CN119775433A - 一种细胞膜表达的il-15融合蛋白及其在细胞治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细胞膜表达的IL‑15融合蛋白及其在细胞治疗中的应用。本发明提供的融合蛋白包含IL‑15Rα信号肽、IL‑15、IL‑15Rαsushi domain和跨膜区，其修饰的细胞能够实现IL‑15在细胞膜表面的高效表达，能有效避免IL‑15分泌表达产生的副作用，且安全可控。包含本发明的膜表达IL‑15融合蛋白的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞具有更强的肿瘤杀伤功能、IFN‑γ分泌和增殖能力；经肿瘤微环境中富含的乳酸和TGF‑β处理后，依然具有很强的肿瘤杀伤功能；且能够激活不包含本发明的免疫细胞的抗肿瘤功能。本发明构建的免疫细胞能够提高肿瘤治疗效果，延长疾病缓解时间，提高患者生存期。

Description

一种细胞膜表达的IL-15融合蛋白及其在细胞治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及一种细胞膜表达IL-15融合蛋白及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞疗法是一种创新的免疫治疗方式，CAR-T细胞是从患者的外周血中提取的T细胞，经过基因修饰后，使其表达能够识别肿瘤抗原的受体，进而具备识别和攻击肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞治疗在血液肿瘤的治疗中取得了巨大的突破，但是当前CAR-T细胞治疗尚无法让大多数肿瘤患者获益，原因包括靶点选择困难、制作过程繁琐且成本高昂、肿瘤微环境的抑制等。

CAR-NK细胞是近年来兴起的一种新型免疫疗法，结合了CAR技术与NK细胞的特性。相比传统的CAR-T细胞，CAR-NK细胞具有一些独特的优点：①广谱抗肿瘤活性：CAR-NK细胞能够识别并攻击多种类型的肿瘤，大大提升了治疗范围；②较低的细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome，CRS)风险：与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞通常引起较轻微的CRS，降低了严重副作用的风险；③快速扩增和成本低：NK细胞可以更快地在体外扩增，相对较短的培养时间使得治疗能够较快进行。NK细胞也可来源于健康供体，实现同种异体输注，成本低廉。但是CAR-NK细胞也存在一些不足：①持久性和生存能力低：CAR-NK细胞在体内的生存时间通常较短，缺乏CAR-T细胞的持久性，可能导致治疗效果的减弱或肿瘤复发的风险增加。②肿瘤微环境的抑制：与CAR-T细胞一样，CAR-NK细胞也受到肿瘤微环境的影响，肿瘤微环境的免疫抑制作用可能抑制CAR-NK细胞的效能。

γδT细胞是一种特殊类型的免疫细胞，其同时具有获得性和先天性免疫反应特征。CAR-γδT细胞是一种新兴的免疫细胞治疗方式，具有更强的肿瘤细胞的识别和清除能力。CAR-γδT细胞具有以下优点：①多样的靶向能力：γδT细胞能够识别多种非特异性抗原，如热休克蛋白、磷酸化抗原和一些细菌抗原，因此可以针对多种不同类型的肿瘤；②天然免疫特性：γδT细胞具有自然杀伤活性，能够通过直接细胞毒作用和分泌细胞因子来消灭肿瘤细胞，不依赖于特定的抗原呈递；③较低的细胞因子释放综合征风险：与CAR-T细胞相比，CAR-γδT细胞通常引起的CRS风险较低，副作用相对较轻；④快速扩增和成本低：γδT细胞能够较快扩增，并在体内迅速响应感染和肿瘤，且能够异体输注，实现货架式供应，成本低。当然CAR-γδT细胞亦存在一些不足：①持久性和生存能力低：CAR-γδT细胞在体内的持久性通常较低，可能导致治疗的长期效果受到制约；②肿瘤微环境的抑制：与CAR-T和CAR-NK细胞一样，CAR-γδT细胞也受到肿瘤微环境的影响，肿瘤微环境的免疫抑制作用可能抑制CAR-γδT细胞的效能。

发明内容

鉴于此，为了弥补现有技术的不足，特提出本发明。本发明的目的在于为本领域提供一种能够提高免疫细胞持久抗肿瘤效果且安全可控的融合蛋白，本发明提供的膜表达融合蛋白包含IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rαsushi domain和跨膜区，其修饰的细胞能够实现IL-15在细胞膜表面的高效表达，但不会分泌表达，能有效避免分泌表达IL-15带来的副作用，且添加了安全保护区后安全可控。包含本发明的膜表达IL-15融合蛋白的嵌合抗原受体，其修饰的免疫细胞具有更强的肿瘤杀伤功能、IFN-γ分泌能力和增殖能力；经肿瘤微环境中富含的乳酸和TGF-β处理后，依然具有很强的肿瘤杀伤功能；且能够激活不包含本发明的免疫细胞的抗肿瘤功能。该优势在临床应用中能够提高肿瘤治疗效果，延长疾病缓解时间，延长患者生存期。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明第一方面提供了一种细胞膜表达的IL-15融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15、IL-15Rα信号肽、IL-15Rα和跨膜区。

进一步，所述IL-15Rα信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述IL-15Rα可以为全长的IL-15Rα。

进一步，所述IL-15Rα也可以为能与IL-15结合的片段，只要保留IL-15Rα与IL-15的结合能力皆落入本发明的保护范围。

进一步，所述IL-15Rα为IL-15Rα的sushi domain。

进一步，所述IL-15Rα的sushi domain的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

进一步，所述跨膜区可以为任何能促进同类亚基之间相互作用，形成二聚体或多聚体的蛋白。

进一步，所述跨膜区为FcεRIγ跨膜区。

进一步，所述FcεRIγ跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

进一步，所述融合蛋白还包括安全保护区或铰链区。

在本发明中，安全保护区是基因编辑的免疫细胞输注人体后，能够保证受试者的安全，使改造的细胞需要具有可控性的区域。进一步，所述安全保护区包括CD20、iCasp9、tEGFR、RQR8。在本发明的具体实施例中，所述安全保护区选自CD20，当改造的细胞出现异常增殖等不可控的风险时，给予临床用药美罗华，结合CD20，利用机体的抗体依赖细胞介导的细胞毒效应清除改造的细胞，更加安全。进一步，所述CD20的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

进一步，铰链区能够使IL-15保持在质膜之外，并具有必要的灵活性，有利于膜表达的IL-15与IL-15Rβ和γ受体结合，稳定传递IL-15活化信号。进一步，所述铰链区包括CD28铰链区、CD8铰链区、CD4铰链区、免疫球抗体IgG的铰链区、免疫球抗体IgG的铰链区偶联CH2CH3区域。进一步，所述铰链区选自CD8铰链区。进一步，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

进一步，所述融合蛋白中的IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rα、跨膜区为达到膜表达目的所必须的，在一个可选的方案中，可加入安全保护区以保证膜表达IL-15的安全性，在一个可选的方案中，可加入铰链区以达到更好的膜表达IL-15的效果。

进一步，所述融合蛋白中的IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rα、跨膜区可依次连接，也可以其他顺序连接，在一个实施方案中，当安全保护区和/或铰链区被加入到所述融合蛋白中时，也可依次连接或以其他顺序连接，无论通过何种顺序连接，只要能达到使IL-15膜表达的目的皆落入本发明的保护范围之内。进一步，所述IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rα、跨膜区、安全保护区、铰链区互相之间可直接相连。进一步，所述IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rα、跨膜区、安全保护区、铰链区互相之间可通过至少一个linker连接，linker可以是柔性的，也可以是刚性的。进一步，所述linker包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、LRQKD(GGGS)₂ERP、DGGGS、LRQRDGERP、TGEKP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKVD、GGRRGGGS、GGRR、LRQKDGGGSERP或(GGGGS)n。进一步，所述linker选自(GGGGS)n。

进一步，所述IL-15和IL-15Rα之间通过linker(GGGGS)₅连接。

进一步，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明第二方面提供了一种膜表达IL-15的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含本发明第一方面所述的融合蛋白。

在本发明中，所述膜表达IL-15的嵌合抗原受体是同时在细胞膜上分别表达IL-15和嵌合抗原受体(CAR)。CAR是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体免疫细胞的核心部件，其可包括抗原识别区(例如，肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)、跨膜结构域、胞内信号结构域、铰链区和共刺激结构域。CAR是工程化的受体，可将任意特异性受体植入到免疫效应细胞上。在CAR中，可以将特异识别肿瘤抗原的抗体植入免疫细胞上。可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸导入免疫细胞中。以这种方式，可以生成大量的癌症特异性免疫细胞用于过继性细胞治疗。

进一步，所述膜表达IL-15的嵌合抗原受体中是将本发明第一方面所述的融合蛋白和CAR依次连接，也可以其他顺序连接，无论通过何种顺序连接，只要能达到使IL-15膜表达的目的皆落入本发明的保护范围之内。

进一步，所述分别表达可通过在膜表达IL-15和嵌合抗原受体之间加入自断裂肽实现。

进一步，所述自断裂肽选自任意一种下列自断裂肽：T2A、P2A、E2A、F2A。

进一步，所述自断裂肽为T2A。

进一步，所述抗原识别区选自针对肿瘤表面抗原的抗体。

进一步，所述肿瘤表面抗原包括CD19、间皮素、CD20、CD22、CD123、CD30、CD33、CD38、CD138、BCMA、FAP、Glypican-3、CEA、CA125、CA199、CA15-3、SCC、NSE、EGFRvIII、PSMA、Her2、IL13Rα2、CD171、GD2、Pro-GRP、CYFRA21-1、TRCP-5b、sB7-H3、DCP、OPN、GP73、CA72-4、MG7-AG、PG、CA50、DC-SIGNR、CHGA、PSA、GPRC5D、Siglec-6的一种或多种。

进一步，所述肿瘤表面抗原选自间皮素。

进一步，所述针对肿瘤表面抗原的抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

进一步，所述针对肿瘤表面抗原的抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

进一步，所述跨膜结构域包括CD8跨膜区、CD8α跨膜区、CD28跨膜区、CD4跨膜区、CD28跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD137/4-1BB跨膜区、CD134/OX40跨膜区、ICOS跨膜区、CD5跨膜区、CD9跨膜区、CD16跨膜区、CD22跨膜区、CD33跨膜区、CD37跨膜区、CD45跨膜区、CD64跨膜区、CD80跨膜区、CD86跨膜区、CD154跨膜区、TCRα跨膜区、TCRβ跨膜区。

进一步，所述跨膜结构域选自CD28跨膜区。

进一步，所述跨膜结构域的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:19所示的部分氨基酸序列。

进一步，所述胞内信号传导结构域包括任意一种下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d。

进一步，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ的胞内信号传导结构域。

进一步，所述胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

进一步，所述铰链区包括任意一种下列分子的铰链区：CD8、CD28、CD34、4-1BB、OX40、CD3ε、IgG1、IgG4、PD-1、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体。

进一步，所述铰链区选自CD28铰链区。

进一步，所述铰链区的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:19所示的部分氨基酸。

进一步，所述共刺激信号结构域包括任意一种下列分子的共刺激信号结构域：CD28、4-1BB、CD19、CD4、CD27、ICOS、CD8α、CD8β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226。

进一步，所述共刺激信号结构域选自4-1BB的共刺激信号结构域。

进一步，所述共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

进一步，所述嵌合抗原受体还包含信号肽。

进一步，所述信号肽包括任意一种下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD16、CD22、CD33、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD28、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM-CSF。

进一步，所述信号肽选自CD8α的信号肽。

本发明第三方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如第一方面所述的融合蛋白，或者编码如第二方面所述的嵌合抗原受体。

进一步，所述核酸分子还包含启动子、和/或位于启动子之后的酶切位点、和/或位于酶切位点之后的kozak序列。

在本发明中，核酸分子是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

进一步，所述编码膜表达的IL-15的核酸分子序列对应于SEQ ID NO:16所示的部分或全部。

进一步，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子序列对应于SEQ ID NO:22所示的部分或全部。

本发明第四方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第三方面所述的核酸分子。

进一步，所述载体的类型不受限制，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒，可根据待导入的细胞而改变。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，NewYork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述，导入可通过标准技术例如，感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包括例如，裸DNA、CaPO₄沉淀、DEAE聚葡糖、电穿孔、原生质体融合、脂质体转染、细胞显微注射和病毒载体。在一些实施方案中，可用作载体的病毒包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。此外，为了评估目的蛋白(例如，单克隆抗体)的表达，被引入细胞的载体也可包含可选择的标记基因或报告基因中的任一个或两个，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。

进一步，所述载体可以是表达载体、克隆载体或整合载体。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。整合载体含有将靶序列整合到细胞基因组上的组件。这些载体可以用于转化适当的细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的单克隆抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。在本发明的具体实施例中，使用的载体为慢病毒表达质粒pCDH载体、慢病毒包装质粒pSPAX2和pMD2G载体。

本发明第五方面提供了一种工程化的细胞及其衍生物，所述工程化的细胞及其衍生物包含本发明第三方面所述的核酸分子，或者包括本发明第四方面所述的表达载体。

进一步，所述衍生物包括但不限于细胞外囊泡，任何由本发明第五方面所述的工程化的细胞产生的衍生物均落入本发明的保护范围内。

在本发明中，细胞外囊泡是一类由细胞分泌的具有脂质双分子层膜结构的囊泡群体，细胞外囊泡的内含物包括细胞外囊泡的miRNA、细胞外囊泡的mRNA或细胞外囊泡的表面蛋白，根据细胞外囊泡的尺寸大小可以分为外泌体、微囊泡和凋亡小体。

进一步，所述细胞外囊泡选自外泌体。

进一步，所述工程化的细胞包括真核细胞、原核细胞。

进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。

进一步，所述哺乳动物细胞包括免疫细胞、CHO细胞、293T细胞、293F细胞。

进一步，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、NK92细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或其任意组合。

进一步，所述T细胞包括αβT细胞、γδT细胞。

进一步，所述免疫细胞选自γδT细胞、NK细胞。

进一步，所述γδT细胞、NK细胞来源于人。

进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。

本发明第六方面提供了一种组合物，所述组合物包括本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物。

进一步，所述组合物还包括药剂学上可接受的载体和/或辅料。

本发明第七方面提供了一种生物制剂，所述生物制剂包含本发明第六方面所述的药物组合物。

进一步，所述生物制剂的剂型为注射剂、冻干剂、口服剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂或贴剂。

在一些实施方案中，本发明对所述生物制剂的具体剂型并无特别限制，在一些实施方案中，本发明提供的药物组合物或生物制剂可根据实际需求被配制用于局部、静脉内、口服、肠内和/或肠胃外施用的药物组合物或生物制剂。在一些实施方案中，本发明提供的药物组合物或生物制剂的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明第八方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂。

本发明第九方面提供了如下任一项方法：

1)一种本发明第一方面所述的融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括培养本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物，使其能够表达本发明第一方面所述的融合蛋白；

2)一种本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物的制备方法，所述制备方法包括将本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体导入细胞中。

本发明第十方面提供了如下任一项应用：

1)本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂、本发明第八方面所述的试剂盒在制备诊断和/或治疗抗肿瘤药物中的应用；

2)本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂、本发明第八方面所述的试剂盒在提高免疫细胞存活能力中的应用。

3)本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂、本发明第八方面所述的试剂盒在抑制免疫细胞凋亡中的应用；

4)本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂、本发明第八方面所述的试剂盒在增强免疫细胞增殖能力中的应用；

5)本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂、本发明第八方面所述的试剂盒在制备提高免疫细胞抗肿瘤能力的药物中的应用；

6)本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂、本发明第八方面所述的试剂盒在增强免疫细胞的细胞因子水平中的应用；

7)本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂、本发明第八方面所述的试剂盒在制备改变肿瘤微环境药物中的应用；

8)本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的生物制剂、本发明第八方面所述的试剂盒在体外杀伤肿瘤细胞的应用；

9)本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物在制备本发明第一方面所述的融合蛋白中的应用；

10)本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体在制备本发明第五方面所述的工程化的细胞及其衍生物中的应用。

进一步，所述肿瘤包括但不限于肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、肺癌(肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、肉瘤、肛门癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中。

进一步，所述肿瘤选自白血病、卵巢癌、淋巴瘤。

进一步，所述肿瘤为卵巢癌。

进一步，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、γδT细胞、NK92细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或其任意组合。

进一步，所述免疫细胞选自γδT细胞、NK细胞。

进一步，所述γδT细胞、NK细胞来源于人。

进一步，所述细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子。

进一步，所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素。

进一步，所述细胞因子为干扰素。

进一步，所述干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-γ、IFN-λ。

进一步，所述干扰素选自IFN-γ。

本发明具有的优点和有益效果：

本发明提供了一种细胞膜表达的IL-15融合蛋白及其在细胞治疗技术中的应用，本发明将IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rαsushi domain、跨膜区串联后与CAR连接，修饰免疫细胞，实现了IL-15在免疫细胞膜表面的高效表达。本发明通过实验证明所述IL-15-IL-15Rαsushi-FcεRI的工程化免疫细胞能够实现高效膜表达IL-15、强杀伤肿瘤细胞和强效抗肿瘤的效果，并且该工程化免疫细胞还具有促进免疫细胞增殖、提高IFN-γ表达水平、改变肿瘤微环境的功能。

附图说明

图1是膜表达IL-15的结构模式图；

图2是CAR-γδT细胞中γδT纯度检测结果图；

图3是CAR-γδT细胞CAR表达效率检测结果图；

图4是CAR-γδT细胞表面IL-15(mIL-15)表达效率检测结果图；

图5是CAR-γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用检测结果图；

图6是CAR-γδT细胞对肿瘤细胞的再次杀伤作用检测结果图；

图7是CAR-γδT细胞增殖能力检测结果图；

图8是CAR-γδT细胞CD107a表达分析结果图；

图9是CAR-γδT细胞IFN-γ表达分析结果图；

图10是CAR-γδT细胞经乳酸或TGF-β处理后肿瘤杀伤功能变化图；

图11是CAR-γδT细胞对γδT细胞肿瘤杀伤作用的影响图；

图12是CAR-γδT细胞对γδT细胞分泌IFN-γ的影响图；

图13是美罗华对CAR-γδT细胞的清除效果分析图；

图14是CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用检测结果图；

图15是CAR-NK细胞分泌IL-15水平检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1膜表达的IL-15的构建

将IL-15Rα的信号肽直接与人IL-15编码基因连接，用柔性linker(G4S)连接IL-15Rα的sushi区域，将美罗华针对CD20的结合区域与IL-15Rα的sushi区域连接，在美罗华结合区后加入CD8铰链区，将跨膜区FcεRIγ(编码基因为FCER1G)的胞内段与CD8铰链区连接，构建的膜表达的IL-15的结构如图1所示。构建膜表达的IL-15所涉及的各基因的序列如表1所示。

表1构建膜表达的IL-15所涉及的各基因的序列

实施例2膜表达IL-15的CAR-γδT细胞的构建及功能检测

1、实验材料

实验材料如表2所示：

表2实验材料

2、实验方法

(1)采用T2A将本发明构建的膜表达IL-15编码基因与靶向间皮素抗体(Mesothelin，MSLN)的CAR连接(专利号：CN111548420A)，该CAR结构包括人CD8α信号肽、抗间皮素单链抗体、人CD28铰链区、跨膜区和胞浆区，以及人4-1BB和CD3ζ胞浆区。构建好的结构亚克隆至慢病毒表达质粒pCDH载体，将其与包装质粒pSPAX2和pMD2G混合后用磷酸钙转染的方法转入293FT细胞以生产慢病毒颗粒，采用PEG8000浓缩病毒。组成CAR的各个组件的氨基酸序列如表3所示。

表3组成CAR的各个组件的氨基酸序列

γδT细胞制备：取人的外周血单个核细胞(PBMCs)，将其调整至1-2×10⁶个/mL完全培养基(含有600IU/mL的IL-2、50μL/mL谷氨酰胺、5-10％(体积比)自体血浆、5μM/mL唑来膦酸的无血清细胞培养液ALyS505N-0)，轻晃混匀，放入5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养。

采用慢病毒转染对数生长期的γδT细胞(培养第5-7天的PBMCs，MOI＝10)，病毒感染一天后，去除含有病毒的培养基，采用不含有唑来膦酸的完全培养基继续培养至第11天，即可以收获细胞。

(2)对CAR-γδT细胞的γδT细胞纯度进行检测。取培养的细胞，调整细胞密度为1×10⁶个细胞/mL，取100μL加入流式管中，加入不同荧光标记的鼠抗人CD3、Vγ9和IL-15抗体以及荧光标记的人Mesothelin(MSLN)蛋白各5μL，室温避光孵育15min，1500rpm室温离心5min，去上清，加入2mLPBS洗涤细胞，500rpm室温离心5min，弃上清，加入200μLPBS悬起细胞，流式细胞仪检测。

(3)对体外肿瘤杀伤能力进行检测：将CAR-γδT细胞和γδT细胞分别去除IL-2培养24h，48h和72h；采用Calcein-AM标记表达Mesothelin的SKOV3细胞，然后与实施例2获得的细胞按照5:1的效靶比作用4h，通过酶标仪检测靶细胞被杀伤后Calcein的释放，检测CAR-γδT细胞和γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

(4)将培养的CAR-γδT细胞与SKOV3细胞按照10:1的效靶比作用24h后，分离CAR-γδT细胞，二次杀伤检测是将分离的CAR-γδT细胞与Calcein-AM标记SKOV3细胞按照5:1的效靶比作用4h，检测CAR-γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。三次杀伤则将分离的CAR-γδT细胞与SKOV3细胞按照10:1的效靶比再作用24h后，分离CAR-γδT细胞，再与Calcein-AM标记SKOV3细胞按照5:1的效靶比作用4h，检测CAR-γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

(5)对体外增殖能力进行检测：检测Ki67的表达水平。取培养的细胞，调整细胞密度为1×10⁶个细胞/mL，取100μL加入流式管中，破膜处理后，加入荧光标记的鼠抗人Ki67抗体5μL，室温避光孵育20-30min，1500rpm室温离心5min，去上清，加入2mL PBS洗涤细胞，500rpm室温离心5min，弃上清，加入200μLPBS悬起细胞，流式细胞仪检测。

(6)对CD107a进行检测：将培养的细胞与SKOV3细胞按照10:1的效靶比作用4h，采用流式细胞术检测培养细胞CD107a的表达。

(7)将CAR-γδT细胞与肿瘤细胞SKOV3细胞共孵育4h后，采用胞内染色方法检测检测IFN-γ表达。

(8)将CAR-γδT细胞经乳酸或TGF-β处理24h后，采用Calcein-Am释放法检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。

(9)将同一供者来源的γδT细胞与CAR-γδT细胞1:1共孵育24h后，然后将γδT细胞与Calcein-AM标记肿瘤细胞SKOV3细胞作用4h，检测杀伤效果。

(10)将同一供者来源的γδT细胞与CAR-γδT细胞1:1共孵育24h后，然后将γδT细胞与Calcein-AM标记肿瘤细胞SKOV3细胞作用4h后，采用胞内染色方法检测IFN-γ表达。

(11)将同一供者来源的NK细胞与Calcein-AM标记的CAR-γδT细胞按照10:1混匀后，分成两组，一组加入美罗华，一组不加入美罗华，孵育4h后，采用Calcein-Am释放法检测检测美罗华对本发明培养的CAR-γδT细胞的清除作用。

3、实验结果

(1)结果(图2)显示本发明构建的靶向Mesothelin的CAR-γδT细胞(mIL-15-CAR-γδT)与对照CAR-γδT细胞(CAR-γδT)和对照γδT细胞(γδT)中γδT细胞比例均高于90％，且不具有明显差异，说明本发明构建的CAR-γδT细胞不影响γδT细胞纯度，且纯度很高。

(2)结果(图3)显示本发明构建的mIL-15-CAR-γδT的CAR表达比例略高于对照CAR-γδT细胞，说明本发明构建的CAR-γδT细胞有更好的CAR表达。

(3)结果(图4)显示本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞膜表达IL-15，而对照组不表达，表明本发明能够实现IL-15的膜表达。

(4)结果(图5)显示本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞在去除IL-2培养24h，48h，72h后的肿瘤杀伤效果均强于对照CAR-γδT细胞和γδT细胞，说明本发明构建的CAR-γδT细胞在去除IL-2的条件下抗肿瘤能力依然最强。

(5)结果(图6)显示本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞的二次和三次肿瘤杀伤能力均明显高于对照组，说明本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞的多次抗肿瘤功能最强。

(6)结果(图7)显示本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞的Ki67表达明显高于对照组，说明本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞增殖能力最强。

(7)结果(图8)显示本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞的CD107a表达明显高于对照组，说明本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤活性更强。

(8)结果(图9)显示本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞的IFN-γ表达明显高于对照组，说明本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞抗肿瘤功能更强。

(9)结果(图10)显示本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞经乳酸或TGF-β处理后对肿瘤细胞的杀伤作用依然明显高于对照组，说明本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞即使在富含乳酸和TGF-β的肿瘤微环境中依然保持较强的抗肿瘤作用。

(10)结果(图11)显示与本发明构建mIL-15-CAR-γδT细胞共孵育的γδT细胞的CD107a表达明显高于对照组，说明本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞能够提高不包含本发明的γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

(11)结果(图12)显示与本发明构建mIL-15-CAR-γδT细胞共孵育的γδT细胞的IFN-γ表达明显升高，说明本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞能够促进不包含本发明的γδT细胞分泌更多的IFN-γ。

(12)结果(图13)显示NK细胞对本发明和对照CAR-γδT细胞的杀伤作用均较低，且不具有统计学差异；但在NK细胞与CAR-γδT细胞作用的同时加入美罗华，NK细胞对本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞的杀伤作用明显高于对照组CAR-γδT细胞，说明本发明构建的mIL-15-CAR-γδT细胞能够被美罗华依赖的NK细胞所清除。

实施例3膜表达IL-15的CAR-NK细胞的构建及功能检测

1、实验方法

(1)采用慢病毒转染对数生长期的人的NK细胞(培养第5-7天的NK细胞，MOI＝10)，病毒感染一天后，去除含有病毒的培养基，更换新的NK细胞培养基继续培养至第11天，即可以收获细胞。

(2)将NK细胞、对照CAR-NK细胞和本发明构建的mIL-15-CAR-NK细胞分别去除IL-2培养24h，然后与SKOV3细胞按照2.5:1的效靶比作用4h，检测NK和CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

(3)将NK细胞、对照CAR-NK细胞和本发明构建的mIL-15-CAR-NK细胞分别去除IL-2培养24h，然后收集培养液上清，Elisa检测IL-15的浓度。

2、实验结果

(1)结果(图14)显示本发明构建的mIL-15-CAR-NK细胞的肿瘤杀伤效果明显强于对照CAR-NK细胞和NK细胞，说明本发明构建的mIL-15-CAR-NK细胞抗肿瘤能力最强。

(2)结果(图15)显示本发明构建的mIL-15-CAR-NK细胞和对照CAR-NK细胞和NK细胞上清液中IL-15浓度不存在统计学差异，说明本发明构建的mIL-15-CAR-NK细胞不会向细胞外分泌IL-15。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种细胞膜表达的IL-15融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括IL-15、IL-15Rα信号肽、IL-15Rα和跨膜区；

优选地，所述IL-15Rα信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

优选地，所述IL-15Rα为全长的IL-15Rα或能与IL-15结合的片段；

优选地，所述IL-15Rα为IL-15Rα的sushi domain；

优选地，所述IL-15Rα的sushi domain的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

优选地，所述跨膜区为FcεRIγ跨膜区；

优选地，所述FcεRIγ跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；

优选地，所述融合蛋白还包括安全保护区或铰链区；

优选地，所述安全保护区包括CD20、iCasp9、tEGFR、RQR8；

优选地，所述安全保护区选自CD20；

优选地，所述CD20的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；

优选地，所述铰链区包括CD28铰链区、CD8铰链区、CD4铰链区、免疫球抗体IgG的铰链区、免疫球抗体IgG的铰链区偶联CH2CH3区域；

优选地，所述铰链区选自CD8铰链区；

优选地，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；

优选地，所述IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rα、跨膜区、安全保护区或铰链区可以以任何能膜表达IL-15的顺序连接；

优选地，所述IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rα、跨膜区、安全保护区或铰链区可依次连接；

优选地，所述IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rα、跨膜区、安全保护区或铰链区互相之间可直接相连；

优选地，所述IL-15Rα信号肽、IL-15、IL-15Rα、跨膜区、安全保护区或铰链区互相之间可通过至少一个linker连接；

优选地，所述linker包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、LRQKD(GGGS)₂ERP、DGGGS、LRQRDGERP、TGEKP、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKVD、GGRRGGGS、GGRR、LRQKDGGGSERP或(GGGGS)n；

优选地，所述linker选自(GGGGS)n；

优选地，所述IL-15和IL-15Rα之间通过linker(GGGGS)₅连接；

优选地，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.一种膜表达IL-15的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含权利要求1所述的融合蛋白；

优选地，所述膜表达IL-15的嵌合抗原受体还包含自断裂肽；

优选地，所述自断裂肽选自任意一种下列自断裂肽：T2A、P2A、E2A、F2A；

优选地，所述自断裂肽为T2A；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含抗原识别区、跨膜结构域、胞内信号传导结构域、铰链区或共刺激信号结构域；

优选地，所述抗原识别区选自针对肿瘤表面抗原的抗体；

优选地，所述肿瘤表面抗原包括CD19、间皮素、CD20、CD22、CD123、CD30、CD33、CD38、CD138、BCMA、FAP、Glypican-3、CEA、CA125、CA199、CA15-3、SCC、NSE、EGFRvIII、PSMA、Her2、IL13Rα2、CD171、GD2、Pro-GRP、CYFRA21-1、TRCP-5b、sB7-H3、DCP、OPN、GP73、CA72-4、MG7-AG、PG、CA50、DC-SIGNR、CHGA、PSA、GPRC5D、Siglec-6的一种或多种；

优选地，所述肿瘤表面抗原选自间皮素；

优选地，所述针对肿瘤表面抗原的抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；

优选地，所述针对肿瘤表面抗原的抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；

优选地，所述跨膜结构域包括CD8跨膜区、CD8α跨膜区、CD28跨膜区、CD4跨膜区、CD28跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD137/4-1BB跨膜区、CD134/OX40跨膜区、ICOS跨膜区、CD5跨膜区、CD9跨膜区、CD16跨膜区、CD22跨膜区、CD33跨膜区、CD37跨膜区、CD45跨膜区、CD64跨膜区、CD80跨膜区、CD86跨膜区、CD154跨膜区、TCRα跨膜区、TCRβ跨膜区；

优选地，所述跨膜结构域选自CD28跨膜区；

优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:19所示的部分氨基酸序列；

优选地，所述胞内信号传导结构域包括任意一种下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、FcRβ、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d；

优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ的胞内信号传导结构域；

优选地，所述胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；

优选地，所述铰链区包括任意一种下列分子的铰链区：CD8、CD28、CD34、4-1BB、OX40、CD3ε、IgG1、IgG4、PD-1、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；

优选地，所述铰链区选自CD28铰链区；

优选地，所述铰链区的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:19所示的部分氨基酸序列；

优选地，所述共刺激信号结构域包括任意一种下列分子的共刺激信号结构域：CD28、4-1BB、CD19、CD4、CD27、ICOS、CD8α、CD8β、BAFFR、HVEM、LIGHT、KIRDS2、SLAMF7、NKp30、NKp46、CD40、CDS、ICAM-1、B7-H3、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD7、CD226；

优选地，所述共刺激信号结构域选自4-1BB的共刺激信号结构域；

优选地，所述共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；

优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；

优选地，所述信号肽包括任意一种下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD16、CD22、CD33、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD28、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、GM-CSF；

优选地，所述信号肽选自CD8α的信号肽。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的融合蛋白，或者编码如权利要求2所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述核酸分子还包含启动子、和/或位于启动子之后的酶切位点、和/或位于酶切位点之后的kozak序列；

优选地，所述编码膜表达的IL-15的核酸分子序列对应于SEQ ID NO:16所示的部分或全部；

优选地，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子序列对应于SEQ ID NO:22所示的部分或全部。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的核酸分子。

5.一种工程化的细胞及其衍生物，其特征在于，所述工程化的细胞及其衍生物包含权利要求3所述的核酸分子，或者包括权利要求4所述的表达载体；

优选地，所述衍生物包括细胞外囊泡；

优选地，所述细胞外囊泡包括微囊泡、外泌体、凋亡小体；

优选地，所述细胞外囊泡选自外泌体；

优选地，所述工程化的细胞包括真核细胞、原核细胞；

优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞；

优选地，所述哺乳动物细胞包括免疫细胞、CHO细胞、293T细胞、293F细胞；

优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、NK92细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或其任意组合；

优选地，所述T细胞包括αβT细胞、γδT细胞；

优选地，所述免疫细胞选自γδT细胞、NK细胞；

优选地，所述γδT细胞、NK细胞来源于人；

优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。

6.一种组合物，所述组合物包括权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物；

优选地，所述组合物还包括药剂学上可接受的载体和/或辅料。

7.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含权利要求6所述的药物组合物；

优选地，所述生物制剂的剂型为注射剂、冻干剂、口服剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂或贴剂。

8.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂。

9.如下任一项方法：

1)一种权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括培养权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物，使其能够表达权利要求1所述的融合蛋白；

2)一种权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体导入细胞中。

10.如下任一项应用：

1)权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂、权利要求8所述的试剂盒在制备诊断和/或治疗抗肿瘤药物中的应用；

2)权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂、权利要求8所述的试剂盒在提高免疫细胞存活能力中的应用；

3)权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂、权利要求8所述的试剂盒在抑制免疫细胞凋亡中的应用；

4)权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂、权利要求8所述的试剂盒在增强免疫细胞增殖能力中的应用；

5)权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂、权利要求8所述的试剂盒在制备提高免疫细胞抗肿瘤能力的药物中的应用；

6)权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂、权利要求8所述的试剂盒在增强免疫细胞的细胞因子水平中的应用；

7)权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂、权利要求8所述的试剂盒在制备改变肿瘤微环境药物中的应用；

8)权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物、权利要求6所述的组合物、权利要求7所述的生物制剂、权利要求8所述的试剂盒在体外杀伤肿瘤细胞的应用；

9)权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物在制备权利要求1所述的融合蛋白中的应用；

10)权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体在制备权利要求5所述的工程化的细胞及其衍生物中的应用；

优选地，所述肿瘤包括肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、肺癌(肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、肉瘤、肛门癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤中的一种或多种；

优选地，所述肿瘤选自白血病、卵巢癌、淋巴瘤；

优选地，所述肿瘤为卵巢癌；

优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、γδT细胞、NK92细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或其任意组合；

优选地，所述免疫细胞选自γδT细胞、NK细胞；

优选地，所述γδT细胞、NK细胞来源于人；

优选地，所述细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子；

优选地，所述细胞因子选自白细胞介素、干扰素；

优选地，所述细胞因子为干扰素；

优选地，所述干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-γ、IFN-λ；

优选地，所述干扰素选自IFN-γ。