CN110257405B

CN110257405B - 牛支原体乙醇脱氢酶基因及其编码蛋白与应用

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Publication number: CN110257405B
Application number: CN201910541509.XA
Authority: CN
Inventors: 陈曦; 郭爱珍; 刘东明; 陈颖钰; 赵刚; 路豆昆; 胡长敏; 陈建国; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN110257405A

Abstract

本发明公开了一种牛支原体乙醇脱氢酶基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，本发明还公开了一种牛支原体乙醇脱氢酶基因编码的蛋白，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，属于动物传染病防治与生物技术领域。本发明的重组蛋白具有乙醇脱氢酶活性，能够黏附牛肺上皮细胞系细胞(EBL)，能与牛纤连蛋白(Fn)结合，同时还具有良好的免疫原性和反应原性，是牛支原体的一种毒力相关蛋白，在牛支原体致病机制研究、疫苗和诊断试剂研发中具有较好的应用前景。

Description

牛支原体乙醇脱氢酶基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治与生物技术领域，具体涉及一种牛支原体乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)基因及其编码的蛋白与应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于柔膜体纲支原体属，是当前引起牛呼吸道疾病的重要病原之一，并导致多种临床病症，主要包括支气管肺炎、乳腺炎、关节炎、中耳炎、生殖道炎、腱鞘炎、脑膜炎、角结膜炎、流产与不孕等。由于其毒力因子不清、致病机理不详，到目前为止，仍然缺乏有效针对牛支原体感染的疫苗，抗生素治疗效果差，疗程长，且病原菌对抗生素耐药性也不断增加，致使本病目前仍然缺乏有效的防控手段，给肉牛业和奶牛业均带来巨大的经济损失。

牛支原体最初是1961年在美国从一例患乳腺炎的牛乳汁内分离得到，1976年证实该病原体导致牛呼吸系统疾病。后来，不同国家陆续报道了该病的流行，目前已在世界范围内广泛流行，导致巨大的经济损失。在欧洲约有25～33％的犊牛肺炎是由牛支原体引起，造成的经济损失更多，至少达到1.44～1.92亿欧元。牛支原体除了造成上述的直接经济损失之外，还导致严重的间接经济损失，如患病期间的药物治疗费用，对患病和死亡牛的扑杀和处理所支出的大量劳动力的费用，以及预防非特定病原体的开支，动物及动物性产品的贸易往来是该病流行的重要原因。

我国于1983首次从牛的乳腺炎奶中分离到牛支原体，2008年首次由本申请人所在实验室报道牛支原体肺炎，此后发现，我国大部分省份都开始流行该病。除湖北省外，河南、江西、新疆、湖南、广东、厦门等地相继从有呼吸道症状的患牛体内分离到牛支原体。

毒力相关蛋白的发掘有助于从蛋白质水平认识支原体与机体的相互作用关系和阐明该病的发病机制；此外，新的毒力相关蛋白有可能作为新型疫苗研发的靶标；同时，具有免疫原性的毒力相关蛋白可能成为该病的新型诊断标识。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体乙醇脱氢酶基因及其编码的蛋白，为研发新型疫苗和诊断试剂提供潜在的候选蛋白。

为了实现本发明的目的，申请人以所在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室分离的M.bovis HB0801株牛支原体为模板，设计引物，克隆和表达了重组ADH蛋白(rADH)。进一步验证确定rADH具有乙醇脱氢酶活性，可以催化乙醇转化为乙醛，同时可将NAD+还原为NADH。体外研究进一步发现，该蛋白还可黏附牛肺上皮细胞(EBL)以及与纤连蛋白(Fn)结合，且具有免疫原性和反应原性。由于黏附功能和免疫原性均与细菌毒力相关，因此，牛支原体ADH蛋白是一种毒力相关蛋白，是牛支原体疫苗和诊断试剂研发的候选靶点。

本发明的技术方案具体如下：

申请人于2008年6月从湖北省应城市某养牛场发病的黄牛的肺组织中分离得到一株牛支原体本地分离株HB0801，申请人将其命名为牛支原体HB0801(Mycoplasma bovisHB0801)，于2010年2月1日送交中国典型培养物保藏中心(武汉)保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2010040。该牛支原体分离株已在CN 109750054A的专利文献中公开。

本发明首先以牛支原体HB0801(基因组在GenBank登录号为CP002058)基因组为模板克隆该基因。大肠杆菌与支原体的表达系统不同，大肠杆菌的表达系统将在支原体中编码色氨酸的密码子UGA作为其终止密码子，因此，含有UGA的支原体基因序列如果插入到大肠杆菌表达系统中，得到的基因表达产物就是被截短的产物。因此采用重叠延伸PCR方法将支原体中的UGA碱基定点突变成在大肠杆菌中同样表达色氨酸的UGG碱基，ADH蛋白基因(Mbov_0338)中共有3个UGA碱基对需要密码子突变，才能保证在大肠杆菌中获得全长表达。

经过人工突变后的牛支原体基因Mbov_0338的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO:1的1-1062位碱基所示的序列，其长度为1062bp；其中在该序列的57位，165位和279位发生等位基因突变。

该牛支原白Mbov_0338基因编码的ADH蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示，共编码353个氨基酸。

将本发明的牛支原体Mbov_0338基因的核苷酸序列通过构建质粒载体pET-30a-Mbov_0338转化大肠杆菌DH5α得到重组大肠杆菌菌株，申请人将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0338(Escherichia coli pET-30a-Mbov_0338)，于2019年4月2日送交位于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019226。该菌株在IPTG诱导下，表达Mbov_0338基因编码的重组蛋白rADH。

经过验证，本发明纯化的rADH具有乙醇脱氢酶活性，能将NAD+还原为NADH，此外，该蛋白还具有免疫原性和反应原性，并且能够黏附宿主EBL上皮细胞和结合纤连蛋白(Fn)。

具体内容详见实施例。

本发明具有以下优点：

1、牛支原体ADH重组蛋白由牛支原体基因Mbov_0338编码，被发明人证实具有乙醇脱氢酶活性。

2、牛支原体ADH重组蛋白具有免疫原性和反应原性，可用于制备疫苗预防牛支原体感染，也可用于牛支原体抗体的检测，还可以通过免疫动物制备多克隆或单克隆抗体，用于牛支原体抗原的检测。

3、牛支原体ADH重组蛋白能与牛肺上皮细胞(EBL)和纤连蛋白(Fn)特异性结合，是一种黏附相关蛋白，所产生的抗体能与牛支原体竞争性与受体结合，从而减少牛支原体的黏附，降低牛支原体的致病性。

序列表说明：

SEQ ID NO：1是经过碱基突变后的牛支原体基因Mbov_0338的核苷酸序列(原基因来源：Mycoplasma bovis HB0801菌株，原基因的登录号GenBank Accession：CP002058)，Mbov_0338基因在基因组中的位置：399768—400829，正向。该修饰后的牛支原体Mbov_0338基因的核苷酸序列如1-1062位碱基所示，其中在该序列的57位，165位和279位发生密码子突变。

SEQ ID NO：2是牛支原体ADH蛋白的氨基酸序列，共编码353个氨基酸。

SEQ ID NO：3是扩增Mbov_0338基因片段的引物0338a1的序列。

SEQ ID NO：4是扩增Mbov_0338基因片段的引物0338a2的序列。

SEQ ID NO：5是扩增Mbov_0338基因片段的引物0338b1的序列。

SEQ ID NO：6是扩增Mbov_0338基因片段的引物0338b2的序列。

SEQ ID NO：7是扩增Mbov_0338基因片段的引物0338c1的序列。

SEQ ID NO：8是扩增Mbov_0338基因片段的引物0338c2的序列。

SEQ ID NO：9是扩增Mbov_0338基因片段的引物0338d1的序列。

SEQ ID NO：10是扩增Mbov_0338基因片段的引物0338d2的序列。

附图说明

图1：pET-30a的质粒图谱。pET-30a为商业化质粒，购自Novagen公司。

图2：重组质粒pET-30a-Mbov_0338的图谱。重组质粒pET-30ab-Mbov_0338是由pET-30a质粒和突变后的Mbov_0338基因全长经过限制性内切酶消化后连接重组而成。

图3：纯化的rADH蛋白SDS-PAGE图。泳道M：高分子质量蛋白质标准；泳道1：纯化的rADH蛋白。

图4：牛支原体rADH蛋白乙醇脱氢酶活性测定结果。

图5：ELISA检测免疫兔血清效价。

图6：Western blot分析rADH蛋白的反应原性。泳道M：高分子质量蛋白质标准；泳道1-8：牛支原体全菌蛋白与牛支原体阳性牛血清作用；泳道9：牛支原体全菌蛋白与阴性牛血清作用。

图7：Western blot分析rADH蛋白的免疫原性。泳道M：高分子质量蛋白质标准；泳道1：牛支原体全菌蛋白。

图8：间接免疫荧光法检测rADH与牛肺上皮细胞(EBL)的黏附。A图：100μg rADH与EBL细胞(1×10⁵/孔)蛋白孵育后，用兔抗rADH高免血清和Alexa488标记的荧光二抗检测黏附的蛋白；B图：EBL细胞与PBS孵育的对照组；细胞膜和细胞核分别用DiI和DAPI染色。激光共聚焦显微镜下观察各处理组细胞的不同颜色荧光，Bar＝20μm。

图9：抗rADH兔血清抑制牛支原体黏附EBL细胞检测。1×10⁸CFU牛支原体预先与200μL免疫前兔血清或兔抗rADH高免血清(在PBS中1:20稀释)孵育后，再与EBL细胞(1×10⁵/孔)作用，最后计算黏附到EBL细胞上的牛支原体数量(CFU/孔)。图中数值代表来自3个独立实验的平均值±SEM，**表示p<0.01。

图10：rADH蛋白与纤连蛋白(Fn)结合能力鉴定图。A图：斑点杂交法检测rADH与Fn结合能力；B图：ELISA检测Fn与微孔板包被的rADH的结合。

具体实施方式

实施例1：牛支原体ADH重组蛋白(rADH)的表达和纯化

1.1牛支原体Mbov_0338基因克隆表达

由于大肠杆菌对密码子的偏爱性，在本发明中牛支原体Mbov_0338基因中编码色氨酸的密码子UGA在大肠杆菌被用作终止子，因此，用大肠杆菌表达牛支原体基因时，需要对支原体Mbov_0338基因进行突变，将密码子UGA突变为能在大肠杆菌中表达色氨酸的密码子UGG。具体步骤是：以牛支原体HB0801(基因组GenBank登录号为WP_038582875.1)中的Mbov_0338基因为模板，利用如下设计的4对引物(编号分别为：0338a1/0338a2、0338b1/0338b2、0338c1/0338c2、0338d1/0338d2)分别扩增出突变后的Mbov_0338基因的4个片段，然后，以突变后的4个片段为模板，利用0338a1/0338d2引物对扩增，得到突变后的Mbov_0338基因的全序列，序列长度为1062bp(见序列表SEQ ID NO：1中1-1062位碱基所示的序列，其编码区也是1-1062位碱基对应的序列)。

扩增Mbov_0338基因的引物序列如下所示：

1、引物0338a1/0338a2，扩增片段在基因组中的位置为1-67碱基处，PCR扩增产物长度为67bp。

(1)正向引物0338a1：5′-TTAGGTACCATGAAACAAATTCCAGCA-3′，(对应序列表SEQ IDNO：3所示的序列)。

(2)反向引物0338a2：5′-CCTTAACACTCCATTTTTTAGGTTCTGTT-3′，(对应序列表SEQID NO：4所示的序列；下划线部分为突变位点，即由T突变为C)。

2、引物0338b1/0338b2，扩增片段在Mbov_0338基因中的位置为45-177碱基处，PCR扩增产物长度为133bp。

(1)正向引物0338b1：5′-ACCTAAAAAATGGAGTGTTAAGGAAG-3′(其中：下划线部分为突变位点，即由A突变为G；对应序列表SEQ ID NO：5所示的序列)。

(2)反向引物0338b2：5′-AGGTTCTACTAACCAGTCATAATTTGCT-3′(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；对应序列表SEQ ID NO：6所示的序列)。

3、引物0338c1/0338c2扩增片段在Mbov_0338基因中的位置为150-292碱基处，PCR扩增产物长度为143bp。

(1)正向引物0338c1：5′-AGCAAATTATGACTGGTTAGTAGAACCT-3′(下划线部分为突变位点，即由A突变为G；对应序列表SEQ ID NO：7所示的序列)。

(2)反向引物0338c2：5′-AAGCATCATGTAACCATGCTAAAG-3′(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；对应SEQ ID NO：8所示的序列)。

4、引物0338d1/0338d2扩增片段在Mbov_0338基因中的位置为261-1062碱基处，PCR扩增产物长度为802bp。

(1)正向引物0338d1：5′-TAGAGTTGCTTTAGCATGGTTACATGAT-3′(下划线部分为突变位点，即由A突变为G；对应序列表SEQ ID NO：9所示的序列)。

(2)反向引物0338d2：5′-CCGGAATTCTTATTTTCTAAAGTCAATAACAG-3′(下划线部分为突变位点，即由T突变为C；对应序列表SEQ ID NO：10所示的序列)。

5、引物0338a1/0338d2扩增片段在Mbov_0338基因中的位置为1-1062碱基处，PCR扩增产物长度为1062bp。

(1)正向引物0338a1:5′-TTAGGTACCATGAAACAAATTCCAGCA-3′(直下划线部分为KpnⅠ酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；对应序列表SEQ ID NO：3所示的序列)。

(2)反向引物0338d2:5′-CCGGAATTCTTATTTTCTAAAGTCAATAACAG-3′(直下划线部分为EcoRⅠ酶切位点，波浪线部分为保护性碱基；对应序列表SEQ ID NO：10所示的序列)。

上述4个片段的PCR反应体系如下：

模板DNA 2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfu buffer with MgSO₄(Thermo)5μL，10×dNTP mix(Thermo)1μL，引物各2μL，超纯水36μL。

回收以上4个片段的PCR扩增产物，以此为模板，使用引物0338a1/0338d2扩增突变后的Mbov_0338基因，其PCR反应体系如下：每个片段2.5μL，pfu酶(Thermo)1.5μL，pfubuffer with MgSO₄(Thermo)5μL，10倍dNTP mix(Thermo)1μL，引物各2μL，超纯水36μL。上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

回收Mbov_0338基因的扩增产物，用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切，同时将pET-30a质粒(图1)(购自Novagen公司)用相同的酶进行双酶切。将酶切后的Mbov_0338基因和pET-30a质粒用DNA连接酶(T4DNA ligase)连接，得到重组质粒pET-30a-Mbov_0338(图2)。将该重组质粒pET-30a-Mbov_0338转化大肠杆菌DH 5α后，置于37℃摇床在180r/min下培养12小时，提取质粒经过测序正确后转化大肠杆菌BL21菌，将该大肠杆菌重组菌在LB液体培养基中培养至OD＝0.6时取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，37℃摇床诱导表达3h。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min后弃掉上清加入1mL磷酸盐缓冲液即PBS(配方：KCl0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，1000mL蒸馏水，pH＝7.6)溶液重悬后，再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液【1M Tris-HCl(pH＝6.8)1mL，200mM DDT 0.31g，4％SDS 0.4g，0.2％溴酚蓝0.02g，20％甘油2mL，7mL超纯水】重悬。100℃沸水中煮沸10min。用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。

将本发明的蛋白的核苷酸序列通过构建重组质粒pET-30a-Mbov_0338转化到大肠杆菌DH5α中得到大肠杆菌重组菌，申请人将该大肠杆菌重组菌命名为大肠杆菌pET-30a-Mbov_0338(Escherichia coli pET-30a-Mbov_0338)；于2019年4月2日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019226。

1.2rADH蛋白的纯化

将重组的大肠杆菌BL21按上述方法诱导表达后，取菌液8000r/min离心10min后弃掉上清，用500mL的PBS离心洗涤2次，8000r/min离心10min/次。弃掉上清后加入30mL的PBS重悬，加入蛋白酶抑制剂(购自罗氏公司)，使用液压破碎仪破碎。破碎后以12000r/min离心30min，取30μL上清加入30μL上样缓冲液，在沸水中煮沸10min作为上清组。取少许沉淀加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液煮沸10min作沉淀组。经过SDS-PAGE凝胶电泳后，确定rADH蛋白大部分表达于上清中。

rADH蛋白具体纯化步骤如下：

(1)向亲和层析柱中加入1mL Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购自GE公司)；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清；

(5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子；

(6)加入50mL washing buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白；

(7)加入12mL elute buffer缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl,1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白，收集前几滴，编号为1；

(8)将编号为1的管中加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

(9)配置SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白(图3)。

实施例2：rADH蛋白的乙醇脱氢酶活性试验

使用乙醇脱氢酶活性测定试剂盒(Alcohol Dehydrogenase Activity AssayKit，Sigma)检测，按产品说明书操作，简述如下：将22.5ng rADH加入到96孔板中，然后再加入乙醇，NAD+，乙醇脱氢酶检测液和显色液，充分混合后，在37℃下孵育3min。然后用酶标检测仪在37℃，450nm波长下，每隔5min测定一次吸光度。检测结果证实，rADH蛋白可以将底物乙醇催化形成乙醛，同时将NAD+还原为NADH，NADH产生的量与底物吸光值成比例，这时450nm波长下的吸光度随酶催化时间延长而增加(图4)。

实施例3：rADH蛋白多抗制备

将纯化的rADH蛋白免疫雄性日本大耳白兔，免疫量约为1mg/只，根据免疫量算出所用重组Mbov_338蛋白的体积，并与等体积弗氏完全佐剂混合乳化完全，皮下多点注射进行免疫，以后每两周免疫一次，从第二次免疫时改用弗氏不完全佐剂进行乳化，并于从第三次免疫一周后耳缘静脉采血进行间接ELISA检测白兔产生抗体水平，一般免疫4-5次即可达到所需效价，当白兔抗体水平不再升高时，即可进行心脏采血纯化多抗。结果表明，rADH蛋白可以产生的抗体效价为2¹¹×100，即2.0×10³(图5)。

实施例4：rADH蛋白的反应原性分析

采用Western blot方法进行rADH蛋白反应原性鉴定，主要步骤为：将纯化的重组蛋白rADH(2.0μg/泳道)进行SDS-PAGE电泳，将胶上蛋白转移到PVDF膜上，膜洗涤后，使用HT-Blot Western Blot孵育器将PVDF膜分别与自然感染和实验感染牛支原体阳性血清(在TBST中1:100稀释)室温孵育1h，洗涤后，膜用兔抗牛IgG-HRP二抗(1:3000在TBST中稀释)室温孵育1h，TBST洗涤三次；将膜用Bio-rad化学发光底物作用2～5min后，在化学发光检测仪上检测信号。结果显示：rADH蛋白能与牛支原体阳性牛血清发生反应，可检测到特异性反应条带，分子量约为44kDa(图6，泳道1-8)，同时，该蛋白不能与阴性牛血清发生反应，未检测到信号(图6，泳道9)，因此，rADH蛋白具有很好的反应原性。

实施例5：rADH蛋白的免疫原性

利用Western Blot方法检测rADH蛋白的免疫原性，牛支原体全菌蛋白转印到PVDF膜后，与抗rMbov_338蛋白兔血清孵育后，TBST洗涤三次，将膜与羊抗兔IgG-HRP抗体(1:5000)室温下孵育1h；TBST洗涤三次；将膜用Bio-rad化学发光底物作用2-5min后，在化学发光检测仪上检测信号。结果显示：能够检测到明显的免疫印迹条带，蛋白质大小与牛支原体ADH蛋白理论分子量相同，表明rADH蛋白具有免疫原性，能够引起患病动物产生特异性抗体(图7)。

实施例6：rADH蛋白对宿主细胞的黏附能力检测

6.1黏附检测

间接免疫荧光结合激光共聚焦扫描显微镜检测rADH蛋白与EBL细胞的黏附。将EBL细胞在24孔板中培养24～36h后，用4％多聚甲醛固定后，将200μL rADH蛋白(0.5μg/μL)加入细胞培养孔中，与EBL细胞(1×10⁵/孔)在4℃孵育1h，洗涤后，在室温下用1％BSA-PBS封闭细胞1h；然后，将细胞与抗rADH兔血清(1:300)在室温下孵育1h。充分洗涤后，将细胞与驴抗兔IgG-Alexa 488抗体(1:400)在室温下孵育1h；细胞膜和细胞核则分别用CellMaskDeep Red和DAPI染色液染色红色(膜)与兰色(核)。最后，在激光共聚焦扫描显微镜下检测荧光信号。结果表明：rADH蛋白黏附在EBL细胞表面，在EBL细胞表面检测到绿色荧光(图8A)，而相同实验条件下，在EBL细胞仅与PBS孵育的对照组中，不能检测到绿色荧光(图8B)，证实：rADH蛋白与EBL细胞特异性结合。

6.2黏附抑制检测

抗rADH蛋白兔血清抑制牛支原体黏附EBL细胞实验。EBL细胞接种在24孔细胞培养板内，在37℃，5％CO₂培养箱中培养20h。在抑制实验之前，弃掉培养基，用1％BSA-MEM在37℃封闭细胞15min。预先将大约1×10⁸CFU的牛支原体与56℃热灭活的兔抗rADH高免血清和免疫前兔血清在4℃孵育2h。然后将牛支原体与血清的混合物一起加入到含有单层EBL细胞(约1×10⁵个/孔)的培养板孔中，并在37℃振荡孵育30min。充分洗涤四次后，用0.25％胰蛋白酶消化单层细胞，采用连续稀释法将细胞悬液涂布到PPLO琼脂平板上，培养72h后显微镜下观察计算黏附的牛支原体的菌落数量，计算CFU/孔。结果表明：与免疫前血清相比，兔抗rADH高免血清(1:20稀释)显著降低了黏附到EBL细胞上的牛支原体数量(p<0.01)(图9)。

实施例7：rADH蛋白黏附纤连蛋白(Fn)检测

7.1Dot-Blot法检测

将硝酸纤维素膜安装在Bio-Dot微孔过滤器上，用PBS连续两倍稀释rADH(从1μg至0.0625μg)，每个稀释度按每孔100μL rADH点到硝酸纤维素膜上。然后将膜从装置中取出，并用含5％脱脂乳的TBS溶液封闭4h。洗涤三次后，将膜与10μg/mL牛Fn在1％脱脂乳-TBS溶液中4℃孵育过夜，然后用兔抗牛Fn抗体(1:1000稀释)和山羊抗兔-HRP抗体(1:4000稀释)室温孵育1h。最后用化学发光底物处理膜，在化学发光检测仪上检测信号。结果表明：Fn与rADH蛋白呈剂量依赖性结合(图10A)，随着rADH蛋白浓度增加，反应的信号越来越强。

7.2ELISA法检测

将rADH蛋白和BSA(阴性对照)包被在96孔板上，每孔500ng，在4℃下孵育过夜；洗涤后，用5％脱脂奶的PBS溶液在37℃封闭2h；洗涤后，将不同浓度的Fn(0，3.125，6.25，12.5，25，50，75，100μg/mL)，以每孔100μL加入孔中，在室温下孵育1.5h；洗涤后，每孔加入兔抗Fn抗体，室温孵育1h；洗涤后，每孔加入抗兔IgG-HRP抗体(在PBST中1:6000稀释)室温孵育1h；加入显色液后用酶标检测仪在630nm波长下读取吸光值。结果表明：Fn以剂量依赖性和饱和性的方式与包被在微孔板中的rADH蛋白结合(图10B)。当Fn浓度为0～5μg/孔时，结合到微孔板上的Fn的量随着Fn浓度的增加而增加；当Fn浓度高于5μg/孔时，rADH重组蛋白结合的Fn数量不再随Fn浓度的增加而增加，结合达到饱和。相反，Fn与BSA是以低水平、不饱和的方式结合，表明Fn和BSA之间的结合是一种非特异性相互作用，而Fn与rADH的结合是一种特异性的结合。

附录：说明书中名词术语说明：

牛支原体ADH蛋白基因以Mbov_0338表示。

牛支原体ADH重组蛋白以rADH表示。

牛支原体本地分离株以牛支原体HB0801表示。

牛纤连蛋白以Fn表示。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 牛支原体乙醇脱氢酶基因及其编码蛋白与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 1

atgaaacaaa ttccagcaaa aatgaaagct tttgttgtaa cagaacctaa aaaatggagt 60

gttaaggaag ttgatgttcc taaaccaaaa tataaagaag ttttaattga aatggaaact 120

tcaggtatct gtcatacaga cttgcatgca gcaaattatg actggttagt agaacctaaa 180

tacccactta ttccaggcca tgaaggaatt ggaaaggtag ttgcattagg ggaaggatgc 240

acacgtttga aaattggtga tagagttgct ttagcatggt tacatgatgc ttgtggctac 300

tgtgaatttt gtctaacagg tagagaaaca ctttgtccaa atcaaaatat gtcggcttac 360

actaaagatg gatcatatgc tgaatatgca attggtcatg aagattatgt aggattggtt 420

cctgaaaaat tagatattgt aactggtgcg ccaattgttt gcgcaggtgt tacaacttat 480

aaatcattaa aacaaaccaa agcaaaagct ggtaactttg tagctgttat cggtgtcggt 540

ggcttaggtc aaatggctat tcaatatgca aaagctatgg gactaagacc tattggtgtt 600

gacttgcaag atgaaaaatg tgaattagct cttaaatcag gcgcagaata tgcatttaac 660

tcagcaaaag atcctaaatt tattgaaaaa attattgaag taactggcgg aggtgtacat 720

gctgtagtta atacatctgt tcacccaagt gctgctgaac aaggtatgga tatgcttcgt 780

cgcggcggcc gtcaagtatt agttggttta ccagcaaaag ataaacacgg aaaagatgac 840

tttaaagtct caattttctg gtcagtatta ttagaacgtg agcttgctgg ctcaattgtt 900

ggaactagac aagacctagc agaagcttta gaatatgctg ctgaaggaaa agttaaatca 960

gaagttacta aggttgtcaa attagaagaa gttgcagata tttttgaaaa acttcaaaaa 1020

ggcgagttct taggacgtgc tgttattgac tttagaaaat aa 1062

<210> 2

<211> 353

<212> PRT

<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)

<400> 2

Met Lys Gln Ile Pro Ala Lys Met Lys Ala Phe Val Val Thr Glu Pro

1 5 10 15

Lys Lys Trp Ser Val Lys Glu Val Asp Val Pro Lys Pro Lys Tyr Lys

20 25 30

Glu Val Leu Ile Glu Met Glu Thr Ser Gly Ile Cys His Thr Asp Leu

35 40 45

His Ala Ala Asn Tyr Asp Trp Leu Val Glu Pro Lys Tyr Pro Leu Ile

50 55 60

Pro Gly His Glu Gly Ile Gly Lys Val Val Ala Leu Gly Glu Gly Cys

65 70 75 80

Thr Arg Leu Lys Ile Gly Asp Arg Val Ala Leu Ala Trp Leu His Asp

85 90 95

Ala Cys Gly Tyr Cys Glu Phe Cys Leu Thr Gly Arg Glu Thr Leu Cys

100 105 110

Pro Asn Gln Asn Met Ser Ala Tyr Thr Lys Asp Gly Ser Tyr Ala Glu

115 120 125

Tyr Ala Ile Gly His Glu Asp Tyr Val Gly Leu Val Pro Glu Lys Leu

130 135 140

Asp Ile Val Thr Gly Ala Pro Ile Val Cys Ala Gly Val Thr Thr Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Leu Lys Gln Thr Lys Ala Lys Ala Gly Asn Phe Val Ala Val

165 170 175

Ile Gly Val Gly Gly Leu Gly Gln Met Ala Ile Gln Tyr Ala Lys Ala

180 185 190

Met Gly Leu Arg Pro Ile Gly Val Asp Leu Gln Asp Glu Lys Cys Glu

195 200 205

Leu Ala Leu Lys Ser Gly Ala Glu Tyr Ala Phe Asn Ser Ala Lys Asp

210 215 220

Pro Lys Phe Ile Glu Lys Ile Ile Glu Val Thr Gly Gly Gly Val His

225 230 235 240

Ala Val Val Asn Thr Ser Val His Pro Ser Ala Ala Glu Gln Gly Met

245 250 255

Asp Met Leu Arg Arg Gly Gly Arg Gln Val Leu Val Gly Leu Pro Ala

260 265 270

Lys Asp Lys His Gly Lys Asp Asp Phe Lys Val Ser Ile Phe Trp Ser

275 280 285

Val Leu Leu Glu Arg Glu Leu Ala Gly Ser Ile Val Gly Thr Arg Gln

290 295 300

Asp Leu Ala Glu Ala Leu Glu Tyr Ala Ala Glu Gly Lys Val Lys Ser

305 310 315 320

Glu Val Thr Lys Val Val Lys Leu Glu Glu Val Ala Asp Ile Phe Glu

325 330 335

Lys Leu Gln Lys Gly Glu Phe Leu Gly Arg Ala Val Ile Asp Phe Arg

340 345 350

Lys

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ttaggtacca tgaaacaaat tccagca 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccttaacact ccatttttta ggttctgtt 29

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

acctaaaaaa tggagtgtta aggaag 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aggttctact aaccagtcat aatttgct 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

agcaaattat gactggttag tagaacct 28

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

aagcatcatg taaccatgct aaag 24

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

tagagttgct ttagcatggt tacatgat 28

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ccggaattct tattttctaa agtcaataac ag 32

Claims

1.牛支原体乙醇脱氢酶基因编码的蛋白或其抗体在制备牛支原体疫苗中的用途，该蛋白具有乙醇脱氢酶活性，具有黏附牛肺上皮细胞和结合牛纤连蛋白的能力，同时还具有免疫原性和反应原性，所产生的抗体能与牛支原体竞争性与受体结合，从而减少牛支原体的黏附，降低牛支原体的致病性，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。