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CN119968389A - 结合至β葡聚糖的抗真菌抗体 - Google Patents

结合至β葡聚糖的抗真菌抗体 Download PDF

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CN119968389A
CN119968389A CN202380056640.1A CN202380056640A CN119968389A CN 119968389 A CN119968389 A CN 119968389A CN 202380056640 A CN202380056640 A CN 202380056640A CN 119968389 A CN119968389 A CN 119968389A
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China
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seq
antibody
antigen
binding fragment
chain variable
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肖恩·史蒂文斯
乔舒亚·罗亚尔
克丽丝特尔·哈莫斯基
迈克尔·保利
迈尔斯·布伦南
安德烈·弗伦策尔
约纳斯·屈格勒
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Kbio Holdings Ltd
Original Assignee
Kbio Holdings Ltd
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Abstract

本发明涉及对β‑葡聚糖具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段。还描述了这种单克隆抗体的生产以及编码这种抗体的核酸。

Description

结合至β葡聚糖的抗真菌抗体
技术领域
本发明涉及对β-葡聚糖具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，以及这种单克隆抗体的生产。
背景技术
抗体是属于免疫球蛋白超家族蛋白质的糖蛋白。主要有五类免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。抗体通常由基本结构单元组成，该基本结构单元包含两条重链和两条轻链。例如，IgG免疫球蛋白分子包含四条多肽链，其中两条是相同的重(H)链，其中两条是相同的轻(K)链。每条重链包含一个N-末端可变域(VH)和三个恒定域(CH1、CH2和CH3)，以铰链区连接CH1和CH2。每条轻链包含一个N-末端可变域(VL)和一个恒定域(CL)，它们共同与重链的VH和CH1域关联。
抗体可经由(via，通过)抗原结合片段(Fab)可变区识别抗原，该可变区包含VL、CL、VH和CH1域。抗体可以通过可结晶片段区(Fc区)激活免疫系统，该可结晶片段区是包含CH2域和CH3域的抗体的尾部区。
重链可变区(VH)是指包含三个互补决定区(CDR)的抗体的重链片段，三个互补决定区位于框架区之间，框架区形成支撑CDR的支架。类似地，轻链可变区(VL)包含三个CDR和它们周围的框架区。
对于抗体或其抗原结合片段，CDR是在重链和轻链的可变区中形成环的高度可变的氨基酸序列。因此，CDR能够与抗原相互作用。重链可变区和轻链可变区各自包含三个CDR，本文中称为CDRH1、CDRH2和CDRH3(重链CDR)以及CDRL1、CDRL2和CDRL3(轻链CDR)。
IgG是在血液和细胞外液中发现的主要抗体同种型(isotype，同型)。IgG在免疫系统中发挥多种作用，包括促进病原体凝集、激活补体系统、中和毒素以及促进抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。IgG以各种亚型存在，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG1是用于本实施方式的目的的示例性抗体。IgG1抗体可源自非人类来源，诸如人类种系(germline)抗体文库(repertoire)之外的任何来源。尽管不相同，但从非人类哺乳动物(诸如小鼠)获得的抗体包含通常可在人类中表达的重链可变区氨基酸序列。
因此，非人类起源但可以像来自人类抗体文库表达的序列可被视为人类序列。当对诸如IgG1的非人类抗体的大部分进行工程化以匹配在人类抗体文库中表达的序列时，该工程化的抗体被称为“人源化的”并且该方法称为“人源化”。在其他方面，人源化是指保留鼠序列的某些部分，其可以包括CDR，并将这些序列整合到人类抗体的部分中，诸如重链和轻链的恒定区。这通常也称为CDR移植，其中异种CDR被整合到人类抗体框架中以降低免疫原性。通常，这种人源化的抗体表现出增加的功效，并且减少与鼠或其他非人类抗体关联的、在人类中经常出现的整体免疫原性、炎症和其他不希望的作用。
β-葡聚糖是在各种生物体的细胞壁中发现的一组异质的(heterogeneous)天然多糖，其中一些生物体是致病的，包括真菌和细菌。研究表明，β-葡聚糖可以发挥免疫调节作用，因此对β-葡聚糖具有良好结合亲和力的抗体可以通过抑制这些分子提供有益结果。
此前，已经以不同程度的成功工程化单克隆抗体，以提供与β-葡聚糖的结合。即便如此，在临床、诊断和治疗背景下，对于显示出改善地与β-葡聚糖结合的单克隆抗体仍然有显著需求，尤其是对于显示出这些特性的人源化的抗体。本文所述的实施方式针对这些及其他改进。
发明内容
本发明人已开发抗体或其抗原结合片段，其靶向β-葡聚糖并且可以用作抗真菌剂或用于制备能够治疗真菌感染的抗真菌剂。
本发明人令人惊讶地证明，可以制备这种与β-葡聚糖有改善的结合的抗体。进一步令人惊讶地证明，当用作抗真菌剂和/或用于治疗真菌感染时，所述抗体导致了改善的临床、治疗和诊断效果。
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1；
(b)CDRL2，选自由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3组成的组；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)CDRH1，选自由SEQ ID NO 5-7组成的组；
(e)CDRH2，选自由SEQ ID NO 8-12和SEQ ID NO 28组成的组；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3。
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或其抗原结合片段包含：含有与SEQ ID NO 14具有至少70％同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或含有与SEQ ID NO 16具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或其抗原结合片段包含：含有与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或含有与SEQ ID NO 18具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或其抗原结合片段包含：含有与SEQ ID NO 15具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或含有与SEQ ID NO 17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或其抗原结合片段包含：含有与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或含有与SEQ ID NO 17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或其抗原结合片段包含：含有与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或含有与SEQ ID NO 19具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或其抗原结合片段包含：含有与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或含有与SEQ ID NO 20具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或其抗原结合片段包含：含有与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区，和/或含有与SEQ ID NO 29具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个方面，本发明提供了抗体或抗原结合片段，其中，该抗体或抗原结合片段是人源化的。
在一个方面，本发明提供了抗体或抗原结合片段，其中，该抗体或抗原结合片段能够结合至β-葡聚糖。
在进一步的方面，抗体或其抗原结合片段能够结合至1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖。
在进一步的方面，抗体或其抗原结合片段能够结合至海带多糖(laminarin，海藻多糖，昆布多糖)。
在一个方面，抗体或其抗原结合片段可用作抗真菌剂。
在进一步的方面，抗体或其抗原结合片段可用在真菌感染的治疗中。
在进一步的方面，抗体或其抗原结合片段可用在用于治疗真菌感染的药物的制备中。
在进一步的方面，抗体或其抗原结合片段可用在曲霉菌(Aspergillus)感染的治疗中。
在进一步的方面，抗体或其抗原结合片段可用在烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)感染的治疗中。
在进一步的方面，本发明提供了治疗真菌感染的方法，包括施用本发明的抗体或其抗原结合片段。
在进一步的方面，本发明提供了治疗曲霉菌感染的方法，包括施用本发明的抗体或其抗原结合片段。
在进一步的方面，本发明提供了治疗烟曲霉菌感染的方法，包括施用本发明的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本发明提供了编码如本文公开的抗体或其抗原结合片段的核酸。
在进一步的方面，本发明提供了核酸，该核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区，和/或与SEQ ID NO 23具有至少70％序列同一性的重链可变区。
在进一步的方面，本发明提供了核酸，该核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区，和/或与SEQ ID NO 24具有至少70％序列同一性的重链可变区。
在进一步的方面，本发明提供了核酸，该核酸编码与SEQ ID NO 22具有至少70％序列同一性的轻链可变区，和/或与SEQ ID NO 24具有至少70％序列同一性的重链可变区。
在进一步的方面，本发明提供了核酸，该核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区，和/或与SEQ ID NO 25具有至少70％序列同一性的重链可变区。
在进一步的方面，本发明提供了核酸，该核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区，和/或与SEQ ID NO 26具有至少70％序列同一性的重链可变区。
在进一步的方面，本发明提供了核酸，该核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区，和/或与SEQ ID NO 27具有至少70％序列同一性的重链可变区。
在进一步的方面，本发明提供了核酸，该核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区，和/或与SEQ ID NO 30具有至少70％序列同一性的重链可变区。
在一个方面，本发明提供了编码抗体或抗原结合片段的核酸，其中，该抗体或抗原结合片段是人源化的。
在一个方面，本发明提供了编码抗体或抗原结合片段的核酸，其中，该抗体或抗原结合片段能够结合至β-葡聚糖。
在进一步的方面，核酸编码能够结合至1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖的抗体或其抗原结合片段。
在进一步的方面，核酸编码能够结合至海带多糖的抗体或其抗原结合片段。
附图说明
本文所述的附图和实施方式阐明了本文公开的多个实施方式和替代方案的多个替代结构、方面和特征，并且它们不应被理解为限制这些实施方式和替代方案中任何一个的范围。
图1：初始人源化的和下一代亲和力成熟的抗真菌抗体的海带多糖结合(ELISA)
图1是使用海带多糖的初始人源化的抗真菌抗体(克隆3.1、14.1和32.3(KB14A.3.1、KB14A.14.1和KB14A.32.3))以及下一代、人源化的且亲和力成熟的抗真菌抗体(即克隆39.1、40.1、41.2、42.1和43.1(KB14A.39.1、KB14A.40.1、KB14A.41.2、KB14A.42.1和KB14A.43.1))的EC50结合的ELISA数据的图。
从图中可以看出，克隆3.1和14.1具有小于0.1μg/mL的EC50值，并且克隆32.3具有小于2.5μg/mL的EC50值(图1.所有绘制的值均代表平均值+/-标准偏差(SD)。具体地，克隆3.1具有0.05124μg/mL的EC50，KB14A.14.1具有0.037125μg/mL的EC50，并且克隆32.3具有1.5845μg/mL的EC50(表5)。
从图中可以看出，克隆39.1、40.1、41.2和43.1具有小于0.1μg/mL的EC50值(图1)。克隆42.1具有小于0.2μg/mL的EC50值(图1)。所有绘制的值均代表平均值。具体地，克隆39.1具有0.05649μg/mL的EC50，克隆40.1具有0.017μg/mL的EC50，克隆41.2具有0.02878的EC50，克隆42.1具有0.1356μg/mL的EC50，并且克隆43.1具有0.05045μg/mL的EC50(表5)。
图2：初始人源化的和下一代亲和力成熟的抗真菌抗体的海带多糖结合亲和力(KD)
图2是一系列图，它们展示了使用海带多糖Biocore分析对于每个初始人源化的抗真菌抗体(克隆3.1、14.1和32.3)以及对于每个下一代、人源化的且亲和力成熟的抗体(克隆39.1、40.1、41.2、42.1和43.1)的KD值(图2A)、ka值(图2B)和kd值(图2C)。所有绘制的值均代表平均值+/-标准偏差(SD)。
每个抗体的KD、ka和kd的具体值详见相应的表(表6-8)。
从图和相应的表可以看出，克隆3.1和克隆KB14A.14.1具有小于5x10-9的KD，并且克隆32.3具有小于1.5x10-8的KD值(图2A；表8)。
从图和相应的表可以看出，克隆41.2、40.1和42.1都具有5x10-9或更小的KD值。克隆39.1和43.1具有小于1x10-8的KD(图2A；表8)。
图3：用初始人源化的抗真菌抗体或下一代、人源化的且亲和力成熟的抗体治疗后，感染烟曲霉菌的免疫抑制小鼠的改善的存活率
图3A是显示使用烟曲霉菌(AF293)攻击(challenge)后免疫抑制小鼠的存活率％的图。测试组被给予15mg/kg剂量的初始人源化的抗体(克隆3.1、14.1或32.3)或下一代、人源化的且亲和力成熟的抗体(克隆39.1、40.1、41.2、42.1和43.1)。
用两次IV施用初始人源化的抗体或下一代、人源化的且亲和力成熟的抗体处理的小鼠与媒介物对照处理的小鼠相比显示出改善的存活率(图3A)。
通过测量支气管肺泡灌洗(BAL)半乳甘露聚糖水平，图3B详述了在盐水对照、烟曲霉菌(A.fumigatus)/媒介物对照或抗体处理后每个测试组的肺中真菌的水平。例如，半乳甘露聚糖是曲霉菌细胞壁的主要成分，由于半乳甘露聚糖在感染过程中释放，因此可作为宿主中真菌负担(burden，负荷)的指标。
数据显示，对于烟曲霉菌/媒介物组和每个抗体处理组，通过测量BAL半乳甘露聚糖水平，大量动物在肺中展示了可检测水平的真菌。如预期，盐水/媒介物对照在肺中未显示出可检测水平的真菌。此外，在曲霉菌攻击的小鼠中半乳甘露聚糖水平与存活率相关。
图4：初始人源化的和下一代亲和力成熟的抗真菌抗体的热迁移分析(thermalshift assay，热变换分析)(TSA)
图4详述了每个抗体克隆的热稳定性。通过在生命科技(Life Technologies)qPCR系统上进行的通过TSA测定每个抗体的熔解温度(Tm)。每个抗体的Tm1在图4A中详述，精确值在表9中提供。Tm1值代表第一次转变，该转变被认为涉及CH2域的热解折叠(unfolding，展开)。每个抗体的Tm2在图4B中详述，精确值在表10中提供。Tm2值代表第二次转变，该转变代表CH3/Fab域的解折叠。
具体实施方式
现将通过非限制性实施例的方式描述本发明的各种优选的特征和实施方式。
必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
本文使用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprisedof)”与“包括(including)”、“包括(includes)”、“含有(containing)”或“含有(contains)”同义，并且是包含性的或开放式的，且不排除额外的、未列举的成员、元素或步骤。术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of，由…组成)”也包括术语“由…组成(consisting of)”。
数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，分别地，任何核酸序列以5'至3'方向从左到右书写，并且氨基酸序列以氨基至羧基方向从左到右书写。
本文所讨论的出版物仅由于它们在本申请提交日之前公开而提供。本文中的任何内容均不应被解释为承认这种出版物构成本文所附权利要求的现有技术。在说明书中提及的所有出版物均通过引证并入本文。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且任何与本文所述类似或等同的方法和材料均可在本公开实施方式的实践或测试中使用。本领域技术人员将理解，他们可以组合本文公开的本发明的所有特征而不背离公开的本发明的范围。
抗体或其抗原结合片段的序列
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其中，该抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1；
(b)CDRL2，其选自由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3组成的组；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)CDRH1，其选自由SEQ ID NO 5-7组成的组；
(e)CDRH2，其选自由SEQ ID NO 8-12和SEQ ID NO 28组成的组；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含：轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO 1的CDRL1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的CDRL2和SEQ ID NO4的CDRL3的三个轻链可变区CDR；以及三个重链可变区CDR，该重链可变区CDR选自以下：SEQID NO 5、SEQ ID NO 6、或SEQ ID NO 7的CDRH1；选自SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ IDNO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 28的CDRH2；和SEQ ID NO 13的CDRH3。
本发明包括下述CDR区的“变体”。任何给定序列的“变体”是这样的序列，其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列以这样的方式修饰，使得所讨论的多肽或多核苷酸保留至少一种或所有其内源性功能。变体序列可通过天然存在的多肽或多核苷酸中存在的至少一个残基的添加、删除、取代、修饰、替换和/或改变而获得。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体；
(b)SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)SEQ ID NO 5的CDRH1或其变体；
(e)SEQ ID NO 8的CDRH2或其变体；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且重链可变区包含与SEQ ID NO 16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含或由以下组成：
(i)轻链可变区，其包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体、SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体以及SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；和/或
(ii)重链可变区，其包含与SEQ ID NO 16具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ IDNO 5的CDRH1或其变体、SEQ ID NO 8的CDRH2或其变体以及SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体；
(b)SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)SEQ ID NO 5的CDRH1或其变体；
(e)SEQ ID NO 10的CDRH2或其变体；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且重链可变区包含与SEQ ID NO 18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含或由以下组成：
(i)轻链可变区，其包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体、SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体以及SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；和/或
(ii)重链可变区，其包含与SEQ ID NO 18具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ IDNO 5的CDRH1或其变体、SEQ ID NO 10的CDRH2或其变体以及SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体；
(b)SEQ ID NO 3的CDRL2或其变体；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)SEQ ID NO 6的CDRH1或其变体；
(e)SEQ ID NO 9的CDRH2或其变体；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO 15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含或由以下组成：
(i)轻链可变区，其包含与SEQ ID NO 15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体、SEQ ID NO 3的CDRL2或其变体以及SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；和/或
(ii)重链可变区，其包含与SEQ ID NO 17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ IDNO 6的CDRH1或其变体、SEQ ID NO 9的CDRH2或其变体以及SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体；
(b)SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)SEQ ID NO 6的CDRH1或其变体；
(e)SEQ ID NO 9的CDRH2或其变体；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含或由以下组成：
(i)轻链可变区，其包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体、SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体以及SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；和/或
(ii)重链可变区，其包含与SEQ ID NO 17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ IDNO 6的CDRH1或其变体、SEQ ID NO 9的CDRH2或其变体以及SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体；
(b)SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)SEQ ID NO 5的CDRH1或其变体；
(e)SEQ ID NO 11的CDRH2或其变体；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 19具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且重链可变区包含与SEQ ID NO 19具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含或由以下组成：
(i)轻链可变区，其包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体、SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体以及SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；和/或
(ii)重链可变区，其包含与SEQ ID NO 19具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ IDNO 5的CDRH1或其变体、SEQ ID NO 11的CDRH2或其变体以及SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体；
(b)SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)SEQ ID NO 7的CDRH1或其变体；
(e)SEQ ID NO 12的CDRH2或其变体；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且重链可变区包含与SEQ ID NO 20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含或由以下组成：
(i)轻链可变区，其包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体、SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体以及SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；和/或
(ii)重链可变区，其包含与SEQ ID NO 20具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ IDNO 7的CDRH1或其变体、SEQ ID NO 12的CDRH2或其变体以及SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体；
(b)SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)SEQ ID NO 6的CDRH1或其变体；
(e)SEQ ID NO 28的CDRH2或其变体；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 29具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且重链可变区包含与SEQ ID NO 29具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含或由以下组成：
(i)轻链可变区，其包含与SEQ ID NO 14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ ID NO 1的CDRL1或其变体、SEQ ID NO 2的CDRL2或其变体以及SEQ ID NO 4的CDRL3或其变体；和/或
(ii)重链可变区，其包含与SEQ ID NO 29具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中，该氨基酸序列包含SEQ IDNO 6的CDRH1或其变体、SEQ ID NO 28的CDRH2或其变体以及SEQ ID NO 13的CDRH3或其变体。
抗体或其抗原结合片段的另外的特征
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgG及其所有同种型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgG1及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgG2及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgG3及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgG4及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgA及其所有同种型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgA1及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgA2及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgM及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgE及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgD及其所有同种型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgD1及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是IgD2及其所有同种异型。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
在一个优选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段是人源化的抗体。
在一个优选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段是亲和力成熟的抗体。
在一个优选的实施方式中，抗体或其抗原结合片段是亲和力成熟的人源化的抗体。
因此，在本公开的上下文中使用的术语“人源化的(humanized)”、“人源化(humanization)”或与术语“人源化(humanize)”相关的其他形式应理解为指的是抗体结构，其可以是完整的抗体或其任何部分或片段，其被修饰以与人类IgG1极为相近但保留至少一个非人类起源的CDR。这种修饰可在鼠IgG抗体(例如IgG1)上进行，并且在一些实施方式中，受试者单克隆抗体是人源化的或嵌合的。这种修饰的特征可以在于，用与人类种系序列一致的一个或多个氨基酸取代在非人类哺乳动物形式的IgG1中发现的相应数量的氨基酸。这种取代可发生在一个或多个CDR中或在CDR之间的框架区中，或者实际上在轻链可变链和重链可变链上的任何位置。
抗体片段
虽然本文中的公开内容更详细地讨论了IgG，但实施方式的范围不限于IgG，但包括其它天然存在的抗体，诸如IgM、IgA、IgE和IgD以及它们的相应亚型和同种型。实施方式的范围还包括所述抗体的抗原结合片段，包括但不限于抗原结合片段(Fab)、片段抗体(fragment antibody，抗体片段)(F(ab’)2)、单链抗体(scFv)和单域抗体(sdAb)。
片段抗体(F(ab’)2)是指Fc区消化(其留下完整的铰链区部分)后仍然存在的抗体上的区。
单链抗体(scFv)是指已经工程化的抗体，该抗体由通过肽连接子(linker，接头)序列连接的轻链可变区和重链可变区组成。肽连接子序列长度通常为10-25个氨基酸，富含甘氨酸以助于柔韧性，且富含丝氨酸或苏氨酸以助于溶解性。肽连接子可以将重链可变区的N-末端与轻链可变区的C-末端连接。
单域抗体(sdAb)，通常称为纳米抗体，是指由单个单体可变抗体域组成的抗体的抗原结合片段。因此，sdAb可以是轻链可变区或重链可变区。单域抗体的实例包括但不限于VHH片段和VNAR片段。VHH和VNAR片段包含重链的抗原结合片段。
在一个实施方式中，本文公开的抗体的抗原结合片段可以是本文公开抗体的任何片段。
在另一实施方式中，本文公开的抗体的抗原结合片段可以是抗体的一个或多个片段的基因工程化产物。
虽然本文中的公开内容更详细地讨论了IgG，但实施方式的范围不限于IgG，但包括其它天然存在的抗体，诸如IgM、IgA、IgE和IgD以及它们的相应亚型。
在一个实施方式中，片段是抗原结合片段(Fab)、片段抗体(F(ab’)2)、单链可变片段(scFV)或单域抗体(sdAb)、或者骆驼科(camelid)抗体(VHH)。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可以组合以产生对两种或更多种不同抗原或表位展示特异性的工程化的抗原结合蛋白。进一步地，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以与可替代的抗体组合以产生对两种或更多种不同抗原或表位展示特异性的工程化的抗原结合蛋白。进一步地，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以与一个或多个相同的抗体、其抗原结合片段组合，以形成同源二聚体或同源多聚体。
抗体的结合特性
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段结合至β-葡聚糖。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段结合至1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段结合至海带多糖。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是双特异性的。术语双特异性用于表示基于抗体的分子，诸如抗体、或其抗原结合片段、或它们的组合，其具有两个不同的抗原结合位点。换言之，它可以是工程化的抗体，该抗体与两个靶标或同一靶标上的两个表位接合(engage)。双特异性抗体有多种形式(format，版式，格式)。例如，双特异性抗体可通过将本文公开的任何抗体或其抗原结合片段与另一抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段组合而产生。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是多特异性的。术语多特异性用于表示基于抗体的分子，诸如抗体、或其抗原结合片段、或它们的组合，其具有两个或更多个不同的抗原结合位点。换言之，它可以是工程化的抗体，该抗体与两个或更多个靶标，或者与同一靶标上的两个或更多个表位接合。多特异性抗体有多种形式。例如，多特异性抗体可通过将本文公开的至少一个抗体或其抗原结合片段与至少一个其它抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段组合而产生。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于双特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该双特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至两种不同抗原或表位。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于双特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该双特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至β-葡聚糖和另外的抗原或表位。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于双特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该双特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖和另外的抗原或表位。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于双特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该双特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至海带多糖和另外的抗原或表位。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于多特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该多特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至两种或更多种不同的抗原或表位。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于多特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该多特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至两种或更多种不同的抗原或表位。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于多特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该多特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至β-葡聚糖和一种或多种不同的抗原或表位。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于多特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该多特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖和一种或多种不同的抗原或表位。
在进一步的实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可用于多特异性抗原结合蛋白、抗体、或其抗原结合片段中，该多特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段结合至海带多糖和一种或多种不同的抗原或表位。
在另一实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源二聚体的形式。
按照定义，同源二聚体可通过两个相同的蛋白的连接或相互作用而形成。因此，在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以与另一个相同的抗体或其抗原结合片段连接或相互作用以产生同源二聚体。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源二聚体形式，该同源二聚体由两个具有相同抗原结合特异性的抗体分子或其抗原结合片段组成。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源二聚体形式，该同源二聚体由两个对β-葡聚糖具有相同抗原结合特异性的抗体分子或其抗原结合片段组成。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源二聚体形式，该同源二聚体由两个对1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖具有相同抗原结合特异性的抗体分子或其抗原结合片段组成。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源二聚体形式，该同源二聚体由两个对海带多糖具有相同抗原结合特异性的抗体分子或其抗原结合片段组成。
在另一实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源多聚体的形式。
按照定义，同源多聚体可通过两个或更多个相同蛋白连接或相互作用形成。因此，在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以与一个或多个相同的抗体或其抗原结合片段连接或相互作用以产生同源多聚体。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源多聚体形式，该同源多聚体由两个或更多个具有相同抗原结合特异性的抗体分子或其抗原结合片段组成。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源多聚体形式，该同源多聚体由两个或更多个对β-葡聚糖具有相同抗原结合特异性的抗体分子或其抗原结合片段组成。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源多聚体形式，该同源多聚体由两个或更多个对1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖具有相同抗原结合特异性的抗体分子或其抗原结合片段组成。
在一个实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以是同源多聚体形式，该同源多聚体由两个或更多个对海带多糖具有相同抗原结合特异性的抗体分子或其抗原结合片段组成。
在一个实施方式中，同源二聚体或同源多聚体展示了增加的亲和力(avidity，活动性)。换言之，增加了同源二聚体或同源多聚体与抗原之间相互作用的强度。
本发明的抗体或其抗原结合片段可由它的EC50值限定。EC50值是半数最大有效浓度的量度，表示具有一半最大效应需要的药物浓度。因此，本文公开的抗体或其抗原结合片段的结合可以通过任何合适的检测(诸如ELISA)测定的其EC50值表示。适当地，如通过海带多糖ELISA测定的，本文公开的抗体或其抗原结合片段的EC50值可为约2μg/mL或更低、约1μg/mL或更低、约0.5μg/mL或更低、约0.4μg/mL或更低、约0.3μg/mL或更低、约0.2μg/mL或更低、约0.1μg/mL或更低、或者约0.05μg/mL或更低。
抗体结合亲和力也可由平衡结合常数(KD)来测定，该常数可通过合适的检测测定。适当地，抗体或其抗原结合片段可以以1.5x10-8M或更低、1x10-8M或更低、9x10-9M或更低、8x10-9M或更低、7x10-9M或更低、6x10-9M或更低、5x10-9M或更低、4x10-9M或更低、3x10-9M或更低、2x10-9M或更低、或者1x10-9M或更低的结合亲和力(KD)结合至β-葡聚糖诸如1,3-β-葡聚糖、1,6-β-葡聚糖或海带多糖。
抗体或其抗原结合片段可通过它的热稳定性进一步限定。热稳定性可由当抗体或其抗原结合片段经历温度升高时发生的解折叠事件被限定。“起始温度(Tonset)”是在解折叠事件开始发生时的温度，“Tm”是在解折叠事件中点的温度，且Tagg是在解折叠事件导致聚集时的温度。“Tm”，解折叠事件的中点，通常表现为两次转变，称为Tm1和Tm2。Tm1值代表被认为涉及CH2域热解折叠的第一次转变。Tm2值代表第二次转变，该转变代表CH3/Fab域的解折叠。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段在高达60℃下是热稳定的。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段在高达70℃下是热稳定的。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段在高达80℃下是热稳定的。
药物制剂
在一个实施方式中，本发明提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。抗体或其抗原结合片段可以与药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂组合。
在一个实施方式中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含与L-组氨酸和蔗糖组合的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含5mg/kg的抗体或其抗原结合片段，与20mM L-组氨酸和240mM蔗糖组合。
在一个实施方式中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含至少1mg/g、至少2mg/kg、至少3mg/kg、至少4mg/kg、至少5mg/kg、至少6mg/kg、至少7mg/kg、至少8mg/kg、至少9mg/kg、至少10mg/k、至少15mg/kg或至少20mg/kg的抗体或其抗原结合片段，与至少5mM、至少10mM、至少15mM、至少16mM、至少17mM、至少18mM、至少19mM、至少20mM、至少21mM、至少22mM、至少23mM、至少24mM、至少25mM或至少30mM L-组氨酸以及至少200mM、至少210mM、至少220mM、至少230mM、至少235、至少236mM、至少237mM、至少238mM、至少239mM、至少240mM、至少241mM、至少242mM、至少243mM、至少244mM、至少245mM、至少250mM、至少260mM、至少270mM、至少280mM、至少290mM或至少230mM的蔗糖组合。
在一个实施方式中，本发明提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段、和/或根据本发明的药物组合物，用于作为药剂使用。
在一个实施方式中，本发明提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段、或根据本发明的药物组合物用于制备药物的用途。
在一个实施方式中，本发明提供了方法，该方法包括向有此需要的受试者施用根据本发明的抗体或其抗原结合片段、或根据本发明的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可用作抗真菌剂。
在一个实施方式中，包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物可用作抗真菌剂。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可用在真菌感染的治疗中。
在一个实施方式中，包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物可用在真菌感染的治疗中。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用在曲霉菌感染的治疗中。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用在烟曲霉菌感染的治疗中。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用在念珠菌(Candida)感染的治疗中。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用在白色念珠菌(Candida albicans)或耳念珠菌(Candida auris)感染的治疗中。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗真菌感染的方法，该方法包括施用抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗真菌感染的方法，该方法包括施用包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗曲霉菌感染的方法，该方法包括施用抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗烟曲霉菌感染的方法，该方法包括施用抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可用于制备用于治疗真菌感染的药物。
在一个实施方式中，本发明的包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物可用于制备用于治疗真菌感染的药物。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用于制备用于治疗曲霉菌感染的药物。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用于制备用于治疗烟曲霉菌感染的药物。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗念珠菌感染的方法，该方法包括施用抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗白色念珠菌感染的方法，该方法包括施用抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗耳念珠菌感染的方法，该方法包括施用抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用于制备用于治疗念珠菌感染的药物。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用于制备用于治疗白色念珠菌感染的药物。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、或包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，可用于制备用于治疗耳念珠菌感染的药物。
抗体-药物偶联物
抗体-药物偶联物(ADC)是可以经由抗体或其抗原结合片段特异性地靶向抗原的治疗性分子，能够将药物精准递送至特定位置。例如，ADC已被用作化学治疗剂，以将细胞毒性药物靶向至表达抗原的肿瘤细胞，随着它们被所述肿瘤细胞内化，能够使细胞毒性药物在特定的肿瘤细胞中发挥作用。这个策略通过将药物与抗体通过可裂解的(cleavable，可切割的)连接子分子偶联得到了进一步改进，能够使ADC一旦被内化进入特定细胞就能被裂解，释放细胞毒性药物，使得它有更高的活性。
在一个实施方式中，本发明提供了包含本文公开的抗体或其抗原结合片段的抗体-药物偶联物。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及连接部分(coupling moiety，连接基团)。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及通过可裂解的连接子分子连接的连接部分。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及通过不可裂解的连接子分子连接的连接部分。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及连接部分，其中，连接部分是药物。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及连接部分，其中，连接部分是毒素。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及连接部分，其中，连接部分是细胞因子。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及连接部分，其中，连接部分是酶。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体-药物偶联物，该抗体-药物偶联物包含本文公开的抗体或其抗原结合片段以及连接部分，其中，连接部分是药物、毒素、细胞因子、酶或它们的组合。
抗体-毒素融合蛋白
抗体-毒素融合蛋白，诸如重组免疫毒素，包含连接至肽毒素的抗体、或其抗原结合片段、或者免疫球蛋白。这种抗体-毒素融合蛋白可由随后表达的重组DNA序列编码。重组DNA序列，也称为融合基因，可以经由包含DNA段(segment)的表达载体或质粒进行表达，从而指导这种融合蛋白的合成。因此，抗体-毒素融合蛋白、或重组免疫毒素包含连接至肽毒素的氨基酸序列，该氨基酸序列代表抗体、其抗原结合片段、或免疫球蛋白。
换言之，重组免疫毒素是多肽，其中，肽毒素通常通过连续的多肽连接子基因地连接至抗体组分。
类似于抗体-药物偶联物，抗体-毒素融合蛋白能够实现毒素的靶向积累和激活，以实现特定效果，提高效率同时最小化对正常细胞的伤害。
在一个实施方式中，本发明提供了重组融合蛋白，其中，该融合蛋白包含连接至肽毒素的本文公开的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，本发明提供了重组融合蛋白，其中，该融合蛋白包含如本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中重链区或轻链区的至少一个连接至肽毒素。
在一个实施方式中，本发明提供了重组融合蛋白，其中，该融合蛋白包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中，SEQ ID NO 14-20和29中的至少一个连接至肽毒素。
在一个实施方式中，重组融合蛋白包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 16中的至少一个连接至肽毒素。
在一个实施方式中，重组融合蛋白包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中，SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 17中的至少一个连接至肽毒素。
在一个实施方式中，重组融合蛋白包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 18中的至少一个连接至肽毒素。
在一个实施方式中，重组融合蛋白包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 19中的至少一个连接至肽毒素。
在一个实施方式中，重组融合蛋白包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 20中的至少一个连接至肽毒素。
在一个实施方式中，重组融合蛋白包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 17中的至少一个连接至肽毒素。
在一个实施方式中，重组融合蛋白包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 29中的至少一个连接至肽毒素。
核苷酸序列
抗体或其抗原结合片段可以由任何合适的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中，核苷酸序列是密码子优化的，例如针对在人类或植物中的表达，是密码子优化的。细胞对特定密码子的偏好可以有所不同，其中有些密码子使用得更多。这种密码子偏好与给定的细胞类型中特定tRNA的相对丰度相对应。因此，在序列中可以改变密码子，使其与细胞类型中具有最高相对丰度的tRNA匹配，从而增加表达。类似地，通过改变序列使其匹配最低丰度的tRNA，其可以降低表达。因此，可获得更高程度的翻译调控(control，控制)。对于各种生物体的密码子使用表在本领域是已知的。
在一个实施方式中，本发明提供了编码如本文公开的抗体或其抗原结合片段的核酸。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 23具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区，以及与SEQ ID NO 23具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 25具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区，以及与SEQ ID NO 25具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 22具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 24具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 22具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区，以及与SEQ ID NO 24具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 26具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区，以及与SEQ ID NO 26具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 27具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区，以及与SEQ ID NO 27具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区，以及与SEQ ID NO 24具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 30具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
在一个实施方式中，核酸编码与SEQ ID NO 21具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的轻链可变区，以及与SEQ ID NO 30具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的重链可变区。
表达系统
本发明还涉及本文公开的抗体或其抗原结合片段的生产以及工程化的方法。
在一些实施方式中，一系列生产宿主可以用于生产本文公开的抗体或其抗原结合片段。这种宿主(被用于生产抗体或其抗原结合片段)可以包括但不限于哺乳动物细胞(例如CHO细胞)、植物细胞(例如本氏烟草(Nicotiana benthamiana)细胞)、真核细胞(例如酵母细胞)以及微生物细胞。
在本公开范围内的一些实施方式中以及如本领域已知的，可以组装一个或多个质粒表达载体，并转染到活细胞中，用于由宿主进行瞬时表达。如果使用多个表达载体，它们可以分别或共同转染到细胞中，并由宿主进行表达。在一个优选的实施方式中，工程化的本氏烟草(Nb)植物品系(strain，品种)是生产宿主，将包含编码本公开的抗体或其抗原结合片段的核酸的一个或多个表达载体转染到该宿主中。
在一个实施方式中，将质粒表达载体转染到农杆菌(Agrobacterium)宿主中。在一个优选的实施方式中，将质粒表达载体转染到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中。
在进一步的实施方式中，携带载体的农杆菌在轻微擦伤(mild abrasion)的存在下通过喷雾接种引入植物宿主中。在进一步的实施方式中，携带载体的农杆菌通过真空渗入(infiltration，渗透)引入植物宿主中。
进一步的实施方式
单克隆抗体，包括免疫球蛋白，已在各种真核细胞和其他活细胞中工程化和生产。然而，哺乳动物表达系统往往受到缓慢的生产周转周期的阻碍，并且通过使用某些细胞系的生产可以受到哺乳动物系统中的哺乳动物病毒以及与单克隆抗体一起产生的其他不期望的化合物的存在的限制。
虽然不旨在限制本发明实施方式的范围，但需注意的是，基于植物的抗体生产系统可以避免基于哺乳动物的单克隆抗体生产的某些缺陷(pitfalls，误区)。一个这样的系统(作为非限制性实例提供)利用工程化的本氏烟草(Nb)植物品系表达一个或多个包含用于形成期望的mAb的核酸构建体的表达载体。在本发明公开范围内的一些实施方式中以及如本领域已知的，组装一个或多个质粒表达载体，然后转染到活细胞中，用于由宿主进行瞬时表达。如果使用多个表达载体，它们可以分别或共同转染到细胞(例如，在Nb的植物组织中发现的)中，并由宿主进行表达。示例性的瞬时表达方法使用农杆菌菌株(例如，根癌农杆菌)，其中培育(grow，种植)农杆菌并使其渗入整个植物中，感染植物并将基因引入植物细胞。在发芽的植物中，感兴趣的基因渗入和瞬时表达后，对渗入的植物进行合适的饲养和护理，为期望的植物生长和最终收获含有mAb渗入的植物样本提供条件。然后从收获的植物部分提取期望的mAb产物，通常随后纯化和表征所提取的单克隆抗体。
虽然将携带载体的农杆菌引入这些宿主中的方式并非旨在作为限制因素，在轻微擦伤的存在下喷雾接种和真空渗入是选项。再一次地，关于植物宿主，可以使用其他方法，以及可以利用其他非植物宿主，通过已知方法将核酸构建体引入那些宿主中。
如相关领域普通技术人员理解的，一系列其他生产宿主可适用于在mAb生产中使用。根据本发明的实施方式用于生产mAb的这种宿主可以包括但不必须限于哺乳动物(例如CHO细胞)、植物(例如Nb植物或植物细胞)、酵母、真核细胞、和微生物细胞。通过在相关文献中可用的已知步骤，这种宿主已经通过基因工程化、诱变(mutagenesis，突变发生)、或(在植物的情况下)选择性育种开发，旨在提高mAb产量，或者在增加或减少分子、代谢、化学、表型、或其他影响宿主蛋白质形成的性状方面提供额外的理化特性。
本发明的实施方式提供了源自鼠来源的单克隆抗体的代表性氨基酸序列，其已经被人源化以修饰氨基酸序列以增加它们与在人类中发现的抗体序列变体的相似性。因此，虽然不必须限于本文具体提供的那些序列，但本公开范围内的氨基酸序列包含人源化单克隆抗体，显示出抗β-葡聚糖活性或其他有利于中和β-葡聚糖作用的活性。在一些方面，抗-β-葡聚糖活性是针对1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖分子。
这种氨基酸序列可以提供人源化mAb，其表现为以下形式：完整组装的双链抗体；单链抗体；包含免疫球蛋白抗体(诸如IgG)可变区的抗体片段，该抗体片段具有能够结合至感兴趣的分子并在生物体(包括哺乳动物，尤其是人类)中引发免疫反应的抗原结合位点；包含来自这种抗体的可变区的一个或多个CDR的抗体片段；人类、嵌合或人源化的抗体；多聚体抗体诸如但不限于六聚体抗体；纳米抗体；一个或多个单独的免疫球蛋白域；包含本公开的一个或多个抗体或抗体部分的融合蛋白；以及作为这种抗体的抗原结合序列；或者上述形式或其他形式的任意组合。
更进一步地，本公开的实施方式包括以任何数量形式包装的任何产品(例如注射器、小瓶(vial)、泡罩包装、吸入器)。这种产品可以包含适当的缓冲剂、添加剂和赋形剂，并且可以经由注射器、药丸、喷雾剂、吸入器和其他形式通过各种途径以单位剂量递送，该途径包括但不限于皮下、肌肉、皮内、注射、口服、鼻腔以及局部施用或其他形式，其中任何一种都可以按照临床指示进行。这种产品可以是生物制剂或药物组合物的形式，诸如将本公开的一个或多个抗体以临床或治疗有效的量连接至合适的载体(例如非感染性载体，诸如病毒、病毒样颗粒和纳米颗粒)。
本文设想的药物组合物可以包括本文公开的单克隆抗体与药学上可接受的载体。此外，本公开的范围包括如本文公开的mAb本身以及它们的生产方法。
鉴于本文的教导，如所描述的和/或要求保护的，根据本发明的实施方式生产的各种新的mAb将展示出几种益处，包括对特定抗原或靶标分子的改善的亲和力、增加的半衰期、针对更高产率和成本效益的增加的可扩展性，举几个例子。此外，为了完成这些目标，本文描述了多个靶向β-葡聚糖(即β-葡聚糖分子，例如1,3-β-葡聚糖和1,6-β-葡聚糖分子)的示例性抗体序列。
本发明的实施方式包括一个或多个能够结合且确实结合至β-葡聚糖分子的人源化单克隆抗体。具体鉴定了五条人源化的重链氨基酸序列以及五条人源化的轻链氨基酸序列。本发明的实施方式包括由重链和轻链组合形成的多个人源化的mAb。
受试者mAb的人源化和纯化
尽管已经尝试了各种的人源化技术，并且其中多个已发表或者在本领域中已知，但是在保留源自动物抗体的结合亲和力同时获得人源化的mAb施用于人类受试者时的合适的相容性之间，总是存在平衡。关于本文公开的发明的氨基酸序列，人源化方法通过对适当的人类受体框架进行序列分析开始，该人类受体框架在重链序列和轻链序列两者上，从而导致鉴定人类受体框架与已知的鼠抗体之间的氨基酸差异，可以测定该鼠抗体对β-葡聚糖的结合活性。
氨基酸差异一旦确定，就基于人类受试者与鼠受试者之间生物化学相似性的程度进行排序。从这些步骤，设计三条可变重序列以及三条可变轻序列。下表(表1)以百分比比较人类序列与wt(即源自鼠野生型)的同一性，反映了对于所有五条重链变体的百分比均高于wt对照。
表1
标识符 VH的GI[％]
wt 68.2
VH_V1 77.7
VH_V2 85.0
VH_V3 90.7
VH_V4 88.8
VH_V5 92.5
通过考虑表面展示的氨基酸的影响，并将可能的变体与临床NSG(下一代测序数据库)中类似的人类抗体结构对比，设计出两条额外的可变重序列和两条可变轻序列。这些变体中的每一个都试图使不断增加与人类受体框架相同的氨基酸的交换数量，以及增加使抗原结合位点中发现的来自鼠来源的保守氨基酸数量。
此外，以同样方式得出的用于可变轻链以及在变体与对照之间显示相同的趋势的数据在表2中提供。
表2
标识符 VH的GI[％]
wt 82.5
VL_V1 89.3
VL_V2 91.3
VL_V3 93.2
VL_V4 92.2
VL_V5 96.1
因此，确定了五条重链序列和五条轻链序列，它们以配对组合在VH和VL中表达，它们的序列以SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:37在本文中公开。虽然不旨在限制将这些教导为单一方法，但本文所讨论的测试的每一种人源化的mAb都是通过在第一表达载体上表达重链序列以及在第二表达载体上表达轻链序列来生产的。为了非限制性说明的目的，PVX(带有马铃薯病毒X骨架的载体)和TVCV(带有番茄脉清(tomato vein clearing)病毒骨架的载体)是用于这些目的的合适的载体。
一旦生产，本公开的单克隆抗体可以通过相关领域中已知的方法纯化。例如，美国专利号10,214,747(“纯化单克隆抗体的方法”，2019年2月26日发布)，其内容通过引证完全并入本文，该专利描述了单克隆抗体纯化平台，该平台包括纯化众多不同抗体的程序和方法，该程序和方法适用于纯化根据本公开生产的抗体。
根据本发明的实施方式的进一步的氨基酸序列
本文所述的示例性氨基酸序列可以以多个选择方式中的任何一个表示，以及以重氨基酸链和轻氨基酸链的任何组合表示。应当理解的是，当提供示例性序列时，本公开的范围将还包括其他序列，包括部分鉴定的序列、呈现共同结构特征的序列以及其中包括本文提供的示例性序列的较长序列。
本文公开的序列包括SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29以及SEQ IDNO:31-SEQ ID NO:37(见下表3)。SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31-SEQ IDNO:33为重链氨基酸序列。SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:37为轻链氨基酸序列。
根据本发明的实施方式，人源化的单克隆抗体的重链包含SEQ ID NO:17中含有的氨基酸序列。SEQ ID NO:17的氨基酸序列可以与轻链氨基酸序列结合以形成人源化的抗体，其中，该轻链包含SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:37中任意一个含有的氨基酸序列。作为非限制性实例，重链和轻链的组合可以使用SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:35结合，或者SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:14结合。
此外，根据本公开的实施方式包括那些其中人源化的单克隆抗体的重链包含SEQID NO:31中含有的氨基酸序列。SEQ ID NO:31的氨基酸序列可以与轻链氨基酸序列结合以形成人源化的抗体，其中，该轻链包含SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:37中任意一个含有的氨基酸序列。作为非限制性实例，重链和轻链的组合可以使用SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:35结合，或者SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:14结合。
根据本公开的实施方式还包括那些其中人源化的单克隆抗体的重链包含SEQ IDNO:32中含有的氨基酸序列。SEQ ID NO:32的氨基酸序列可以与轻链氨基酸序列结合以形成人源化的抗体，其中，该轻链包含SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:37中任意一个含有的氨基酸序列。作为非限制性实例，重链和轻链的组合可以使用SEQ ID NO:32与SEQ ID NO:35结合，或者SEQ ID NO:32与SEQ ID NO:14结合。
更进一步地，本公开的实施方式包括那些其中人源化的单克隆抗体的重链包含SEQ ID NO:29中含有的氨基酸序列。SEQ ID NO:29的氨基酸序列可以与轻链氨基酸序列结合以形成人源化的抗体，其中，该轻链包含SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:37中任意一个含有的氨基酸序列。作为非限制性实例，重链和轻链的组合可以使用SEQ IDNO:29与SEQ ID NO:35结合，或者SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:14结合。
另外，本公开的实施方式包括那些其中人源化的单克隆抗体的重链包含SEQ IDNO:33中含有的氨基酸序列。SEQ ID NO:33的氨基酸序列可以与轻链氨基酸序列结合以形成人源化的抗体，其中，该轻链包含SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:37中任意一个含有的氨基酸序列。作为非限制性实例，重链和轻链的组合可以使用SEQ ID NO:33与SEQ ID NO:35结合，或者SEQ ID NO:33与SEQ ID NO:14结合。
此外，本公开的实施方式包括那些其中人源化的单克隆抗体的轻链包含SEQ IDNO:35中含有的氨基酸序列。SEQ ID NO:36的氨基酸序列可以与重链氨基酸序列结合以形成人源化的抗体，其中，该重链包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31-SEQID NO:33中任意一个含有的氨基酸序列。
另外，本公开的实施方式包括那些其中人源化的单克隆抗体的轻链包含SEQ IDNO:14中含有的氨基酸序列。SEQ ID NO:14的氨基酸序列可以与重链氨基酸序列结合以形成人源化的抗体，其中，该重链包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31-SEQID NO:33中任意一个含有的氨基酸序列。
更进一步地，本公开的实施方式包括那些其中人源化的单克隆抗体的轻链包含SEQ ID NO:34以及SEQ ID NO:36-SEQ ID NO:37中任意一个含有的氨基酸序列。SEQ IDNO:34以及SEQ ID NO:36-SEQ ID NO:37中任意一个的氨基酸序列可以与重链氨基酸序列结合以形成人源化的抗体，其中，该重链包含SEQ ID NO 17、SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:33中任意一个含有的氨基酸序列。
根据上述鉴定的序列，SEQ ID NO 17、SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31-SEQ IDNO:33是变体重链可变区。因此，表3将每个重链可变区变体(VH)与上述重链SEQ ID NO之一关联。
此外，根据上述鉴定的序列，SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:37是变体轻链可变区。因此，表3将每个轻链变体(VK)与上述轻链SEQ ID NO之一关联。鉴于上述情况，本文提供了三个克隆：3.1、14.1和32.3。
克隆3.1是VH_wt与VL_野生型结合的源自鼠的mAb，被用作对照，因此在这个克隆中不包括上述提及的序列。
克隆14.1另外被确定为VH_V1_VL_V5，并且包含SEQ ID NO:17_SEQ ID NO:14的组合。
克隆32.3另外被确定为VH_V4_VK_V5。它包含SEQ ID NO:29_SEQ ID NO:14的组合。
应当理解，本文所述的实施方式在它们的应用中不限于提出的教导和描述的细节，或附图中所示的内容。相反，应当理解如本文描述的及要求保护的本实施方式及替代方案能够以多种方式进行实践或实施。此外，应当理解，本文使用的词和短语是用于描述目的，并且不应被视为是限制性的。文中使用的“包括(including)”、“包含(comprising)”、“例如”、“含有(containing)”或“具有(having)”以及这些词的变体，旨在涵盖此后列出的项、和那些的等同物、以及额外的项。
因此，几种实施方式及替代方案的前述描述旨在说明，而非对本文公开的范围提供限制。本文的描述并非旨在穷尽，也无意将对实施方式的理解限制于公开的确切形式。本领域普通技术人员应当理解，鉴于上述教导及描述，这些实施方式的修改和变化是合理可能的。
带编号的实施方式：
1.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1；
(b)CDRL2，选自由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3组成的组；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3；
以及重链可变区，该重链可变区包含：
(d)CDRH1，选自由SEQ ID NO 5-7组成的组；
(e)CDRH2，选自由SEQ ID NO 8-12和SEQ ID NO 28组成的组；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3。
2.根据实施方式1的抗体或其抗原结合片段，其中，轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1；
(b)SEQ ID NO 2的CDRL2；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3。
3.根据实施方式1或实施方式2的抗体或其抗原结合片段，其中，轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％同一性的氨基酸序列。
4.根据实施方式1至3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 5的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 8的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3。
5.根据实施方式1至4中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含与SEQ ID NO 16具有至少70％同一性的氨基酸序列。
6.根据实施方式1至3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 5的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 10的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3。
7.根据实施方式1至3、或6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含与SEQ ID NO 18具有至少70％同一性的氨基酸序列。
8.根据实施方式1的抗体或其抗原结合片段，其中，轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1；
(b)SEQ ID NO 3的CDRL2；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3。
9.根据实施方式1或实施方式8的抗体或其抗原结合片段，其中，轻链可变区包含与SEQ ID NO 15具有至少70％同一性的氨基酸序列。
10.根据实施方式1至3、8或9中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 6的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 9的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3。
11.根据实施方式1至3、8、9或10中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％同一性的氨基酸序列。
12.根据实施方式1至3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 5的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 11的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3。
13.根据实施方式1至3或12中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含与SED ID NO 19具有至少70％同一性的氨基酸序列。
14.根据实施方式1至3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 7的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 12的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3。
15.根据实施方式1至3或14中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含与SEQ ID NO 20具有至少70％同一性的氨基酸序列。
16.根据实施方式1至3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 6的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 28的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3。
17.根据实施方式1至3或16中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区包含与SEQ ID NO 29具有至少70％同一性的氨基酸序列。
18.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％同一性的氨基酸序列。
19.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 16具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
20.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 16具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
21.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 18具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
22.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 18具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
23.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 15具有至少70％同一性的氨基酸序列。
24.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
25.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 15具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
26.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
27.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 19具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
28.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 19具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
29.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 20具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
30.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 20具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
31.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 29具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
32.一种抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且其中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO 29具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
33.根据实施方式3、5、7、9、11、13、15以及17至32中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段与所列序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。
34.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)、单域抗体(sdAb)、抗原结合片段(Fab)或片段抗体(F(ab’)2)。
35.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD同种型或其任何同种异型。
36.根据实施方式35的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgG1同种型或其任何同种异型。
37.根据实施方式35的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgG2同种型或其任何同种异型。
38.根据实施方式35的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgG3同种型或其任何同种异型。
39.根据实施方式35的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgG4同种型或其任何同种异型。
40.根据实施方式35的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgA1同种型或其任何同种异型。
41.根据实施方式35的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgA2同种型或其任何同种异型。
42.根据实施方式35的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgD1同种型或其任何同种异型。
43.根据实施方式35的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是IgD2同种型或其任何同种异型。
44.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段是人源化的。
45.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体结合至β-葡聚糖。
46.根据实施方式45的抗体或其抗原结合片段，其中，β-葡聚糖是1,3-β-葡聚糖或1,6-β-葡聚糖。
47.根据实施方式45或实施方式46的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体结合至海带多糖。
48.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，用于在结合至两种不同的抗原或表位的双特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中使用。
49.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，用于在结合至两种或更多种不同的抗原或表位的多特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中使用。
50.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段是同源二聚体或同源多聚体的形式。
51.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段具有小于0.2μg/mL的EC50。
52.根据实施方式51的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段具有小于0.1μg/mL的EC50。
53.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段具有低于1.5x10-8M的KD值。
54.根据实施方式53的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段具有低于1x10-8M的KD值。
55.根据实施方式54的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段具有低于5x10-9M的KD值。
56.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段在高达80℃下是热稳定的。
57.根据实施方式56的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段在高达70℃下是热稳定的。
58.根据实施方式57的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段在高达60℃下是热稳定的。
59.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，用于作为抗真菌剂使用。
60.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，用于在治疗真菌感染中使用。
61.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，用于在制备用于治疗真菌感染的药物中使用。
62.一种治疗真菌感染的方法，包括施用前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段。
63.根据实施方式59-61的用于使用的抗体或其抗原结合片段或根据实施方式62的方法，其中，真菌感染是曲霉菌感染。
64.根据实施方式63的抗体或其抗原结合片段、或者方法，其中，曲霉菌感染是烟曲霉菌感染。
65.根据实施方式59-61的用于使用的抗体或其抗原结合片段或根据实施方式62的方法，其中，真菌感染是念珠菌感染。
66.根据实施方式65的抗体或其抗原结合片段、或者方法，其中，念珠菌感染是白色念珠菌或耳念珠菌感染。
67.一种重组融合蛋白，其中，融合蛋白包含前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段以及肽毒素。
68.根据实施方式67的重组融合蛋白，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 16中的至少一个连接至肽毒素。
69.根据实施方式67的重组融合蛋白，其中，SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 17中的至少一个连接至肽毒素。
70.根据实施方式67的重组融合蛋白，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 18中的至少一个连接至肽毒素。
71.根据实施方式67的重组融合蛋白，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 19中的至少一个连接至肽毒素。
72.根据实施方式67的重组融合蛋白，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 20中的至少一个连接至肽毒素。
73.根据实施方式67的重组融合蛋白，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 17中的至少一个连接至肽毒素。
74.根据实施方式67的重组融合蛋白，其中，SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 29中的至少一个连接至肽毒素。
75.根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段偶联至连接部分。
76.根据实施方式75的抗体或其抗原结合片段，其中，连接部分是药物。
77.根据实施方式75的抗体或其抗原结合片段，其中，连接部分是毒素。
78.根据实施方式75的抗体或其抗原结合片段，其中，连接部分是细胞因子。
79.根据实施方式75的抗体或其抗原结合片段，其中，连接部分是酶。
80.根据实施方式75-79中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或其抗原结合片段与连接部分通过连接子分子偶联。
81.根据实施方式80的抗体或其抗原结合片段，其中，连接子分子是可裂解的连接子分子。
82.一种编码根据前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合片段的核酸。
83.一种编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区的核酸。
84.一种编码与SEQ ID NO 23具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
85.一种编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区以及与SEQID NO 23具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
86.一种编码与SEQ ID NO 22具有至少70％序列同一性的轻链可变区的核酸。
87.一种编码与SEQ ID NO 24具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
88.一种编码与SEQ ID NO 22具有至少70％序列同一性的轻链可变区以及与SEQID NO 24具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
89.一种编码与SEQ ID NO 25具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
90.一种编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区以及与SEQID NO 25具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
91.一种编码与SEQ ID NO 26具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
92.一种编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区以及与SEQID NO 26具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
93.一种编码与SEQ ID NO 27具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
94.一种编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区以及与SEQID NO 27具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
95.一种编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区以及与SEQID NO 24具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
96.一种编码与SEQ ID NO 30具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
97.一种编码与SEQ ID NO 21具有至少70％序列同一性的轻链可变区以及与SEQID NO 30具有至少70％序列同一性的重链可变区的核酸。
98.根据实施方式83-97中任一项的核酸，其中，核酸与所列序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。
99.一种化合物，其为抗-β-葡聚糖抗体或其抗原结合片段，其中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，VH氨基酸序列选自SEQ ID NO:29以及SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:34中的任意一个，并且VL氨基酸序列选自SEQ ID NO:14以及SEQID NO:35-SEQ ID NO:38中的任意一个。
100.根据实施方式99的化合物，其中，VH氨基酸序列是SEQ ID NO:31或SEQ NO:29，并且VL氨基酸序列是SEQ ID NO:14。
表3：抗体序列的概述
实施例
现在本发明将通过实施例的方式进一步被描述，其旨在为本领域普通技术人员提供帮助来实施本发明，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中测试的抗体经过两步色谱纯化后纯度>99％，如表4中所示的柱HPLC SEC最终单体％表示。
表4
测试品(Test Article) HPLC SEC最终单体％
克隆39 100
克隆40 100
克隆41 100
克隆42 100
克隆43 100
克隆14 100
克隆32 99.65
实施例1-海带多糖结合(ELISA)以确定初始人源化的和下一代亲和力成熟的抗真菌抗体的EC50值
EC50值是半数最大有效浓度的量度。使用海带多糖结合ELISA计算EC50，如下所述。
ELISA板用10μg/mL的海带多糖(海带多糖来自掌状海带(Laminaria digitata)，Sigma L9634)在PBS中包被于5℃过夜，然后用3％ BSA在PBST中于室温下封闭2-3小时。将以10μg/mL开始的3倍连续稀释的抗体(2G8变体)施加至板上，并在室温下孵育1h。通过HRP偶联的兔抗人IgG FC(Invitrogen,Rockford,IL)以1:20,000的稀释度检测海带多糖结合的抗体。使用四甲基联苯胺(TMB)底物(SeraCare Life Sciences INC,Milford,MA,USA)用于检测；在酶标仪(plate reader)上测量在450nm的吸光度。绘制图(图1)，并使用GraphPadPrism 8.0软件计算EC50(表5)。使用两种KBio制备的抗体(非2G8)作为阴性对照，显示没有结合至海带多糖。
表5
实施例2-海带多糖结合(Biacore-SPR)以确定初始人源化的和下一代亲和力成熟的抗真菌抗体的结合亲和力(KD)
平衡结合常数(KD)是抗体与其靶标的结合亲和力的量度，其可以通过任何合适的检测来测定，诸如表面等离子体共振(SPR)。
在环境温度下，在Biacore T200仪器上测量2G8变体与海带多糖的结合亲和力(KD)。对于每个循环，按照制造商的说明，将2G8变体捕获在蛋白A(Pro A)传感器芯片上，达到约1300-1500RU的表面密度。海带多糖的连续稀释液在运行缓冲液(HBS-EP+,Cytiva)中进行，并且以30μL/min的流量注入，接触时间为120s和解离时间为600s。在样品注入之间，使用蛋白A清洗缓冲液清洗系统。利用参考流通池(reference flow cell)来校正诸如在样品流通池和参考流通池中同等发生的体积偏移(bulk shift)的响应贡献。进行空白循环(运行缓冲液)，并且对所有样品注入进行空白扣除，以校正传感图中影响参考扣除曲线的漂移和其他干扰。在每个实验中注入非零浓度的海带多糖重复品和空白对照用于双重参考，从而验证Pro A芯片在整个实验中的可靠性。通过动力学结合分析对结合速率常数(ka)(图2B；表6)、解离速率常数(kd)(图2C；表7)以及平衡解离常数(KD)(图2A；表8)的数据进行评估。
表6
测试品 Ka(1/Ms)
克隆14.1参考 121000
克隆3.1 165500
克隆14.1 125440
克隆32.3 73900
克隆39.1 98445
克隆40.1 135200
克隆41.2 97815
克隆42.1 138300
克隆43.1 92245
表7
测试品 Kd(1/s)
克隆14.1参考 0.0004435
克隆3.1 0.000471
克隆14.1 0.00045028
克隆32.3 0.000921
克隆39.1 0.0004966
克隆40.1 0.00024695
克隆41.2 0.0002927
克隆42.1 0.0006862
克隆43.1 0.00064185
表8
测试品 KD(M)
克隆14.1参考 3.83e-009
克隆3.1 2.85e-009
克隆14.1 3.63e-009
克隆32.3 1.25e-008
克隆39.1 5.05e-009
克隆40.1 1.83e-009
克隆41.2 2.96e-009
克隆42.1 4.97e-009
克隆43.1 6.96e-009
实施例3-免疫抑制小鼠受到烟曲霉菌攻击后用初始人源化的抗真菌抗体或下一代、人源化的且亲和力成熟的抗体进行治疗及真菌载量评估
在侵袭性曲霉菌病的鼠模型中，动物首先接受免疫抑制机制(regime)。所有动物在第2天(相对于在第0天接种)经腹腔注射施用环磷酰胺(250mg/kg)，以及经皮下施用醋酸可的松(500mg/kg)。在第3天，所有动物经腹腔注射施用环磷酰胺(250mg/kg)，以及经皮下施用醋酸可的松(500mg/kg)。在第2天和第3天剂量给药前记录体重，动物剂量给药体积为10mL/kg。
所有测试组在曲霉菌攻击后24小时和120小时，给予15mg/kg的mAb，该mAb在20mML-组氨酸+240mM蔗糖中配制，pH为6.0。媒介物对照组接受配制缓冲液(20mM L-组氨酸+240mM蔗糖，pH 6.0)。所有组剂量给予2.5mL/kg的测试项(mAb或媒介物)。
感染烟曲霉菌后，监控免疫抑制小鼠长达14天，并每天记录存活率百分比。
如预期，受到烟曲霉菌攻击并且仅被提供对照媒介物的小鼠，在第8天发现存活比率为0％。
给予媒介物对照或克隆14.1抗体的小鼠组在8天后显示0％的存活率。给予克隆39.1或41.2抗体的小鼠组达到了10％的存活比率，并且给予克隆3.1、32.3、40.1、42.1或43.1抗体的小鼠组达到了20％的存活比率(图3A)。
按照制造商的说明，通过ELISA(Platelia Aspergillus Ag#62794，Bio-Rad)分析BAL中的半乳甘露聚糖水平。
在BAL程序完成后，对肺样本进行组织病理学评估。简要地，打开动物胸腔，切除肺并称重。然后用10％中性缓冲福尔马林对整个肺进行喷注(insufflate)至少24小时，且将组织处理成石蜡块。将大约4-5um切片的肺组织用苏木素和伊红(H&E)以及过碘酸希夫(PAS)进行染色。对肺进行显微镜评估，包括对炎症细胞渗入和组织炎症(H&E)进行分级，尤其考虑真菌孢子和菌丝(PAS)的存在。
数据显示，来自第2-10组的大多数动物，由于福利原因在第14天之前被处死；通过BAL半乳甘露聚糖水平或PAS阳性染色或两者，可检测肺中的真菌水平(图3B)。只有两只动物(来自32.3组的动物39和来自39.1组的动物47)不是这种情况。
在生理盐水/媒介物组、42.1组或3.1组中存活的动物中没有一个具有通过BAL半乳甘露聚糖水平或PAS阳性染色的方式，在肺中可检测水平的真菌。32.3组的1只幸存者PAS染色呈阳性，然而另1只在两种检测中呈阴性，39.1组的唯一幸存者BAL半乳甘露聚糖呈阳性，40.1组的两只幸存者中的1只BAL半乳甘露聚糖呈阳性，然而另1只在两种检测中均呈阴性，41.2组的唯一幸存者BAL半乳甘露聚糖呈阳性，43.1组的两只幸存者中的1只PAS染色呈阳性，然而另1只在任一种检测中均不具有可检测的水平。
实施例4-热迁移分析(TSA)以测定抗体的熔解温度
进行热迁移分析(TSA)来测定抗体的熔解温度。通过在生命科技(LifeTechnologies)qPCR系统上进行TSA来测定抗体的熔解温度(Tm)。每种抗体在蛋白热迁移TM缓冲液(Protein Thermal Shift TM Buffer)(由Biosystems提供，Cat.#4462263)中的终浓度为0.5mg/mL，与1X蛋白热迁移TM染料(Protein Thermal Shift TM Dye)(由Biosystems提供，Cat.#4462263)混合，使得在MicroAmpTM光学反应96孔板中每孔的总体积为20μl。设置仅有蛋白的空白对照。对样品进行三次重复分析。以0.05℃/s的增量加热板，从25℃至99℃。使用蛋白热迁移软件1.4版本(由Biosystems提供，Cat.#4466037)分析数据。绘制熔解温度(Tm)，并展示出Tm1(图4A；表9)和Tm2(图4B；表10)。
表9
测试品 Tm1(℃)
克隆3.1 66.196
克隆14.1 65.457
克隆32.3 65.457
克隆39.1 65.556
克隆40.1 64.866
克隆41.2 66.935
克隆42.1 65.014
克隆43.1 64.964
表10
测试品 Tm2(℃)
克隆3.1 76.390
克隆14.1 82.644
克隆32.3 80.379
克隆39.1 81.265
克隆40.1 83.087
克隆41.2 77.917
克隆42.1 79.689
克隆43.1 80.231
。

Claims (33)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1；
(b)选自由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3组成的组的CDRL2；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3；
以及重链可变区，所述重链可变区包含：
(d)选自由SEQ ID NO 5-7组成的组的CDRH1；
(e)选自由SEQ ID NO 8-12和SEQ ID NO 28组成的组的CDRH2；和
(f)SEQ ID NO 13的CDRH3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1；
(b)SEQ ID NO 2的CDRL2；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3，
任选地，其中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO 14具有至少70％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 5的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 8的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3，
任选地，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO 16具有至少70％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 5的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 10的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3，
任选地，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO 18具有至少70％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 1的CDRL1；
(b)SEQ ID NO 3的CDRL2；和
(c)SEQ ID NO 4的CDRL3，
任选地，其中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO 15具有至少70％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1、2或5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 6的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 9的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3，
任选地，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO 17具有至少70％同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 5的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 11的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3，
任选地，其中，所述重链可变区包含与SED ID NO 19具有至少70％同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 7的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 12的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3，
任选地，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO 20具有至少70％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
(a)SEQ ID NO 6的CDRH1；
(b)SEQ ID NO 28的CDRH2；和
(c)SEQ ID NO 13的CDRH3，
任选地，其中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO 29具有至少70％同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段与所列序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或100％的序列同一性。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)、单域抗体(sdAb)、抗原结合片段(Fab)或片段抗体(F(ab’)2)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD同种型或它们的任何同种异型。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是人源化的。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体结合至β-葡聚糖。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，用于在结合至两种不同的抗原或表位的双特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中使用。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，用于在结合至两种或更多种不同的抗原或表位的多特异性抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段中使用。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段是同源二聚体或同源多聚体的形式。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段具有小于0.2μg/mL的EC50。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段具有低于1.5x 10-8M的KD值。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段在高达80℃下是热稳定的。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，用于作为抗真菌剂使用。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，用于在治疗真菌感染中使用。
23.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，用于在制备用于治疗真菌感染的药物中使用。
24.一种治疗真菌感染的方法，所述方法包括施用前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
25.根据权利要求21-23所述的用于使用的抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求24所述的方法，其中，真菌感染是曲霉菌(Aspergillus)感染。
26.根据权利要求21-23所述的用于使用的抗体或其抗原结合片段或者根据权利要求24所述的方法，其中，真菌感染是念珠菌(Candida)感染。
27.一种重组融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、以及肽毒素。
28.根据权利要求27所述的重组融合蛋白，其中：
(a)SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 16中的至少一个，
(b)SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 17中的至少一个，
(c)SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 18中的至少一个，
(d)SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 19中的至少一个，
(e)SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 20中的至少一个，
(f)SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 17中的至少一个，或
(g)SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 29中的至少一个连接至所述肽毒素。
29.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段偶联至连接部分。
30.根据权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述连接部分是药物、毒素、细胞因子、酶或酶。
31.根据权利要求29-30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段与所述连接部分通过连接子分子偶联。
32.根据权利要求31所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述连接子分子是可裂解的连接子分子。
33.一种核酸，所述核酸编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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