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CN110016074A - Mage-a3人源化t细胞受体 - Google Patents

Mage-a3人源化t细胞受体 Download PDF

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CN110016074A
CN110016074A CN201810015578.2A CN201810015578A CN110016074A CN 110016074 A CN110016074 A CN 110016074A CN 201810015578 A CN201810015578 A CN 201810015578A CN 110016074 A CN110016074 A CN 110016074A
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Abstract

本发明提供了一种人源化改造的T细胞受体(TCR)SRm1g13t，其具有结合人抗原MAGE‑A3:112‑120(KVAELVHFL)与人类白细胞抗原(HLA)复合物：pHLA(MAGE‑A3)的特性；并且所述SRm1g13t对所述pHLA(MAGE‑A3)复合物的结合亲和力是相应鼠源TCR SRm1对pHLA(MAGE‑A3)复合物的结合亲和力的至少2倍。本发明还提供了此类TCR与治疗剂的融合分子。此类TCR可以单独使用，也可与治疗剂联用。

Description

MAGE-A3人源化T细胞受体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及能够识别人抗原pHLA(MAGE-A3)的人源化T细胞受体(T cell receptor,TCR)。本发明还涉及所述受体的制备和用途。
背景技术
目前基于表达特异性T细胞受体(TCR)的T细胞免疫治疗越来越受到重视，这种免疫疗法被寄予厚望去消灭肿瘤。这种抗肿瘤的效应是由转入的TCR来介导的，转入的TCR可以识别肿瘤细胞上的肽-人白细胞抗原(pHLA)复合物，从而使T细胞来识别肿瘤细胞，进而使T细胞杀伤肿瘤细胞。近期研究表明，亲和力越高的TCR可以使T细胞发挥更好的抗肿瘤效应。临床试验也表明亲和力提高的NY-ESO-1特异性T细胞不仅表现出安全性也展现出来很好的抗肿瘤疗效。这些数据都表明提高T细胞免疫疗效可以从提高亲和力方面出发。
MAGE-A3在人肿瘤中高度频繁表达，并且它的表达与预后差呈正相关性。研究者已经能够通过用人抗原MAGE-A3:112-120(KVAELVHFL)短肽来免疫HLA-A*02的转基因小鼠已经得到了针对人抗原MAGE-A3的鼠源TCR。这个鼠源TCR展示出了良好的抗肿瘤效应并且也进行了临床试验研究(Chinnasamy,N.,et al.,J Immunol,2011.186(2):p.685-96.)。
但是，人体为了防止产生自身免疫反应，高亲和力的TCR已经在胸腺中被剔除了，因而在人体的TCR库中找到高亲和力的TCR是非常困难的。不过研究发现当T细胞表达高亲和力TCR时，T细胞的激活是不需要CD8的辅助。然而老鼠的CD8无法有效的和人的HLA的α3有效的结合，因而在HLA转基因老鼠体内找到针对人肿瘤抗原的高亲和力鼠源的TCR是相对容易很多的。并且已经有大量的文章报导鼠源TCR可以发挥很好的抗肿瘤反应，因而高亲和鼠源的TCR有着相当大的优势和潜能被应用于抗肿瘤的免疫治疗。
然而鼠源的TCR对于人体而言存在免疫原性，会使人体产生宿主免疫应答，从而产生针对鼠源TCR的抗体，这极有可能会使回输的转入鼠源TCR的T细胞被清除掉。研究者目前已经发现，当病人回输转入针对人抗原p53或者gp100的鼠源TCR的T细胞时，病人体内产生了针对鼠源TCR的抗体。同时也发现当病人回输转入针对人抗原CEA的鼠源TCR的T细胞时，病人在治疗后的3-4个月产生了针对鼠源TCR的抗体，这些抗体也抑制了表达鼠源TCR的PBL产生IFN-γ的释放能力。虽然目前的数据没有给出明确的答案来说抗鼠源TCR的抗体会影响抗肿瘤的效果，但是鼠源TCR的免疫原性是不可避免的会影响机体产生抗体，这种影响必须被受到重视以防止鼠源TCR被应用到临床产生不必要的影响。
众所周知，人源化抗体的产生已经克服了鼠源抗体的免疫原性，并且取得了相当大的成就，目前已经能够有很多上市的人源化抗体被应用于治疗。人源化抗体是通过将互补决定区(complementarity determining regions，CDRs)进行移植得到的，主要就是将鼠源的CDR区替换到人抗体可变区的骨架上。虽然CDR移植保留了识别抗原的能力，但是这种识别抗原的亲和力经常都是降低的。这种现象可能是因为鼠源CDR移植到人抗体骨架上使得鼠源CDR构象发生了改变。
因此，本领域亟待开发对鼠源的TCR进行人源化改造的方法，从而得到高亲和力、低免疫原性的人源化CDR，用于肿瘤等疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对人抗原pHLA(MAGE-A3)具有较高亲和力的人源化TCR。
本发明的又一目的是提供一种上述类型人源化TCR的制备方法及上述类型人源化TCR的用途。
本发明的第一方面，提供了一种人源化T细胞受体(TCR)，所述人源化TCR具有结合人抗原pHLA(MAGE-A3)的活性，并且所述T细胞受体包含TCRα链可变域和/或TCRβ链可变域，并且所述人源化TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)的亲和力较鼠源TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)的亲和力高。
在另一优选例中，所述人源化TCR具有结合MAGE A3:112–120(KVAELVHFL)与HLA-A*0201的复合物的活性。
在另一优选例中，所述人源化TCR还具有结合MAGE A12：112-120(KMAELVHFL)、MAGE A2：(KMVELVHFL)或MAGE A6：(KVAKLVHFL)与HLA-A*0201的复合物的活性。
在另一优选例中，所述人源化TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)结合解离常数为鼠源TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)结合解离常数的1.5-3倍。
在另一优选例中，所述TCRα链可变域包含3个CDR区，所述TCRα链可变域的3个CDR区的基准序列如下，
CDR1α：TIYSNPF，SEQ ID NO:5；
CDR2α：SFTDNKR，SEQ ID NO:6；
CDR3α：AFDTNAYKVI，SEQ ID NO:7；
和/或，所述TCRβ链可变域包含3个CDR区，所述TCRβ链可变域的3个CDR区的基准序列如下，
CDR1β：MSHET，SEQ ID NO:8；
CDR2β：SYDVDS，SEQ ID NO:9；
CDR3β：ASSSTNTEVF，SEQ ID NO:10；
其中，上述任一CDR的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留人抗原pHLA(MAGE-A3)结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的Vα和Vβ所构成的衍生TCR能够保留与人抗原pHLA(MAGE-A3)结合的亲和力。
在另一优选例中，所述的衍生TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)结合的亲和力F1与相应非衍生的TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2，较佳地为0.7-1.5，和更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的人源化TCR在人中的免疫原性Z1与非人源化的TCR(如鼠源TCR)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5，较佳地0-0.2，更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
本发明的第二方面，提供了一种人源化T细胞受体(TCR)，其具有结合人抗原pHLA(MAGE-A3)的活性，并且所述T细胞受体包含TCRα链可变域和/或TCRβ链可变域，
所述TCRα链可变域包含3个CDR区，所述TCRα链可变域的3个CDR区的基准序列如下，
CDR1α：TIYSNPF，SEQ ID NO:5；
CDR2α：SFTDNKR，SEQ ID NO:6；
CDR3α：AFDTNAYKVI，SEQ ID NO:7；
和/或，所述TCRβ链可变域包含3个CDR区，所述TCRβ链可变域的3个CDR区的基准序列如下，
CDR1β：MSHET，SEQ ID NO:8；
CDR2β：SYDVDS，SEQ ID NO:9；
CDR3β：ASSSTNTEVF，SEQ ID NO:10；
其中，上述任一CDR的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留人抗原pHLA(MAGE-A3)结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述人源化TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)的亲和力较鼠源TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)的亲和力高。
在另一优选例中，所述人源化TCR与人抗原MAGE-A3结合解离常数为鼠源TCR与人抗原MAGE-A3结合解离常数的1.5-3倍。
在另一优选例中，所述TCRα链可变域的框架区包含3个FR区，所述3个FR区的基准序列如下：
FR1α：GDSVTQTEGLLNVPEGLPVSINCTYQ，SEQ ID NO:21；
FR2α：LFWYRQDPGKSPRLLLK，SEQ ID NO:22；
FR3α：TEHQRFHATLHKSDSSFHLQIERIQPNDSGTYFC，SEQ ID NO:23；
和/或，所述TCRβ链可变域的框架区包含3个FR区，所述3个FR区的基准序列如下：
FR1β：DMKITQTPRYLIVKTGENVTLECGQD，SEQ ID NO:24；
FR2β：MYWYRQDPGQGLQLIYI，SEQ ID NO:25；
FR3β：NSEGDIPKRYRVSRKKREHFSLRIDSVKTSDSALYLC，SEQ ID NO:26；
其中，上述任一FR的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留人抗原pHLA(MAGE-A3)结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述TCRα链可变域的框架区的FR区的序列衍生自TRAV18*01。
在另一优选例中，所述TCRβ链可变域的框架区的FR区的序列衍生自TRBV28*01。
在另一优选例中，上述任一FR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生FR序列，并且使得含有所述衍生FR序列的Vα和Vβ所构成的衍生TCR能够保留与人抗原pHLA(MAGE-A3)结合的亲和力。
在另一优选例中，所述T细胞受体选自下组：
(a)一种T细胞受体，具有SEQ ID NO:1(SRm1a g13t的序列)所示的TCRα链可变域或其变体；
(b)一种T细胞受体，具有SEQ ID NO:2(SRm1b g13t的序列)所示的TCRβ链可变域或其变体；
(c)一种T细胞受体，具有(a)所述T细胞受体的TCRα链可变域和(b)T细胞受体所述的TCRβ链可变域；和
(d)一种T细胞受体，与(a)～(c)中任一项所述的T细胞受体竞争结合人抗原pHLA(MAGE-A3)的人源化T细胞受体。
在另一优选例中，所述TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域为与SEQ ID NO:1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO：2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述TCR在SEQ ID NO：1所示的α链可变域中发生突变，所述突变的氨基酸残基位点包括：L(11)、N(12)、V(13)、P(14)、S(20)、I(21)、R(43)、D(45)、P(46)、G(47)、K(48)、R(75)、D(84)、I(91)、E(92)、R(93)、I(94)、P(96)、N(97)、G(100)、T(101)、F(103)中的一个或多个，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号；和/或所述TCR在SEQ ID NO：2所示的β链可变域中发生突变，所述突变的氨基酸残基位点包括I(4)、T(7)、V(13)，K(14)、T(15)、T(20)、Q(48)、R(75)、R(90)、I(91)、V(94)、S(97)、D(98)、S(99)、A(100)、L(101)、L(103)中的一个或多个，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:2所示的编号。
在另一优选例中，所述可溶性TCR为αβ异质二聚体，其包含TCRα链恒定区和TCRβ链恒定区均为人源的。
在另一优选例中，所述可溶性TCR为αβ异质二聚体，其包含TCRα链TRAV18*01的FR区和TCRβ链TRBV28*01的FR区。
在另一优选例中，所述可溶性TCR为αβ异质二聚体，其包含TCRα链恒定区TRAC*01和TCRβ链恒定区TRBC1*01或TRBC2*01。
在另一优选例中，所述TCR的α链氨基酸序列为SEQ ID NO：17和/或所述TCR的β链氨基酸序列为SEQ ID NO:18。
在另一优选例中，所述TCR是可溶的。
在另一优选例中，所述TCR为单链。
在另一优选例中，所述TCR是由α链可变域与β链可变域通过肽连接序列连接而成。
在另一优选例中，所述TCR包括(a)除跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链；以及(b)除跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链；
并且(a)和(b)各自包含功能性可变结构域,或包含功能性可变结构域和所述TCR链恒定结构域的至少一部分。
在另一优选例中，半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成人工二硫键。
在另一优选例中，在所述TCR中形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：
TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57；
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；
TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；
TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；
TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19；和
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。
在另一优选例中，所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。
在另一优选例中，在所述TCR中形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸；
TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；或
TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。
在另一优选例中，所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。
在另一优选例中，所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物。
在另一优选例中，与所述T细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合。优选地，所述治疗剂为抗-CD3、抗-PDL1、抗-PD1或抗-CD28抗体。
本发明的第三方面，提供了一种多价TCR复合物，包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为本发明的第一方面或本发明的第二方面所述的TCR。
本发明的第四方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明的第一方面或本发明的第二方面中任一所述的TCR的核酸序列或其互补序列。
在另一优选例中，所述核酸分子包含编码TCRα链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO：3。
在另一优选例中，所述的核酸分子包含编码TCRβ链可变域的核苷酸序列SEQ IDNO：4。
在另一优选例中，所述核酸分子包含编码TCRα链的核苷酸序列SEQ ID NO：19和/或包含编码TCRβ链的核苷酸序列SEQ ID NO：20。
本发明的第五方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明的第四方面中所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。
在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。
本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明的第五方面中所述的载体或染色体中整合有外源的本发明的第四方面中所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述细胞为T细胞或干细胞。
本发明的第七方面，提供了一种分离的细胞，所述细胞表达本发明的第一方面或本发明的第二方面中任一项所述的TCR。
本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明的第一方面或本发明的第二方面中任一项所述的TCR、或本发明的第三方面中所述的TCR复合物、或本发明的第七方面中所述的细胞。
本发明的第九方面，提供了本发明的第一方面或本发明的第二方面中任一项所述的T细胞受体、本发明的第三方面中所述的TCR复合物或本发明的第七方面中所述细胞的用途，用于制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。
本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用本发明的第一方面或本发明的第二方面中任一所述的TCR、或本发明的第三方面中所述的TCR复合物、或本发明的第七方面中所述的细胞、或本发明的第八方面中所述的药物组合物。
优选地，所述的疾病为肿瘤。优选地所述肿瘤包括肺癌，乳腺癌，黑色素瘤，肝癌，鳞状细胞癌。
本发明的第十一方面，提供了一种制备本发明的第一方面或本发明的第二方面中任一所述的T细胞受体的方法，包括步骤：
(i)培养本发明的第六方面所述的宿主细胞，从而表达本发明的第一方面或本发明的第二方面中任一所述的T细胞受体；
(ii)分离或纯化出所述的T细胞受体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1稳定性优化的人源化TCR(SRm1g13t)序列。(A)SRm1a:鼠源MAGE-A3 TCR的α链；SRm1a g13t:稳定性优化的人源化MAGE-A3 TCR的α链；TRAV18*01:序列比对后IMGT中最为相似的人的TCR的α链；(B)SRm1b:鼠源MAGE-A3 TCR的β链；SRm1b g13t:稳定性优化的人源化MAGE-A3 TCR的β链；TRBV28*01:序列比对后IMGT中最为相似的人的TCR的β链；蓝色:人源化的位点。
图2SRm1和SRm1g13t的α，β链纯化后的包涵体图。(A)不同TCR表达成包涵体的基因表达构建图，这些序列将克隆到pET-28a载体上。Vα:TCR的α链的可变区，Cα：TCR的α链的恒定区，Vβ：TCR的β链的可变区，Cβ:TCR的β链的恒定区。(B)和(C)SRm1和SRm1g13t的α，β链纯化后的包涵体经过倍比稀释后跑SDS-PAGE图。(B)SRm1的α，β链纯化后的包涵体用尿素分别稀释10，20，40倍后，跑SDS-PAGE图,M:蛋白标记(Protein marker),泳道(Lane)1-3,SRm1的α链包涵体稀释10，20，40倍，泳道(Lane)4-6:SRm1的β链包涵体稀释10，20，40倍。(C)SRm1g13t的α，β链纯化后的包涵体用尿素分别稀释5，10，20，40倍后，跑SDS-PAGE图,M：蛋白标记(Protein marker)；泳道(Lane)1-4，SRm1g13t的α链包涵体稀释40，20，10，5倍，泳道(Lane)5-8：SRm1的β链包涵体稀释40，20，10，5倍。
图3SRm1和SRm1g13t TCR及其配体pHLA。(A)体外复性的SRm1经过分子筛的洗脱图。经过包涵体表达提取后，进行SRm1的体外复性，用AKTA纯化仪首先进行例子交换柱纯化，收集后的样品再次用PBS通过分子筛洗脱。(B)体外复性的SRm1g13t经过分子筛的洗脱图。经过包涵体表达提取后，进行SRm1g13t的体外复性，用AKTA纯化仪首先进行例子交换柱纯化，收集后的样品再次用PBS通过分子筛洗脱。(C)对于TCR配体pHLA复合物的表达纯化，并进行生物素化检测。pHLA体外复性样品最终生物素化后经过分子筛，用PBS洗脱。(D)洗脱后的pHLA收集后并经过浓缩，最终验证其生物素化效果。泳道(Lane)M:蛋白标记(proteinmarker),泳道(Lane)1:链霉亲和素，泳道(Lane)2:pHLA,泳道(Lane)3-5:链霉亲和素和pHLA的摩尔比为：1：1，1：4，1：8。
图4不同TCR与配体pHLA(MAGE-A3)之间的亲和力。(A)SRm1和(B)SRm1g13t TCR的结合识别pHLA(MAGE-A3)是用Biacore SPR分析。CM5 Biacore芯片包被了SA，然后生物素化的pHLA(MAGE-A3)结合到了芯片上，不同浓度的SRm1和SRm1g13t TCR进行结合解离，最后用Biacore T200分析软件来分析结合常数ka，解离常数kd，以及结合解离常数KD。
图5SRm1和SRm1g13t TCR转染CD3+ T细胞后的测定阳性率。(A)SRm1和SRm1g13tTCR的mRNA表达示意图。(B)SRm1和SRm1g13t TCR转染CD3+ T细胞的阳性率。转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞分别用anti-CD3和抗-鼠TCRβ链(anti-mouse TCR Betachain)的抗体进行染色，而后进行流式分析。(C)SRm1和SRm1g13t TCR转染CD3+ T细胞中CD8+ T细胞的比例以及可以结合pHLA四聚体的比例。转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞分别用anti-CD8抗体和pHLA四聚体进行染色，而后进行流式分析。
图6SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞的特异性分析。(A)和(B)转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞与不同靶细胞共同孵育24h，IFN-γ的释放利用ELISpot检测试剂盒进行检测。
图7SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞的杀伤能力对比。转染了SRm1和SRm1g13tTCR的CD3+ T细胞与不同靶细胞共同孵育24h，其中CD3+ T细胞的数目为7500，效靶比为5：1，然后24h后用LDH检测试剂盒进行检测。
图8SRm1和SRm1g13t TCR赋予CD3+ T细胞释放因子的能力。转染SRm1和SRm1g13tTCR的CD3+ T细胞与NCI-H1299-A2细胞过夜共培养，然后这些CD3+ T细胞通过胞内染色检测胞内IFN-γ，IL-2，TNFα的水平，右上角显示了分析CD3阳性的细胞胞内的IFN-γ，IL-2，TNFα的水平。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，选用了针对人抗原MAGE-A3(例如MAGE-A3:112-120(KVAELVHFL，SEQ ID NO：27))的鼠源TCR，基于人源化抗体的原则以及鼠源恒定区的非免疫原性及优点，构建了人源化TCR。这个人源化TCR是将鼠源TCR的CDR区移植到相应人的TCR可变区骨架上。并且考虑到CDR移植后的构象稳定性，本发明人通过计算机模拟结构也引进了点突变来稳定那些重要的接触面。结果表明，针对人抗原MAGE-A3的鼠源TCR可以进行人源化改造，并且经过人源化改造后表现出了更好的亲和力(例如结合常数为改造前的鼠源TCR的2.3倍)。将CD3+ T细胞转入人源化TCR可以保留识别抗原的特异性，并且较鼠源TCR，展示出更高的释放因子IFN-γ，TNFα，IL-2的能力，同时杀伤肿瘤的能力较鼠源TCR没有显著性差异。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外，本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。在此基础上，完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且其意图不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
术语
MHC分子
MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白质，可以是Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子。因此，其对于抗原的呈递具有特异性，不同的个体有不同的MHC，能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。
T细胞受体(T cell receptor,TCR)
T细胞受体(TCR)，是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。
TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95％的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。广义上讲，α和β各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合，其中CDR3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域，可变域由连接的可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到，如TCR分子α链的恒定域序列为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区，胞质区很短。
可以采用国际免疫遗传学信息系统(IMGT)来描述TCR。天然αβ异源二聚TCR具有α链和β链。广义上讲，各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。通过独特的IMGT的TRAJ和TRBJ确定TCR的连接区，通过IMGT的TRAC和TRBC确定TCR的恒定区。
各可变区包含嵌合在框架序列中的3个CDR(互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。在IMGT命名法中，TRAV和TRBV的不同编号分别指代不同Vα类型和Vβ的类型。在IMGT系统中，α链恒定结构域具有以下的符号：TRAC*01，其中“TR”表示T细胞受体基因；“A”表示α链基因；C表示恒定区；“*01”表示等位基因1。β链恒定结构域具有以下的符号：TRBC1*01或TRBC2*01，其中“TR”表示T细胞受体基因；“B”表示β链基因；C表示恒定区；“*01”表示等位基因1。α链的恒定区是唯一确定的，在β链的形式中，存在两个可能的恒定区基因“C1”和“C2”。本领域技术人员通过公开的IMGT数据库可以获得TCRα与β链的恒定区基因序列。
TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定结构域。可变域由连接的可变区和连接区构成。因此，在本申请的说明书和权利要求书中，“TCRα链可变域”指连接的TRAV和TRAJ区，同样地，“TCRβ链可变域”指连接的TRBV和TRBD/TRBJ区。TCRα链可变域的3个CDR分别为CDR1α、CDR2α和CDR3α；TCRβ链可变域的3个CDR分别为CDR1β、CDR2β和CDR3β。本发明TCR可变域的框架序列可以为鼠源的或人源的，优选为人源的。TCR的恒定结构域包含胞内部分、跨膜区和胞外部分。为获得可溶性TCR，以便测定TCR与KVAELVHFL-HLA-A*0201复合物之间的亲和力，本发明TCR优选地不包含跨膜区。更优选地，本发明TCR的氨基酸序列是指TCR的胞外氨基酸序列。
在本发明地一个较佳地实施方式中，根据本发明的T细胞受体(TCR)，包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域包括CDR1α、CDR2α、和CDR3α。
鼠源TCR
本发明中，鼠源TCR是指来源于鼠的TCR库中的TCR。由于鼠源的TCR库在胸腺发育时没有剔除掉针对人抗原的TCR，因而得到针对于人抗原的TCR是相对容易的。同时由于老鼠的CD8无法有效的和人的HLA的α3有效的结合，因而在HLA转基因老鼠体内找到针对人肿瘤抗原的高亲和力鼠源的TCR是更为简便的。但是鼠源的TCR对于人体而言存在免疫原性，会使人体产生宿主免疫应答，从而产生针对鼠源TCR的抗体，这极有可能会使回输的转入鼠源TCR的T细胞被清除掉。
在本发明中，术语“本发明多肽”、“本发明的TCR”、“本发明的T细胞受体”可互换使用。
天然链间二硫键与人工链间二硫键
在天然TCR的近膜区Cα与Cβ链间存在一组二硫键，本发明中称为“天然链间二硫键”。在本发明中，将人工引入的，位置与天然链间二硫键的位置不同的链间共价二硫键称为“人工链间二硫键”。
为方便描述，本发明中TRAC*01与TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序列的位置编号按从N端到C端依次的顺序进行位置编号，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按从N端到C端依次的顺序第60个氨基酸为P(脯氨酸)，则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Pro60，也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按从N端到C端依次的顺序第61个氨基酸为Q(谷氨酰胺)，则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Gln61，也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸，其他以此类推。本发明中，可变区TRAV与TRBV的氨基酸序列的位置编号，按照IMGT中列出的位置编号。如TRAV中的某个氨基酸，IMGT中列出的位置编号为46，则本发明中将其描述为TRAV第46位氨基酸，其他以此类推。本发明中，其他氨基酸的序列位置编号有特殊说明的，则按特殊说明。
肿瘤
术语“肿瘤”指包括所有类型的癌细胞生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官，不管病理类型或侵染的阶段。肿瘤的实施例非限制性地包括：实体瘤，软组织瘤，和转移性病灶。实体瘤的实施例包括：不同器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤，肺鳞癌和癌症。例如：感染的前列腺，肺，乳房，淋巴，肠胃(例如：结肠)，和生殖泌尿道(例如：肾脏，上皮细胞)，咽头。肺鳞癌包括恶性肿瘤，例如，多数的结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺部的非小细胞癌，小肠癌和食道癌。上述癌症的转移性病变可同样用本发明的方法和组合物来治疗和预防。
发明详述
TCR分子
在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后通过MHC分子携带至细胞表面。T细胞受体能够识别抗原呈递细胞表面的肽-MHC复合物。因此，本发明的第一方面提供了一种能够结合MAGE-A3:112-120(KVAELVHFL)和HLA-A*0201复合物的TCR分子。优选地，所述TCR分子是分离的或纯化的。该TCR的α和β链各具有3个互补决定区(CDR)。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述人源化TCR具有结合MAGE A3:112–120(KVAELVHFL)与HLA-A*0201的复合物的活性。
在本发明的另一个优选地实施方式中，所述人源化TCR还具有结合MAGE A12：112-120(KMAELVHFL)、MAGE A2：(KMVELVHFL)或MAGE A6：(KVAKLVHFL)与HLA-A*0201的复合物的活性。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述TCRα链可变域的3个互补决定区为：
CDR1α：TIYSNPF，SEQ ID NO:5
CDR2α：SFTDNKR，SEQ ID NO:6
CDR3α：AFDTNAYKVI，SEQ ID NO:7
所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为：
CDR1β：MSHET，SEQ ID NO:8
CDR2β：SYDVDS，SEQ ID NO:9
CDR3β：ASSSTNTEVF，SEQ ID NO:10
可以将上述本发明的CDR区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容，本领域技术人员根据本发明公开的CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此，本发明TCR分子是指包含上述α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。本发明TCRα链可变域为与SEQ ID NO:1具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列相同性的氨基酸序列；和/或本发明TCRβ链可变域为与SEQ ID NO：2具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列相同性的氨基酸序列。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述TCRα链可变域的框架区包含3个FR区，所述3个FR区的基准序列如下：
FR1α：GDSVTQTEGLLNVPEGLPVSINCTYQ，SEQ ID NO:21；
FR2α：LFWYRQDPGKSPRLLLK，SEQ ID NO:22；
FR3α：TEHQRFHATLHKSDSSFHLQIERIQPNDSGTYFC，SEQ ID NO:23；
和/或，所述TCRβ链可变域的框架区包含3个FR区，所述3个FR区的基准序列如下：
FR1β：DMKITQTPRYLIVKTGENVTLECGQD，SEQ ID NO:24；
FR2β：MYWYRQDPGQGLQLIYI，SEQ ID NO:25；
FR3β：NSEGDIPKRYRVSRKKREHFSLRIDSVKTSDSALYLC，SEQ ID NO:26；
其中，上述任一FR的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留人抗原pHLA(MAGE-A3)结合亲和力的衍生序列。
优选地本发明TCRα链(SRm1a g13t)可变域的氨基酸序列为SEQ ID NO:1GDSVTQTEGLLNVPEGLPVSINCTYQTIYSNPFLFWYRQDPGKSPRLLLKSFTDNKRTEHQRFHATLHKSDSSFHLQIERIQPNDSGTYFCAFDTNAYKVIFGKGTHLHVLP；
和/或本发明TCRβ链(SRm1b g13t)可变域的氨基酸序列为SEQ ID NO:2DMKITQTPRYLIVKTGENVTLECGQDMSHETMYWYRQDPGQGLQLIYISYDVDSNSEGDIPKRYRVSRKKREHFSLRIDSVKTSDSALYLCASSSTNTEVFFGPGTRLTVV。
在本发明的一个优选例中，本发明的TCR分子是由α与β链构成的异质二聚体。具体地，一方面所述异质二聚TCR分子的α链包含可变域和恒定域，所述α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：6)和CDR3(SEQ ID NO:7)。优选地，所述TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更优选地，所述TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:1。另一方面，所述异质二聚TCR分子的β链包含可变域和恒定域，所述β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO:8)、CDR2(SEQ ID NO：9)和CDR3(SEQID NO:10)。优选地，所述TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:2。更优选地，所述TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
在本发明的一个优选例中，本发明的TCR分子是由α链的部分或全部和/或β链的部分或全部组成的单链TCR分子。有关单链TCR分子的描述可以参考文献Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658。根据文献中所述，本领域技术人员能够容易地构建包含本发明CDRs区的单链TCR分子。具体地，所述单链TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ，优选地按照从N端到C端的顺序连接。
所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：6)和CDR3(SEQ ID NO:7)。优选地，所述单链TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更优选地，所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:1。所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO：8)、CDR2(SEQID NO：9)和CDR3(SEQ ID NO：10)。优选地，所述单链TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQID NO:2。更优选地，所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
在本发明的一个优选例中，本发明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获得人的恒定域氨基酸序列。例如，本发明TCR分子α链的恒定域序列可以为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列可以为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中给出的氨基酸序列的第53位为Arg，在此表示为：TRAC*01外显子1的Arg53，其他以此类推。
优选地，
本发明TCR分子α链的氨基酸序列为SEQ ID NO:17
MGDSVTQTEGLLNVPEGLPVSINCTYQTIYSNPFLFWYRQDPGKSPRLLLKSFTDNKRTEHQRFHATLHKSDSSFHLQIERIQPNDSGTYFCAFDTNAYKVIFGKGTHLHVLPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDT；
和/或β链的氨基酸序列为SEQ ID NO:18
MGDMKITQTPRYLIVKTGENVTLECGQDMSHETMYWYRQDPGQGLQLIYISYDVDSNSEGDIPKRYRVSRKKREHFSLRIDSVKTSDSALYLCASSSTNTEVFFGPGTRLTVVEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD。
天然存在的TCR是一种膜蛋白，通过其跨膜区得以稳定。如同免疫球蛋白(抗体)作为抗原识别分子一样，TCR也可以被开发应用于诊断和治疗，这时需要获得可溶性的TCR分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜区。可溶性TCR有很广泛的用途，它不仅可用于研究TCR与pMHC的相互作用，也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类似地，可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到呈递特异性抗原的细胞，另外，可溶性TCR还可与其他分子(如，抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞，从而使其靶向呈递特定抗原的细胞。本发明也获得了对MAGE-A3抗原短肽具有特异性的可溶性TCR。
为获得可溶性TCR，一方面，本发明TCR可以是在其α和β链恒定域的残基之间引入人工二硫键的TCR。半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域间形成人工链间二硫键。半胱氨酸残基可以取代在天然TCR中合适位点的其他氨基酸残基以形成人工链间二硫键。例如，取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基来形成二硫键。引入半胱氨酸残基以形成二硫键的其他位点还可以是：TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19；或TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。即半胱氨酸残基取代了上述α与β链恒定域中任一组位点。可在本发明TCR恒定域的一个或多个C末端截短最多50个、或最多30个、或最多15个、或最多10个、或最多8个或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸残基来达到缺失天然二硫键的目的，也可通过将形成天然二硫键的半胱氨酸残基突变为另一氨基酸来达到上述目的。
如上所述，本发明的TCR可以包含在其α和β链恒定域的残基间引入的人工二硫键。应注意，恒定域间含或不含上文所述的引入的人工二硫键，本发明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通过存在于TCR中的天然二硫键连接。
为获得可溶性TCR，另一方面，本发明TCR还包括在其疏水芯区域发生突变的TCR，这些疏水芯区域的突变优选为能够使本发明可溶性TCR的稳定性提高的突变，如在公开号为WO2014/206304的专利文献中所述。这样的TCR可在其下列可变域疏水芯位置发生突变：(α和/或β链)可变区氨基酸第11，13，19，21，53，76，89，91，94位，和/或α链J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒数第3,5,7位,和/或β链J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒数第2,4,6位，其中氨基酸序列的位置编号按国际免疫遗传学信息系统(IMGT)中列出的位置编号。本领域技术人员知晓上述国际免疫遗传学信息系统，并可根据该数据库得到不同TCR的氨基酸残基在IMGT中的位置编号。
本发明中疏水芯区域发生突变的TCR可以是由一柔性肽链连接TCR的α与β链的可变域而构成的稳定性可溶单链TCR。应注意，本发明中柔性肽链可以是任何适合连接TCRα与β链可变域的肽链。
基于本发明的目的，本发明TCR是具有至少一个TCRα和/或TCRβ链可变域的部分。它们通常同时包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域。它们可以是αβ异源二聚体或是单链形式或是其他任何能够稳定存在的形式。在过继性免疫治疗中，可将αβ异源二聚TCR的全长链(包含胞质和跨膜结构域)进行转染。本发明TCR可用作将治疗剂递送至抗原呈递细胞的靶向剂或与其他分子结合制备双功能多肽来定向效应细胞，此时TCR优选为可溶形式。
对于稳定性而言，现有技术中公开了在TCR的α与β链恒定域之间引入人工链间二硫键能够获得可溶且稳定的TCR分子，如专利文献PCT/CN2015/093806中所述。因此，本发明TCR可以是在其α和β链恒定域的残基之间引入人工链间二硫键的TCR。半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域间形成人工链间二硫键。半胱氨酸残基可以取代在天然TCR中合适位点的其他氨基酸残基以形成人工链间二硫键。例如，取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57来形成二硫键。引入半胱氨酸残基以形成二硫键的其他位点还可以是：TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19；或TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。即半胱氨酸残基取代了上述α与β链恒定域中任一组位点。可在本发明TCR恒定域的一个或多个C末端截短最多15个、或最多10个、或最多8个或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸残基来达到缺失天然链间二硫键的目的，也可通过将形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基突变为另一氨基酸来达到上述目的。
如上所述，本发明的TCR可以包含在其α和β链恒定域的残基间引入的人工链间二硫键。应注意，恒定域间含或不含上文所述的引入的人工二硫键，本发明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通过存在于TCR中的天然链间二硫键连接。
另外，对于稳定性而言，专利文献PCT/CN2016/077680还公开了在TCR的α链可变区与β链恒定区之间引入人工链间二硫键能够使TCR的稳定性显著提高。因此，本发明的高亲和力TCR的α链可变区与β链恒定区之间还可以含有人工链间二硫键。具体地，在所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。优选地，这样的TCR可以包含(ⅰ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，和(ⅱ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域，α链与β链形成异质二聚体。更优选地，这样的TCR可以包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。
对于稳定性而言，另一方面，本发明TCR还包括在其疏水芯区域发生突变的TCR，这些疏水芯区域的突变优选为能够使本发明TCR的稳定性提高的突变，如在公开号为WO2014/206304的专利文献中所述。这样的TCR可在其下列可变域疏水芯位置发生突变：(α和/或β链)可变区氨基酸第11，13，19，21，53，76，89，91，94位，和/或α链J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒数第3,5,7位,和/或β链J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒数第2,4,6位，其中氨基酸序列的位置编号按国际免疫遗传学信息系统(IMGT)中列出的位置编号。本领域技术人员知晓上述国际免疫遗传学信息系统，并可根据该数据库得到不同TCR的氨基酸残基在IMGT中的位置编号。
更具体地，本发明中疏水芯区域发生突变的TCR可以是由一柔性肽链连接TCR的α与β链的可变域而构成的高稳定性单链TCR。TCR可变区的CDR区决定了其与短肽-HLA复合物之间的亲和力，疏水芯的突变能够使TCR更加稳定，但并不会影响其与短肽-HLA复合物之间的亲和力。应注意，本发明中柔性肽链可以是任何适合连接TCRα与β链可变域的肽链。本发明实施例1中构建的用于筛选高亲和性TCR的模板链即为上述含有疏水芯突变的高稳定性单链TCR。采用稳定性较高的TCR，能够更方便的评估TCR与KVAELVHFL-HLA-A*0201复合物之间的亲和力。
本发明的TCR也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价TCR复合体包含两个、三个、四个或更多个本发明TCR相结合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚结构域来产生四聚体，或多个本发明TCR与另一分子结合而形成的复合物。本发明的TCR复合物可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用于产生具有此类应用的其他多价TCR复合物的中间体。
本发明的TCR可以单独使用，也可与偶联物以共价或其他方式结合，优选以共价方式结合。所述偶联物包括可检测标记物(为诊断目的，其中所述TCR用于检测呈递MAGE-A3:112-120(KVAELVHFL):HLA-A*0201复合物的细胞的存在)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明TCR结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.抗体Fc片段(Mosquera等，2005，免疫学杂志(The Journal Of Immunology)174，4381)；5.抗体scFv片段(Zhu等，1995，癌症国际期刊(International Journal of Cancer)62,319)；6.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；7.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；8.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；9.纳米磁粒；10.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；11.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
与本发明TCR结合的抗体或其片段包括抗-T细胞或NK-细胞决定抗体，如抗-CD3或抗-CD28或抗-CD16抗体，上述抗体或其片段与TCR的结合能够对效应细胞进行定向来更好地靶向靶细胞。一个优选的实施方式是本发明TCR与抗-CD3抗体或所述抗-CD3抗体的功能片段或变体结合。具体地，本发明的TCR与抗CD3单链抗体的融合分子包括TCRα链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:1和TCRβ链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:2。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示，氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。因此，本发明TCR还包括本发明TCR的至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸(尤其是位于CDR区之外的氨基酸)，被性质相似或相近的氨基酸所替换，并仍能够保持其功能性的TCR。
本发明还包括对本发明TCR略作修饰后的TCR。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：本发明TCR的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在本发明TCR的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的TCR。这种修饰可以通过将TCR暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的TCR。
可通过任何合适的方法测定结合亲和力(与解离平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)。应了解，TCR的亲和力翻倍将导致KD减半。T1/2计算为In2除以解离速率(Koff)。因此，T1/2翻倍会导致Koff减半。优选采用相同的试验方案检测给定TCR的结合亲和力或结合半衰期数次，例如3次或更多，取结果的平均值。在优选的实施方式中，采用本文实施例中的表面等离振子共振(BIAcore)方法进行这些检测。
核酸分子
本发明还涉及编码本发明TCR的核酸分子。本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。举例说明“简并的变异体”的含义，如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白序列，但与SEQ ID NO:3的序列有差别的核酸序列。
本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子，所述部分可以是一个或多个CDR，α和/或β链的可变域，以及α链和/或β链。
编码本发明第一方面TCR分子α链CDR区的核苷酸序列如下：
CDR1α：ACCATTTATTCCAATCCCTTC，SEQ ID NO:11
CDR2α：TCATTTACTGATAATAAACGA，SEQ ID NO:12
CDR3α：GCCTTTGACACCAATGCTTATAAGGTGATC，SEQ ID NO:13
编码本发明第一方面TCR分子β链CDR区的核苷酸序列如下：
CDR1β：ATGTCCCATGAGACC，SEQ ID NO:14
CDR2β：AGCTATGACGTGGATAGC，SEQ ID NO:15
CDR3β：GCAAGTTCAAGCACCAACACAGAGGTGTTC，SEQ ID NO:16
因此，编码本发明TCRα链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19，和/或编码本发明TCRβ链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:20。
优选地，编码TCRα链的核苷酸序列为SEQ ID NO：19
GGCGACTCTGTCACCCAGACAGAGGGACTGCTGAACGTGCCTGAAGGCCTGCCAGTCAGCATCAACTGTACTTACCAGACCATTTATTCCAATCCCTTCCTGTTTTGGTACAGACAGGACCCCGGAAAGAGTCCTAGGCTGCTGCTGAAGTCATTTACTGATAATAAACGAACCGAGCACCAGCGGTTCCATGCTACCCTGCACAAATCTGACAGCTCCTTTCACCTGCAGATCGAACGGATTCAGCCAAACGATAGCGGCACTTACTTCTGCGCCTTTGACACCAATGCTTATAAGGTGATCTTCGGCAAAGGGACACACCTGCATGTCCTGCCCTACATTCAGAACCCAGATCCCGCCGTGTATCAGCTGAGGGACTCAAAGTCTAGTGATAAAAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTTGATTCTCAGACAAATGTCTCCCAGTCTAAGGACAGTGATGTGTATATCACTGACAAATGTGTCCTGGATATGCGCAGCATGGACTTTAAGAGTAACTCAGCCGTGGCTTGGAGTAATAAATCAGACTTCGCATGCGCCAACGCTTTTAACAATTCAATCATTCCTGAGGATACATTCTTTCCTAGCCCAGAATCAAGCTGTGACGTGAAGCTGGTCGAGAAATCTTTCGAAACTGATACCAACCTGAATTTTCAGAACCTGAGCGTGATCGGCTTCCGGATTCTGCTGCTGAAGGTCGCCGGGTTCAATCTGCTGATGACCCTGAGACTGTGGTCCTCT。
优选地，编码TCRβ链的核苷酸序列SEQ ID NO：20
GATATGAAGATCACACAGACTCCTAGGTACCTGATTGTGAAAACAGGGGAGAACGTCACTCTGGAATGCGGACAGGACATGTCCCATGAGACCATGTACTGGTATCGACAGGACCCCGGACAGGGACTGCAGCTGATCTACATTAGCTATGACGTGGATAGCAATTCCGAGGGCGATATCCCCAAGAGGTACCGCGTGTCCAGAAAGAAAAGGGAACACTTCAGCCTGCGGATTGATTCCGTGAAAACCTCTGACAGTGCTCTGTATCTGTGTGCAAGTTCAAGCACCAACACAGAGGTGTTCTTTGGCCCAGGGACAAGACTGACTGTGGTCGAAGACCTGAAGAATGTGTTCCCCCCTGAGGTGGCTGTCTTTGAACCTTCTGAGGCAGAAATCAGTCATACCCAGAAAGCAACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGGTTCTACCCAGATCATGTGGAGCTGTCCTGGTGGGTCAACGGCAAGGAAGTGCACTCTGGGGTCTGTACTGACCCACAGCCCCTGAAAGAGCAGCCCGCCCTGAATGATAGTAGATACGCTCTGTCCTCTCGACTGCGAGTGTCCGCAACCTTCTGGCAGGACCCTCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTATGGCCTGTCTGAGAATGATGAATGGACACAGGACCGCGCTAAGCCCGTGACTCAGATTGTCAGCGCAGAGGCCTGGGGGCGAGCAGATTGTGGATTTACATCAGAAAGCTATCAGCAGGGGGTGCTGAGCGCCACTATCCTGTACGAGATTCTGCTGGGAAAGGCTACCCTGTATGCAGTGCTGGTCAGCGCCCTGGTGCTGATGGCTATGGTCAAGAGGAAAGACTCCCGCGGCTAA。
本发明核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的，该核酸分子可以是RNA或DNA，并且可以包含或不包含内含子。优选地，本发明核酸分子的核苷酸序列不包含内含子但能够编码本发明多肽，例如编码本发明TCRα链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3和/或编码本发明TCRβ链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQID NO:3。更优选地，本发明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。
优选地，编码TCRα链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO：3
GGCGACTCTGTCACCCAGACAGAGGGACTGCTGAACGTGCCTGAAGGCCTGCCAGTCAGCATCAACTGTACTTACCAGACCATTTATTCCAATCCCTTCCTGTTTTGGTACAGACAGGACCCCGGAAAGAGTCCTAGGCTGCTGCTGAAGTCATTTACTGATAATAAACGAACCGAGCACCAGCGGTTCCATGCTACCCTGCACAAATCTGACAGCTCCTTTCACCTGCAGATCGAACGGATTCAGCCAAACGATAGCGGCACTTACTTCTGCGCCTTTGACACCAATGCTTATAAGGTGATCTTCGGCAAAGGGACACACCTGCATGTCCTGCCC。
优选地，编码TCRβ链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO：4
GATATGAAGATCACACAGACTCCTAGGTACCTGATTGTGAAAACAGGGGAGAACGTCACTCTGGAATGCGGACAGGACATGTCCCATGAGACCATGTACTGGTATCGACAGGACCCCGGACAGGGACTGCAGCTGATCTACATTAGCTATGACGTGGATAGCAATTCCGAGGGCGATATCCCCAAGAGGTACCGCGTGTCCAGAAAGAAAAGGGAACACTTCAGCCTGCGGATTGATTCCGTGAAAACCTCTGACAGTGCTCTGTATCTGTGTGCAAGTTCAAGCACCAACACAGAGGTGTTCTTTGGCCCAGGGACAAGACTGACTGTGGTC。
核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的，可以根据细胞的类型，改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。
载体
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体，包括表达载体，即能够在体内或体外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。
优选地，载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中，例如T细胞中，使得该细胞表达MAGE-A3抗原特异性的TCR。理想的情况下，该载体应当能够在T细胞中持续高水平地表达。
细胞
本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞中含有本发明的载体或染色体中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自：原核细胞和真核细胞，例如大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞等。
另外，本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞，特别是T细胞。该T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞，或者可以是从受试者中分离的混合细胞群，诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。如，该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC)，可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群中。一般地，该细胞可以用抗体(如，抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化，以便使它们能够更容易接受转染，例如用包含编码本发明TCR分子的核苷酸序列的载体进行转染。
备选地，本发明的细胞还可以是或衍生自干细胞，如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞表面不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时，CD3分子的表达将启动在胸腺细胞的表面表达该引入的TCR分子。
本发明还包括表达本发明TCR的分离细胞，特别是T细胞。有许多方法适合于用编码本发明的高亲和力TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表达本发明高亲和性TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如，Rosenberg等.，(2008)NatRev Cancer8(4)：299-308)。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有药学上可接受的载体以及本发明TCR、或本发明TCR复合物、或呈递本发明TCR的细胞。
本发明的TCR、TCR复合物或本发明TCR转染的T细胞可与药学上可接受的载体一起在药物组合物中提供。本发明的TCR、多价TCR复合物或细胞通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述组合物通常包括药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。其可采用单位剂型提供，通常在密封的容器中提供，可作为试剂盒的一部分提供。此类试剂盒(但非必需)包括使用说明书。其可包括多个所述单位剂型。
此外，本发明的TCR可以单用，也可与其他治疗剂结合或偶联在一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991))中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药，优选为胃肠外包括皮下、肌肉内或静脉内。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有针剂、口服剂等。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明TCR可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明TCR或TCR复合物或呈递本发明TCR的细胞，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定，最终由医师决定合理的用量。
治疗方法
本发明还提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明TCR、或本发明TCR复合物、或呈递本发明TCR的细胞、或本发明的药物组合物。
本发明还涉及在受试者中治疗和/或预防与人MAGE-A3抗原相关疾病的方法，其包括过继性转移MAGE-A3特异性T细胞至该受试者的步骤。该MAGE-A3特异性T细胞可识别MAGE-A3:112-120(KVAELVHFL)和HLA-A*0201的复合物。
本发明的MAGE-A3特异性的T细胞可用于治疗任何呈递人MAGE-A3抗原短肽KVAELVHFL与HLA-A*0201复合物的MAGE-A3相关疾病。包括但不限于非小细胞肺癌，乳腺癌，黑色素瘤，鳞状细胞癌，肝癌。
可以通过分离患有与MAGE-A3抗原相关疾病的病人或志愿者的T细胞，并将本发明的TCR导入上述T细胞中，随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体内来进行治疗。因此，本发明提供了一种治疗MAGE-A3相关疾病的方法，包括将分离的表达本发明TCR的T细胞，优选地，该T细胞来源于病人本身，输入到病人体内。一般地，包括(1)分离病人的T细胞，(2)用本发明核酸分子或能够编码本发明TCR分子的核酸分子体外转导T细胞，(3)将基因工程修饰的T细胞输入到病人体内。分离、转染及回输的细胞的数量可以由医师决定。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明经过人源化后的TCR表现出更好的亲和力，结合解离常数为改造前的鼠源TCR的2.3倍。
(2)本发明来源于小鼠体内的TCR，因而为寻找TCR的来源限制性解决了问题。
(3)本发明制备的人源化TCR不仅表现出更好的亲和力，也维持了本身的特异性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
通用方法
人源化TCR的改造及其功能验证方法
(1)通过序列比对，找到与鼠源TCR序列同源性最高的人的TCR序列；
(2)将鼠源TCR的CDR区移植到人的TCR骨架上；
(3)将鼠源TCR的CDR区移植同时，引入维持CDR移植后构象稳定性的位点；
(4)将CDR移植后的人源化TCR进行体外复性表达，测定其识别抗原的能力与亲和力，与鼠源TCR进行对比；
(5)将鼠源TCR和人源化TCR分别转入CD3+ T细胞，测定其二者表达能力，识别短肽能力，释放因子能力，及杀伤肿瘤细胞能力，从而进行对比。
实施例1
人源化TCR的改造及其细胞功能实验验证详细方法或步骤如下：
一、TCR改造
1、序列比对
经过序列对比将鼠源TCR的CDR区移植到人TCR骨架上，并引入稳定性位点的序列得到SRm1g13t(见图1)。
1.1分别将鼠源TCR的α，β链的V区与IMGT上的人的TCR库中的TRAV和TRBV数据库序列进行序列比对，找到与之最相近的序列，比如本发明找到最相近序列的是TRAV18*01和TRBV28*01(图1-A和图1-B)。
1.2将鼠源TCR的α，β链V区中CDR区(CDR1、CDR2、CDR3)直接移植到对应的TRAV18*01和TRBV28*01的框架区，形成相对应的未经稳定性优化的人源化TCRα，β链的V区，加上相对应的C区形成未经稳定性优化的人源化的TCRα，β链(可命名为SRm1CLa和SRm1CLb)。同时在SRm1CLa和SRm1CLb的基础上进行稳定性优化，通过电脑模拟分析稳定人源化TCR构象的稳定性位点，从而形成稳定性优化的人源化TCRα，β链(SRm1a g13t和SRm1b g13t)的V区(图1)加上相对应的C区形成稳定性优化的人源化的TCRα，β链，而后也需要做体外复性，亲和力测定。
2、体外复性：
2.1合成TCR的α，β链序列(体外复性时用的C区为人C区)，将其克隆到pet28a载体上，转入到BL23(DE3)感受态中，挑取阳性克隆，测序。
2.2接种序列正确的克隆，进行包涵体预表达检测，观察蛋白是否诱导成功表达及可溶性。
2.3将菌液接种至含有含有抗生素Kan的LB培养基中，通过0.5M IPTG诱导4h后离心收菌后进行包涵体纯化。
2.4纯化好的α，β链的包涵体用6M的盐酸胍和15uM在37℃静置40min进行变性，而后将变性好50mg/ml的SRm1a g13t和30mg/ml的SRm1b g13t的refolding buffer(包括100mM Tris-HCl,0.4M L-arginine,5M Urea,2mM EDTA,6.5mM半胱胺和1.87mM胱胺，PH调至8.1)中，放入H2O中在冷库中透析过夜，然后用10mM Tris-HCl透析两次。
2.5复性透析好的样品用阴离子交换柱(QHP)进行梯度洗脱，洗脱液为10mMTris-HCl,pH 8.1/1M NaCl，将洗脱下来的样品在SDS-PAGE上进行目的蛋白鉴定，将目的蛋白用10KD的超滤管浓缩至500ul。
2.6而后经过分子筛，用PBS进行洗脱，洗脱下来的样品在SDS-PAGE上进行目的蛋白鉴定，将目的蛋白用10KD的超滤管浓缩，并且经过BCA定量保存。
3、亲和力鉴定
3.1利用Biacore T200进行亲和力鉴定，包被了链霉亲和素(SA)的CM5芯片捕捉生物素化的pHLA(提前制备)分子，将不同浓度复性好的TCR进行结合解离测试，最终BiacoreT200分析软件进行1：1模拟，计算出亲和力。
二、TCR细胞功能实验验证
1、构建电转载体，制备mRNA
1.1将TCR的α，β链(此处C区序列需要用鼠的C区，因为鼠的C区未被发现免疫原性，并且可以解决内源TCR错配的问题，提高转入TCR的表达)序列经过序列优化，构建到RNA表达载体pGEM-4Z上，提取质粒准备制备mRNA。
1.2利用mMESSAGE mMECHINE试剂盒制备mRNA,跑胶鉴定。
2、电转CD3+ T细胞进行功能实验
2.1分离CD3+ T细胞，利用磁珠(Human T-activation anti-CD3/28的磁珠)按照1：1的比例刺激，在12孔板中培养48-72h,培养基为RPMI-1640+50U/mlIL-2+10％FBS。
2.2刺激好的CD3+ T细胞利用Lonza的电转仪进行电转，继续培养过夜。
2.3第二天用相对应的抗-鼠β链(anti-mouse beta chain)和anti-CD3抗体进行染色，跑流式检测转入TCR的阳性率，同时也可以用anti-CD8抗体和pHLA四聚体进行染色，可以根据四聚体的阳性率观察到亲和力与染上四聚体的关系。
2.4检测完阳性率之后首先验证TCR的特异性和非特异性，利用IFN-γElispot进行验证，对应的特异性细胞是HLA-A0201+/MAGE-A3+细胞:T2负载特异性肽MAGE-A3:112-120(KVAELVHFL)，NCI-H1299-A2，U266B1,对应的非特异性细胞是HLA-A0201+/MAGE-A3-细胞：T2和HLA-A0201-/MAGE-A3+细胞：NCI-H1299。2×103阳性表达转入TCR的CD3+ T细胞和1×104的靶细胞在37℃共孵育24h，而后用Elispot读数仪进行读数。
2.5进行杀伤验证:7500阳性表达转入TCR的CD3+ T细胞和1500靶细胞(U266B1,NCI-H1299,NCI-H1299-A2)在96孔圆底板中进行共孵育，培养条件为5％CO2，37℃。24h后，离心取上清，通过检测上清中的乳酸盐脱氢酶(LDH)，通过公式计算的到杀伤效率。
计算公式：杀伤率＝(实验孔-效应细胞自发孔-靶细胞自发孔)/(靶细胞最大裂解孔-靶细胞自发孔)
2.6进行T细胞释放因子能力实验验证：1×105阳性表达转入TCR的CD3+ T细胞和2×105靶细胞在48孔中在5％CO2，37℃培养过夜，培养基为RPMI-1640+10％FBS。检测前6h加入高尔基阻断剂(Brefeldin A)，6h后，通过染anti-CD3抗体同时分别共染anti-IFN-γ,anti-IL-2,anti-TNFα抗体，从而通过分析CD3阳性细胞中胞内IFN-γ,IL-2,TNFα的阳性率，从而比较TCR赋予T细胞释放因子的能力。
人源化TCR的改造结果及讨论
1.SRm1和SRm1g13t的α，β链包涵体纯化
通过密码子优化后基因合成将所需要的序列(图2-A)通过酶切克隆至pET28a载体上，而后转入BL21(DE3)菌株中，通过IPTG诱导表达。利用BugBuster纯化SRm1和SRm1g13t的α，β链包涵体蛋白，用6M尿素倍比稀释后跑SDS-PAGE鉴定，通过比较包涵体蛋白与杂蛋白的比例，大概估计纯度。如图2-B、图2-C，所示，纯化的SRm1和SRm1g13t的α，β链包涵体纯度较高90％以上，并且大小与预期的α链为22kDa，β链为28kDa相符合。
2.SRm1和SRm1g13t TCR及其配体pHLA体外复性纯化
通过将SRm1和SRm1g13t的α，β链包涵体蛋白变形后体外复性，通过一次阴离子交换柱收集目的样品，而后浓缩至500μl后过分子筛，用PBS进行洗脱，如图3-A和图3-B所示，SRm1和SRm1g13t TCR的洗脱主峰都比较明显且单一。同时为了测定SRm1和SRm1g13t TCR的亲和力，需要制备其配体pHLA分子。将HLA-A*0201和β2m包涵体蛋白变性后与合成抗原肽MAGE-A3:112-120(KVAELVHFL)体外共复性，并通过HLA-A*0201基因C末端融合的BirA生物素连接酶底物肽使之加上生物素标记，通过最后分子筛纯化洗脱目的蛋白，如图3-C所示发现样品洗脱峰比较明显，最后通过图3-D生物素化分析也发现生物素化效率大约在95％左右。
3.SRm1和SRm1g13t TCR亲和力测定
为了分析SRm1和SRm1g13t TCR识别和结合pHLA(MAGE-A3)的能力，利用Biacore来分析测定TCR的亲和力。SRm1和SRm1g13t TCR都表现出了识别结合pHLA(MAGE-A3)的能力，其中SRm1的KD为587.2μM。但是对于人源化抗体而言，人源化抗体经常面临一个人源化之后亲和力减弱的现象，然而对于人源化TCR而言，SRm1g13t的KD达到了238.3μM，表现出了更高的亲和力。很明显，SRm1和SRm1g13t的半衰期差不多，分别为1.8s和1.9s，并且解离常数也差不多，分别为3.8×10-1s-1和3.6×10-1s-1。但是SRm1g13t的结合常数更高为1.5×103M-1s-1，而SRm1只有6.4×102M-1s-1，见图4-A和图4-B。
4.SRm1和SRm1g13t TCR转染CD3+ T细胞后的测定阳性率
为了检测人源化之后的SRm1g13t TCR能否在T细胞表面表达，首先设计SRm1和SRm1g13t TCR的RNA表达载体，如图5-A所示，SRm1和SRm1g13t TCR的α，β链分别构建到pGEM-4Z载体上。而后通过电转，使SRm1和SRm1g13t TCR的α，β链的RNA电转进入CD3+ T细胞，使其表达，通过抗-鼠TCRβ链(anti-MouseTCR beta chain)抗体，可以发现SRm1和SRm1g13t TCR均可在CD3+ T细胞上表达，并且阳性率相当，分别为94.2％和91.8％。同时通过检测pHLA(MAGE-A3)四聚体的结合情况，可以发现SRm1g13t的pHLA(MAGE-A3)四聚体结合的更多有7％，比SRm1的3％更多，这也表明了亲和力会影响pHLA(MAGE-A3)四聚体的结合能力，见图5-B和图5-C。
5.转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞的特异性分析
为了验证转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞的识别细胞特异性，将转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞分别与T2负载特异性短肽，NCI-H1299-A2，U266B1，T2和NCI-H1299共同孵育，检测IFN-γ的释放。如图6-A所示，对于特异性细胞T2负载特异性短肽，NCI-H1299-A2，U266B1，转染了SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞表现出更好的释放IFN-γ能力，而对于非特异性细胞NCI-H1299，转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞均不识别，说明SRm1和SRm1g13t TCR对于HLA-A0201的特异性。同时对于MAGE-A3的阴性细胞，如图6-B所示，可以发现转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞也均不识别T2细胞，说明经人源化之后的TCR依旧保持着较好的特异性。
6.转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞的杀伤能力对比
为了验证转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞二者杀伤肿瘤细胞的能力，将转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞分别与NCI-H1299-A2，U266B1和NCI-H1299共同孵育24h后进行LDH检测验证，如图7所示，可以发现，转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞二者杀伤肿瘤细胞的能力相当，并且对于NCI-H1299都为显示出非特异性的杀伤。
7.转染SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞释放因子的能力
为了验证转染了SRm1和SRm1g13t TCR的赋予CD3+ T细胞释放不同因子的能力，将转染了SRm1和SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞与NCI-H1299-A2共孵育过夜，通过胞内染色的方法对比转染了不同TCR的CD3+ T细胞释放IFN-γ，IL-2，TNFα的能力。如图8所示，转染了SRm1g13t TCR的CD3+ T细胞较SRm1表现出了更强释放IFN-γ，IL-2的能力，几乎是SRm1的两倍，然而对于TNFα而言，SRm1和SRm1g13t TCR赋予CD3+ T细胞释放该因子的能力相当。这些结果表明，SRm1g13t TCR较SRm1赋予了CD3+ T细胞更强释放因子的能力。
讨论关于改造后的TCR的免疫原性的验证
1.非临床免疫原性评价
在非临床研究中评价免疫原性主要为了考察受试TCR的免疫原性强弱和免疫原性对安全性评价可能的影响。在非临床毒理学试验中，检测人源化TCR引起的抗体可以在一定程度上反映该人源化TCR的免疫原性强弱。但动物实验中观察到的免疫反应并不一定代表人源化TCR在人体有同样的免疫反应，尤其是对一些种属间交叉反应极少或种属间免疫反应机制人源化TCR来说，动物的免疫原性资料意义不大。因而选择动物时应该选择毒理作用与人体反应一致的动物，如猴。若无相关种属动物时，应考虑使用表达人源受体的相关转基因动物。检测抗体反应对证实毒性试验的有效性至关重要，因为药物引起的抗体反应会影响药动学、药效学和生物学活性，从而使毒性试验得到的资料不能真实反映受试药物的暴露水平和活性。
2.临床研究和上市后的免疫原性评价
免疫原性检测时人源化TCR临床安全性评价的组成部分，虽然没有明确的数据表明人源化TCR引起的抗体反应会影响药动学，药效和毒性。但是考虑到免疫原性的发生和发生率的不可预见性，人源化TCR在上市一年内应以一定间隔检测药物诱导抗体的变化。
3.免疫原性评价的内容
3.1抗体滴度和抗体的特点
在回输转染了人源化TCR的T细胞前后，分别取血样采用免疫学检测方法，检测是否产生抗体，分析抗体亚型，浓度和相对亲和力。
3.2抗体的中和活性
人源化TCR产生的抗体并不一定具有中和活性，如果在体外实验发现抗体具有中和活性，并且观察到产生的抗体中合理大多数实验动物药理或毒理效应是可以停止回输。
3.3免疫复合物沉积
抗体和抗原结合生成免疫复合物，沉积在器官会引发病例变化，也会对队形反应的原因分析变得困难，可通过棉衣组织化学的方法检测组织总是否有沉积，结合提示器官功能编号的血液生化指标和尿液检查结果，分析免疫复合物沉积是否引起组织病变。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> MAGE-A3人源化T细胞受体
<130> P2017-1923
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Gly Asp Ser Val Thr Gln Thr Glu Gly Leu Leu Asn Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Leu Pro Val Ser Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ile Tyr Ser Asn Pro
20 25 30
Phe Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Leu Lys Ser Phe Thr Asp Asn Lys Arg Thr Glu His Gln Arg Phe His
50 55 60
Ala Thr Leu His Lys Ser Asp Ser Ser Phe His Leu Gln Ile Glu Arg
65 70 75 80
Ile Gln Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Phe Asp Thr Asn
85 90 95
Ala Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His Val Leu Pro
100 105 110
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Asp Met Lys Ile Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Val Lys Thr Gly
1 5 10 15
Glu Asn Val Thr Leu Glu Cys Gly Gln Asp Met Ser His Glu Thr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Gln Leu Ile Tyr Ile
35 40 45
Ser Tyr Asp Val Asp Ser Asn Ser Glu Gly Asp Ile Pro Lys Arg Tyr
50 55 60
Arg Val Ser Arg Lys Lys Arg Glu His Phe Ser Leu Arg Ile Asp Ser
65 70 75 80
Val Lys Thr Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Ser Thr
85 90 95
Asn Thr Glu Val Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Val
100 105 110
<210> 3
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggcgactctg tcacccagac agagggactg ctgaacgtgc ctgaaggcct gccagtcagc 60
atcaactgta cttaccagac catttattcc aatcccttcc tgttttggta cagacaggac 120
cccggaaaga gtcctaggct gctgctgaag tcatttactg ataataaacg aaccgagcac 180
cagcggttcc atgctaccct gcacaaatct gacagctcct ttcacctgca gatcgaacgg 240
attcagccaa acgatagcgg cacttacttc tgcgcctttg acaccaatgc ttataaggtg 300
atcttcggca aagggacaca cctgcatgtc ctgccc 336
<210> 4
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gatatgaaga tcacacagac tcctaggtac ctgattgtga aaacagggga gaacgtcact 60
ctggaatgcg gacaggacat gtcccatgag accatgtact ggtatcgaca ggaccccgga 120
cagggactgc agctgatcta cattagctat gacgtggata gcaattccga gggcgatatc 180
cccaagaggt accgcgtgtc cagaaagaaa agggaacact tcagcctgcg gattgattcc 240
gtgaaaacct ctgacagtgc tctgtatctg tgtgcaagtt caagcaccaa cacagaggtg 300
ttctttggcc cagggacaag actgactgtg gtc 333
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Thr Ile Tyr Ser Asn Pro Phe
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Ser Phe Thr Asp Asn Lys Arg
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Ala Phe Asp Thr Asn Ala Tyr Lys Val Ile
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Met Ser His Glu Thr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Ser Tyr Asp Val Asp Ser
1 5
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Ala Ser Ser Ser Thr Asn Thr Glu Val Phe
1 5 10
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
accatttatt ccaatccctt c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
tcatttactg ataataaacg a 21
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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gcctttgaca ccaatgctta taaggtgatc 30
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
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<400> 14
atgtcccatg agacc 15
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<212> DNA
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<400> 15
agctatgacg tggatagc 18
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
gcaagttcaa gcaccaacac agaggtgttc 30
<210> 17
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Met Gly Asp Ser Val Thr Gln Thr Glu Gly Leu Leu Asn Val Pro Glu
1 5 10 15
Gly Leu Pro Val Ser Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Pro Phe Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Leu Lys Ser Phe Thr Asp Asn Lys Arg Thr Glu His Gln Arg Phe
50 55 60
His Ala Thr Leu His Lys Ser Asp Ser Ser Phe His Leu Gln Ile Glu
65 70 75 80
Arg Ile Gln Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Phe Asp Thr
85 90 95
Asn Ala Tyr Lys Val Ile Phe Gly Lys Gly Thr His Leu His Val Leu
100 105 110
Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr
195
<210> 18
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
Met Gly Asp Met Lys Ile Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Val Lys
1 5 10 15
Thr Gly Glu Asn Val Thr Leu Glu Cys Gly Gln Asp Met Ser His Glu
20 25 30
Thr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Gln Leu Ile
35 40 45
Tyr Ile Ser Tyr Asp Val Asp Ser Asn Ser Glu Gly Asp Ile Pro Lys
50 55 60
Arg Tyr Arg Val Ser Arg Lys Lys Arg Glu His Phe Ser Leu Arg Ile
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Thr Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Asn Thr Glu Val Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val
100 105 110
Val Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
115 120 125
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
130 135 140
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
145 150 155 160
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
165 170 175
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
180 185 190
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg
195 200 205
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Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
225 230 235 240
Arg Ala Asp
<210> 19
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ggcgactctg tcacccagac agagggactg ctgaacgtgc ctgaaggcct gccagtcagc 60
atcaactgta cttaccagac catttattcc aatcccttcc tgttttggta cagacaggac 120
cccggaaaga gtcctaggct gctgctgaag tcatttactg ataataaacg aaccgagcac 180
cagcggttcc atgctaccct gcacaaatct gacagctcct ttcacctgca gatcgaacgg 240
attcagccaa acgatagcgg cacttacttc tgcgcctttg acaccaatgc ttataaggtg 300
atcttcggca aagggacaca cctgcatgtc ctgccctaca ttcagaaccc agatcccgcc 360
gtgtatcagc tgagggactc aaagtctagt gataaaagcg tgtgcctgtt caccgacttt 420
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gggttcaatc tgctgatgac cctgagactg tggtcctct 759
<210> 20
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
gatatgaaga tcacacagac tcctaggtac ctgattgtga aaacagggga gaacgtcact 60
ctggaatgcg gacaggacat gtcccatgag accatgtact ggtatcgaca ggaccccgga 120
cagggactgc agctgatcta cattagctat gacgtggata gcaattccga gggcgatatc 180
cccaagaggt accgcgtgtc cagaaagaaa agggaacact tcagcctgcg gattgattcc 240
gtgaaaacct ctgacagtgc tctgtatctg tgtgcaagtt caagcaccaa cacagaggtg 300
ttctttggcc cagggacaag actgactgtg gtcgaagacc tgaagaatgt gttcccccct 360
gaggtggctg tctttgaacc ttctgaggca gaaatcagtc atacccagaa agcaacactg 420
gtgtgcctgg ccacagggtt ctacccagat catgtggagc tgtcctggtg ggtcaacggc 480
aaggaagtgc actctggggt ctgtactgac ccacagcccc tgaaagagca gcccgccctg 540
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cctcggaacc acttcagatg ccaggtgcag ttttatggcc tgtctgagaa tgatgaatgg 660
acacaggacc gcgctaagcc cgtgactcag attgtcagcg cagaggcctg ggggcgagca 720
gattgtggat ttacatcaga aagctatcag cagggggtgc tgagcgccac tatcctgtac 780
gagattctgc tgggaaaggc taccctgtat gcagtgctgg tcagcgccct ggtgctgatg 840
gctatggtca agaggaaaga ctcccgcggc taa 873
<210> 21
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Gly Asp Ser Val Thr Gln Thr Glu Gly Leu Leu Asn Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Leu Pro Val Ser Ile Asn Cys Thr Tyr Gln
20 25
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Lys
<210> 23
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Thr Glu His Gln Arg Phe His Ala Thr Leu His Lys Ser Asp Ser Ser
1 5 10 15
Phe His Leu Gln Ile Glu Arg Ile Gln Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
20 25 30
Phe Cys
<210> 24
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
Asp Met Lys Ile Thr Gln Thr Pro Arg Tyr Leu Ile Val Lys Thr Gly
1 5 10 15
Glu Asn Val Thr Leu Glu Cys Gly Gln Asp
20 25
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Gln Leu Ile Tyr
1 5 10 15
Ile
<210> 26
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
Asn Ser Glu Gly Asp Ile Pro Lys Arg Tyr Arg Val Ser Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Glu His Phe Ser Leu Arg Ile Asp Ser Val Lys Thr Ser Asp Ser
20 25 30
Ala Leu Tyr Leu Cys
35
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu
1 5

Claims (14)

1.一种人源化T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述人源化TCR具有结合人抗原pHLA(MAGE-A3)的活性，并且所述T细胞受体包含TCRα链可变域和/或TCRβ链可变域，并且所述人源化TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)的亲和力较鼠源TCR与人抗原pHLA(MAGE-A3)的亲和力高。
2.一种人源化T细胞受体(TCR)，其特征在于，其具有结合人抗原pHLA(MAGE-A3)的活性，并且所述T细胞受体包含TCRα链可变域和/或TCRβ链可变域，
所述TCRα链可变域包含3个CDR区，所述TCRα链可变域的3个CDR区的基准序列如下，
CDR1α：TIYSNPF，SEQ ID NO:5；
CDR2α：SFTDNKR，SEQ ID NO:6；
CDR3α：AFDTNAYKVI，SEQ ID NO:7；
和/或，所述TCRβ链可变域包含3个CDR区，所述TCRβ链可变域的3个CDR区的基准序列如下，
CDR1β：MSHET，SEQ ID NO:8；
CDR2β：SYDVDS，SEQ ID NO:9；
CDR3β：ASSSTNTEVF，SEQ ID NO:10；
其中，上述任一CDR的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留人抗原pHLA(MAGE-A3)结合亲和力的衍生序列。
3.如权利要求2所述的人源化T细胞受体，其特征在于，所述TCRα链可变域的框架区包含3个FR区，所述3个FR区的基准序列如下：
FR1α：GDSVTQTEGLLNVPEGLPVSINCTYQ，SEQ ID NO:21；
FR2α：LFWYRQDPGKSPRLLLK，SEQ ID NO:22；
FR3α：TEHQRFHATLHKSDSSFHLQIERIQPNDSGTYFC，SEQ ID NO:23；
和/或，所述TCRβ链可变域的框架区包含3个FR区，所述3个FR区的基准序列如下：
FR1β：DMKITQTPRYLIVKTGENVTLECGQD，SEQ ID NO:24；
FR2β：MYWYRQDPGQGLQLIYI，SEQ ID NO:25；
FR3β：NSEGDIPKRYRVSRKKREHFSLRIDSVKTSDSALYLC，SEQ ID NO:26；
其中，上述任一FR的氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留人抗原pHLA(MAGE-A3)结合亲和力的衍生序列。
4.如权利要求2所述的人源化T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体选自下组：
(a)一种T细胞受体，具有SEQ ID NO:1所示的TCRα链可变域或其变体；
(b)一种T细胞受体，具有SEQ ID NO:2所示的TCRβ链可变域或其变体；
(c)一种T细胞受体，具有(a)所述T细胞受体的TCRα链可变域和(b)T细胞受体所述的TCRβ链可变域；和
(d)一种T细胞受体，与(a)～(c)中任一项所述的T细胞受体竞争结合人抗原pHLA(MAGE-A3)的人源化T细胞受体。
5.如权利要求4所述的人源化T细胞受体，其特征在于，所述TCR在SEQ ID NO：1所示的α链可变域中发生突变，所述突变的氨基酸残基位点包括：L(11)、N(12)、V(13)、P(14)、S(20)、I(21)、R(43)、D(45)、P(46)、G(47)、K(48)、R(75)、D(84)、I(91)、E(92)、R(93)、I(94)、P(96)、N(97)、G(100)、T(101)、F(103)中的一个或多个，其中，氨基酸残基编号采用SEQ IDNO:1所示的编号；和/或所述TCR在SEQ ID NO：2所示的β链可变域中发生突变，所述突变的氨基酸残基位点包括I(4)、T(7)、V(13)，K(14)、T(15)、T(20)、Q(48)、R(75)、R(90)、I(91)、V(94)、S(97)、D(98)、S(99)、A(100)、L(101)、L(103)中的一个或多个，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:2所示的编号。
6.一种多价TCR复合物，其特征在于，包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为权利要求1-5中任一项所述的TCR。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-5中任一所述的TCR的核酸序列或其互补序列。
8.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求7中所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求8中所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求7中所述的核酸分子。
10.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1-5中任一项所述的TCR。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1-5中任一项所述的TCR、或权利要求6中所述的TCR复合物、或权利要求10中所述的细胞。
12.权利要求1-5任一项所述的T细胞受体、权利要求6中所述的TCR复合物或权利要求10中所述细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。
13.一种治疗疾病的方法，其特征在于，包括给需要治疗的对象施用权利要求1-5中任一所述的TCR、或权利要求6中所述的TCR复合物、或权利要求10中所述的细胞、或权利要求11中所述的药物组合物。
14.一种制备权利要求1-5中任一所述的T细胞受体的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)培养权利要求9所述的宿主细胞，从而表达权利要求1-5中任一所述的T细胞受体；
(ii)分离或纯化出所述的T细胞受体。
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