CN110229899B - 用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合。具体地，本发明获得了在结直肠癌血浆中明显异常表达的miRNA，即miR‑224‑5p、miR‑301a‑3p、miR‑145‑5p、miR‑193b‑3p和miR‑1183。本发明通过研究这些血浆miRNA在各期结直肠癌患者、结直肠腺瘤患者及健康人群中的表达差异，发现该血浆miRNA组合能够作为结直肠癌早期诊断或预后判断标记物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，从全球范围看CRC发病率女性排第二位，男性排第三位，总体CRC死亡率排名第二。据估计，2018年将有180万新结直肠癌病例和881,000人死亡，约占癌症病例和死亡人数的1％。到2030年,全球CRC发病率预计将增加60％。2015年中国癌症统计数据表示男性CRC发病率居第五位，女性居第四位，总的发病率及死亡率均位于第五位，消化道肿瘤总体发病率逐年攀升。据文献统计，早期CRC规范治疗后,5年生存期可达90％，但仍有15％～20％的CRC在诊断时就已发现肝转移，其余60％亦在后续的治疗过程中发现复发或转移。CRC治疗的关键在于早筛早诊早治，在CRC在腺瘤阶段筛查出来并及时治疗是提高CRC患者生存率的有效方式。80％的结直肠癌是由腺瘤样息肉演变而来，癌变前有10～15年的良性肿瘤发展阶段，该时间窗为结直肠癌预防和早期诊断提供了有力时机，该特性也让结直肠癌成为为数不多的可以通过早期筛查减低发病率和死亡率的恶性肿瘤。通过结直肠癌筛查识别并切除腺瘤可降低大肠癌的发病率达53％。在这个阶段，手术方法几乎可以达到治愈疾病的效果，把握腺瘤恶变的时间,识别早期病变是结直肠癌诊治的关键第一步。然而，只有约59％的在超过50岁以后才接受结肠镜检查。另外，60％～70％的大肠癌患者被发现时已是Ⅱ期或晚期。与治疗相关的不良反应和不良预后导致CRC容易复发和转移。化疗耐药是晚期CRC治疗的一大障碍，而远处转移和局部复发是CRC患者术后死亡的主要原因。了解与CRC生存率相关的危险因素，有助于筛选易复发和转移的高危患者。肿瘤标志物可用于早期肿瘤患者的筛查，反映患者接受手术、放化疗或生物靶向治疗后的疗效、评估复发及远处转移情况，对于CRC的临床治疗、复发转移、预后评估有重要意义。
目前用于结直肠癌的早期筛查手段有：粪便隐血检测(化学法和免疫法)、结肠镜检查、多靶点粪便检测、问卷风险评估、CT模拟结肠镜、粪便PKM2蛋白检测、血浆ctDNASept99甲基化检测等。粪便隐血检测化学法因敏感性差，采样时要求饮食方面的控制，结果受多因素干扰，Brenner等分析了近4万人筛查人群，对比结肠镜的结果，化学法粪检的漏诊率在进展期腺瘤和结直肠癌中分别高达90％和75％。所以现已不再被建议使用；免疫化学法FIT对结直肠癌筛查的敏感性为79％，特异性为94％。主要以胶体金试纸在筛查时最为广泛应用。实际应用中如能每年常规1次的免疫化学法FIT也能达到筛查目的。但其筛查的不足在于对进展期腺瘤的敏感性低，仅为20％～30％。此外，因粪便的采样问题导致弃检率高。结肠镜检查肠道病变检查最敏感的手段，可以直观整个肠壁情况，除了平坦型病变和罕见的“间期癌”较难发现外，大多息肉病变不易漏诊，总体看无症状的结肠镜下筛查人群病变检出率，在结直肠癌中可达0.5％～1.8％，在进展期腺瘤中高达14.8％，肠道息肉的总体检出率可高于1/3。但是结肠镜检查前需经过严格而痛苦的肠道准备，且技术要求高，创伤风险较高等因素很大程度上阻碍了结肠镜检查成为结直肠肿瘤早期筛查的首选工具，特别于我国医疗资源缺乏的现状来说，结肠镜作为初筛仍需慎重考虑。多靶点粪便检测利用粪便中肿瘤脱落细胞的DNA分子检测结合免疫法FIT，进一步提高了肠癌的筛检敏感性，对进展期腺瘤的筛检敏感性也能增强至54％。美国已经应用于无症状人群结直肠肿瘤早诊筛查，筛查周期推荐为1次/1年或3年。这种方法的主要缺点就是价格较高。问卷风险评估筛查，即是询问并评估高危因素的存在，由浙江大学郑树教授团队提出，2007年被纳入国家卫计委癌症早诊早治的标准方案。这种方法最大优势是简单易行，提高了大众群体的筛查顺应率。但问卷中可评估因子风险影响度偏弱，对进展期结直肠肿瘤的筛查敏感性和特异性也不高。其他用于结直肠肿瘤早诊筛查的手段，因为存在各种缺陷也未被广泛推荐。
综上所述，做到对结直肠癌高危人群的早发现，及时干预，临床上尚缺乏更为精准的预警手段或生物指标。
发明概述
本发明的目的是提供一种用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合。
本发明第一方面，提供了miRNA或其检测试剂的用途，用于制备结直肠癌早期诊断或预后预测的试剂盒，所述miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p或其组合。
在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。
在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p；优选地，所述miRNA还包括miR-1183。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、miR-1183、或其组合作为阳性对照。
在另一优选例中，所述检测试剂盒的检测样本包括血液(血浆)或组织。
在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片、或其组合。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括引物、反义核酸、探针或芯片。
本发明第二方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于目标miRNA，所述目标miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：
互补结合区；和/或
与固相载体相连的连接区。
在另一优选例中，所述目标miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。
在另一优选例中，所述目标miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。
本发明第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有miRNA或其检测试剂，所述miRNA选自下组：miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合；并且，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书中注明所述的试剂盒用于结直肠癌早期诊断或预后预测。
在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。
在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。
在另一优选例中，所述的说明书注明以下内容：
当所测定的样本中miR-224-5p、miR-301a-3p和/或miR-193b-3p的水平与健康样本的水平差异显著，则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。
在另一优选例中，所述的说明书注明以下内容：
当所测定的样本中，与健康样本相比，
miR-224-5p水平显著提高；
miR-301a-3p水平显著降低；和/或
miR-193b-3p水平显著提高；
则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。
在另一优选例中，所述的说明书记载一回归模型，建立logit(P)＝-1.052+86.495×(miR-193b-3p)+30.897×(miR-224-5p)–24.876×(miR-301a-3p),其中miR-193b-3p、miR-224-5p、以及miR-301a-3p的表达水平以miR-30a-5p为内参测得，模型中logit(P)值显示检测样本与健康样本存在显著差异，则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。
在另一优选例中，所述的说明书注明以下内容：
当所测定的样本中miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p和/或miR-1183的水平与健康样本的水平差异显著，则提示该检测样本为结直肠肿瘤高危患者样本。
在另一优选例中，当所测定的样本中，与健康样本相比，
miR-224-5p水平显著提高；
miR-301a-3p水平显著降低；
miR-193b-3p水平显著提高；
miR-145-5p水平显著降低；和/或
miR-1183水平显著降低或提高；
则提示该检测样本为结直肠肿瘤高危患者样本。
在另一优选例中，当所测定的样本中，与结直肠腺瘤样本相比，
miR-224-5p水平显著提高；
miR-301a-3p水平显著降低；
miR-193b-3p水平显著提高；
miR-145-5p水平显著降低；和/或
miR-1183水平显著提高；
则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。
在另一优选例中，所述的说明书记载一回归模型，建立logit(P)＝-2.338+7.166×(miR-145-5p)+173.161×(miR-193b-3p)-27.658×(miR-1183)+46.071×(miR-224-5p)–58.807×(miR-301a-3p),其中miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p以及miR-1183的表达水平以miR-30a-5p为内参测得，模型中logit(P)值显示检测样本与结直肠腺瘤样本存在显著差异，则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。
本发明第四方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：
(i)miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、或其组合，或
(i i)与miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、或miR-193b-3p互补的miRNA，或其组合。
在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p。
在另一优选例中，所述miRNA包括miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。
在另一优选例中，所述miRNA包括miR-375-3p、miR-135b-5p、miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、和miR-1183。
在另一优选例中，所述miRNA选自下组：
(a)SEQIDNO.:1-8任一所示的序列；
(b)与SEQIDNO.:1-8任一所示序列互补的8个互补序列中的任一序列；或
(c)来自(a)或(b)的组合，且来自(a)的序列与来自(b)的互补序列互相不为互补。
本发明第五方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第四方面所述的miRNA。
本发明第六方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第四方面所述的miRNA。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在另一优选例中，所述测定是通过real-timePCR实现。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：各miRNA在60例血浆样本中的表达情况，图中：
(1)*表示P<0.05；**表示P<0.005；***表示P<0.001
(2)柱上标为每组与正常组比较；黑线表示两组比较；灰线表示三组或四组比较
(3)N(20)：正常组20例；Ad(20)：结直肠腺瘤组20例；CRC(20)：结直肠癌组20例；0-Ⅱ(10)：0-Ⅱ期早期癌组10例；Ⅲ-Ⅳ(10)：Ⅲ-Ⅳ期早期癌组10例。
图2各miRNA在158例血浆样本中的表达验证情况，图中:
(1)*表示P<0.05；**表示P<0.005；***表示P<0.001
(2)柱上标为每组与正常组比较；黑线表示两组比较；灰线表示三组或四组比较
(3)N(50)：正常组50例；Ad(50)：结直肠腺瘤组50例；CRC(50)：结直肠癌组50例；0-Ⅱ(28)：0-Ⅱ期早期癌组28例；Ⅲ-Ⅳ(30)：Ⅲ-Ⅳ期早期癌组30例。
图3A:ROC曲线分析血浆miRNA对结直肠癌的诊断潜能。
图3B:ROC曲线分析血浆miRNA对结直肠腺瘤的诊断潜能。
图3C:ROC曲线分析血浆miRNA对结直肠癌和腺瘤的鉴别潜能。
图3D:ROC曲线分析血浆miRNA对结直肠早期癌和晚期癌的鉴别潜能。
图4：两个组合模型的ROC曲线分析。
图5：logit方程和组合的诊断效能，图中：
N为正常，M为结直肠腺瘤，T为结直肠癌。
发明详述
本发明经过广泛而深入的研究，将在结直肠癌血浆样本内异常表达明显且较恒定的miRNA确定为初步研究对象，所述的结直肠癌早期诊断和预后预测标志物的表达水平以30a-5p和30e-5p为内参进行检测，找出了与结直肠癌发病密切相关miRNA。最终获得了在结直肠癌血浆中明显异常表达的miRNA，即miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p和miR-1183。本发明通过研究这些血浆miRNA在各期结直肠癌患者、结直肠腺瘤患者及健康人群中的表达差异，发现该血浆miRNA组合能够作为结直肠癌早期诊断标记物。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明应用实时荧光定量PCR方法共在78例各期CRC患者、70例结直肠腺瘤患者及70例健康志愿者血浆中进行验证，检测上述9个候选靶标的表达水平，观察不同临床特点的血浆样本中的表达谱差异，并分析血浆特异性miRNA组合在结直肠癌早期诊断和预后预测中的价值。经验证后，本发明获得特异性血浆3-miRNA组合，即miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-193b-3p，这组生物标志物组合检测结直肠癌的敏感度为0.655，特异度为0.920，并可产生最大受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve，ROC)的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.856。获得特异性血浆5-miRNA组合，即miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p以及miR-1183，这组生物标志物组合区别结直肠腺瘤和结直肠癌癌的敏感度为0.720，特异度为0.680，并可产生的AUC为0.930。本文中结直肠肿瘤包含良性的直肠腺瘤、和恶性的结直肠癌。结直肠肿瘤的进展过程一般为正常-腺瘤-早期癌-晚期癌因此，血浆miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p以及miR-1183可作为结直肠肿瘤潜在的肿瘤标志物，构建的miRNA组合能够准确区分结直肠癌、结直肠腺瘤和健康对照者，为miRNA作为潜在的结直肠癌早期诊断生物标志物现有的实验室证据进行了新的有效补充。
本发明的目的在于提供一种结直肠癌早期诊断和预后预测标志物，开发相关试剂盒。
本发明所述的结直肠癌早期诊断和预后预测标志物是由多种核酸分子组成，所述的多种核酸分子包含编码血浆miR-375-3p、miR-135b-5p、miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p以及miR-1183的核酸分子；所述的核酸分子在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差异表达。本发明所述的结直肠癌早期诊断和预后预测试剂盒，包括本发明所述的结直肠癌早期诊断和预后预测标志物。
本发明提供至少一个血浆miRNA用于区分结直肠早期病变/结直肠癌患者和健康个体的试剂盒。提供至少一个血浆miRNA用于预测结直肠癌患者转移或复发风险或化疗反应的试剂盒。
本发明将在结直肠癌血浆样本内异常表达明显且较恒定的miRNA确定为初步研究对象，所述的结直肠癌早期诊断和预后预测标志物的表达水平是以miR-30a-5p或miR-30e-5p为内参进行检测，优选miR-30a-5p为内参进行检测。找出了与结直肠癌发病密切相关miRNA。本发明选择了8个可能在结直肠癌血浆中明显异常表达的miRNA，即miR-375-3p、miR-135b-5p、miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p和miR-1183。本发明通过研究这些血浆miRNA在各期结直肠癌患者、结直肠腺瘤患者及健康人群中的表达差异，发现血浆中上述miRNA组合能够作为结直肠癌早期诊断标记物。同时结合其中结直肠癌患者的临床病理资料做临床相关分析，发现此组血浆miRNA与临床分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移、血清CEA表达情况等指标相关，从而发现此组血浆miRNA能够作为结直肠癌预后预测标记物。
miRNA及其前体
小分子核糖核酸(microRNA、miRNA)是一类由约19～25nt的非编码单链小RNA。随着miRNAs研究的不断深入，发现细胞外miRNAs(cfmiRNAs)在各种体液中具有很好的稳定性，主要为血液，还有尿液、唾液、汗液、脑脊液等。在高通量技术(如微阵列和测序)迅速发展的基础上，多种癌症中全面的cfmiRNAs表达谱得到揭示(主要为循环miRNA)，发现了越来越多新的具有早期诊断和预测预后潜能的miRNAs。但是在结直肠癌中尚没有血浆miRNA相关的试剂盒上市。
本发明提供了一类新的从人中发现的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(PrecursormiRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、9个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA具有如SEQIDNO:1-8所示的序列。为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。
反义寡核苷酸
根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了其反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(lockednucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。
将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq反向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。
因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
芯片
microRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种microRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种microRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的microRNA的转录水平进行检测。
利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。
在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分结直肠癌样本和正常样本。
本发明的所述的miRNA芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针。
具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：
王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolofg eneexpressiononagenomicscale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
另一方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：
(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；
(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；
(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。
从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。
更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。
对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。
将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。
然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
检测试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的miRNA或其检测试剂(如，芯片)。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于诊断直肠癌，优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例
采样流程
严格遵守1998年由国务院颁布的《人类遗传资源管理暂行办法》及2005《中国人类遗传资源疾病新鲜组织收集整理保存技术规程》并以此为基准。收集2017年01月-2019年02月期间广州医科大学第三附属医院胃肠外科、内镜中心、消化内科和体检中心的78例结直肠癌患者、70例结直肠腺瘤患者和70例健康对照者的外周静脉血，结直肠癌患者均经病理检查确诊，且不包括其他肿瘤性疾病或重大、慢性疾病等可能影响本研究靶标的诊断，样本采集前患者未经任何放、化疗,所有患者均有完整的临床、病理资料。男性43例，女性35例；年龄25-90岁，平均65岁；遵照NCCN指南的TNM分期标准进行TNM分期，0-Ⅱ期38例、Ⅲ-IV期40例。结直肠腺瘤患者纳入标准为病理诊断明确腺瘤性息肉或管状/绒毛状/锯齿状腺瘤或高/低级别上皮内瘤变，且不包括肿瘤性疾病或重大、慢性疾病等可能影响本研究靶标的诊断。男性39例，女性31例；年龄22-88岁，平均59岁。健康者纳入标准为排除有肿瘤疾病史、重大或慢性疾病史和其他可能影响本研究靶标的疾病。其中男性34例、女性36例；年龄19-68岁，平均41岁。本研究已通过广州医科大学第三附属医院医学伦理委员会的审核批准，所有标本的采集均获得患者的知情同意。
实验主要材料
1、主要仪器
基因扩增仪：TC-96/G/H(b)，杭州博日。
荧光定量PCR仪：LightCycler480II，Roche。
2、主要试剂
血清/血浆miRNA提取分离试剂盒，DP503，天根。
All-in-OneTM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit：QP014，GeneCopoeia。
HieffTM qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)：11201ES08，翊圣生物。
引物：泓迅生物合成。
实验步骤
1、RNA抽提
取血浆样品200uL，按照说明书内容进行操作，最后洗脱体积为35uL。
1)样品处理：每200μl血清或血浆中加入900μl裂解液MZA，振荡器振荡混匀30sec至完全
匀浆，颠倒混匀。如需使用检测外参(CR100-01),请于完全匀浆之后、颠倒混匀之前加
入(1μM浓度，加入1μl)。
2)室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。
4)12,000rpm(～13,400×g)，4℃，离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，白色的
中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
5)量取转移液的体积，缓慢加入转移液2倍体积的无水乙醇(如：500μl的转移液加1ml无水
乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室
温放置2min,室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附
柱miRelute。
6)向吸附柱miRelute中加入700μl去蛋白液MRD(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置
2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
7)向吸附柱miRelute中加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，
室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
8)重复步骤7一次。
9)室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃收集管。
2、cDNA合成
1)解冻miRNA qRT-PCR Detection Kit的试剂，上下轻柔颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
2)冰上配制miRNA反转录反应液，在预冷的RNase-free反应管内加入以下成分至总体积25μL
| 成分 | 加入量 | 终浓度 |
| Total RNA | 50ng | |
| 2.5U/μl PolyA Polymerase | 1μL | |
| RTase Mix | 1μL | |
| 5×Reaction Buffer | 5μL | 1× |
| DEPC处理水 | to 25μL |
3)反转录反应：混匀反应Mix，短暂离心后37℃孵育1小时。
4)终止反应：85℃灭活处理5min，用灭菌水稀释8倍后-20℃保存反转录产物待用。
3、定量PCR检测
1)将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。
2)冰上配制下表中的反应液
3)将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
4)采用以下程序进行反应：
4、引物序列
5、统计分析
应用Primer Premier 5.0软件和SPSS16.0统计学分析。血浆miRNA的数据正态分布时，采用t检验分析比较两组数据；数据偏态分布或方差不齐时，血浆样本两组间比较及临床病理参数相关分析采用Mann-Whitney U检验，3组间比较采用Kruskal-Wallis检验。采用logistic二元回归进行多因素分析并建立logit方程。用受试者工作特征(receiveroperator characteristic，ROC)曲线分析血浆miRNA对结直肠癌和腺瘤的诊断效能。以P<0.05为差异具有统计学意义。
实验结果
1、临床病例特征资料
收集并整理218例(78例结直肠癌、70例结直肠腺瘤和70例健康对照)样本来源者的临床病理特征资料(表1)。
表1.218例样本来源者的临床病例特征资料
2、血浆miRNA的表达与临床病理特征之间的关系
采用t检验分析78例结直肠癌患者血浆中miRNA的表达水平与临床病理参数的相关性，结果显示结直肠癌患者血浆miR-1183表达水平与患者的病理分期(P＝0.015)和N分期(P＝0.018)显著相关；血浆miR-301a-3p表达水平与患者的M分期(P＝0.000)显著相关；血浆miR-193b-3p表达水平与患者的血清CEA表达水平(P＝0.028)显著相关；血浆miR-145-5p表达水平与患者的M分期(P＝0.001)显著相关(表2)。其他相关性分析未见显著差异。表明差异的miRNA可能参与了结直肠癌的恶性进程，有作为结直肠肿瘤预后生物标记物的潜能。
采用t检验分析70例结直肠腺瘤患者血浆中miRNA的表达水平与性别、年龄和血清CEA表达的相关性，结果显示结直肠腺瘤患者血浆miR-301a-3p表达水平与患者的性别(P＝0.038)和年龄(P＝0.004)显著相关；血浆miR-224-5p(P＝0.045)和miR-145-5p(P＝0.043)表达水平与患者年龄显著相关(表3)。其他相关性分析未见显著差异。表明血浆miR-301a-3p、血浆miR-224-5p和miR-145-5p表达可能受到患者的性别和年龄分布的影响。同样采用t检验分析70例健康志愿者血浆中miRNA的表达水平与性别和年龄的相关性，结果显示所测血浆miRNA表达水平与患者的性别和年龄无明显相关(表4)。
表2.miRNA在结直肠癌血浆中表达水平与临床病理参数的相关性
表2-续
表3.miRNA在结直肠腺瘤血浆中表达水平与临床病理参数的相关性
表3-续
表4.miRNA在健康对照者血浆中表达水平与临床病理参数的相关性
表4-续
3、7个靶标在一轮60例血浆样本中的表达水平检测
实时荧光定量PCR检测60例(结直肠癌、结直肠腺瘤和健康对照各20例)血浆样本中miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、miR-125b-5p、miR-224-5p、miR-375-3p、135b-5p的表达水平。结果显示miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p、miR-125b-5p、miR-224-5p在各组间具有显著统计学差异，miR-375-3p、135b-5p差异不明显。所以差异显著的五个靶标可以进入二轮大样本验证。(部分结果见图1)。
4、6个靶标在二轮158血浆样本中的表达水平验证
从一轮结果中筛选到miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p五个靶标进入二轮验证，另外加上已经验证有显著意义的miR-1183，共组成6个靶标进入二轮大样本验证。实时荧光定量PCR检测158例(结直肠癌58例、结直肠腺瘤50例和健康对照50例)血浆样本中6个靶标的表达情况。结果显示，miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-1183四个靶标差异显著。(部分结果见图2)。
5、ROC曲线分析单个miRNA对结直肠癌和腺瘤的诊断价值
将两轮数据合并，分析miR-224-5p、miR-125b-5p、miR-301a-3p、miR-145-5p、miR-193b-3p和miR-1183单独对结直肠癌和腺瘤的诊断价值。ROC曲线分析显示，血浆miR-224-5p、miR-301a-3p和miR-145-5p水平能够鉴别结直肠癌患者和健康者(图3A)。血浆miR-1183、miR-224-5p和miR-301a-3p水平能够鉴别结直肠腺瘤患者和健康者(图3B)。血浆miR-1183、miR-224-5p和miR-301a-3p水平能够鉴别结直肠癌和腺瘤者(图3C)。血浆miR-1183水平能够鉴别结直肠早期癌和晚期癌(图3D)。将以上ROC曲线的曲线下面积AUC、95％的置信区间CI、敏感性sensitivity、特异性specificity和p值统计在表1中。
图3A ROC曲线分析血浆miRNA对结直肠癌的诊断潜能
图3B ROC曲线分析血浆miRNA对结直肠腺瘤的诊断潜能
图3C ROC曲线分析血浆miRNA对结直肠癌和腺瘤的鉴别潜能
图3D ROC曲线分析血浆miRNA对结直肠早期癌和晚期癌的鉴别潜能
表5单个miRNA对结直肠癌和腺瘤的诊断价值
注：截断值取约登指数最大值。
6、miRNA的多因素分析、组合模型建立及诊断潜能检测
miRNA靶标在各类型血浆样本中的表达差异检测后，把所有有意义的靶标放入logistic二元回归，筛选到可以独立影响结直肠腺瘤和癌的靶标。并建立logit方程,进行组合后ROC曲线分析。logit方程和组合的诊断效能总结在下图5。结果表示，第一个方程代表miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-193b-3p可以作为CRC发生的独立预测因子，由这三个miRNA构成的组合对结直肠癌进行诊断的曲线下面积0.856，95％CI是0.781～0.930，敏感性和特异性分别是0.655和0.92(图4中的A)；第二个方程代表miR-145-5p、miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-193b-3p和miR-1183可以鉴别腺瘤和癌症，由五个miRNA构成的组合对腺瘤和癌症进行鉴别的曲线下面积0.930，95％CI是0.881～0.979，敏感性和特异性分别是0.72和0.68(图4中的B)。这些数据显示这两个组合模型对结直肠肿瘤具有较高的诊断价值，并且检测效能高于目前的早筛及辅助诊断手段。从分组比较分析，miR-224-5p、miR-301a-3p、miR-193b-3p在癌症组可能具有明显的标志意义，可能参与了结直肠的由正常-腺瘤-癌症阶段的发生发展。
图5.logit方程和组合的诊断效能
检测验证
将100例检测样本(包括30例结直肠癌样本、30例结直肠腺瘤样本和40例健康样本)，按上述方法进行miRNA标志物的表达水平的检测，根据本发明所示的miRNA标志物的表达水平判断样本的类别，进行双盲验证。
结果表明，包括本发明的三miRNA的组合能够有效鉴别出结直肠癌样本，其灵敏度可达70％(21/30)，特异性达92.9％(65/70),重复性稳定性良好。包括本发明的五miRNA的组合能够有效区分直肠腺瘤样本和结直肠癌样本，其灵敏度可达76.7％(23/30)，特异性达73.3％(22/30),重复性稳定性良好。
本发明涉及多种血浆miRNA构成的组合作为结直肠癌早期诊断和预后判断标记物及相关试剂盒。相比传统的粪便隐血检测，其敏感性提高，特别是对进展期腺瘤的敏感性明显提高，且采样无严格饮食控制，从而弃检率大大降低。与结肠镜检查相比，筛查前无需经过严格而痛苦的肠道准备，且技术要求明显降低，创伤风险非常小，结肠镜作为首筛的普及性低，若能通过本发明涉及的试剂盒进行高敏感性的初筛后，再进行结肠镜下的确诊，将大大提高大肠病变的检出率。与新纳入筛查指南的多靶点粪便检测相比，本发明在敏感性和特异性相当的情况下，还具有价格低廉，操作简便，易于实行等优势。相比问卷风险评估筛查法，本发明涉及的血浆miRNA分子可评估风险影响度提高，克服了进展期结直肠肿瘤的筛查敏感性和特异性不高的缺点。综上所述，做到对结直肠癌高危人群的早发现，及时干预，临床上尚缺乏更为精准的预警手段或生物指标。而本发明涉及的试剂盒是一种敏感性特异性良好、价格低廉，操作简便，易于推行的检测手段，除对CRC的早期筛查/诊断有价值，还对CRC的预后判断有较好的意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广州医科大学附属第三医院
中山大学达安基因股份有限公司
<120> 用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合
<130> 000034
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
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gctgtcaacg atacgctacg taac 24
Claims (2)
1. 血浆中miRNA检测试剂的用途，其特征在于，用于制备鉴别结直肠腺瘤和结直肠癌的试剂盒，所述miRNA由miR-224-5p、miR-301a-3p、 miR-145-5p、miR-193b-3p和miR-1183组成；
当所测定的样本中，与结直肠腺瘤样本相比，
miR-224-5p水平显著提高；
miR-301a-3p水平显著降低；
miR-193b-3p水平显著提高；
miR-145-5p水平显著降低；
miR-1183水平显著提高；
则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，以回归模型logit(P) =-2.338+7.166×（miR-145-5p）＋173.161×(miR-193b-3p)-27.658×(miR-1183)＋46.071×(miR-224-5p)– 58.807×(miR-301a-3p)进行判断,其中 miR-224-5p、miR-301a-3p、 miR-145-5p、miR-193b-3p以及miR-1183的表达水平以miR-30a-5p为内参测得，模型中logit(P)值显示检测样本与结直肠腺瘤样本存在显著差异，则提示该检测样本为结直肠癌高危患者样本。
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