CN110028584B

CN110028584B - 针对egfr蛋白和met蛋白的双特异性抗体

Info

Publication number: CN110028584B
Application number: CN201810032492.0A
Authority: CN
Inventors: 王秀丽; 刁德坤
Original assignee: Beijing Kexin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Kexin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2038-01-12
Also published as: CN110028584A

Abstract

本发明公开了针对EGFR和MET的双特异性抗体。通过糖基化改造使得双特异性抗体含核心岩藻糖糖型比例不高于4.5％，进而提高ADCC活性；通过对Fc段氨基酸序列进行改造，增强双特异性抗体的ADCC活性、或增强与FcRn的亲和力以延长半衰期。由于本发明制备的双特异性抗体制备简单、结构稳定，并具有更好的肿瘤抑制效果，因此具有良好的市场前景。

Description

针对EGFR蛋白和MET蛋白的双特异性抗体

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种双特异性抗体及其制备方法，此外，本发明还涉及该双特异性抗体的应用。

背景技术

自从1986年批准第一个抗体药物以来，抗体类药物已经过30多年的蓬勃发展，由于抗体药物具有高度的靶向性、特异性、专一性等明显优势，治疗领域也从传统的癌症、自身免疫性疾病逐步扩展到抗感染、代谢性疾病以及心血管疾病的诊治方面等，并取得了瞩目的疗效，在其改善患者生存质量的同时，也创造了巨大的经济效益。

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BsAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BsAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BsAb能同时结合肿瘤相关抗原和效应细胞上的靶分子，直接触发效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。目前可通过化学工程、细胞工程以及基因工程等方法制备BsAb。基因工程法构建BsAb的最大优点是可对抗体进行工程化改造，如构建人源化BsAb、小分子BsAb、多价BsAb等。可采用基因工程技术设计、构建双价BsAb，其构建模式包括双特异性微抗体(Bispecific miniantibody)、双链抗体(Diabody)、单链双特异性抗体(Sc-BsAb)等。双价BsAb具有分子量小、肿瘤组织渗透性好、易于构建和表达等优点，但是由于它们对每一个特异性抗原仅有一个结合功能域，对靶分子的亲和力不高，导向效果较差。为提高BsAb地稳定性及治疗潜能，近几年又出现了四价BsAb的构建模式，如二聚化双特异性微抗体(Dimericbispecific miniantibody，DibiMiniantibody)、四价双特异性抗体Tandemdiabody(Tandab)、IgG样双特异性抗体等，它们除具有双特异性的特征外，对每一个靶抗原又是双价的，因而对靶细胞有更高的亲和力及更强的效应功能，在人血清中的稳定性有所增强，在循环中的滞留时间亦明显延长。但由于四价BsAb对效应细胞(T淋巴细胞、NK细胞等)也是以双价结合，临床应用时可引起循环血液中效应细胞表面受体交联，导致效应细胞广泛活化，释放大量细胞因子(如TNFα等)，引起无法接受的毒性反应。过去十几年的动物和临床试验结果表明，有更大临床应用价值的BsAb应具有以下特性，(1)必须能够高选择性及高亲和性地结合肿瘤相关抗原；(2)在循环系统中，BsAb与效应细胞或细胞毒性触发分子应有相对较低的亲和力，从而能够限制全身性效应细胞活化引起的副反应，同时BsAb结合于表达靶抗原的肿瘤细胞时又必须能有效地诱导效应细胞的细胞毒性；(3)BsAb应为人源化的抗体，从而最大限度地减少人抗鼠免疫反应，使重复给药不受限制；(4)BsAb分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保证适当的循环滞留时间。目前采用人IgG1重链第一恒定区(CH1)和κ链恒定区(CL)结构域作为异二聚化结构域构建的二价双特异或三价三特异性抗体，它们对每一个特异性抗原仅有一个结合功能域，对靶分子的亲和力不高，导向效果较差。因此结构更加合理、功能效应更为强大的BsAb仍有待开发。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种结合EGFR和MET的双特异性抗体。

本发明的目的之二在于提供上述双特异性抗体的制备方法。

本发明的目的之三在于提供上述双特异性抗体的的应用。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括特异性结合EGFR蛋白的轻-重链对，和，特异性结合MET蛋白的轻-重链对或融合肽，所述融合肽包括ScFv。

作为本发明的一个具体实施方案，所述双特异性抗体包括一个特异性结合EGFR的轻-重链对，和，一个特异性结合MET的轻-重链对或一个特异性结合MET的融合肽，所述融合肽包括ScFv、具有CH2结构域和CH3结构域的Fc段，CH2结构域位于scFv片段和CH3结构域之间，换句话说，该scFv片段连接于该Fc段的CH2末端，该scFv片段通过Linker该scFv片段连接于该Fc段的CH2末端。

可用于本发明的Fc段是人或人源化的Fc段。在一个具体的方面，该重链的Fc段包含人IgG Fc片段。在某些方面，与野生型的抗体片段比较，重链的Fc段和/或前面所述的融合肽的Fc段可包含一处或多处替换，这些替换之间形成杵-臼结构对。杵-臼构型在本领域中是已知的。参见，例如Ridgway等的“‘Knob-into-holes’engineering of antibody CH3domains for heavy chain heterodimerization,”Protein Engineering9(7):617-21(1996)。

可用于本发明的用于ScFv与Fc连接的Linker包括但不限于以下氨基酸序列：GTCPPCP、DKTHTCPPCP、GGGTHTCPPCP、EKDKTHTCPPCP、EPKSCDKTHTCPPCP、EPKSSDKTHTCPPCP、AAEPKSSDKTHTCPPCP、GAAAEPKSCDKTHTCPPCPAP、VDKTHTCPPCP、GGGGGVDKTHTCPPCP、GGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCP。在本发明的具体实施方案中，所述用于ScFv与Fc连接的的氨基酸序列是DKTHTCPPCP。

可用于本发明的用于ScFv中轻链可变区和重链可变区连接的氨基酸序列包括但不限于以下氨基酸序列：(G4S)n(n＝1～4)、GGGGSGGG、GSTSGGGSGGGSGGGGSS、GSTSGSGKPGSSEGSTKG、VEGGSGGSGGSGGSGGVD、GGGGGG、GGGGGGGG、(EAAAK)n(n＝1～3)。在本发明的具体实施方案中，所述用于ScFv中轻链可变区和重链可变区连接的氨基酸序列是(G4S)3。

在本发明的具体实施方案中，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中的任一个，所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的具体实施方案中，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，当所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示时，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；当所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示序列中的任一个时，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.18所示序列中的任一个；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的具体实施方案中，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，当所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示时，所述特异性结合MET的融合肽中Fc段的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示的序列中CH2加CH3结构域形成的序列。当所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示序列中的任一个时，所述特异性结合MET的融合肽中Fc段的氨基酸序列选自SEQ ID NO.11所示的序列中CH2加CH3结构域形成的序列、SEQ ID NO.16所示的序列中CH2加CH3结构域形成的序列、SEQ ID NO.18所示的序列中CH2加CH3结构域形成的序列、SEQ ID NO.13所示的序列中CH2加CH3结构域形成的序列。

在本发明具体实施例中，双特异性抗体的结构包括：

(1)所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

(2)所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

(3)所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

(4)所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

(5)所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

(6)所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

(7)所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，Linker+Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

作为本发明的可替换的实施方案，所述双特异性抗体包括两个特异性结合EGFR的轻-重链对，以及一个特异性结合MET的融合肽，所述融合肽包括ScFv，所述融合肽通过连接子连接于特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链的C端。

更进一步，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.4或SEQ ID NO.5所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列中的任一个，所述ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述连接子的氨基酸序列选自以下序列中的一个：GGGGS、GGGGSGGGS，GGGGSGGG、GGGGSGGGSGGGGS、GGGGSGGGSGGGGSGGGS、GSTSGGGSGGGSGGGGSS、GSTSGSGKPGSSEGSTKG、VEGGSGGSGGSGGSGGVD、GGGGGGGG、GGGGGG、(EAAAK)n(n＝1～3)。

更进一步，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如下：SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列中的任一个。

更进一步，本发明的以上所述双特异性抗体的结构可以是：

(1)两个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO.10所示；或

(2)当一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQID NO.11所示时，另一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；或

(3)当一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示序列中的任一个时，另一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16、SEQID NO.18所示序列中的任一个。

在本发明的具体实施方案中，所述连接子的氨基酸序列是GGGGSGGGSGGGGS。

在本发明具体实施例中，本发明的上述双特异性抗体的实例为：一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；另一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，另一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的序列如SEQ ID NO.3所示，另一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，另一个所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述融合肽连接于氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示的重链恒定区的C端，所述融合肽和所述重链恒定区形成融合重链恒定区，融合重链恒定区序列如SEQ ID NO.14所示。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种编码前面所述的双特异性抗体的核酸分子，所述核酸分子序列如SEQ ID NO.19-35所示。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括序列如SEQ ID NO.19-35所示的核酸分子。

用于重组载体的载体的类型包括细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的重组载体中的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种包含序列如SEQ ID NO.19-35所示的核酸分子或前面所述的重组载体的宿主细胞。

可用于本发明的合适宿主细胞源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(如Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝脏细胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见，例如，Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。

本发明前面所述的宿主细胞可以经过重组载体转化或转染而获得。宿主细胞在转化或转染含本发明前面所述的核酸分子或重组表达载体后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产抗体。合适的转化和转染方法包括但不限于：用于细菌细胞，如氯化钙法、电穿孔法；用于酵母细胞，如电穿孔法和原生质体融合法；用于哺乳动物细胞等，如质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。

根据本发明的又一个方面，一种前面所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)合成SEQ ID NO.19-35所示的DNA序列并将其连接到质粒载体上构建重组载体；

(2)将步骤(1)获得的重组载体导入宿主细胞中表达；优选地，所述宿主细胞是Fut8基因阅读框发生移码突变的宿主细胞；

(3)纯化，组装。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的双特异性抗体。

本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体和双特异性抗体一起组成药物组合物从而更稳定地发挥疗效，这些药物组合物可以保证本发明公开的双特异性抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的或美国药典或其它普遍认可的药典中列出的用于在动物中，并且更具体地用于人类的情况。药学上可接受的载体通常为无毒的固体，半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或任何类型的制剂助剂。

术语“药学上可接受的载体”是指用于实施治疗的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体(vehicle)。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油类，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油类，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。药物组合物静脉内给药时水是一种优选的载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以被用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖(malt)、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，该组合物也可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苄醇或羟苯甲酸甲酯，抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂如乙二胺四乙酸，和调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖也可以使用。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。该组合物可以配制成栓剂，使用传统的粘合剂和载体如甘油三酯。口服配方可包括标准载体，例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明抗体可以治疗的肿瘤包括但不限于，白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病(包括粒细胞、早幼粒细胞、骨髓单核、单核细胞、红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病(Hodgkin's disease)和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病，和固体肿瘤包括，但不限于，肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、乳头状囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管细胞癌、绒毛膜上皮癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、听神经瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

本发明的抗体包括经过修饰的抗体，即可以将任何类型的分子共价连接至抗体且该共价连接不会阻止抗体结合至抗原表位。例如，但不限于，该抗体可以被修改，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生、蛋白水解裂解、连接到细胞配体或其他蛋白等。众多的化学修饰的任一种均可以通过已知的技术进行，包括，但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。此外，该抗体可以包含一种或多种非经典氨基酸。

本发明的抗体可以结合治疗剂、药物前体、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂或PEG。该抗体可以连接至或融合至治疗剂上，该治疗剂可包括可检测标记物，如放射性标记物、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活性治疗剂或诊断剂、细胞毒性剂，其可为药物或毒素，超声增强剂，非放射性标记物，它们的组合和其他这类本领域已知的成分。

通过将其偶联化学发光化合物，该抗体被可检测地标记。然后，通过检测化学反应过程中产生的发光来确定化学发光物标记的抗原结合多肽的存在。化学发光物标记化合物的例子有鲁米诺、异鲁米诺、热性(theromatic)吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。该抗体也可被荧光发光金属如152Eu，或其他的镧系标记。这些金属可使用以下金属螯合基团连接到抗体上，如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。将多种基团连接至抗体的技术是公知的。

在本发明的具体实施例中，前面所述的本发明的双特异性抗体含核心岩藻糖糖型比例不高于4.5％。

本文中“EGFR”，是由c-erbB原癌基因编码的170kDa的跨膜受体，并且显示固有的酪氨酸激酶活性。还存在EGFR的同种型和变体(例如，可变RNA转录物，截短形式，多态性等)，包括但不限于Swissprot数据库登录号P00533-1，P00533-2，P00533-3，和P00533-4确定的那些。EGFR经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节许多细胞过程，包括但不限于激活控制细胞增殖、分化、细胞存活、程序性细胞死亡、血管发生、有丝分裂发生和转移的信号转导途径。

本文中“MET(间充质-上皮转变因子)”是一种原癌基因，其编码蛋白质MET，(也已知为c-Met；肝细胞生长因子受体HGFR；HGF受体；分散因子受体；SF受体)。MET是胚胎发育和伤口愈合必需的膜受体。肝细胞生长因子(HGF)是MET受体仅有的已知配体。MET被上皮来源的细胞正常表达，而HGF的表达局限于间充质来源的细胞。经HGF刺激，MET诱导数种生物学反应，它们共同产生已知为侵袭性生长的程序。癌症中异常的MET活化与差的预后相关，在此异常活性的MET引发肿瘤生长，形成向肿瘤供应营养素的新血管(血管生成)，以及癌症扩散到其它器官(转移)。MET在许多类型的人恶性肿瘤中下调，所述人恶性肿瘤包括肾癌、肝癌、胃癌、乳腺癌和脑癌。通常，仅有干细胞和祖细胞表达MET，其允许这些细胞侵袭性生长以便在胚胎中产生新组织或在成人中再生受损伤的组织。然而，认为癌症干细胞劫持了正常干细胞表达MET的能力，因此成为癌症持续和扩散到身体中的其它部位的原因.

本文术语“scFv”或“单链可变片段”指免疫球蛋白的重链(V_H)和轻链(V_L)的可变区域的融合蛋白。在某些方面，这些区域用10至约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头可富含甘氨酸以具有柔性，也含有丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，且能将V_H的N-末端连接至V_L的C末端，反过来也一样。该蛋白质保留了原始的免疫球蛋白的特性，只是去除了恒定区并引入了接头。ScFv分子为本领域已知的，且描述于美国专利5,892,019中。

本文术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种∶CH1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。具有CH1结构域、至少一部分的铰链结构域和CH2结构域的多肽。具有CH1结构域和CH3结构域的多肽链。具有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链。或者具有CH1结构域，至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。或者至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。本领域技术的普通技术人员应理解，重链恒定区可能会被修改，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。

本文术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定kappa结构域和恒定lambda结构域中的至少一个。

本文术语“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，它们可通过轻链的CL结构域和CH1结构域之间的二硫键形成二聚体。

本文术语“CH2结构域”包括一部分的重链分子，该部分范围，例如，从抗体的约残基244到残基360，使用常规的编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统；见Kabat等,美国卫生和公共服务部，“Sequences of ProteinsofImmunological Interest”(1983)。CH2结构域是独特的，因为它与另一个结构域配对不紧密。相反，两个N-连接的支链的糖链插入至完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。有文献记载，CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端，并包含约108个残基。

本文术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或防治措施，其中对于受试者进行防止或减慢(减轻)不良的生理变化或疾病，如癌症的发展。有益的或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状，降低疾病的程度、稳定(例如使其不恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病发展，改善或缓和疾病状态，并缓解(无论是部分或全部)，无论可否被检测到。“治疗”也可指与不接受治疗时的预计生存期相比能延长生存期。那些需要治疗的状况包括那些已经具有病症或症状以及那些容易具有病症或症状或那些将对病症或症状进行预防的情况。

抗体特异性指抗体对于抗原特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。根据本发明所述的“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如果抗体具有超过一种的特异性，识别的表位可以与单抗原或一种以上的抗原相关。本发明的抗体特异于两种不同的抗原，即作为第一抗原的EGFR和作为第二抗原的MET。

本文术语“杵(knob)”和臼(hole)，是为了增强抗体的稳定性和治疗能力，对重链进行重组基因改造以促进它们的异二聚化，即，二硫键、盐桥、杵-臼(knobs-into-holes)。通过在两条多肽相互作用的界面处将隆起(杵)引入一个多肽中并将腔体(臼)至引入另一个多肽在体外或在体内指导这两种多肽配对。例如，已经在抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面中引入杵-臼结构(例如，US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人，(1997)ProteinScience 6:781-788)。在并置的位置处产生杵(knob)和臼(hole)的基础在于该杵和臼相互作用将有助于形成异二聚体。

本文术语“EGFR”与“EGFR蛋白”通用。

本文术语“MET”与“MET蛋白”通用。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了针对EGFR和MET的双特异抗体，相比现有技术，本发明的双特异抗体更稳定，更容易质控、具有更好的疗效。

本发明提供的针对EGFR和MET的双特异抗体通过敲除岩藻糖，提高ADCC活性，通过对氨基酸序列进行改造，提高ADCC的同时延长了半衰期。

附图说明

图1显示pcDNA3.1载体质粒图谱；

图2显示本发明的双特异性抗体的ADCC活性分析图；

图3显示本发明的双特异性抗体对肿瘤的抑制作用图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1制备双特异性抗体

1、序列设计

本发明制备的抗体的氨基酸序列组成和编码核酸序列如表1所示。

表1双特异性抗体的氨基酸序列和核酸序列

2、抗体的表达

2.1基因合成及载体构建

分别合成如SEQ ID NO.19-35所示的DNA序列，合成的DNA序列5’端含有Kozak序列(CCCACCATGG)和信号肽(METDTLLLWVLLLWVPGSTG)；且5’端含有EcoRI酶切位点、3’含有HindIII酶切位点。将合成的DNA区段和pcDNA3.1(-)载体质粒(图1)用EcoRI和HindIII限制性酶消化，并进行琼脂糖凝胶电泳并回收相应酶切后的基因片段。然后将纯化的重链和轻链编码DNA区段连接到切胶回收的pcDNA3.1(-)表达载体中，转化到大肠杆菌细胞中，挑选克隆进行DNA测序，测序确认正确的克隆提取相应的质粒。

2.2瞬时转染表达

通过CHO-K1细胞的瞬时转染来表达重组免疫球蛋白变体。将处于对数生长期的CHO-K1细胞以4×10⁵/ml密度接种于摇瓶中，置37℃、5％的CO₂摇床125r/min培养24小时后进行转染。

每100ml的CHO-K1细胞，取5mL的OPTI-MEM加入200μg的质粒(质粒的比例按照表2)，震荡混匀室温孵育5min，得到质粒溶液；另取5mL的OPTI-MEM加入600μg的PEI，震荡混匀室温孵育5min，得到PEI溶液；将质粒和PEI溶液混合，震荡混匀室温孵育20min，将反应混合物滴加入细胞中，置37℃、5％的CO₂摇床125r/min培养，第2、4、6天流加补料，第8天收获上清。以14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤收获包含抗体的细胞培养物上清液，将上清液贮存在-20℃直到纯化。

2.3低岩藻糖修饰的抗体表达

靶向FUT8基因的gRNA的序列，参照美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布的中国仓鼠FUT8的全长基因序列(XM_003501735.2)的编码区，设计了3段gRNA：5’-GGGACCTTATTGTTTTATAT-3’(SEQ ID NO.36)，5’-GTTTTATATAGGTGGTCATT-3’(SEQ IDNO.37)，5’-GTGTACCATGTATTCCTCAA-3’(SEQ ID NO.38)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，之后插入到pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0载体的限制性内切酶BbsI识别的位点中，测序验证后挑取单克隆后培养，提取质粒。将处于对数生长期的CHO-K1细胞以4×10⁵/ml密度接种于摇瓶中，置37℃、5％的CO₂摇床125r/min培养24小时后进行转染。每10ml的CHO-K1细胞，取500μL的OPTI-MEM加入20μg的质粒，震荡混匀室温孵育5min，得到质粒溶液；另取500μL的OPTI-MEM加入60μg的PEI，震荡混匀室温孵育5min，得到PEI溶液；将质粒和PEI溶液混合，震荡混匀室温孵育20min，将反应混合物滴加入细胞中，置37℃、5％的CO₂摇床125r/min培养，24hr后加入嘌呤霉素筛选14天后，获得稳定株细胞。获得的稳定株抽提基因组DNA后，PCR扩增基因片段克隆到T载体并测序，筛选出Fut8基因阅读框发生移码突变的单克隆细胞株，记作CHO-KF。

将处于对数生长期的CHO-KF细胞以4×10⁵/ml密度接种于摇瓶中，置37℃、5％的CO₂摇床125r/min培养24小时后进行转染。每100ml的CHO-KF细胞，取5mL的OPTI-MEM加入200μg的质粒(质粒的比例按照表2)，震荡混匀室温孵育5min，得到质粒溶液；另取5mL的OPTI-MEM加入600μg的PEI，震荡混匀室温孵育5min，得到PEI溶液；将质粒和PEI溶液混合，震荡混匀室温孵育20min，将反应混合物滴加入细胞中，置37℃、5％的CO₂摇床125r/min培养，第2、4、6天流加补料，第8天收获上清。以14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤收获包含抗体的细胞培养物上清液，将上清液贮存在-20℃直到纯化。

表2转染方式

2.4纯化与组装

(1)纯化

培养结束后收获上清，并进行无菌过滤，并上样品至PBS缓冲液(pH7.4)平衡的Protein A亲和层析柱(MabSelect SuRe)柱上,用500mM pH 6.0的磷酸盐缓冲液进一步清洗柱子，之后用pH2.8的柠檬酸缓冲液洗脱，得到抗体或半抗，用pH 8.5的1M Tris将溶液的pH调至5.8，于4℃保存。

(2)组装

按杵臼结构1:1的摩尔比例混合半抗后，将柠檬酸缓冲液的pH调至7.9～8.2，加入适量β-巯基乙醇还原剂还原后，于室温匀速搅拌装配8～12hr，结束后超滤去除还原剂，终止反应。

实施例2双特异性抗体的质谱鉴定

实验方法：

分别取各抗体400μg，加入10μL G7PNGaseF酶切缓冲液、10μL 10％的NP40、2.5μLPNGaseF、补加超纯水，终体积至100μL，混匀后用封口膜包上，置于37℃水浴锅内温浴过夜。将切掉N-糖的抗体样品经C4反向色谱柱脱盐后，AB Sciex公司TripleTOF 5600(AB Sciex)质谱分析，数据由Analyst TF软件分析。

结果：

纯化和组装后抗体经糖苷酶去除N糖基修饰后，经质谱测定的分子量如表3所示，由表3可见经纯化和组装后抗体与理论值相差在仪器误差范围内，表明抗体按照设计表达、纯化、组装成功。

表3质谱分子量测定

实施例3双特异性抗体的纯度测定

(1)分子排阻高效液相色谱

在200mM KH₂PO₄，250mM KCl，pH 6.0的流动相中，柱温25℃，进样量：40μg，流速0.6ml/min，等度运行25min，通过分子排阻高效液相色谱分析双特异性抗体和对照抗体样品的单体纯度和聚体的比例。

(2)十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)

采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)紫外检测方法，在非还原条件下，依据分子量大小，定量测定重组单克隆抗体产品的纯度。取100μg样品，加入0.8M碘乙酰胺水溶液5μl，涡旋混匀后，70℃孵育5分钟，冷却至室温后以每分钟6000转离心1分钟。从样品管中分别取出75μl至样品瓶中，加入毛细管电泳仪立即进行分析，通过十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)分析双特异性抗体和对照抗体样品的单体纯度和半抗的比例。

(3)结果

分子排阻高效液相色谱和十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)测定的经纯化和组装后抗体的纯度见下表4，由表4可见经纯化和组装后抗体纯度都在90％以上。

表4双特异性抗体的纯度测定

实施例4双特异性抗体的N-糖修饰分析

1、N-糖链酶切、回收、标记

抗体糖链酶切：取抗体100μg，加入10μL G7PNGaseF酶切缓冲液、10μL 10％的NP40、1μL PNGaseF、补加超纯水，终体积至100μL，混匀后用封口膜包上，置于37℃水浴锅内温浴过夜。

糖链回收：将酶切好的样品加入-20℃预冷好的300μL无水乙醇，混匀后放如-20℃冰箱，放置30min，抗体蛋白沉淀后12000rpm离心5min，用移液枪小心吸取上清至另一新的0.5mL离心管。将上步得到的糖液放入真空离心浓缩仪中，38℃，浓缩干燥，直至没有液体。

糖链标记：每管加入2-AB标记试剂3μL和还原剂NaBH3CN 2μL(Prozyme)，用枪混匀，放入65℃水浴锅中，衍生反应3小时。

糖链纯化：将衍生好的样品加入100μL乙腈，用枪吹打混匀，放置10min。的HILIC纯化枪头(Thermo)在活化液中用枪吹打，将枪头打空。放入加有乙腈的样品中缓慢匀速吹打5min，使糖链结合至HILIC纯化枪头上，最后将HILIC纯化枪头排空。在200μL95％乙腈中缓慢吹打，排空枪头，将枪头置于30μL的超纯水中缓慢吹打5min，糖链就此被纯化回收至30μL的纯水中。

2、HILIC-UPLC分析

仪器：WATERS Acquity UPLC；色谱柱：WATERS Acquity UPLC BEH Amide1.7μm,2.1*100mm Column；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；检测荧光：λ_ex＝330nm；λ_em＝420nm；进样量：2μL；洗脱梯度如表5所示。

表5洗脱梯度

(3)经纯化和组装后的抗体的N-糖型分析结果如表6所示，由表6可见经CHO-KF细胞表达的抗体含核心岩藻糖糖型比例不高于4.5％。

表6双特异性抗体含核心岩藻糖糖型比例

实施例5双特异性抗体与抗原EGFR或MET的亲和力分析

(1)测定方法

使用表面等离子体共振生物传感器来测量抗体与EGFR和MET抗原的结合动力学和亲合力。除非另有说明，可以从GE公司购买所有试剂和材料，并且可以在25℃下进行测量。亲和力分析通过SPR(Biacore X100)仪器上进行分析，通过氨基偶联的方式在CM5芯片偶联抗人IgG Fc的抗体，将各待测抗体在以10μl/min的流速流入，用偶联于芯片上的抗人IgGFc的抗体捕获待测抗体；分析物(EGFR或MET ECD)梯度稀释后(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM、1.56nM、0.78nM、0.39nM和0nM)，以流速30μl/min的流速流入，待测抗体与分析物(EGFR或MET ECD)结合时间200s，解离时间1500s；整个实验用HBS-EP作为运行缓冲液，芯片用10mM甘氨酸HCl、pH 2.0溶液60秒脉冲进行再生。测定数据拟合成1:1结合模型，来测定结合速率Ka、解离速率Kd和平衡解离常数KD。

(2)结果

经纯化和组装后的抗体与EGFR或MET的结合速率Ka、解离速率Kd和平衡解离常数KD测定结果见表7，可见，各个抗体都具有与EGFR或MET强的亲和力；抗EGFR的序列，突变1或3个可变区位点后，亲和力未见明显变化。

表7双特异性抗体与EGFR或MET的亲和力分析

实施例6双特异性抗体与Fc受体CD16a(FcγRIIIa,176V)亲和力测定(1)测定方法

使用表面等离子体共振生物传感器来测量抗体与Fc受体CD16a(FcγRIIIa,176V)亲合力。

亲和力分析通过SPR(Biacore X100)仪器上进行分析，通过氨基偶联的方式在CM5芯片偶联抗His的抗体，将带有His标签的CD16a(176V)以10μl/min的流速流入，用偶联再芯片上的抗His的抗体捕CD16a(176V)；待测抗体梯度稀释后(720nM、240nM、80nM、26.7nM、8.89nM、2.96nM、0.99nM和0nM)，以流速30μl/min的流速流入，待测抗体与CD16a(176V)结合时间200s，解离时间200s；整个实验用HBS-EP作为运行缓冲液，再生芯片用10mM甘氨酸HCl、pH 2.0溶液60秒脉冲进行再生，用亲和力分析方法以稳态模式拟合图形，并得到亲和力值。

(2)结果

经纯化和组装后的抗体与CD16a(176V)的亲和力KD测定结果见表8，由表8可见，降低核心岩藻糖或DE突变后，抗体与CD16a(176V)的亲和力显著增强。

表8双特异性抗体与CD16a(176V)的亲和力分析

实施例7与FcRn亲和力测定(1)测定方法

使用表面等离子体共振生物传感器来测量抗体与Fc受体FcRn的亲合力。

亲和力分析通过SPR(Biacore X100)仪器上进行分析，通过氨基偶联的方式在CM5芯片偶联抗His的抗体，将带有His标签的FcRn以10μl/min的流速流入，用偶联再芯片上的抗His的抗体捕获FcRn；待测抗体梯度稀释后(720nM、240nM、80nM、26.7nM、8.89nM、2.96nM、0.99nM和0nM)，以流速30μl/min的流速流入，待测抗体与FcRn结合时间200s，解离时间200s；整个实验用HBS-EP作为运行缓冲液，再生芯片用10mM甘氨酸HCl、pH 2.0溶液60秒脉冲进行再生，用亲和力分析方法以稳态模式拟合图形，并得到亲和力值。

(2)结果

经纯化和组装后的抗体与FcRn的亲和力KD测定结果见表9，可见YTE突变显著增强了与FcRn的亲和力。

表9双特异性抗体与FcRn的亲和力分析

实施例8双特异性抗体的ADCC活性分析

(1)步骤：

将胃癌SNU-5(

CRL-5973^TM)靶细胞和效应细胞NK92MI-CD16a以1000rpm离心5min后重悬后，按照效靶比10:1的比例加入96孔板，分别加入梯度稀释的不同浓度的抗体(1×10^-7～-10nM)，于37℃孵育8小时，加入LDH显色液，室温避光放置20分钟，酶标仪检测。

(2)结果

经纯化和组装后的抗体的ADCC测定结果见表10和图2，由表10和图2可见，降低核心岩藻糖或DE突变后，抗体的ADCC活性显著增强。

表10双特异性抗体的ADCC活性分析

实施例9双特异性抗体对肿瘤的治疗作用

利用裸鼠体内抑瘤实验来研究双特异性抗体对肿瘤的治疗作用。

(1)步骤：

采用CR17/SCID小鼠(24～28g)为宿主的肿瘤移植模型。小鼠皮下接种表达人HGF的SNU-5的胃癌细胞(5×10⁶细胞)，待皮下移植瘤体积达到100～300mm³时，按照肿瘤体积随机分组。将空白对照(PBS)、C1+C2、EXM2、EXM4、EXM4-KF、EXM4-DE、EXM4-YTE-KF分别腹腔给药，抗体给药方案为C1+C2(各5mg/kg)，EXM2、EXM4、EXM4-KF、EXM4-DE、EXM4-YTE-KF分别为10mg/kg，每周1次，共4次。每周测2次瘤体积实验结束时颈部脱臼处死动物，并剥离肉眼可见肿瘤，称重记录数据。

(2)结果

结果如图3所示，PBS组小鼠的肿瘤体积迅速增大；C1+C2(各5mg/kg)组肿瘤生长得到一定程度的抑制，但随时间的延长肿瘤逐渐增大；EXM2、EXM4组比C1+C2抑瘤能力强，但肿瘤仍有部分生长；EXM4-KF、EXM4-DE、EXM4-YTE-KF三组中，肿瘤几乎不生长，抑制肿瘤效果最佳。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 北京科昕生物科技有限公司

<120> 针对EGFR蛋白和MET蛋白的双特异性抗体

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Gln Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 19

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 19

gaattcccca ccatggagac cgacaccctg ctgctgtggg tgctgctgct gtgggtgccc 60

ggctccaccg gccaggtgca gctgaagcag tccggccccg gcctggtgca gccctcccag 120

tccctgtcca tcacctgcac cgtgtccggc ttctccctga ccaactacgg cgtgcactgg 180

gtgaggcagt cccccggcaa gggcctggag tggctgggcg tgatctggtc cggcggcaac 240

accgactaca acaccccctt cacctccagg ctgtccatca acaaggacaa ctccaagtcc 300

caggtgttct tcaagatgaa ctccctgcag tccaacgaca ccgccatcta ctactgcgcc 360

agggccctga cctactacga ctacgagttc gcctactggg gccagggcac cctggtgacc 420

gtgtccgccg cctccaccaa gggcccctcc gtgttccccc tggccccctc ctccaagtcc 480

acctccggcg gcaccgccgc cctgggctgc ctggtgaagg actacttccc cgagcccgtg 540

accgtgtcct ggaactccgg cgccctgacc tccggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg 600

cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc gtggtgaccg tgccctcctc ctccctgggc 660

acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagccctcca acaccaaggt ggacaagaag 720

gtggagccca agtcctgcga caagacccac acctgccccc cctgccccgc ccccgagctg 780

ctgggcggcc cctccgtgtt cctgttcccc cccaagccca aggacaccct gatgatctcc 840

aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg gacgtgtccc acgaggaccc cgaggtgaag 900

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag 960

cagtacaact ccacctacag ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 1020

aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgcccgcccc catcgagaag 1080

accatctcca aggccaaggg ccagcccagg gagccccagg tgtacaccct gcccccctcc 1140

agggaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1200

tccgacatcg ccgtggagtg ggagtccaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1260

ccccccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctgtact ccaagctgac cgtggacaag 1320

tccaggtggc agcagggcaa cgtgttctcc tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1380

cactacaccc agaagtccct gtccctgtcc cccggcaagt aaaagctt 1428

<210> 20

<211> 724

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 20

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgacatcc tgctgaccca gtcccccgtg atcctgtccg tgtcccccgg 120

cgagagggtg tccttctcct gcagggcctc ccagtccatc ggcaccaaca tccactggta 180

ccagcagagg accaacggct cccccaggct gctgatcaag tacgcctccg agtccatctc 240

cggcatcccc tccaggttct ccggctccgg ctccggcacc gacttcaccc tgtccatcaa 300

ctccgtggag tccgaggaca tcgccgacta ctactgccag cagaacaaca actggcccac 360

caccttcggc gccggcacca agctggagct gaagaggacc gtggccgccc cctccgtgtt 420

catcttcccc ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtgg tgtgcctgct 480

gaacaacttc taccccaggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc 540

cggcaactcc caggagtccg tgaccgagca ggactccaag gactccacct actccctgtc 600

ctccaccctg accctgtcca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt 660

gacccaccag ggcctgtcct cccccgtgac caagtccttc aacaggggcg agtgctaaaa 720

gctt 724

<210> 21

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 21

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctggtgga gtccggcggc ggcctggtgc agcccggcgg 120

ctccctgagg ctgtcctgcg ccgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggctgcactg 180

ggtgaggcag gcccccggca agggcctgga gtgggtgggc atgatcgacc cctccaactc 240

cgacaccagg ttcaacccca acttcaagga caggttcacc atctccgccg acacctccaa 300

gaacaccgcc tacctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg 360

cgccacctac aggtcctacg tgacccccct ggactactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtcctcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtcctgc gccgtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctggtg tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 22

<211> 763

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 22

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgacaaga cccacacctg ccccccctgc cccgcccccg agctgctggg 120

cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tctccaggac 180

ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccccgagg tgaagttcaa 240

ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccaggg aggagcagta 300

caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg 360

caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc gcccccatcg agaagaccat 420

ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtac accctgcccc cctccaggga 480

ggagatgacc aagaaccagg tgtccctgtg gtgcctggtg aagggcttct acccctccga 540

catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc 600

cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtccag 660

gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta 720

cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtaaaag ctt 763

<210> 23

<211> 742

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 23

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgacatcc agatgaccca gtccccctcc tccctgtccg cctccgtggg 120

cgacagggtg accatcacct gcaagtcctc ccagtccctg ctgtacacct cctcccagaa 180

gaactacctg gcctggtacc agcagaagcc cggcaaggcc cccaagctgc tgatctactg 240

ggcctccacc agggagtccg gcgtgccctc caggttctcc ggctccggct ccggcaccga 300

cttcaccctg accatctcct ccctgcagcc cgaggacttc gccacctact actgccagca 360

gtactacgcc tacccctgga ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca agaggaccgt 420

ggccgccccc tccgtgttca tcttcccccc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc 480

ctccgtggtg tgcctgctga acaacttcta ccccagggag gccaaggtgc agtggaaggt 540

ggacaacgcc ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtg accgagcagg actccaagga 600

ctccacctac tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa 660

ggtgtacgcc tgcgaggtga cccaccaggg cctgtcctcc cccgtgacca agtccttcaa 720

caggggcgag tgctaaaagc tt 742

<210> 24

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 24

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggccaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca 120

gtccctgtcc atcacctgca ccgtgtccgg cttctccctg accaactacg gcgtgcactg 180

ggtgaggcag tcccccggca agggcctgga gtggctgggc gtgatctggt ccggcggcaa 240

caccgactac aacaccccct tcacctccag gctgtccatc aacaaggaca actccaagtc 300

ccaggtgttc ttcaagatga actccctgca gtccaacgac accgccatct actactgcgc 360

cagggccctg acctactacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtccgcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgc ctggtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 25

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 25

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggccaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca 120

gtccctgtcc atcacctgca ccgtgtccgg cttctccctg accaactacg gcgtgcactg 180

ggtgaggcag tcccccggca agggcctgga gtggctgggc gtgatctggt ccggcggcaa 240

caccgactac aacaccccct tcacctccag gctgtccatc aacaaggaca actccaagtc 300

ccaggtgttc ttcaagatga actccctgca gtccaacgac accgccatct actactgcgc 360

cagggccctg acctactacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtccgcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtcctgc gccgtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctggtg tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 26

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 26

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctggtgga gtccggcggc ggcctggtgc agcccggcgg 120

ctccctgagg ctgtcctgcg ccgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggctgcactg 180

ggtgaggcag gcccccggca agggcctgga gtgggtgggc atgatcgacc cctccaactc 240

cgacaccagg ttcaacccca acttcaagga caggttcacc atctccgccg acacctccaa 300

gaacaccgcc tacctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg 360

cgccacctac aggtcctacg tgacccccct ggactactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtcctcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

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ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa 1320

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ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 27

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 27

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggccaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca 120

gtccctgtcc atcacctgca ccgtgtccgg cttctccctg accaactacg gcgtgcactg 180

ggtgaggcag tcccccggca agggcctgga gtggctgggc gtgatctggt ccggcggcaa 240

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cgtgtccgcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtcctgc gccgtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctggtg tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 28

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 28

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca 120

gtccctgtcc atcacctgca ccgtgtccgg cttctccctg accaactacg gcgtgcactg 180

ggtgaggcag tcccccggca agggcctgga gtggctgggc gtgatctggt ccggcggcaa 240

caccgactac aacaccccct tcacctccag gctgtccatc aacaaggaca actccaagtc 300

ccaggtgttc ttcaagatga actccctgca gtcccaggac accgccatct actactgcgc 360

cagggccctg acctactacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtccgcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtcctgc gccgtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctggtg tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 29

<211> 724

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 29

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgacatcc tgctgaccca gtcccccgtg atcctgtccg tgtcccccgg 120

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gctt 724

<210> 30

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 30

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca 120

gtccctgtcc atcacctgca ccgtgtccgg cttctccctg accaactacg gcgtgcactg 180

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cagggccctg acctactacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtccgcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc cccgacgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccgaggagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtcctgc gccgtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctggtg tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 31

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 31

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctggtgga gtccggcggc ggcctggtgc agcccggcgg 120

ctccctgagg ctgtcctgcg ccgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggctgcactg 180

ggtgaggcag gcccccggca agggcctgga gtgggtgggc atgatcgacc cctccaactc 240

cgacaccagg ttcaacccca acttcaagga caggttcacc atctccgccg acacctccaa 300

gaacaccgcc tacctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg 360

cgccacctac aggtcctacg tgacccccct ggactactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtcctcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc cccgacgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccgaggagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgc ctggtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 32

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 32

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca 120

gtccctgtcc atcacctgca ccgtgtccgg cttctccctg accaactacg gcgtgcactg 180

ggtgaggcag tcccccggca agggcctgga gtggctgggc gtgatctggt ccggcggcaa 240

caccgactac aacaccccct tcacctccag gctgtccatc aacaaggaca actccaagtc 300

ccaggtgttc ttcaagatga actccctgca gtcccaggac accgccatct actactgcgc 360

cagggccctg acctactacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtccgcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgtacatcac 840

cagggagccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtcctgc gccgtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctggtg tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 33

<211> 1429

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 33

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctggtgga gtccggcggc ggcctggtgc agcccggcgg 120

ctccctgagg ctgtcctgcg ccgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggctgcactg 180

ggtgaggcag gcccccggca agggcctgga gtgggtgggc atgatcgacc cctccaactc 240

cgacaccagg ttcaacccca acttcaagga caggttcacc atctccgccg acacctccaa 300

gaacaccgcc tacctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg 360

cgccacctac aggtcctacg tgacccccct ggactactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtcctcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgtacatcac 840

cagggagccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgc ctggtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag taaaagctt 1429

<210> 34

<211> 1504

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 34

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctggtgga gtccggcggc ggcctggtgc agcccggcgg 120

ctccctgagg ctgtcctgcg ccgcctccgg ctacaccttc acctcctact ggctgcactg 180

ggtgaggcag gcccccggca agggcctgga gtgggtgggc atgatcgacc cctccaactc 240

cgacaccagg ttcaacccca acttcaagga caggttcacc atctccgccg acacctccaa 300

gaacaccgcc tacctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg 360

cgccacctac aggtcctacg tgacccccct ggactactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtcctcc ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc ggcggcggcg gctccgacat 480

ccagatgacc cagtccccct cctccctgtc cgcctccgtg ggcgacaggg tgaccatcac 540

ctgcaagtcc tcccagtccc tgctgtacac ctcctcccag aagaactacc tggcctggta 600

ccagcagaag cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tgggcctcca ccagggagtc 660

cggcgtgccc tccaggttct ccggctccgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc 720

ctccctgcag cccgaggact tcgccaccta ctactgccag cagtactacg cctacccctg 780

gaccttcggc cagggcacca aggtggagat caaggacaag acccacacct gccccccctg 840

ccccgccccc gagctgctgg gcggcccctc cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga 900

caccctgatg atctccagga cccccgaggt gacctgcgtg gtggtggacg tgtcccacga 960

ggaccccgag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcaca acgccaagac 1020

caagcccagg gaggagcagt acaactccac ctacagggtg gtgtccgtgc tgaccgtgct 1080

gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtgtccaaca aggccctgcc 1140

cgcccccatc gagaagacca tctccaaggc caagggccag cccagggagc cccaggtgta 1200

caccctgccc ccctccaggg aggagatgac caagaaccag gtgtccctgt ggtgcctggt 1260

gaagggcttc tacccctccg acatcgccgt ggagtgggag tccaacggcc agcccgagaa 1320

caactacaag accacccccc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tgtactccaa 1380

gctgaccgtg gacaagtcca ggtggcagca gggcaacgtg ttctcctgct ccgtgatgca 1440

cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc ctgtcccccg gcaagtaaaa 1500

gctt 1504

<210> 35

<211> 2215

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 35

gaattcccca ccaatggaga ccgacaccct gctgctgtgg gtgctgctgc tgtgggtgcc 60

cggctccacc ggcgaggtgc agctgaagca gtccggcccc ggcctggtgc agccctccca 120

gtccctgtcc atcacctgca ccgtgtccgg cttctccctg accaactacg gcgtgcactg 180

ggtgaggcag tcccccggca agggcctgga gtggctgggc gtgatctggt ccggcggcaa 240

caccgactac aacaccccct tcacctccag gctgtccatc aacaaggaca actccaagtc 300

ccaggtgttc ttcaagatga actccctgca gtcccaggac accgccatct actactgcgc 360

cagggccctg acctactacg actacgagtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac 420

cgtgtccgcc gcctccacca agggcccctc cgtgttcccc ctggccccct cctccaagtc 480

cacctccggc ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt 540

gaccgtgtcc tggaactccg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct 600

gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcct cctccctggg 660

cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa 720

ggtggagccc aagtcctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct 780

gctgggcggc ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc 840

caggaccccc gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ccgaggtgaa 900

gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga 960

gcagtacaac tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct 1020

gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa 1080

gaccatctcc aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgcccccctc 1140

cagggaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgc ctggtgaagg gcttctaccc 1200

ctccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac 1260

cccccccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa 1320

gtccaggtgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa 1380

ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag ggcggcggcg gctccggcgg 1440

cggcggctcc ggcggcggcg gctccgaggt gcagctggtg gagtccggcg gcggcctggt 1500

gcagcccggc ggctccctga ggctgtcctg cgccgcctcc ggctacacct tcacctccta 1560

ctggctgcac tgggtgaggc aggcccccgg caagggcctg gagtgggtgg gcatgatcga 1620

cccctccaac tccgacacca ggttcaaccc caacttcaag gacaggttca ccatctccgc 1680

cgacacctcc aagaacaccg cctacctgca gatgaactcc ctgagggccg aggacaccgc 1740

cgtgtactac tgcgccacct acaggtccta cgtgaccccc ctggactact ggggccaggg 1800

caccctggtg accgtgtcct ccggcggcgg cggctccggc ggcggcggct ccggcggcgg 1860

cggctccgac atccagatga cccagtcccc ctcctccctg tccgcctccg tgggcgacag 1920

ggtgaccatc acctgcaagt cctcccagtc cctgctgtac acctcctccc agaagaacta 1980

cctggcctgg taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag ctgctgatct actgggcctc 2040

caccagggag tccggcgtgc cctccaggtt ctccggctcc ggctccggca ccgacttcac 2100

cctgaccatc tcctccctgc agcccgagga cttcgccacc tactactgcc agcagtacta 2160

cgcctacccc tggaccttcg gccagggcac caaggtggag atcaagtaaa agctt 2215

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gggaccttat tgttttatat 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gttttatata ggtggtcatt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gtgtaccatg tattcctcaa 20

Claims

1. 一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括特异性结合EGFR的轻-重链对，和，特异性结合MET的轻-重链对；所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列；所述特异性结合EGFR的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述特异性结合MET的轻-重链对中的重链恒定区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列；所述特异性结合MET的轻-重链对中的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体含核心岩藻糖糖型比例不高于4.5%。

3.编码权利要求1所述的双特异性抗体的核酸分子，所述核酸分子序列如SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.32所示。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求3所述的核酸分子。

5.包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体的宿主细胞。

6.一种权利要求1所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）合成SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示的DNA序列并将其连接到质粒载体上构建重组载体；

（2）将步骤（1）获得的重组载体导入宿主细胞中表达；

（3）纯化，组装。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是Fut8基因阅读框发生移码突变的宿主细胞。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的双特异性抗体。

9.权利要求1所述的双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。