CN119838010A - 抑制thap3和smyd3在协同治疗肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抑制THAP3和SMYD3在协同治疗肿瘤中的应用。具体地，本发明提供了THAP3抑制剂，以及包含THAP3抑制剂和SMYD3抑制剂的活性成分组合的用途。本发明首次发现了转录因子THAP3与线粒体电子传递链基因表达高度相关，并且THAP3将SMYD3募集到电子传递链基因，并上调基因启动子附近区域的H3K4me3以表观调控靶基因表达；抑制THAP3和/或SMYD3能够显著抑制肿瘤细胞的线粒体生物发生。由此，为治疗和/或预防肿瘤或癌症提供了新靶点。

Description

抑制THAP3和SMYD3在协同治疗肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及抑制THAP3和SMYD3在协同治疗肿瘤中的应用。

背景技术

线粒体是真核细胞的能量工厂。作为高度特化的细胞器，线粒体被双层膜包裹，并含有电子传递链(ETC)以维持氧化磷酸化和细胞产能。尽管线粒体被认为在进化过程中起源于原核生物并保留着细胞器特异的基因组，但大多数线粒体基因是由核基因组编码的。转录因子在调节基因表达中起着重要作用。人类基因组编码大约1600个转录因子。以往研究已经鉴定出了部分控制线粒体基因表达和生物发生的核转录因子或其协同调节因子。例如雌激素相关受体α(ESRRA)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)被发现促进线粒体基因表达和生物发生(Austin和St Pierre，2012；Dings等人，2022)。核呼吸因子1和2(NRF-1和NRF-2)也在转录水平上提高线粒体呼吸相关基因的表达(Bennett等人，2022)。因此，很有可能存在着更多的未知转录因子参与核基因组编码线粒体基因的表达调控过程。

电子传递链是定位于线粒体内膜上的独特分子机器。ETC负责将质子从线粒体基质泵送到膜间隙，从而建立质子梯度以产生能量。电子传递链包括五种蛋白复合体：NADH:泛醌氧化还原酶(复合体I，或称为CI)、琥珀酸脱氢酶(CII)、细胞色素bc1氧化还原酶(CIII)、细胞细胞色素c氧化酶(CIV)和ATP合酶(CV)。复合体V帮助质子回流到线粒体基质并产生ATP。因此电子传递链对细胞呼吸和能量生产至关重要。值得注意的是，电子传递链的生物发生存在于两个独立的细胞区室中。虽然线粒体基因组只编码13个电子传递链组分，但大多数电子传递链基因位于核基因组中。目前研究对哪些转录因子控制电子传递链基因表达仍知之甚少。

近年研究发现转录因子可以与表观修饰酶相互作用进而调节靶基因表达(Wu和Zhang，2017)。具体而言，转录因子能够募集表观修饰酶并将其引导到特定的基因，使其能够精确地修饰靶基因的基因组DNA或组蛋白(Rasmussen和Helin，2016；Wang等人，2015)。组蛋白甲基化是重要的表观遗传修饰类型之一，根据修饰位点和方式的不同可能激活或沉默靶基因的表达。在近十余年的研究中，组蛋白甲基转移酶或甲基化酶已被系统的发现和鉴定，但是组蛋白甲基化酶在线粒体呼吸中的作用尚未完全明确。

值得注意的是，电子传递链的生物发生过程在多种类型的肿瘤中处于失调状态(Liu和Shi，2020；Raimondi等人，2020；Zhao等人，2023)。不同类型肿瘤对线粒体活性的依赖程度体现出较大的异质性。线粒体生物发生在部分类型肿瘤(如肝癌、胆管癌、白血病、乳腺癌、肺癌等)中显著上调，因此这些肿瘤对线粒体活性的依赖度相对较高。通过干预线粒体生物发生有望获得高效的抑癌效果。因此，探索线粒体电子传递链的生物发生，对于发掘新的肿瘤治疗靶点具有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤或癌症治疗和/或预防的新靶点，进而提供新的抗肿瘤药物以及治疗和/或预防肿瘤或癌症的新方法。

本发明的第一方面，提供了THAP3抑制剂的用途，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于：

(1)抑制线粒体生物发生；(2)下调线粒体电子传递链基因表达；和/或(3)治疗和/或预防肿瘤或癌症。

在另一优选例中，所述THAP3抑制剂下调THAP3基因的表达(包括转录水平和蛋白水平)，和/或抑制或阻断THAP3的功能活性。

在另一优选例中，所述THAP3抑制剂选自下组：小分子化合物、多肽、核酸(例如，shRNA、siRNA或sgRNA)或其组合。

在另一优选例中，所述THAP3抑制剂为特异性靶向THAP3基因的shRNA，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:1和2所示，或如SEQ ID NO:3和4所示。

在另一优选例中，所述“下调线粒体电子传递链基因表达”包括降低线粒体电子传递链基因启动子附近区域的组蛋白甲基化水平，从而在表观遗传水平下调电子传递链基因表达。

在另一优选例中，所述“下调线粒体电子传递链基因表达”包括降低线粒体电子传递链基因启动子附近区域的H3K4me3水平。

在另一优选例中，所述线粒体电子传递链基因选自下组：NDUFB10、SDHB、UQCRH、COX5B、ATP5ME、或其组合。

在另一优选例中，所述肿瘤或癌症具有以下特征：所述肿瘤或癌症的发生和/或进展与线粒体生物发生的异常调控特别相关。

在另一优选例中，所述肿瘤或癌症选自下组：胆管癌、肝癌、急性髓系白血病(AML)、乳腺癌、肺癌。

在另一优选例中，所述组合物或制剂还包括第二活性成分，所述第二活性成分为SMYD3抑制剂。

在另一优选例中，所述SMYD3抑制剂下调SMYD3基因的表达(包括转录水平和蛋白水平)，和/或抑制或阻断SMYD3的功能活性。

在另一优选例中，所述SMYD3抑制剂选自下组：小分子化合物、多肽、核酸(例如，shRNA、siRNA或sgRNA)或其组合。

在另一优选例中，所述SMYD3抑制剂为特异性靶向SMYD3基因的shRNA，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:5和6所示，或如SEQ ID NO:7和8所示。

在另一优选例中，所述SMYD3抑制剂为BCI-121。

本发明的第二方面，提供了一种活性成分组合的用途，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于：

(1)抑制线粒体生物发生；(2)下调线粒体电子传递链基因表达；和/或(3)治疗和/或预防肿瘤或癌症；

其中所述活性成分组合包括第一活性成分THAP3抑制剂，和第二活性成分SMYD3抑制剂。

在另一优选例中，所述THAP3抑制剂下调THAP3基因的表达(包括转录水平和蛋白水平)，和/或抑制或阻断THAP3的功能活性。

在另一优选例中，所述THAP3抑制剂选自下组：小分子化合物、多肽、核酸(例如，shRNA、siRNA或sgRNA)或其组合。

在另一优选例中，所述SMYD3抑制剂下调SMYD3基因的表达(包括转录水平和蛋白水平)，和/或抑制或阻断SMYD3的功能活性。

在另一优选例中，所述SMYD3抑制剂选自下组：小分子化合物、多肽、核酸(例如，shRNA、siRNA或sgRNA)或其组合。

在另一优选例中，所述第一活性成分为特异性靶向THAP3基因的shRNA，且第二活性成分为特异性靶向SMYD3基因的shRNA。

在另一优选例中，所述第一活性成分为特异性靶向THAP3基因的shRNA，且第二活性成分为SMYD3特异性化学抑制剂BCI-121。

在另一优选例中，所述特异性靶向THAP3基因的shRNA的序列如SEQ ID NO:1和2所示，或如SEQ ID NO:3和4所示。

在另一优选例中，所述特异性靶向SMYD3基因的shRNA的序列如SEQ ID NO:5和6所示，或如SEQ ID NO:7和8所示。

本发明的第三方面，提供了一种活性成分组合，所述活性成分组合包括：

(i)第一活性成分，所述第一活性成分为THAP3抑制剂；和

(ii)第二活性成分，所述第二活性成分为SMYD3抑制剂。

在另一优选例中，所述THAP3抑制剂和SMYD3抑制剂如上所述。

本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：(a)THAP3抑制剂，(b)SMYD3抑制剂，和(c)药物学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述THAP3抑制剂和SMYD3抑制剂如上所述。

在另一优选例中，所述药物组合物用于：(1)抑制线粒体生物发生；(2)下调线粒体电子传递链基因表达；和/或(3)治疗和/或预防肿瘤或癌症。

在另一优选例中，所述肿瘤或癌症具有以下特征：所述肿瘤或癌症的发生和/或进展与线粒体生物发生的异常调控特别相关。

在另一优选例中，所述肿瘤或癌症选自下组：胆管癌、肝癌、急性髓系白血病(AML)、乳腺癌、肺癌。

在另一优选例中，所述药物组合物被制备为液态制剂或冻干制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物被制备为注射剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的给药途径包括：静脉注射、静脉输注、瘤内注射、皮下注射或肌肉注射。

本发明的第五方面，提供了一种药盒，所述药盒包括：

(C1)位于第一容器内的第一制剂，所述第一制剂包含THAP3抑制剂作为第一活性成分，和药学上可接受的载体；

(C2)位于第二容器内的第二制剂，所述第二制剂包含SMYD3抑制剂作为第二活性成分；和药物学可接受的载体；以及

(C3)说明书，所述说明书注明所述药盒用于治疗和/或预防肿瘤或癌症。

在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂是各自独立的。

在另一优选例中，所述的第一制剂为冻干制剂或液态制剂，优选为液态制剂。

在另一优选例中，所述的第二制剂为冻干制剂或液态制剂，优选为液态制剂。

在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂均为注射剂。

在另一优选例中，所述第一制剂在第二制剂施用之前或之后施用，或与第二制剂同时施用。

本发明的第六方面，提供了一种治疗和/或预防肿瘤或癌症的方法，所述方法包括步骤：向有需要的受试者施用THAP3抑制剂，或本发明第三方面所述的活性成分组合，或本发明第四方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述肿瘤或癌症具有以下特征：所述肿瘤或癌症的发生和/或进展与线粒体生物发生的异常调控特别相关。

在另一优选例中，所述肿瘤或癌症选自下组：胆管癌、肝癌、急性髓系白血病(AML)、乳腺癌、肺癌。

在另一优选例中，所述有需要的受试者包括人类或非人类哺乳动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.THAP3是维持线粒体呼吸的转录因子。

其中，(A)从cBioPortal检索电子传递链基因与人转录因子的Spearman相关性系数，统计所示为每个转录因子与ETC基因相关性的平均值。(B)图中所示为TCGA肝肿瘤中与电子传递链基因呈正相关的前十个转录因子的排名。(C-E)不同肿瘤数据集中THAP3与氧化磷酸化途径的基因集富集分析(GSEA)。(F)在Huh7细胞中稳定表达对照shRNA或两个不同的靶向THAP3的shRNA，通过蛋白质印迹测定THAP3的敲低效率。(G)提取总RNA以测定对照组细胞或稳定敲低THAP3细胞中的mRNA表达，检测的基因包括电子传递链复合体I-V和线粒体自噬途径的代表性基因。(H)用MitoTracker Green(MTG)染色并用流式细胞术分析定量稳定细胞株的荧光强度。(I)将对照组细胞和稳定敲低THAP3细胞用于海马代谢通量检测以测定耗氧率(OCR)。所有数据显示为至少三个独立实验的平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01；n.s.表示不显著。

图2.THAP3与SMYD3相互作用以维持线粒体呼吸。

其中，(A)从cBioPortal检索电子传递链基因与人组蛋白甲基化酶的Spearman相关性系数。所示为每种甲基化酶与电子传递链基因相关性系数的平均值。(B)将HA标记的甲基化酶与Flag标记的THAP3在HEK293T细胞中共表达。通过免疫共沉淀和蛋白质印迹测定蛋白质相互作用。(C)通过免疫共沉淀和蛋白质印迹实验在Huh7细胞中测定SMYD3和THAP3之间的相互作用。其中THAP3抗体用于免疫纯化，IgG为阴性对照。(D-F)不同肿瘤数据集中SMYD3与氧化磷酸化途径的基因集富集分析。(G)在Huh7细胞中稳定表达靶向SMYD3的shRNA。通过蛋白质印迹实验测定SMYD3的敲低效率。(H)提取总RNA以测定对照组细胞或稳定敲低SMYD3细胞中的mRNA表达，对来自电子传递链复合物和线粒体自噬通路的代表性基因的表达水平进行了测定。(I)在Huh7细胞中稳定表达靶向SMYD3或THAP3的shRNA，通过蛋白质印迹测定敲低效率。(J)提取总RNA以测定对照组细胞或稳定敲低细胞中的mRNA表达。(K)用MitoTracker Green(MTG)将对照细胞和稳定敲低细胞染色，并用流式细胞术分析，测定MTG荧光强度后用细胞数进行标准化。(L)将对照细胞和稳定敲低细胞进行海马代谢通量检测以测定耗氧率(OCR)。所有数据显示为至少三个独立实验的平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01；n.s.表示不显著。

图3.THAP3募集SMYD3在表观遗传水平上调电子传递链活性。

其中，(A-D)对Huh7稳定细胞株进行ChIP-qPCR测定，SMYD3抗体用于染色质的免疫沉淀，IgG为阴性对照。(E-H)对Huh7稳定细胞株进行ChIP-qPCR测定；THAP3抗体用于免疫沉淀染色质，IgG为阴性对照。(I-L)对Huh7稳定细胞株进行ChIP-qPCR测定；H3K4me3抗体用于免疫沉淀染色质，IgG为阴性对照。(M)用SMYD3抑制剂处理对照细胞和稳定敲低THAP3的细胞，通过蛋白质印迹实验测定THAP3和SMYD3的蛋白表达。(N-P)用SMYD3抑制剂处理稳定敲低THAP3的细胞，并进行ChIP-qPCR分析；采用SMYD3、THAP3和H3K4me3抗体进行染色质免疫沉淀。(Q)用SMYD3抑制剂处理细胞后提取总RNA，测定mRNA表达。所有数据显示为至少三个独立实验的平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01；n.s.表示不显著。

图4.THAP3和SMYD3协同维持肿瘤细胞增殖。

其中，(A)用SMYD3抑制剂处理对照细胞或稳定敲低THAP3的细胞，测定Huh7的生长曲线。(B-C)对稳定敲低THAP3的细胞进行集落形成测定，用SMYD3抑制剂处理细胞，测定相对集落数，图示为每组的代表性图像。(D-F)在肝癌细胞Huh7、胆管癌细胞RBE和白血病细胞MV411中稳定敲低THAP3和/或SMYD3，测定细胞生长曲线。(G-I)在肝癌细胞Huh7、胆管癌细胞RBE和白血病细胞MV411中稳定敲低THAP3和/或SMYD3，测定细胞的集落或克隆形成能力。所有数据显示为至少三个独立实验的平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01；n.s.表示不显著。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了转录因子THAP3与线粒体电子传递链基因表达的相关性，THAP3是一种维持线粒体呼吸的转录因子，并进一步揭露了THAP3调控线粒体生物发生的机制。具体地，本发明分析了TCGA肿瘤转录组数据中电子传递链与转录因子的相关性，发现转录因子THAP3与电子传递链高度正相关。机制研究表明，THAP3将SMYD3募集到电子传递链基因，并上调基因启动子附近区域的H3K4me3以表观调控靶基因表达。THAP3和SMYD3之间的相互作用维持肿瘤细胞的呼吸、增殖和克隆形成。并且，抑制THAP3和/或SMYD3能够显著抑制肿瘤细胞的线粒体生物发生，抑制肿瘤细胞的生长。因此，THAP3和SMYD3可以作为治疗和/或预防肿瘤或癌症(尤其是与线粒体生物发生的异常调控相关的肿瘤或癌症)的新靶点。

在此基础上，完成了本发明。

术语

THAP3

THAP3中文名THAP结构域蛋白3，英文全称THAP Domain Containing 3，是定位于细胞核的转录因子。

SMYD3

SMYD3中文名SET和MYND结构域包含蛋白3，英文全称SET And MYND DomainContaining 3，是组蛋白甲基转移酶，可以特异性催化组蛋白H3K4等位点发生甲基化，并可作为转录因子调控基因转录表达、参与信号转导过程。

线粒体生物发生

线粒体生物发生是指线粒体的形成和扩增过程，包括线粒体基因组复制、基因转录和线粒体蛋白合成，此外也包括其它线粒体组分如脂类和呼吸链组分的生物合成过程。

如本文所用，术语“线粒体生物发生的异常调控”包括：肿瘤细胞中线粒体生物发生的增强或减弱、线粒体基因的表观修饰和转录失调、线粒体蛋白表达的异常调控和线粒体活性的异常。

本发明的活性成分组合、药物组合物

本发明提供了一种活性成分组合，其包括第一活性成分THAP3抑制剂，和第二活性成分为SMYD3抑制剂。

基于上述组合，本发明提供了一种药物组合物，它可用于：(1)抑制线粒体生物发生；(2)下调线粒体电子传递链基因表达；和/或(3)治疗和/或预防肿瘤或癌症。

本发明药物组合物包括：(a)THAP3抑制剂，(b)SMYD3抑制剂，和(c)药物学上可接受的载体。

通常，可将本发明的THAP3抑制剂和/或SMYD3抑制剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“THAP3抑制剂”是指能够下调THAP3基因的表达(包括转录水平和蛋白水平)，和/或抑制或阻断THAP3的功能活性的试剂，包括(但不限于)小分子化合物、多肽、核酸(例如，shRNA、siRNA或sgRNA)。所述THAP3抑制剂施用于受试者后，通过减少THAP3与靶基因(线粒体电子传递链基因)的结合，以及减少THAP3对SMYD3的招募，下调线粒体电子传递链基因表达，从而抑制线粒体生物发生。在本发明的一个优选实施方式中，所述THAP3抑制剂为靶向THAP3的shRNA。

如本文所用，术语“SMYD3抑制剂”是指能够下调SMYD3基因的表达(包括转录水平和蛋白水平)，或者能够完全或部分地抑制SMYD3甲基转移酶活性的试剂，包括(但不限于)小分子化合物、多肽、核酸(例如，shRNA、siRNA或sgRNA)。所述SMYD3抑制剂施用于受试者后，通过下调靶基因启动子附近区域的H3K4me3水平，从而下调线粒体电子传递链基因表达，抑制线粒体生物发生。在本发明的一个优选实施方式中，所述SMYD3抑制剂为靶向SMYD3的shRNA。在本发明的另一个优选实施方式中，所述SMYD3抑制剂为SMYD3特异性化学抑制剂BCI-121。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

术语“药学上可接受的载体”指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物和/或细胞产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、聚山梨酯、乙醇及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物制剂可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物组合我还可制成缓释制剂。

使用药物制剂时，是将安全有效量的活性成分组合(包THAP3抑制剂和/或SMYD3抑制剂)施用于哺乳动物。

应理解，本发明所述活性成分的有效量，可随给药的模式和疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明所述的药物组合物的给药方式没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：静脉注射、静脉输注、瘤内注射、皮下注射、肌肉注射等。

本发明的药盒

本发明提供一种药盒，所述药盒包括：

(C1)位于第一容器内的第一制剂，所述第一制剂包含THAP3抑制剂作为第一活性成分，和药学上可接受的载体；

(C2)位于第二容器内的第二制剂，所述第二制剂包含SMYD3抑制剂作为第二活性成分；和药物学可接受的载体；以及

(C3)说明书，所述说明书注明所述药盒用于治疗和/或预防肿瘤或癌症；和/或治疗和/或预防高胰岛素血症。所述的第一制剂包括(但并不限于)：冻干制剂、液态制剂(如注射剂)。

所述的第一制剂或第二制剂包括(但并不限于)：固体剂(如片剂、胶囊、粉剂)、液体制剂。

典型地，药盒中装有一个或多个(如至少两个)含有THAP3抑制剂的单元剂型和一个或多个(如至少两个)含有SMYD3抑制剂的单元剂型；较佳地各为4-10个。

如本文所用，术语“单元剂型”是指为了施用方便，将组合物制备成单次施用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

本发明提供的说明书中可以有如下描述：所述药盒的使用方法是同时使用含有THAP3抑制剂的单元剂型和含有SMYD3抑制剂的单元剂型。在另一优选例中，所述药盒的使用方法还包括单独使用含有THAP3抑制剂的单元剂型或含有SMYD3抑制剂的单元剂型。所述药盒特别适用于与线粒体生物发生的异常调控相关、高度依赖线粒体呼吸的癌症，例如胆管癌、肝癌、急性髓性白血病等。

本发明提供的药盒通过下述步骤制备得到：将含有THAP3抑制剂的制剂和含有SMYD3抑制剂的制剂，以及说明书一起放置，形成药盒。所述的含有THAP3抑制剂的制剂优选含有THAP3抑制剂的单元剂型，所述含有SMYD3抑制剂的制剂优选含有SMYD3抑制剂的单元剂型。

所述步骤优选将至少一个含有THAP3抑制剂的单元剂型和至少一个含有SMYD3抑制剂的单元剂型，以及说明书一起放置，形成药盒。

其中，术语“THAP3抑制剂”和“SMYD3抑制剂”如前所述。

本发明的用途

本发明提供了THAP3抑制剂的用途，其用于制备治疗和/或预防肿瘤或癌症的组合物或制剂。所述THAP3抑制剂通过下调肿瘤细胞中线粒体电子传递链基因表达，抑制线粒体生物发生，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

本发明还提供了一种活性成分组合的用途，其包括THAP3抑制剂和SMYD3抑制剂，用于制备治疗和/或预防肿瘤或癌症的组合物或制剂。THAP3抑制剂和SMYD3抑制剂分别阻断肿瘤细胞中THAP3和SMYD3的活性，减少THAP3将SMYD3招募至线粒体电子传递链基因，下调线粒体电子传递链基因的H3K4me3水平，从而下调基因表达水平，抑制线粒体生物发生，从而共同发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。

本发明所述的THAP3抑制剂以及活性成分组合特别适用于这样一类肿瘤或癌症：所述肿瘤或癌症的发生和/或进展与线粒体生物发生的异常调控特别相关。因此，本发明所述的THAP3抑制剂以及活性成分组合特别适用于治疗和/或预防胆管癌、肝癌、急性髓系白血病(AML)、乳腺癌、肺癌等。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明首次发现了转录因子THAP3线粒体电子传递链基因表达的相关性，并通过实验验证了THAP3是一种维持线粒体呼吸的转录因子，从而提出了THAP3抑制剂可用于抑制线粒体生物发生，从而治疗和/或预防癌症或肿瘤(尤其是高度依赖线粒体呼吸的癌症或肿瘤)。

(2)本发明进一步发现了THAP3与组蛋白甲基转移酶SMYD3的相互作用，并证实了THAP3招募SMYD3在表观遗传水平上调电子传递链基因表达。同时，实验证明抑制THAP3和SMYD3能够有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。在此基础上，提出了抑制THAP3和SMYD3在协同治疗癌症或肿瘤(尤其是高度依赖线粒体呼吸的癌症或肿瘤)中的应用。

(3)本发明揭露了转录因子通过表观遗传调控线粒体生物发生的重要机制，为肿瘤或癌症治疗和/或预防提供了新靶点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条例，例如J.Sambrook等人，分子克隆实验指南(第四版)(科学出版社有限责任公司，2017)中所述的条件，或按照产品制造商提供的产品说明书中所述条件。实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料和方法

1.质粒和试剂

将编码人全长THAP3、SMYD3、PRMT1、SUV39H1和KMT5C的cDNA克隆到Flag或HA标记的载体(pLV-EF1a-IRES)中，所有表达载体均通过DNA测序进行验证。通过使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher)进行质粒转染。

BCI-121是SMYD3的化学抑制剂(Selleckchem#S6833)，处理细胞浓度为5μM。

2.细胞培养

Huh7和HEK293T细胞培养于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)中，培养基中添加有10％胎牛血清(Biological Industries)、青霉素、链霉素和2mM L-谷氨酰胺(Corning)。细胞培养在37℃、5％ CO₂增湿环境下。

3.稳转细胞株构建

选用pMKO.1-puro和pMKO.1-hygro载体构建靶向THAP3和SMYD3的shRNA。逆转录病毒采用双质粒系统(gag和vsvg)进行包装。将细胞与8μg/mL polybrene混合并用病毒转导。在嘌呤霉素(4μg/mL)或潮霉素(200μg/mL)中筛选一周后获得稳转细胞株。进一步通过蛋白质印迹测定敲低效率。抗体信息为：THAP3(Abclone，兔抗#A12899)、SMYD3(AbClon，兔抗#A2262)和β-肌动蛋白(Abclone，鼠抗#AC004)，均为商业化抗体。

靶向THAP3的shRNA序列如下所示：

靶向SMYD3的shRNA序列如下所示：

4.实时定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)

使用EasyPure RNA纯化试剂盒(Transgen)从培养的细胞中抽提总RNA，采用QuantScript RT试剂盒(Tiangen)进行逆转录反应。使用SYBR Green qPCR Master Mix(EZBioscience)试剂盒，用基因特异性引物对cDNA进行实时PCR。每个PCR反应三组重复，并使用β-肌动蛋白作为对照，通过比较C_T方法计算cDNA的相对量。

5.MitoTracker Green染色

为了测定线粒体量，用50nM MitoTracker Green(Invitrogen)在37℃下对5x 10⁶个细胞染色30分钟，并用流式细胞术进行分析。定量荧光强度后以细胞数标准化线粒体量。

6.染色质免疫沉淀和定量PCR(ChIP-qPCR)

用1％多聚甲醛交联Huh7细胞并超声处理。用THAP3(Abclone，A12899)、SMYD3(Abclone，A2262)、组蛋白H3K4me3(Abclone，A22146)和对照IgG(Abclone，AC005)的抗体免疫沉淀超声破碎的染色质。使用Protein A-琼脂糖(Millipore)富集抗体-染色质复合体，洗涤后洗脱。逆转交联并用蛋白酶K处理后，用苯酚-氯仿提取免疫沉淀的DNA，并用乙醇沉淀回收，通过qPCR定量DNA富集效率。

7.细胞增殖测定

将Huh7细胞接种在10厘米的培养皿中，每皿接种一百万个细胞培养于10毫升培养基中，连续计数5天。用台盼蓝染色后对活细胞进行计数。

8.克隆形成能力测定

将Huh7细胞接种在6孔板中，每孔接种1000个细胞培养于2mL培养基中。7-10天后用4％多聚甲醛将细胞集落固定，并用0.2％结晶紫染色。对细胞数大于50的集落进行计数分析。

9.肿瘤基因组相关性分析

从cBioportal(www.cBioportal.org)(Gao等人，2013)中检索到具有ETC基因的转录因子和表观遗传酶的Spearman系数。

10.统计分析

采用双尾非配对Student’s t检验进行统计分析。数据所示的所有数据为至少三个独立实验的重复结果(平均值±SD)。p<0.05被认为具有统计学意义。

11.qPCR引物序列

实施例1.THAP3是一种维持线粒体呼吸的转录因子

为了解析转录因子与线粒体呼吸活性之间的关系，本发明人在多种TCGA肿瘤的转录组水平上分析了电子传递链与转录因子表达的相关性。人类基因组编码至少1639个转录因子，其中1596个转录因子在cBioportal数据库中具有明确的与电子传递链基因的Spearman相关性信息。引人注目的是，许多转录因子与电子传递链基因的表达呈正相关(Spearman相关性系数>0.3)(图1A)。线粒体在维持肝肿瘤细胞干性和促进肿瘤发展过程中发挥着重要作用(Chen等人，2023；Lee等人，2022；Li等人，2022b)。值得注意的是，在所有转录因子中，THAP3在TCGA肝细胞癌(LIHC)中与电子传递链基因表达相关性排名第一(图1B)。

为了验证THAP3与线粒体呼吸之间的关系，对电子传递链基因进行了基因集富集分析(GSEA)。在京都基因和基因组百科全书(KEGG)中，电子传递链被注释为氧化磷酸化途径。结果发现在TCGA肝癌和另外两项独立的肿瘤转录组研究中均可观察到THAP3与氧化磷酸化的正相关(Li等人，2022a；TCGA，2017；Zhang等人，2022)(图1C-E)。因此，推测THAP3可能是电子传递链生物发生和线粒体呼吸的正调控因子。

使用两个不同的shRNA在人肝癌细胞系Huh7中稳定敲低了THAP3(图1F)，进一步测定了来自不同电子传递链复合体(CI-CV)基因的mRNA表达水平。这些基因在THAP3敲低细胞中的表达水平明显降低(图1G)。与之相反，来自线粒体自噬途径的基因，包括PINK1、PARK2、TBK1和ATG5(Liu et al.，2021；Lu et al.，2019)，在敲低THAP3后没有表现出显著变化(图1G)。

此外，用荧光染料MitoTracker Green(MTG)对对照细胞和稳定敲低THAP3的细胞进行染色，并利用流式细胞仪测定线粒体荧光强度。结果显示，THAP3敲低后细胞内的线粒体量显著降低(图1H)。更重要的是，代谢流分析显示THAP3敲低细胞的基础和最大呼吸速率均显著降低(图1I)。

总之，这些数据表明THAP3维持电子传递链基因的表达、线粒体量和细胞的呼吸速率。

实施例2.THAP3与SMYD3相互作用以支持线粒体呼吸

研究指出，转录因子可与表观修饰酶相互作用以调节基因表达(Feinberg等人，2016；Sindhu等人，2012)。组蛋白甲基化是一种广泛存在的表观遗传学修饰，发生在赖氨酸或精氨酸残基上。组蛋白尾部不同残基的修饰可以开启或关闭靶基因的转录。因此，本发明人聚焦于组蛋白甲基化酶开展后续研究。

对TCGA转录组学进行相关性分析观察到电子传递链基因的表达与四种不同的甲基化酶存在的正相关，即蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)、SET和MYND结构域包含蛋白3(SMYD3)、SUV39H1组蛋白赖氨酸甲基化转移酶(SUV39H1)和赖氨酸甲基转移酶5C(KMT5C)(图2A)。为了确定THAP3是否与这些甲基化酶相互作用以调节组蛋白甲基化，构建了Flag标记的THAP3和HA标记的甲基化酶的表达载体。在HEK293T细胞中共表达THAP3和四种不同的甲基化酶后进行免疫沉淀。有趣的是，THAP3仅与SMYD3特异性相互作用，与其他三种甲基化酶未检测到结合(图2B)。使用THAP3抗体进行免疫共沉淀，发现THAP3在Huh7细胞中可以检测到与SMYD3结合(图2C)。

为了验证SMYD3和电子传递链之间的相关性，在不同的肿瘤转录组学研究中进行了GSEA分析。与THAP3类似，SMYD3在不同的数据集中也显示出与氧化磷酸化的正相关(Li等人，2022a；Yang等人，2021b；Zhang等人，2022)(图2D-F)。这些结果表明SMYD3可能与THAP3相互作用进而增强细胞呼吸。

为了确定SMYD3在调节电子传递链基因表达中的作用，在Huh7细胞中用shRNA稳定地敲低SMYD3(图2G)。SMYD3的敲低降低了复合体I-V中多个电子传递链基因的表达(图2H)。作为对照，来自线粒体自噬途径的多个基因没有显示出明显的变化(图2H)。这些结果进一步支持SMYD3在维持电子传递链基因表达中的作用。

接下来，进一步检测了SMYD3-THAP3相互作用如何影响电子传递链活性和细胞呼吸。将靶向THAP3和SMYD3的shRNA在Huh7细胞中稳定表达(图2I)。敲低THAP3或SMYD3显著下调了电子传递链基因(NDUFB10、SDHB、COX5B和ATP5ME)的mRNA表达(图2J)。重要的是，对Huh7细胞进行MTG染色显示THAP3或SMYD3敲低细胞的线粒体量显著降低(图2K)。代谢流分析进一步显示，SMYD3和THAP3敲低细胞的耗氧速率显著减少(图2L)。因此，THAP3与SMYD3相互作用以维持电子传递链基因表达和线粒体呼吸。

实施例3.THAP3招募SMYD3在表观遗传水平上调电子传递链基因表达

SMYD3是组蛋白H3K4甲基化酶，可介导H3K4三甲基化(H3K4me3)。H3K4me3是基因表达被激活的标志。为了解析THAP3和SMYD3相互作用的方式，采用THAP3、SMYD3和H3K4me3的抗体进行染色质免疫沉淀(ChIP)。因为NDUFB10、SDHB、UQCRH和ATP5ME在THAP3或SMYD3敲低细胞中的mRNA表达发生了显著变化，将这些基因也纳入了后续的分析。

ChIP结果显示，敲低SMYD3后SMYD3抗体的ChIP信号降低到背景水平，表明抗体具有特异性(图3A-D)。重要的是，THAP3的敲低削弱了SMYD3与靶基因的结合(图3A-D)。这些数据表明，SMYD3与电子传递链靶基因的结合依赖于THAP3。

进一步在稳定敲低细胞中测试了THAP3与电子传递链基因的结合。虽然THAP3的敲低降低了THAP3抗体的ChIP效率，SMYD3的敲低仅微弱影响THAP3与靶基因(NDUFB10、SDHB、UQCRH和ATP5ME)的结合(图3E-H)。这些结果表明，THAP3可能招募SMYD3以表观调控电子传递链基因。特别值得注意的是，SMYD3或THAP3的敲低降低了电子传递链靶基因的H3K4me3水平(图3I-L)，这些结果提示SMYD3与THAP3在同一通路中表观调控电子传递链基因的表达。

为了解析SMYD3的甲基化酶活性在调控电子传递链基因表达中的作用，用SMYD3特异性化学抑制剂BCI-121(SMYD3i)处理稳定敲低THAP3的细胞(Wang等人，2019)。抑制SMYD3甲基化酶活性并不影响THAP3的蛋白表达(图3M)。进一步以NDUFB10为检测对象测试了SMYD3和THAP3的结合状态。SMYD3的抑制剂显著削弱了其与NDUFB10的结合(图3N)。同时，SMYD3抑制剂对THAP3与NDUFB10基因结合的影响并不明显(图3O)。重要的是，SMYD3抑制剂显著降低了NDUFB10基因启动子附近区域的H3K4me3水平(图3P)。此外，SMYD3抑制剂处理细胞后可明显下调NDUFB10、SDHB、UQCRH、COX5B和ATP5ME的mRNA表达(图3Q)。综上，转录因子THAP3可招募SMYD3至电子传递链靶基因处，并在表观遗传水平上调基因表达。

实施例4.THAP3和SMYD3协同维持肿瘤细胞增殖

在本实施例中，进一步研究了THAP3-SMYD3相互作用的生物学功能。线粒体维持ATP的产生进而满足肿瘤细胞的能量需求。已有研究表明，线粒体呼吸对维持肿瘤细胞干性至关重要(Wei等人，2019)。在Huh7细胞中稳定表达靶向THAP3的shRNA后用SMYD3抑制剂处理细胞并监测细胞的增殖速率。敲低THAP3或抑制SMYD3均减缓了Huh7的生长，并降低了细胞的克隆形成能力(图4A-C)。有趣的是，敲低THAP3同时用SMYD3抑制剂处理细胞可导致Huh7细胞增殖速率的进一步下降(图4A-C)。这些结果表明，THAP3和SMYD3协同维持肝癌细胞生长和克隆形成。

为了进一步解析THAP3和SMYD3的协同作用，在肝癌细胞Huh7、胆管癌细胞RBE和白血病细胞MV411中稳定表达靶向THAP3和SMYD3的shRNA，同时敲低THAP3和SMYD3比单独敲低其中任一基因能够更显著的降低细胞的增殖速率(图4D-F)和克隆形成能力(图4G-I)。

以上结果表明，抑制THAP3和SMYD3能够用于协同治疗多种肿瘤。

讨论

线粒体在细胞代谢和能量产生中发挥着基础作用(Koch等人，2021)。线粒体生物发生的异常调控与多种人类疾病有关，包括肿瘤、神经退行性疾病和心血管疾病等(Pfanner等人，2019年；Xu等人，2021年)。到目前为止，只有少数核调控因子被鉴定出调控线粒体的生物发生(Hao等人，2021；Kropotov等人，2007年；Yin等人，2020)。电子传递链对线粒体产能至关重要。本发明系统挖掘了电子传递链和核转录因子之间的相关性，鉴定THAP3是细胞呼吸的调节因子。值得注意的是，目前对THAP3的生物学功能认识并不清晰。本发明发现THAP3促进了电子传递链的生物发生。THAP3招募SMYD3至靶基因处并上调H3K4me3水平，从而在表观遗传水平增强电子传递链的功能。

线粒体基因的表达已被发现受表观遗传因子和细胞代谢控制。例如，TEA结构域转录因子4(TEAD4)结合并上调OXPHOS基因；精氨酸作为代谢信号上调组蛋白乙酰化，促进TEAD4的招募和线粒体生物发生(Chen et al.，2021)。此外，组蛋白H3K18去乙酰化酶SIRT7可以负调控线粒体基因表达(Mohrin等人，2015)。葡萄糖信号下调SIRT7活性并上调组蛋白H3K18乙酰化以促进线粒体生物发生(Yan等人，2018)。而本发明发现THAP3招募SMYD3以提高电子传递链基因的H3K4me3水平，该过程很有可能也受细胞代谢信号调控。

值得注意的是，前期研究已发现SMYD3上调细胞周期依赖性激酶2(CDK2)和基质金属肽酶2(MMP2)的表达，分别加速细胞周期和促进肿瘤细胞转移(Wang等人，2019)。此外，SMYD3可以转录激活促肿瘤基因的表达从而加速肿瘤的发生发展(Sarris等人，2016)。与这些发现相呼应，在本发明中证实了SMYD3参与肿瘤细胞线粒体生物发生的重塑过程。因此，SMYD3可能有多个下游靶点来促进肿瘤的发展。

线粒体由细胞核和线粒体基因组共同编码。电子传递链组分必须由两个基因组按比例产生以确保氧化磷酸化活性的正常发挥(Basu等人，2020；皮尔斯等人，2017)。然而核转录因子和线粒体特异的转录机器之间如何协调，在很大程度上仍处于未知状态。尽管有报道表明一些核因子会转位到线粒体中(Chatterjee等人，2016；Lee等人，2005)，但核转录因子是否直接促进线粒体内的转录仍待进一步阐明。因此，后续研究需关注THAP3是否与线粒体转录因子通讯以协同调节电子传递链的生物发生。

线粒体功能失调是肿瘤的关键特征(Jin等人，2020；Yang等人，2021a)。由于线粒体在细胞凋亡中具有关键调控作用，以往的研究主要集中于致癌信号如何抑制肿瘤中的凋亡途径。而最近的研究主要聚焦于肿瘤细胞如何重塑线粒体代谢。尽管Warburg效应强调了糖酵解途径在肝肿瘤等多种肿瘤中的重要性，线粒体代谢在促进肿瘤发展过程中也起着关键作用。例如线粒体氧化代谢对肿瘤干细胞和肿瘤转移至关重要(Raggi等人，2021；Wang等人，2020；Xie等人，2022)。现有的肿瘤基因组学提示不同类型肿瘤和同种肿瘤的不同亚型对线粒体呼吸体的依赖性是特异的。因此，从干预线粒体活性特别是干预线粒体生物发生入手有望发掘新的肿瘤治疗靶点。值得注意的是，肝癌、胆管癌、白血病肺癌和乳腺癌等肿瘤体现出线粒体生物发生的激活，提示干预线粒体生物发生是治疗这些肿瘤的潜在策略。通过干预THAP3抑制线粒体活性在上述肿瘤来源的细胞系中体现出了较好的抑癌效果。因此，本发明的结果提示肿瘤细胞可能通过THAP3-SMYD3-电子传递链轴来介导线粒体生物发生的重塑，这也是关键的治疗靶点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.THAP3抑制剂的用途，其特征在于，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于：

(1)抑制线粒体生物发生；(2)下调线粒体电子传递链基因表达；和/或(3)治疗和/或预防肿瘤或癌症。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述THAP3抑制剂选自下组：小分子化合物、多肽、核酸(例如，shRNA、siRNA或sgRNA)或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述“下调线粒体电子传递链基因表达”包括降低线粒体电子传递链基因启动子附近区域的组蛋白甲基化水平，从而在表观遗传水平下调电子传递链基因表达；

优选地，所述“下调线粒体电子传递链基因表达”包括降低线粒体电子传递链基因启动子附近区域的H3K4me3水平。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤或癌症具有以下特征：所述肿瘤或癌症的发生和/或进展与线粒体生物发生的异常调控特别相关。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肿瘤或癌症选自下组：胆管癌、肝癌、急性髓系白血病(AML)、乳腺癌、肺癌。

6.一种活性成分组合的用途，其特征在于，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于：

(1)抑制线粒体生物发生；(2)下调线粒体电子传递链基因表达；和/或(3)治疗和/或预防肿瘤或癌症；

其中所述活性成分组合包括第一活性成分THAP3抑制剂，和第二活性成分SMYD3抑制剂。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述SMYD3抑制剂选自下组：小分子化合物、多肽、核酸(例如，shRNA、siRNA或sgRNA)或其组合。

8.一种活性成分组合，其特征在于，所述活性成分组合包括：

(i)第一活性成分，所述第一活性成分为THAP3抑制剂；和

(ii)第二活性成分，所述第二活性成分为SMYD3抑制剂。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：(a)THAP3抑制剂，(b)SMYD3抑制剂，和(c)药物学上可接受的载体。

10.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：

(C1)位于第一容器内的第一制剂，所述第一制剂包含THAP3抑制剂作为第一活性成分，和药学上可接受的载体；

(C2)位于第二容器内的第二制剂，所述第二制剂包含SMYD3抑制剂作为第二活性成分；和药物学可接受的载体；以及

(C3)说明书，所述说明书注明所述药盒用于治疗和/或预防肿瘤或癌症。