGCGTTCATGATTACGTCAGCCGCGATATGATGATAGAAATTTTGCGTGATGAAGAAGGCCATATCGACTGGCTGGAAACGGAACTTGATCTGATTCAGAAGATGGGCCTGCAAAATTATCTGCAAGCACAGATCCGCGAAGAAGGT
SEQ ID NO:8
序列名称：融合蛋白构建体的核苷酸序列
序列类型：DNA
生物体名称：合成构建体
序列：
ATGCAGCGGGGAAACTTCAGGAACCAGAGAAAAACTGTGAAGTGCTTCAATTGCGGAAAGGAGGGCCACATCGCTAAGAACTGCCGCGCCCCCAGAAAGAAAGGCTGCTGGAGATGCGGCAGAGAGGGCCACCAGATGAAGGACTGCACAGAGAGACAGGCAAACCATCACCATCACCATCACGAAAACCTGTATTTTCAGGGTGGATCCAATAACCTGTACCGGGACCTTGCACCAGTCACTGAGGCTGCGTGGGCCGAGATCGAGCTTGAGGCCGCACGTACGTTTAAGCGTCATATTGCGGGCCGTCGGGTTGTGGATGTATCAGATCCTGGAGGTCCTGTAACCGCTGCGGTATCGACAGGGCGTTTGATTGACGTAAAGGCTCCAACCAACGGTGTCATTGCCCACTTACGCGCCAGCAAGCCTTTAGTTCGTTTAAGAGTGCCCTTTACGTTAAGCCGGAACGAAATTGATGATGTGGAACGTGGGTCAAAGGACAGTGATTGGGAACCAGTGAAAGAGGCGGCGAAGAAGTTGGCCTTCGTCGAAGATCGTACCATATTTGAAGGCTACTCCGCTGCTTCCATAGAAGGGATTCGGTCCGCCTCCTCAAATCCAGCATTAACGCTGCCTGAAGACCCGCGCGAGATTCCTGATGTAATCTCACAGGCACTTTCGGAATTACGTTTGGCAGGGGTCGATGGACCATACAGTGTTCTTTTGAGTGCAGATGTATACACCAAGGTGAGCGAGACCAGTGATCACGGCTATCCAATACGGGAACACCTGAACAGACTTGTCGATGGCGACATAATCTGGGCGCCCGCAATTGACGGCGCATTCGTGTTGACCACCCGTGGTGGTGATTTTGATTTACAATTAGGCACCGATGTTGCGATTGGGTATGCGAGTCATGATACGGACACTGTACGTTTGTATCTTCAAGAGACGCTGACGTTCTTATGTTACACCGCTGAGGCGTCCGTGGCGCTTTCGCATGATATCGTCGACAAGCTTTGA
SEQ ID NO:9
序列名称：预期的融合蛋白的氨基酸序列
序列类型：AA
生物体名称：合成构建体
序列：
MQRGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIAKNCRAPRKKGCWRCGREGHQMKDCTERQANHHHHHHENLYFQGGSNNLYRDLAPVTEAAWAEIELEAARTFKRHIAGRRVVDVSDPGGPVTAAVSTGRLIDVKAPTNGVIAHLRASKPLVRLRVPFTLSRNEIDDVERGSKDSDWEPVKEAAKKLAFVEDRTIFEGYSAASIEGIRSASSNPALTLPEDPREIPDVISQALSELRLAGVDGPYSVLLSADVYTKVSETSDHGYPIREHLNRLVDGDIIWAPAIDGAFVLTTRGGDFDLQLGTDVAIGYASHDTDTVRLYLQETLTFLCYTAEASVALSHDIVDKL
SEQ ID NO:10
序列名称：融合蛋白构建体的核苷酸序列
序列类型：DNA
生物体名称：合成构建体
序列：
CAGCGGGGAAACTTCAGGAACCAGAGAAAAACTGTGAAGTGCTTCAATTGCGGAAAGGAGGGCCACATCGCTAAGAACTGCCGCGCCCCCAGAAAGAAAGGCTGCTGGAGATGCGGCAGAGAGGGCCACCAGATGAAGGACTGCACAGAGAGACAGGCAAACGAAAACCTGTATTTTCAGGGCCATCACCATCACCATCACGATGATGATGATGGTACCGGATCCAATAACCTGTACCGGGACCTTGCACCAGTCACTGAGGCTGCGTGGGCCGAGATCGAGCTTGAGGCCGCACGTACGTTTAAGCGTCATATTGCGGGCCGTCGGGTTGTGGATGTATCAGATCCTGGAGGTCCTGTAACCGCTGCGGTATCGACAGGGCGTTTGATTGACGTAAAGGCTCCAACCAACGGTGTCATTGCCCACTTACGCGCCAGCAAGCCTTTAGTTCGTTTAAGAGTGCCCTTTACGTTAAGCCGGAACGAAATTGATGATGTGGAACGTGGGTCAAAGGACAGTGATTGGGAACCAGTGAAAGAGGCGGCGAAGAAGTTGGCCTTCGTCGAAGATCGTACCATATTTGAAGGCTACTCCGCTGCTTCCATAGAAGGGATTCGGTCCGCCTCCTCAAATCCAGCATTAACGCTGCCTGAAGACCCGCGCGAGATTCCTGATGTAATCTCACAGGCACTTTCGGAATTACGTTTGGCAGGGGTCGATGGACCATACAGTGTTCTTTTGAGTGCAGATGTATACACCAAGGTGAGCGAGACCAGTGATCACGGCTATCCAATACGGGAACACCTGAACAGACTTGTCGATGGCGACATAATCTGGGCGCCCGCAATTGACGGCGCATTCGTGTTGACCACCCGTGGTGGTGATTTTGATTTACAATTAGGCACCGATGTTGCGATTGGGTATGCGAGTCATGATACGGACACTGTACGTTTGTATCTTCAAGAGACGCTGACGTTCTTATGTTACACCGCTGAGGCGTCCGTGGCGCTTTCGCATGATATCGTCGACAACATAACAAATCTATGTCCCTTTGGAGAAGTGTTTAACGCGACCCGTTTTGCCAGCGTTTACGCATGGAATCGCAAGCGCATTTCTAACTGCGTGGCGGACTACAGCGTGCTGTATAATTCCGCGTCGTTCTCTACGTTTAAATGCTACGGCGTGAGCCCGACTAAGTTGAATGATCTGTGTTTTACCAATGTTTACGCTGACAGCTTTGTTATTCGTGGTGATGAGGTTCGTCAGATTGCGCCAGGTCAGACCGGTAAAATCGCGGACTATAACTACAAACTTCCGGATGATTTCACCGGCTGCGTCATCGCCTGGAACTCCAACAACTTGGACTCGAAGGTGGGTGGTAATTACAACTACCTCAGACGTCTGTTCCGCAAGTCTAACCTGAAACCGTTTGAACGTGACATCAGCACCGAGATCTACCAAGCGGGTAGCACCCCGTGTAATGGCGTTGAAGGTTTCAACTGCTATTTCCCGCTGCAGAGCTATGGCTTCCAACCGACGAACGGCGTGGGCTATCAACCGTATCGTGTTGTCGTACTGAGCTTCGAGAACAAGTCCGCTCCGGCAACCGTTTGCGGTCCG
SEQ ID NO: 11
序列名称：预期的融合蛋白的氨基酸序列
序列类型：AA
生物体名称：合成构建体
序列：
QRGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIAKNCRAPRKKGCWRCGREGHQMKDCTERQANENLYFQGHHHHHHDDDDGTGSNNLYRDLAPVTEAAWAEIELEAARTFKRHIAGRRVVDVSDPGGPVTAAVSTGRLIDVKAPTNGVIAHLRASKPLVRLRVPFTLSRNEIDDVERGSKDSDWEPVKEAAKKLAFVEDRTIFEGYSAASIEGIRSASSNPALTLPEDPREIPDVISQALSELRLAGVDGPYSVLLSADVYTKVSETSDHGYPIREHLNRLVDGDIIWAPAIDGAFVLTTRGGDFDLQLGTDVAIGYASHDTDTVRLYLQETLTFLCYTAEASVALSHDIVDNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLRRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFENKSAPATVCGP
SEQ ID NO:12
序列名称：融合蛋白构建体的核苷酸序列
序列类型：DNA
生物体名称：合成构建体
序列：
CAGCGGGGAAACTTCAGGAACCAGAGAAAAACTGTGAAGTGCTTCAATTGCGGAAAGGAGGGCCACATCGCTAAGAACTGCCGCGCCCCCAGAAAGAAAGGCTGCTGGAGATGCGGCAGAGAGGGCCACCAGATGAAGGACTGCACAGAGAGACAGGCAAACCATCATCATCATCATCATGAAAACCTGTATTTTCAGGGTGGTACCGGATCCGGAGTGAAGCCTCTAATTTTAAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGGAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTACCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAACCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAGTTTCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAAATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCGATCATGAAGCCTCATCAGGAGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTGGGAAGTCCCTCCTTTTTTAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAGAAAAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGAATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAGGCTATATCAAAACCCAACCACCTATATTTCCATTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAAAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCTAATGATGCAATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCAGCAATTATGAAAAGTGAATTGGATATCGTCGACATGAAAGGTGATACTAAAGTTATAAATTATCTCAACAAACTGTTGGGAAATGAGCTTGTCGCAATCAATCAGTACTTTCTCCATGCCCGAATGTTTAAAAACTGGGGTCTCAAACGTCTCAATGATGTGGAGTATCATGAATCCATTGATGAGATGAAACACGCCGATCGTTATATTGAGCGCATTCTTTTTCTGGAAGGTCTTCCAAACTTACAGGACCTGGGCAAACTGAACATTGGTGAAGATGTTGAGGAAATGCTGCGTTCTGATCTGGCACTTGAGCTGGATGGCGCGAAGAATTTGCGTGAGGCAATTGGTTATGCCGATAGCGTTCATGATTACGTCAGCCGCGATATGATGATAGAAATTTTGCGTGATGAAGAAGGCCATATCGACTGGCTGGAAACGGAACTTGATCTGATTCAGAAGATGGGCCTGCAAAATTATCTGCAAGCACAGATCCGCGAAGAAGGT
SEQ ID NO:13
序列名称：预期的融合蛋白的氨基酸序列
序列类型：AA
生物体名称：合成构建体
序列：
QRGNFRNQRKTVKCFNCGKEGHIAKNCRAPRKKGCWRCGREGHQMKDCTERQANHHHHHHENLYFQGGTGSGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSPSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELDIVDMKGDTKVINYLNKLLGNELVAINQYFLHARMFKNWGLKRLNDVEYHESIDEMKHADRYIERILFLEGLPNLQDLGKLNIGEDVEEMLRSDLALELDGAKNLREAIGYADSVHDYVSRDMMIEILRDEEGHIDWLETELDLIQKMGLQNYLQAQIREEG

Claims (15)

1.一种用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体，所述表达载体包括编码作为靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述靶蛋白是选自抗原、抗体、细胞受体、酶、结构蛋白、血清和细胞蛋白的至少一者。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述可结晶蛋白是包封蛋白或铁蛋白。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述病毒核衣壳是人免疫缺陷病毒(HIV)的核衣壳。
5.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述病毒核衣壳包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述载体用于在大肠杆菌中产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒。
7.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述多核苷酸编码可结晶蛋白和与所述可结晶蛋白的N末端连接的病毒核衣壳，并且包括用于将靶蛋白编码位点或靶蛋白与所述可结晶蛋白的C末端连接的克隆位点。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞用根据权利要求1至7中任一项所述的用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体转化。
9.一种产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的方法，所述方法包括：
制造用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的表达载体，所述表达载体包括编码靶蛋白以及作为所述靶蛋白的融合配偶体的可结晶蛋白和病毒核衣壳的多核苷酸；
通过将用于产生靶蛋白融合的自组装纳米颗粒的所述表达载体引入宿主细胞中来产生转化体；以及
培养所述转化体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶蛋白是选自抗原、抗体、细胞受体、酶、结构蛋白、血清和细胞蛋白的至少一者。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述可结晶蛋白是包封蛋白或铁蛋白。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒核衣壳是人免疫缺陷病毒(HIV)的核衣壳。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒核衣壳包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述多核苷酸编码所述可结晶蛋白、与所述可结晶蛋白的N末端连接的病毒核衣壳和与所述可结晶蛋白的C末端连接的靶蛋白。
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