CN119662621A - 一种葡萄糖异构酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖异构酶突变体及其应用。属于酶工程技术领域。该葡萄糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明提供了一种耐高温且耐低pH值的葡萄糖异构酶突变体，该突变体的最适pH值从7.0降低到6.0，最适温度从95℃提高到100℃，解决了现有的葡萄糖异构酶耐酸耐高温性较差的问题。

Description

一种葡萄糖异构酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，更具体的说是涉及一种葡萄糖异构酶突变体及其应用。

背景技术

葡萄糖异构酶(Glucose isomerase,EC 5.3.1.5)是将D-葡萄糖异构为D-果糖的单糖酶，它在工业上用于生产高果糖玉米糖浆(HFCS)。HFCS具有良好的溶解度、高甜度和成本效益，在饮料、糖果和烘焙食品中广泛用作甜味剂替代品和食品添加剂。

HFCS是葡萄糖和果糖的液体混合物，在工业生产中通常通过酸或酶转化方法获得。酶转化远优于酸转化，原因在于酶转化更安全、反应条件更温和及获得更高的果糖产量。

在HFCS的生产过程中，高温使酶反应平衡向正方向移动，使果糖产量增加，反应速度加快，底物减少。耐酸葡萄糖异构体酶可减少HFCS的褐变和副产物生成。耐高温耐酸的葡萄糖异构酶更适合于高果糖玉米糖浆的工业生产。然而，行业中的大多数葡萄糖异构酶耐酸耐高温性较差，生产的HFCS质量较差，成本较高。

综上，如何提供一种耐酸耐高温的葡萄糖异构酶是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种葡萄糖异构酶突变体及其应用。

鉴于大多数葡萄糖异构酶在高温低pH下表现出低活性或失活，本发明选择耐高温的海栖热袍菌(Thermotoga mariitma)葡萄糖异构酶MSB8基因，在酶活性位点附近突变E237H/N298K/N337R三个氨基酸残基引入正电荷，使用Swiss-model以Thermotoganeapolitana的葡萄糖异构酶(PDB ID 1A0E)晶体结构作为模板进行同源建模，使用Pymol查看其可视化模型的三维结构，并分析突变位点、活性中心与底物之间的相互作用模式。获得的突变体基因通过毕赤酵母密码子偏好性进行基因优化，委托基因合成公司合成，将合成的目的基因连接到毕赤酵母表达载体pPinkα-HC上，获得pPinkα-HC-TMGI-MSB8C重组质粒，线性化重组质粒后，将其电转到PichiaPink^TMStrain4毕赤酵母感受态细胞内，在PAD平板上培养获得阳性子，命名为PP-pPinkα-HC-TMGI-MSB8C。然后将阳性重组菌株进行甲醇诱导表达目的蛋白，并对发酵及诱导条件进行摸索和优化，以获得较高表达量。然后使用改进后的半胱氨酸-咔唑法测定葡萄糖异构酶的酶活。通过试验得知，突变后获得的葡萄糖异构酶的最适pH值从7.0降低到6.0，最适温度从95℃提高到100℃，通过5L发酵罐发酵，获得的粗酶液酶活可达84.6U/ml。将表达的酶进行酶学特性及动力学参数测定，对其催化残基进行pKa值分析，对表达的酶进行分子动力学模拟，最后使用通过改性后的海泡石固定化葡萄糖异构酶。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种葡萄糖异构酶突变体，由序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为第237位、第298位和第337位。

进一步的，由序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸将第237位、第298位和第337位分别突变为组氨酸、赖氨酸和精氨酸。

进一步的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述的葡萄糖异构酶突变体在催化生产D-果糖中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

本发明提供了一种耐高温且耐低pH值的葡萄糖异构酶突变体，该突变体的最适pH值从7.0降低到6.0，最适温度从95℃提高到100℃，解决了现有的葡萄糖异构酶耐酸耐高温性较差的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中定点突变选择的氨基酸残基(突变的残基用紫色表示)；

图2为本发明实施例2中目的蛋白SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1代表TMGI-MSB8结果，泳道2代表E237H/N298K/N337R突变体结果；

图3为本发明实施例4中TMGI-MSB8与E237H/N298K/N337R突变体的酶活特性，其中a为最适pH值的测定结果；b为pH值耐受性结果；c为最适温度的测定结果；d为热稳定结果；

图4为本发明实施例6中TMGI-MSB8与E237H/N298K/N337R突变体中催化残基的pKa值；

图5为本发明实施例7中TMGI-MSB8与E237H/N298K/N337R突变体的分子对接图，其中，a为TMGI-MSB8分子对接；b为E237H/N298K/N337R突变体分子对接；

图6为本发明实施例7中TMGI-MSB8与E237H/N298K/N337R突变体的RMSD结果；

图7为本发明实施例7中TMGI-MSB8与E237H/N298K/N337R突变体的RMSF结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

活性位点附近突变E237H/N298K/N337R三个氨基酸残基引入正电荷

从NCBI数据库(ID:AKE29424.1)中获得海栖热袍菌Thermotoga marimita MSB8中葡萄糖异构酶(TMGI-MSB8)的蛋白质序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。使用Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org)，利用已报道的Thermotoga neapolitana的葡萄糖异构酶(PDB ID 1A0E)晶体结构作为模板(同源性为95.03％，序列覆盖率为100％)进行同源建模，并获得PDB文件。

海栖热袍菌葡萄糖异构酶原始氨基酸序列：

MAEFFPEIPKIQFEGKESTNPLAFRFYDPNEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTAERPWNRFSDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGLELENLARFLRMAVEYAKKIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKNHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNIYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLNFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKIAYKLAKDGVFDKFIEEKYRSFKEGIGKEIVEGKTDFEKLEEYIIDKEDIELPSGKQEYLESLLNSYIVKTIAELR，SEQID NO.1。

筛选TMGI-MSB8活性中心范围内的非保守和非碱性氨基酸，将其突变为碱性带正电荷氨基酸(将酸性氨基酸突变成碱性氨基酸，活性位点附近的残基更活跃，可能增加了与底物接触的机会，从而使得酶的比活性有所提高；同时形成碱性区域，耐受更高浓度的H⁺，从而降低最适pH值)，定点突变选择的氨基酸残基如图1所示(突变的残基用紫色表示)。使用Pymol软件查看模型的三维结构并分析突变位点在蛋白质结构中的作用模式。

ΔΔG值通过FoldX(https://tango.crg.es/)和Deep DDG网站(http://protein.org.cn/ddg.html)确定，基于同源模型三维结构进行能量计算。显示ΔΔG<0kcal·mol^-1的氨基酸被确定为潜在的突变位点。这揭示了蛋白质序列中除半胱氨酸外的所有氨基酸的相对自由能变化(ΔΔG)。计算公式如下：

结果如表1所示。

表1FoldX计算突变体ΔΔG值

根据表1结果，突变位点选择为E237H/N298K/N337R(同时突变三个位点，更易形成碱性环境，使降低酶的最适pH值更易实现)。

海栖热袍菌葡萄糖异构酶突变后氨基酸序列：

其中，

突变位点(加粗字体加大)：E237H/N298K/N337R；

催化位点(加粗斜体)：H101 D104；

结合位点(加粗下划线)：E232 E268 H271 D296 D307 D309 D339。

实施例2

PichiaPink毕赤酵母表达系统表达目的蛋白

海栖热袍菌葡萄糖异构酶原始基因序列：

ATGGCCGAGTTTTTTCCAGAAATCCCAAAGATCCAATTTGAAGGCAAGGAATCAACTAATCCCCTGGCTTTCAGGTTCTACGATCCAAACGAAGTCATAGACGGTAAGCCTTTGAAGGACCACCTGAAGTTTAGTGTAGCATTCTGGCATACTTTTGTTAACGAAGGACGTGATCCATTCGGCGACCCAACTGCCGAACGTCCATGGAACAGATTCTCTGATCCAATGGATAAGGCATTTGCTAGAGTGGATGCCTTGTTTGAATTCTGCGAGAAATTGAACATTGAGTATTTTTGCTTCCACGACCGTGATATCGCTCCTGAAGGTAAAACCTTACGTGAGACCAACAAAATTTTGGATAAGGTGGTAGAGAGGATCAAGGAACGTATGAAGGACAGTAACGTCAAACTGCTATGGGGTACTGCTAATCTATTTTCTCATCCAAGATACATGCACGGTGCAGCTACTACATGTTCAGCCGATGTTTTTGCTTATGCCGCTGCACAAGTTAAGAAAGCTCTAGAGATCACTAAAGAGTTAGGTGGAGAGGGTTACGTATTTTGGGGTGGTAGAGAAGGATATGAGACCTTGTTGAACACCGACTTGGGATTAGAATTGGAGAATCTAGCAAGATTCTTGAGAATGGCCGTCGAATACGCTAAGAAAATTGGTTTCACGGGACAATTTTTGATTGAGCCTAAGCCAAAGGAACCTACTAAGCATCAGTACGACTTCGACGTAGCTACGGCTTACGCTTTTTTGAAGAATCACGGATTGGACGAATACTTCAAGTTCAACATTGAAGCTAATCATGCCACCCTGGCAGGTCACACTTTCCAACACGAGTTGCGTATGGCCAGAATTCTTGGTAAATTGGGTTCCATTGATGCTAACCAAGGTGATTTGTTATTGGGTTGGGATACTGACCAGTTTCCAACCAACATTTACGATACTACCCTAGCAATGTATGAAGTCATTAAGGCCGGTGGTTTCACAAAGGGTGGCTTAAATTTTGATGCCAAAGTGAGGAGAGCTTCCTATAAGGTAGAGGATTTGTTTATTGGCCACATTGCTGGAATGGATACTTTTGCACTTGGTTTCAAGATTGCTTACAAGTTAGCTAAAGATGGAGTCTTTGATAAATTCATCGAAGAGAAGTACCGTTCCTTCAAGGAGGGTATTGGAAAAGAGATTGTGGAAGGAAAAACTGACTTTGAAAAACTGGAGGAGTATATTATTGATAAGGAAGACATTGAACTGCCATCCGGTAAGCAAGAGTATCTGGAGTCCCTTCTGAATTCTTACATTGTTAAGACGATCGCCGAGCTGAGA，SEQ ID NO.4。

将获得的突变体的基因通过毕赤酵母密码子偏好性进行基因优化，优化后的海栖热袍菌葡萄糖异构酶基因序列如下：

ATGGCTGAATTTTTCCCTGAAATTCCTAAAATTCAATTTGAAGGTA

AAGAATCTACTAATCCATTGGCTTTTAGATTCTACGATCCAAATGAAGT

TATTGATGGTAAACCATTGAAGGATCATCTGAAATTTTCTGTTGCCTTTT

GGCATACCTTTGTTAACGAAGGTAGAGATCCATTTGGTGACCCAACTGC

TGAAAGACCATGGAATAGATTTTCTGATCCAATGGATAAGGCTTTTGCT

AGAGTTGATGCTTTGTTTGAATTCTGTGAAAAGTTGAATATTGAATACT

TTTGTTTTCATGACAGAGACATTGCTCCAGAAGGTAAAACTTTGAGAGA

AACTAACAAGATTTTGGATAAGGTCGTTGAAAGAATTAAGGAAAGAAT

GAAAGACTCTAACGTTAAATTGTTGTGGGGTACTGCTAACTTGTTCTCT

CACCCAAGATATATGCACGGAGCTGCAACTACCTGTAGTGCTGATGTTT

TTGCTTACGCTGCCGCCCAAGTTAAAAAGGCTTTGGAAATAACTAAGG

AATTGGGTGGTGAAGGTTACGTTTTCTGGGGTGGTAGAGAAGGTTATG

AAACTTTGTTGAACACTGATTTGGGTTTGGAATTGGAAAACTTGGCTAG

ATTTTTGAGAATGGCTGTTGAGTACGCTAAAAAGATTGGTTTTACTGGA

CAGTTTTTGATTGAGCCTAAACCTAAGCACCCAACTAAACATCAATATG

ATTTTGATGTTGCCACTGCTTACGCTTTTCTGAAGAATCATGGACTTGAT

GAATATTTTAAATTCAACATTGAGGCTAACCATGCTACCCTTGCAGGAC

ATACTTTCCAACATGAATTGAGAATGGCTAGAATTTTGGGTAAATTGGG

TTCTATTGATGCTAAGCAAGGAGATTTGTTGTTAGGTTGGGATACTGAT

CAATTCCCTACTAACATCTACGATACTACCTTAGCTATGTATGAAGTTA

TTAAGGCTGGTGGTTTTACTAAAGGAGGTTTAAGATTCGATGCTAAGGT

TAGAAGAGCTTCTTACAAGGTTGAAGATCTGTTTATTGGTCATATTGCT

GGTATGGATACTTTCGCTTTGGGTTTTAAGATTGCCTACAAGTTGGCTA

AGGACGGTGTTTTTGATAAATTCATTGAAGAAAAATATAGATCCTTTAA

GGAAGGAATTGGAAAGGAAATTGTTGAAGGTAAAACTGATTTCGAAAA

GTTGGAAGAATACATTATTGATAAGGAGGATATTGAATTGCCATCTGG

AAAGCAAGAGTACTTGGAATCTTTGCTGAATTCTTATATTGTTAAGACT

ATTGCTGAATTGAGATGA，SEQ ID NO.3。

由生物公司合成原始基因及优化后的突变体基因序列，首次使用PichiaPink表达系统，将目的基因连接到pPinkα-HC载体上，获得pPinkα-HC-TMGI-MSB8C重组质粒，然后使用Spe I酶将目的基因酶切，使用Bio-rad电转仪将线性化重组质粒电转到PichiaPink^TMStrain4毕赤酵母感受态细胞中，然后将混合液涂布到PAD培养基上，30℃培养24小时，挑取平板上的白色菌落，并提取其染色体进行PCR及测序鉴定，获得阳性子，命名为PP-pPinkα-HC-TMGI-MSB8C。然后对阳性重组菌进行发酵诱导表达，步骤为：

选择阳性重组菌在YPD中(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)，200rpm，30℃下培养24小时，然后按2％接种于BMGY(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，100mM磷酸缓冲液，1.34％(w/v)YNB，4×10^-5D-生物素，1％(w/v)甘油)培养基中，25、28或31℃，200rpm培养24小时，以甘油为碳源，甘油消耗完后使用甲醇进行诱导表达目的蛋白，每天添加浓度为1～3％，连续诱导72～144小时。发酵液离心获得上清液进行SDS-PAGE及蛋白质分离、表达量测定。按照不同的温度、pH值、发酵时间、碳源探索最佳诱导表达条件，结果如表2所示。

表2试验设计及表达量结果

经探索在2％甲醇诱导下，培养液pH值为6.0，诱导温度为25℃，在144h时表达量最高，可达466mg/L。将获得的最优发酵条件，进行发酵罐发酵。获得的目的蛋白SDS-PAGE电泳图如图2所示。

实施例3

优化半胱氨酸-咔唑法测定酶活测定方法

参考GB/T 23533-2009固定化葡萄糖异构酶制剂中链霉菌和游动放线菌的酶活测定方法，根据海栖热袍菌来源的葡萄糖异构酶特性，对测定方法进行改进。改进后步骤如下：

往试管中添加50μl 3mol/L葡萄糖溶液，400μl 100mmol/L pH7.0邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液(含5mmol/L Mg²⁺，1mmol/L Co²⁺)，50μl稀释酶液，95℃反应10min后，用500μl 50％三氯乙酸终止反应。对照组：在试管中加入葡萄糖、邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液，先加三氯乙酸终止反应，然后95℃温度下放置10min，再加入酶液。

取适量的反应液(取50μl)，再用蒸馏水分别补充至500μl，然后每管中加入0.1mL半胱氨酸盐酸盐溶液，3mL硫酸溶液，摇匀后，立即加入0.1mL咔唑酒精溶液，摇匀，于60℃水浴中保温10min，取出用水冷却呈红紫色，用10mm光径的比色皿，在560nm波长下比色，得到的A560值参考果糖标准曲线即可得到待测液体中果糖含量。

酶单位(U)的定义：在该反应条件下，1min内转化生成的1umol果糖所需的酶量。

GI酶活(U/mL)＝Q×V1/(180×T×V2)×N，其中，

Q:生成的果糖浓度；N:酶液起始稀释倍数；V1:反应体积(mL)；V2:反应时加酶量(mL或g)；T:反应时间(min)；180：果糖分子量。

突变体使葡萄糖异构酶的最适pH从7.0降低到6，最大比酶活为55.92U/mg，是原始序列(41.38U/mg)的1.35倍。在pH值为6时，突变体的比酶活为55.92U/mg，是原始序列酶活34.51U/mg的1.62倍。

实施例4

酶学性质的测定

为了确定TMGI-MSB8及其突变体的最佳反应pH值，在pH 4.5～8.5范围内测定了葡萄糖异构酶的活性，结果如图3a所示。结果表明，突变体的酶活性高于野生型，酶的最佳pH从7.0降至6.0，突变体的最大活性为55.92U/mg，是TMGI-MSB8(41.38U/mg)的1.35倍。在pH6.0时，E237H/N298K/N337R的比酶活性比TMGI-MSB8高1.62倍，表明突变体的抗酸能力优于TMGI-MSB8。

为了确定TMGI-MSB8及其突变体的最佳反应温度，在65～100℃范围内测定了葡萄糖异构酶的活性，结果如图3c所示。结果表明，与TMGI-MSB8相比，确定突变体E237H/N298K/N337R的最适温度为100℃，比TMGI-MSB8高5℃。

将纯化后的葡萄糖异构酶在50mM邻苯二甲酸氢钾-咪唑钠缓冲液(pH4.5～8.5)中室温孵育4小时，测定酶的残留活性，结果如图3b所示。

在95℃条件下，将纯化后的葡萄糖异构酶在50mM邻苯二甲酸氢钾-咪唑钠缓冲液中室温分别孵育2、4、6、8、10和12h，测定酶的残留活性，结果如图3d所示。结果表明，突变体E237H/N298K/N337R在95℃孵育4h后的比酶活性为45.37U/mg，比TMGI-MSB8高1.58倍。

综上，对酶的活性位点附近进行修饰，具有提高耐酸性和热稳定性的潜在能力。

实施例5

酶动力学参数测定

对突变前后的葡萄糖异构酶的酶动力学参数进行测定，结果如下表所示。

表3酶动力学参数测定结果

注:数据以均数±标准差(n＝3)表示。星号表示TMGI-MSB8与E237H/N298K/N337R突变体有显著差异(P<0.01)。

TMGI-MSB8的K_m值比E237H/N298K/N337R高1.09倍，表明突变体对底物的亲和力高于野生型。E237H/N298K/N337R的K_cat值是野生型的1.53倍，说明突变体与野生型相比催化效率显著提高。E237H/N298K/N337R的K_cat/Km值是野生型的1.66倍，说明突变体的亲和性和酶促反应速率均有显著提高。

实施例6

测定催化残基的pKa值

对突变前后的葡萄糖异构酶的H101、D104的pKa值进行测定，结果如图4所示。E237H/N298K/N337R突变体的H101、D104的pKa值分别从4.89和2.33变到4.77和2.57，E237H/N298K/N337R突变体的H101的pKa值变低可能是酶最适pH酸移的主要原因。

实施例7

分子对接及分子动力学模拟

(1)分子对接

本研究使用AutoDockVinav1.2.3软件进行分子对接分析。使用AutoDock Toolv1.5.6软件，检查葡萄糖(Glucose)空间结构无误后，将其添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键都改为默认可旋转并保存为“pdbqt”格式，作为对接配体。对MSB8，MSB8-pka和MSB8-sueface进行了添加氢原子和删除所有水分子的处理。然后设置对接盒子(Girdbox)为X：30，Y：30，Z：30，最后将优化后的蛋白保存为“pdbqt”格式，作为对接受体。随后，使用AutoDock Vina v1.2.3软件进行对接并计算结合亲和能(kJ/mol)。分子可视化是建模研究分析和交流的一个关键方面。因此，利用Molecular Operating Environment(MOE)v2022.02软件分析配体与受体相互作用细节并绘制相互作用2D图。

结果如图5所示，Glucose与TMGI-MSB8、E237H/N298K/N337R突变体的Asp234，Asp339和His50氨基酸残基形成氢键，与钴原子(Co₅)形成金属共价键，与Phe60，Trp188，Phe145和Trp49形成疏水作用，与His271和Asp309形成阳离子键。

(2)Affinity值

对突变前后的葡萄糖异构酶的Affinity值进行测定，结果分别为-5.817kcal/mol，-5.819kcal/mol。

(3)RMSD

RMSD结果如图6所示，RMSD均值为0.2nm(野生型)，0.18nm(E237H/N298K/N337R突变体)，相较于野生型TMGI-MSB8蛋白，似乎E237H/N298K/N337R突变体与Glucose形成的复合物更加稳定。

(4)RMSF

RMSF结果如图7所示，RMSF分析显示TMGI-MSB8、E237H/N298K/N337R复合物的RMSF并无较大的变化，说明Glucose对突变后的蛋白柔性无明显影响。

(5)结合自由能

对突变前后的葡萄糖异构酶的结合自由能进行测定，结果如下。

表4复合物在300K温度下结合自由能(kcal/mol)

结果显示TMGI-MSB8复合物的总结合自由能为-21.06kcal/mol，其中范德华力(-13.35kcal/mol)，静电力(-56.03kcal/mol)和气相能量(-69.38kcal/mol)有利于TMGI-MSB8复合物体系的稳定。E237H/N298K/N337R复合物的总结合自由能为-26.08kcal/mol，其中范德华力(-20.02kcal/mol)，静电力(-45.79kcal/mol)和气相能量(-65.81kcal/mol)有利于E237H/N298K/N337R复合物体系的稳定性。相较于野生型的TMGI-MSB8蛋白，突变后的E237H/N298K/N337R可与Glucose形成更加稳定的复合物体系。

实施例8

通过改性后的海泡石固定化葡萄糖异构酶

海泡石采用2mol/L的癸酸于60℃下处理110min，分离，洗涤至中性，真空干燥，粉碎，过200目筛，烘干备用。取20g上述酸处理海泡石，加入50m1体积比5％KH550水溶液，用癸酸调节pH5～6，常温搅拌处理一夜，离心，反复洗涤，真空烘干，过200目筛，得硅烷偶联剂KH550改性海泡石。改性后的海泡石防膨作用大幅增强，层间形成空腔较大的刚性有序结构。

运用双功能试剂戊二醛，采用交联法进行固定。将KH550改性海泡石加入到10ml戊二醛溶液中，搅拌处理0.5h，离心，反复洗涤以除去游离戊二醛，常温真空烘干。取0.3g戊二醛处理过载体，加入30ml的1mg/mL葡萄糖异构酶溶液(0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值6.0)，充分混匀，于200r/min水浴恒温振荡器上反应6小时。然后离心分离，测定上清液酶含量，计算固载率；下层沉淀反复洗涤，即得固定化葡萄糖异构酶，于室温真空干燥，测定其酶活。通过试验得知，本法固载率可达63％，产品酶活可达5329.8U/g，酶活回收率可达52％。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种葡萄糖异构酶突变体，其特征在于，由序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸经定点突变而来，所述突变的位点为第237位、第298位和第337位；

MAEFFPEIPKIQFEGKESTNPLAFRFYDPNEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTAERPWNRFSDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGLELENLARFLRMAVEYAKKIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKNHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNIYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLNFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKIAYKLAKDGVFDKFIEEKYRSFKEGIGKEIVEGKTDFEKLEEYIIDKEDIELPSGKQEYLESLLNSYIVKTIAELR，SEQ IDNO.1。

2.如权利要求1所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征在于，由序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸将第237位、第298位和第337位分别突变为组氨酸、赖氨酸和精氨酸。

3.如权利要求1所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；

MAEFFPEIPKIQFEGKESTNPLAFRFYDPNEVIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGRDPFGDPTAERPWNRFSDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYVFWGGREGYETLLNTDLGLELENLARFLRMAVEYAKKIGFTGQFLIEPKPKHPTKHQYDFDVATAYAFLKNHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDAKQGDLLLGWDTDQFPTNIYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLRFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKIAYKLAKDGVFDKFIEEKYRSFKEGIGKEIVEGKTDFEKLEEYIIDKEDIELPSGKQEYLESLLNSYIVKTIAELR，SEQ IDNO.2。

4.如权利要求1所述的葡萄糖异构酶突变体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

ATGGCTGAATTTTTCCCTGAAATTCCTAAAATTCAATTTGAAGGTAAAGAATCTACTAATCCATTGGCTTTTAGATTCTACGATCCAAATGAAGTTATTGATGGTAAACCATTGAAGGATCATCTGAAATTTTCTGTTGCCTTTTGGCATACCTTTGTTAACGAAGGTAGAGATCCATTTGGTGACCCAACTGCTGAAAGACCATGGAATAGATTTTCTGATCCAATGGATAAGGCTTTTGCTAGAGTTGATGCTTTGTTTGAATTCTGTGAAAAGTTGAATATTGAATACTTTTGTTTTCATGACAGAGACATTGCTCCAGAAGGTAAAACTTTGAGAGAAACTAACAAGATTTTGGATAAGGTCGTTGAAAGAATTAAGGAAAGAATGAAAGACTCTAACGTTAAATTGTTGTGGGGTACTGCTAACTTGTTCTCTCACCCAAGATATATGCACGGAGCTGCAACTACCTGTAGTGCTGATGTTTTTGCTTACGCTGCCGCCCAAGTTAAAAAGGCTTTGGAAATAACTAAGGAATTGGGTGGTGAAGGTTACGTTTTCTGGGGTGGTAGAGAAGGTTATGAAACTTTGTTGAACACTGATTTGGGTTTGGAATTGGAAAACTTGGCTAGATTTTTGAGAATGGCTGTTGAGTACGCTAAAAAGATTGGTTTTACTGGACAGTTTTTGATTGAGCCTAAACCTAAGCACCCAACTAAACATCAATATGATTTTGATGTTGCCACTGCTTACGCTTTTCTGAAGAATCATGGACTTGATGAATATTTTAAATTCAACATTGAGGCTAACCATGCTACCCTTGCAGGACATACTTTCCAACATGAATTGAGAATGGCTAGAATTTTGGGTAAATTGGGTTCTATTGATGCTAAGCAAGGAGATTTGTTGTTAGGTTGGGATACTGATCAATTCCCTACTAACATCTACGATACTACCTTAGCTATGTATGAAGTTATTAAGGCTGGTGGTTTTACTAAAGGAGGTTTAAGATTCGATGCTAAGGTTAGAAGAGCTTCTTACAAGGTTGAAGATCTGTTTATTGGTCATATTGCTGGTATGGATACTTTCGCTTTGGGTTTTAAGATTGCCTACAAGTTGGCTAAGGACGGTGTTTTTGATAAATTCATTGAAGAAAAATATAGATCCTTTAAGGAAGGAATTGGAAAGGAAATTGTTGAAGGTAAAACTGATTTCGAAAAGTTGGAAGAATACATTATTGATAAGGAGGATATTGAATTGCCATCTGGAAAGCAAGAGTACTTGGAATCTTTGCTGAATTCTTATATTGTTAAGACTATTGCTGAATTGAGATGA，SEQ ID NO.3。

5.权利要求1-4任一所述的葡萄糖异构酶突变体在催化生产D-果糖中的应用。