CN110018143B - 检测甲藻细胞凋亡的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测甲藻细胞凋亡的方法。所述检测甲藻细胞凋亡的方法包括步骤有：对甲藻细胞进行凋亡处理；对凋亡处理的甲藻细胞进行浓缩处理；对甲藻细胞浓缩液进行AnnexinV、PI染色处理；对染色甲藻细胞液进行成像流式检测处理；依据AnnexinV/PI散点图计算甲藻细胞的凋亡率。本发明检测甲藻细胞凋亡的方法通过成像流式细胞仪能够有效区分AnnexinV荧光、碘化丙啶荧光、叶绿素自发荧光，从而直接定量测出待测甲藻细胞中发生凋亡的甲藻细胞个数，从而得出细胞早期凋亡率，而且还具有定量可靠，分析准确，结果精度高等优点。

Description

检测甲藻细胞凋亡的方法

技术领域

本发明属于细胞检测技术领域，具体涉及一种检测甲藻细胞凋亡的方法。

背景技术

赤潮是浮游生物大量爆发后引起水体改变颜色的一种有害生态现象，能够引起赤潮发生的种类有300多种，例如赤潮有害甲藻塔玛亚历山大甲藻 (Alexandriumtamarense)它能够释放麻痹性贝毒(paralyticshell fish poisoning，PSP)，贝毒进入环境以后对海洋经济和人类健康构成严重威胁。程序性死亡(Programmed cell death，PCD)是细胞在生长或受到环境胁迫时基因调控的自主有序死亡，为了有效控制赤潮，了解赤潮甲藻细胞凋亡有着显著的意义。

目前应用较多的细胞凋亡检测方法主要有细胞膜磷酰脂丝氨酸(PS)检测，Caspase酶活性检测，原位DNA标记检测法，ROS检测。其中，以细胞膜磷酰脂丝氨酸(PS)检测方法为例，其原理是利用AnnexinV/PI双染来检测细胞凋亡。细胞在凋亡早期的时候，细胞膜内的磷酰脂丝氨酸(PS)会从细胞膜内转移到细胞膜外，使其暴露在细胞膜外表面，而AnnexinV是钙依赖性磷脂结合蛋白，它能与PS进行特异性结合，PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此采用AnnexinV/PI双染的方法可以区分正常细胞、凋亡早期、凋亡晚期与坏死细胞。

流式细胞仪主要应用于医学研究中如细胞活力、细胞鉴定。细胞凋亡和细胞信号转导等方面，利用AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡PS的方法应用广泛。但这一方法应用于检测甲藻类细胞凋亡的时候具有局限性，因为甲藻细胞具有自发荧光，普通流式细胞仪普遍不能区分甲藻细胞自发叶绿素 (Chla)红色荧光与碘化丙啶(PI分子式为C₂₇H₃₄I₂N₄)发出的荧光，而且在使用的同时也无法直观观察到甲藻细胞的外观特征，在分析样品数据的时候难以区分处于不同特征界限的部分甲藻细胞群体，也无法精准定位单个细胞内的荧光信号，从而导致结果准确度不高，而且还存在技术要求高、样品耗用量大的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的所述不足，提供一种检测甲藻细胞凋亡的方法，以解决现有普通流式细胞仪不能区分甲藻细胞自发Chla红色荧光与PI发出的荧光，从而导致细胞凋亡检测结果准确度不高的技术问题。

为了实现所述发明目的，本发明提供了一种检测甲藻细胞凋亡的方法。所述检测甲藻细胞凋亡的方法包括如下步骤：

将待检测甲藻液采用细胞凋亡诱导剂进行细胞凋亡诱导处理；

对经所述细胞凋亡诱导处理处理的所述甲藻液进行离心悬浮处理，甲藻细胞浓缩液；

向所述甲藻细胞浓缩液中添加AnnexinV/FITC并进行孵育处理后，再继续加入碘化丙啶进行染色处理，获得染色甲藻细胞液；

将采用成像流式细胞仪对所述染色甲藻细胞液中的甲藻细胞特征进行分析，生成AnnexinV/PI散点图，根据所述散点图选取细胞群体，然后根据选取的所述细胞群体得出受测甲藻样品中的甲藻细胞凋亡细胞个数，根据所述甲藻细胞凋亡细胞个数计算出甲藻细胞的凋亡率。

与现有技术相比，本发明检测甲藻细胞凋亡的方法利用磷酯酰丝氨酸染料和PI染料对甲藻细胞进行染色，根据甲藻细胞自身特性和细胞凋亡特征，通过成像流式细胞仪能够有效区分AnnexinV荧光、碘化丙啶荧光叶绿素自发荧光，从而直接定量测出待测甲藻细胞中发生凋亡的甲藻细胞个数，从而得出细胞早期凋亡率，而且还具有定量可靠，分析准确，结果精度高等优点。

附图说明

图1为本发明实施例检测甲藻细胞凋亡的方法工艺流程示意图；

图2为本发明实施例1中对照组甲藻细胞在不同时期的AnnexinV/PI散点图；其中，图2A为对照组甲藻细胞在0min时的AnnexinV/PI散点图，图 2B为对照组甲藻细胞在120min时的AnnexinV/PI散点图；

图3为本发明实施例1中实验组甲藻细胞在不同时期的AnnexinV/PI散点图；其中，图3A为实验组甲藻细胞在0min时的AnnexinV/PI散点图，图 3B为实验组甲藻细胞在120min时的AnnexinV/PI散点图；

图4为本发明实施例1中AnnexinV/PI散点图中单个甲藻细胞的图像；

图5为本发明实施例2中对照组甲藻细胞在不同时期的AnnexinV/PI散点图；其中，图5A为对照组甲藻细胞在0min时的AnnexinV/PI散点图，图 5B为对照组甲藻细胞在60min时的AnnexinV/PI散点图；

图6为本发明实施例2中实验组甲藻细胞在不同时期的AnnexinV/PI散点图；其中，图6A为实验组甲藻细胞在0min时的AnnexinV/PI散点图，图 6B为实验组甲藻细胞在60min时的AnnexinV/PI散点图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例中，对下文名词作出如下说明。

磷脂酞丝氨酸:(Phosphatidlserinea,PS)其正常位于细胞膜的内侧，但在细胞调亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin V：是一种分子量为35-36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin V进行荧光素(FITC)标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞调亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide,PI)：是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

本发明实施例提供了一种检测甲藻细胞凋亡的方法。所述检测甲藻细胞凋亡的方法包括如下步骤：

S01.对甲藻细胞进行凋亡处理：将待检测甲藻液采用细胞凋亡诱导剂进行细胞凋亡诱导处理；

S02.对凋亡处理的甲藻细胞进行离心悬浮处理：将经所述细胞凋亡诱导处理的所述甲藻液进行离心悬浮处理，获得甲藻细胞浓缩液；

S03.对甲藻细胞浓缩液进行AnnexinV、PI染色处理：向所述甲藻细胞浓缩液中添加AnnexinV/FITC并进行孵育处理后，再继续加入碘化丙啶进行染色处理，获得染色甲藻细胞液；

S04.对染色甲藻细胞液进行成像流式检测处理：采用成像流式细胞仪对所述染色甲藻细胞液中的甲藻细胞进行流式检测，生成甲藻细胞的体积/纵横比散点图以获取所需的甲藻细胞群体；再根据选取的所述甲藻细胞群体生成 AnnexinV/PI散点图；

S05.依据AnnexinV/PI散点图计算甲藻细胞的凋亡率：依据所述 AnnexinV/PI散点图得出所述待检测甲藻液中的甲藻细胞凋亡细胞个数，依据所述甲藻细胞凋亡细胞个数计算出所述待检测甲藻液中的甲藻细胞凋亡率。

其中，所述步骤S01中，当所述细胞凋亡诱导剂加入所述待检测甲藻液中后，所述细胞凋亡诱导剂会发生作用从而诱导待检测甲藻液中的甲藻细胞发生凋亡。其中，所述细胞凋亡诱导剂可以根据需要选择不同的细胞凋亡诱导剂。如一实施例中，所述细胞凋亡诱导剂可以包括溶甲藻菌、H₂O₂、病毒中的至少一种。其中，所述溶甲藻细菌(6A1)由本课题组分离于深圳大鹏湾东山海域暴发的赤潮海水中。当然，溶甲藻细菌还可以是其他溶藻细菌。当然还可以构件细胞凋亡的环境实现所述甲藻细胞的凋亡，如构建氮饥饿、铁饥饿等实现所述甲藻细胞的凋亡。

另外，选取的所述细胞凋亡诱导剂的种类不同，其加入至所述待检测甲藻液中的量不同，但是一般所述细胞凋亡诱导剂加入至所述待检测甲藻液中的量不超过所述待检测甲藻液体积比的10％。如在一实施例中，所述细胞凋亡诱导剂添加至所述待检测甲藻液中的体积比为1％-10％。

为了检测的准确性，一实施例中，所述待检测甲藻液被分成若干份，将若干份的所述待检测甲藻液分成包括实验组和空白对照组；其中，所述实验组为向所述待检测甲藻液中添加一定量的所述细胞凋亡诱导剂，进一步地，当所述细胞凋亡诱导剂选用所述6A1时，由于6A1含有自身的培养基，如含有高压灭菌的2216E培养基，为了验证所述6A1含培养基对甲藻细胞凋亡的影响，因此，所述实验组为向所述待检测甲藻液中添加一定量的所述6A1，所述空白对照对照组为向所述待检测甲藻液中添加与实验组同等量的所述 6A1培养基(也即是不添加6A1所含的抑制菌，只添加6A1所含的培养基，如高压灭菌的2216E培养基)。

当然所述实验组和空白对照组设置完毕后置于相同条件下进行培养处理。

为了进一步提高检测的准确性，所述实验组和空白对照组每组设置2-4 个平行样，而且每一份所述待检测甲藻液中的甲藻细胞含量控制相同，以保证检测的可对比性。一实施例中，每一份所述待检测甲藻液中的甲藻细胞含量为10⁵-10⁶cells/ml；在具体实施例中，所述待检测甲藻液中的甲藻可以但不仅仅为塔玛亚历山大藻。通过控制待检测甲藻液中的甲藻细胞含量和平行样的数量，以提高检测的准确度。另外，所述待检测甲藻液的培养基可以但不仅仅为高压灭菌的f/2培养基。

所述步骤S02中，对将经所述细胞凋亡诱导处理的所述甲藻液进行离心悬浮处理可以按照如下方法进行：

将经所述细胞凋亡诱导处理的所述甲藻液进行离心处理，收集沉淀的甲藻细胞，然后对沉淀的甲藻细胞进行悬浮处理。用于悬浮处理溶液可以但不仅仅是去离子水按1:3稀释结合缓冲液(AnnexinV/FITC Binding Buffer)。一实施例中，获得所述甲藻细胞浓缩液中的甲藻细胞的浓度可以控制在 10⁵-10⁶cells/ml，具体可以是10⁵cells/ml。

所述步骤S03中，向所述甲藻细胞浓缩液中添加AnnexinV/FITC实现对甲藻细胞进行染色处理，一实施例中，所述AnnexinV/FITC是按照每100μl 所述甲藻细胞浓缩液加入1-5μl所述AnnexinV/FITC的比例添加至所述甲藻细胞浓缩液中，其中，所述甲藻细胞浓缩液中的甲藻细胞浓度为10⁵cells/ml。另外，加入添加AnnexinV/FITC实现对甲藻细胞进行染色孵育处理过程中，所述孵育处理可以在室温避光条件下进行，如孵育5min。

待AnnexinV/FITC对所述甲藻细胞浓缩液进行染色处理完毕后，接着向所述甲藻细胞浓缩液中添加碘化丙啶进行染色处理，一实施例中，所述碘化丙啶是按照每100μl所述甲藻细胞浓缩液加入0.1-0.5μg所述碘化丙啶的比例添加至所述甲藻细胞浓缩液中，其中，所述甲藻细胞浓缩液中的甲藻细胞浓度为10⁵cells/ml。通过控制染料的添加量控制对甲藻细胞染色程度的控制，从而控制甲藻细胞染色效果的调控，从而提高最终甲藻细胞凋亡率检测的准确性。

所述步骤S04中，生成所述甲藻细胞的所述体积/纵横比散点图的方法包括如下步骤：

取步骤S03中所述染色甲藻细胞液并上机所述成像流式细胞仪，再将所述成像流式细胞仪的激光器功率调至功率上限，接着调试所述激光器功率逐步降低直至避免荧光饱和，然后生成所述体积/纵横比散点图。

其中，控制所述成像流式细胞仪的激光器的功率由上限逐步降低直至避免荧光饱和，是为获得清晰高质量的体积/纵横比散点图(Area/Aspect Ratio 散点图)。一实施例中，通过对激光器的功率由上限逐步降低的调节直至避免荧光饱和时的所述激光器功率为4-20MV，此时，生成的所述体积/纵横比散点图的原始最大像素(raw max pixel)＜4096。通过调节所述激光器功率至4-20MV获得清晰高质量的体积/纵横比散点图。其中，荧光饱和是指一般情况下，物质受到激发就会发生荧光，荧光的强度会随着激发强度的增大而增大，但当激发强度大到一定程度时，荧光的强度便开始趋向于一恒定值，而不再因激发强度的增大而增大，这时我们称出现了荧光饱和。

在调节所述成像流式细胞仪的所述激光器功率的基础上，还可以通过降低所述染色甲藻细胞液在所述成像流式细胞仪中进样的流速实现增加仪器对各通道荧光的灵敏度，如进一步实施例中，控制所述染色甲藻细胞液在所述成像流式细胞仪中进样的流速为1μl/min-4μl/min。

因此，在一具体实施例中，当所述待检测甲藻液中的甲藻为甲甲藻时，且根据步骤S04中生成的所述体积/纵横比散点图选取纵横比在0-0.6的甲藻细胞群体。当所述待检测甲藻液中的甲藻为其他时，可以选取根据步骤S04 中生成的所述体积/纵横比散点图中所有的甲藻细胞群体。

一实施例中，根据步骤S04中选取的所述甲藻细胞群体生成所述 AnnexinV/PI散点图的方法包括如下步骤：

利用所述成像流式细胞仪的分析软件对所述甲藻细胞群体做荧光补偿处理后，再生成所述AnnexinV/PI细胞散点图。

其中，利用所述成像流式细胞仪的分析软件对所述甲藻细胞群体做所述荧光补偿的方法包括如下步骤：

获取叶绿素单荧光样本数据生成单荧光样本数据文件，在所述分析软件中选择补偿(Compensation)窗口导入所述单荧光样本数据文件后自动生成补偿矩阵(CompensationMatrix)，调整标红的矩阵(Matrix)数值，通过图像验证以后完成补偿文件，在分析数据的时候导入所述补偿文件实现对所述甲藻细胞群体做荧光补偿。

在具体实施例中，在生成所述AnnexinV/PI细胞散点图中，AnnexinV荧光为第二通道，PI荧光为第四通道，甲藻细胞所含叶绿素自发荧光在第五通道。在生成的所述AnnexinV/PI细胞散点图中，其的横坐标为 Intensity_MC_AnnexinV，纵坐标为Intensity_MC_PI。因此，对所述 AnnexinV/PI细胞散点图通过对其甲藻细胞的图像可以验证将其圈门分成四种亚群，分别为正常活细胞亚群，早期凋亡细胞亚群，晚期凋亡细胞亚群，坏死细胞亚群。

另外，所述步骤S05中的所述成像流式细胞仪可以但不仅仅为

FlowSight，所述分析软件可以是分析软件ideas等。

所述步骤S05中，由于步骤S05生成的所述AnnexinV/PI散点图 AnnexinV荧光、PI荧光和甲藻细胞所含叶绿素自发荧光是分别在不同的第五通道中显示，因此，本检测甲藻细胞凋亡的方法能够有效区分AnnexinV 荧光、碘化丙啶荧光叶绿素自发荧光，从而直接定量测出待测甲藻细胞中发生凋亡的甲藻细胞个数，从而得出细胞早期凋亡率。一实施例中，依据所述甲藻细胞凋亡细胞个数计算出所述待检测甲藻液中的甲藻细胞凋亡率是按照如下公式计算：

所述甲藻细胞凋亡率％＝C_X/C₀×100％

式中的C_X为第x份待检测甲藻液中的凋亡细胞个数；C₀为成像流式细胞仪所收集的第x份待检测甲藻液中总的甲藻细胞个数。

因此，上文所述检测甲藻细胞凋亡的方法利用AnnexinV/FITC和PI染料对甲藻细胞进行染色，根据甲藻细胞自身特性和细胞凋亡特征，通过成像流式细胞仪能够有效区分AnnexinV荧光、碘化丙啶荧光叶绿素自发荧光，从而直接定量测出待测甲藻细胞中发生凋亡的甲藻细胞个数，从而得出细胞早期凋亡率，而且还具有定量可靠，分析准确，结果精度高等优点。有效克服现有AnnexinV/PI双染的方法不能够有效区分甲藻细胞自发Chla红色荧光与PI发出的荧光和无法直观观察到甲藻细胞的外观特征，而导致的难以区分处于不同特征界限的部分甲藻细胞群体和无法精准定位单个细胞内的荧光信号的难题。

现结合具体实例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

本实施例提供了一种检测甲藻细胞凋亡的方法。所述检测甲藻细胞凋亡的方法包括如下步骤：

S11：取4个容量瓶分别加入塔玛亚历山大甲藻液(塔玛亚历山大甲藻液的培养基为2216E培养基)，将所述4个容量瓶分成2组：实验组(2瓶)、空白对照组(2瓶)；并且使实验组、对空白照组的甲藻细胞个数一致；其中，在所述实验组的容量瓶加入体积5％的6A1(其中，6A1含有10⁸cells/ml抑制菌细胞，培养基为2216E培养基)；在所述对照组的容量瓶加入体积5％的6A1 的2216E培养基(也即是在对照组不含6A1的抑制菌细胞)；将实验组和对照组在相同条件下进行上清液诱导120min；

S12：将步骤S11中处理后的各组甲藻细胞1000rpm离心5min，沉淀细胞，吸除上清，再加入约1ml、4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，吸除上清；用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4*结合缓冲液+12ml去离子水)，用1*结合缓冲液重新悬浮细胞，获得所述甲藻细胞浓缩液；

S13：取100μl的所述甲藻细胞浓缩液(甲藻细胞浓度为2×10⁵cells/ml)，加入5μl的AnnexinV/FITC混匀后于室温避光孵育，5min后加入10μl的20ug/ml 的碘化丙啶溶液(PI)，获得染色甲藻细胞液；

S14：取样后立即上机检测，调整激光器功率为4MV，所述染色甲藻细胞液在所述成像流式细胞仪中进样的流速为3μl/min，生成Area/Aspect Ratio 散点图，获取Area在500-2500μm³，Aspect Ratio在0-0.6之间的细胞群体；

S15：利用

FlowSight的分析软件ideas首先对步骤S13中的细胞群体做荧光补偿，其次再生成AnnexinV/PI细胞散点图，图中分析比较得出塔玛亚历山大甲藻细胞凋亡的区域，结果图为AnnexinV/PI散点图；其中，对照组的AnnexinV/PI散点图如图2所示，实验组的AnnexinV/PI散点图如图3所示；

S16：根据从图2和图3中根据所述甲藻细胞凋亡率的计算公式，可以计算得出对照组在0min时早调率为0％，在120min时早凋率为3.21％，实验组在 0min时早凋率为0％，在120min时早凋率为47.59％。

而且由图2和图3中左上角区域Q1为AnnexinV-/PI+，表示坏死细胞；右上角区域Q2为AnnexinV+/PI+，表示晚期凋亡细胞；左下角区域Q3为 AnnexinV-/PI-，表示正常活细胞；右下角区域Q4为AnnexinV+/PI-，表示早期凋亡细胞。进一步对不同状态下的单个甲藻细胞图像，每个细胞有四个图像，分别为BF(明场)、AnnexinV(假绿色)、PI(假橙色)、Chla(假红色)和BF/PI/AnnexinV，具体如图4所示。

实施例2

本实施例提供了一种检测甲藻细胞凋亡的方法。所述检测甲藻细胞凋亡的方法包括如下步骤：

S11：取4个容量瓶分别加入塔玛亚历山大甲藻液(塔玛亚历山大甲藻液的培养基为2216E培养基)，将所述4个容量瓶分成2组：实验组(2瓶)、对照组(2瓶)；并且使实验组、对空白照组的甲藻细胞个数一致；其中，在所述实验组的容量瓶加入体积10％的6A1(其中，6A1含有10⁸cells/ml抑制菌细胞，培养基为2216E培养基)；在所述对照组的容量瓶加入体积10％的6A1 的2216E培养基(也即是在对照组不含6A1的抑制菌细胞)；将实验组和对照组在相同条件下进行上清液诱导60min；

S12：将步骤S11中处理后的各组甲藻细胞1000rpm离心5min，沉淀细胞，吸除上清，再加入约1ml、4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，吸除上清；用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4*结合缓冲液+12ml去离子水)，用1*结合缓冲液重新悬浮细胞，获得所述甲藻细胞浓缩液；

S13：取100μl的所述甲藻细胞浓缩液(甲藻细胞浓度为2×10⁵cells/ml)，加入1μl的AnnexinV/FITC混匀后于室温避光孵育，5min后加入20μl的20ug/ml 的碘化丙啶溶液(PI)，获得染色甲藻细胞液；

S14：取样后立即上机检测，调整激光器功率为4MV，所述染色甲藻细胞液在所述成像流式细胞仪中进样的流速为4μl/min，生成Area/Aspect Ratio 散点图，获取Area在500-2500μm³，Aspect Ratio在0-0.6之间的细胞群体；

S15：利用

FlowSight的分析软件ideas首先对步骤S13中的细胞群体做荧光补偿，其次再生成AnnexinV/PI细胞散点图，图中分析比较得出塔玛亚历山大甲藻细胞凋亡的区域，结果图为AnnexinV/PI散点图；其中，对照组的AnnexinV/PI散点图如图5所示，实验组的AnnexinV/PI散点图如图6所示；

S16：根据从图2和图3中根据上述甲藻细胞凋亡率的计算公式，可以计算得出对照组在0min时早调率为0％，在60min时早凋率为0.37％，实验组在 0min时早凋率为0％，在60min时早凋率为63.6％。

综上各实施例中检测甲藻细胞凋亡的方法可知，本发明实施例提供的检测甲藻细胞凋亡的方法能够有效区分AnnexinV荧光、碘化丙啶荧光叶绿素自发荧光，从而直接定量测出待测甲藻细胞中发生凋亡的甲藻细胞个数，从而得出细胞早期凋亡率，而且还具有定量可靠，分析准确，结果精度高等优点。因此，比传统检测法更加方便快捷准确。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种检测甲藻细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将待检测甲藻液采用细胞凋亡诱导剂进行细胞凋亡诱导处理；

将经所述细胞凋亡诱导处理的所述甲藻液进行离心悬浮处理，获得甲藻细胞浓缩液；

向所述甲藻细胞浓缩液中添加AnnexinV/FITC并进行孵育处理后，再继续加入碘化丙啶进行染色处理，获得染色甲藻细胞液；

采用成像流式细胞仪对所述染色甲藻细胞液中的甲藻细胞进行流式检测，生成甲藻细胞的体积/纵横比散点图，根据所述体积/纵横比散点图选取纵横比在0-0.6的甲藻细胞群体以获取所需的甲藻细胞群体；

获取叶绿素单荧光样本数据生成单荧光样本数据文件，在所述成像流式细胞仪的分析软件中选择补偿窗口导入所述单荧光样本数据文件后自动生成补偿矩阵，调整标红的矩阵数值，通过图像验证以后完成补偿文件，在分析数据的时候导入所述补偿文件实现对所述甲藻细胞群体做荧光补偿，再生成AnnexinV/PI细胞散点图；其中，在生成所述AnnexinV/PI细胞散点图中，AnnexinV荧光为第二通道，PI荧光为第四通道，甲藻细胞所含叶绿素自发荧光在第五通道；

依据所述AnnexinV/PI散点图得出所述待检测甲藻液中的甲藻细胞凋亡细胞个数，依据所述甲藻细胞凋亡细胞个数计算出所述待检测甲藻液中的甲藻细胞凋亡率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：生成所述甲藻细胞的所述体积/纵横比散点图的方法包括如下步骤：

取所述染色甲藻细胞液并上机所述成像流式细胞仪，再将所述成像流式细胞仪的激光器功率调至功率上限，接着调试所述激光器功率逐步降低直至避免荧光饱和，然后生成所述体积/纵横比散点图。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：调试所述激光器功率逐步降低直至避免荧光饱和时的所述激光器功率为4-20 MV；

所述染色甲藻细胞液在所述成像流式细胞仪中进样的流速为1μl/min-4μl/min。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：依据所述甲藻细胞凋亡细胞个数计算出所述待检测甲藻液中的甲藻细胞凋亡率是按照如下公式计算：

所述甲藻细胞凋亡率%=C_X/C₀×100%;

式中的C_X为第x份待检测甲藻液中的凋亡细胞个数；C₀为成像流式细胞仪所收集的第x份待检测甲藻液中总的甲藻细胞个数。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述待检测甲藻液中的甲藻为塔玛亚历山大藻。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述甲藻细胞浓缩液中的甲藻细胞浓度为10⁵-10⁶cells/ml；和/或

所述AnnexinV/FITC是按照每100μl所述甲藻细胞浓缩液加入1-5μl所述AnnexinV/FITC的比例添加至所述甲藻细胞浓缩液中，其中，所述甲藻细胞浓缩液中的甲藻细胞浓度为10⁵-10⁶cells/ml；和/或

所述碘化丙啶是按照每100μl所述甲藻细胞浓缩液加入0.1-0.5μg所述碘化丙啶的比例添加至所述甲藻细胞浓缩液中，其中，所述甲藻细胞浓缩液中的甲藻细胞浓度为10⁵-10⁶cells/ml。

Images