CN110423769A - 一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法，包括以下步骤：第一步，对目的基因和宿主基因组的密码子进行密码子偏爱性分析；第二步，比较并总结密码子使用差异，找出可能的限速密码子；第三步，将目的基因编码序列中的限速密码子进行替换优化；第四步，编码序列前后分别连接宿主管家基因的5’UTR和3’UTR；第五步，对起始密码子上游30bp附近的碱基进行优化；第六步，对DNA甲基化寡片段进行优化；第七步，排除优化后目的基因中的常见限制性内切酶位点；第八步，对优化结果表达水平进行预测。本发明的优化方法能提高目的基因在宿主内的表达水平。
Description
技术领域
本发明涉及于生物技术领域，具体是一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法。
背景技术
由于生物体中编码同一种氨基酸的密码子有不只一种，所以存在着同义密码子。对于同义密码子之间的选择，不同物种之间会出现一定的差异，甚至在同一物种的不同器官，不同发育阶段都可能不一致，这种现象被称作密码子偏爱性。同一物种在编码各自蛋白的时候会偏向于选择某一种或几种密码子作为其主要的密码子，而其余的密码子的出现频率会极其低，甚至为零。这是由于在不同物种的生物体中存在不同的tRNA池，及每种tRNA的含量分布不同，密码子的使用正是与该分布相互对应的，如果出现差异，在表达过程中出现大量稀有密码子，则对应的稀少tRNA会被大量使用而匮乏，结果不能及时供应翻译的需求，阻滞核糖体合成，导致蛋白的产量就会大大减少。所以当转入外源基因的时候，可能会含有大量宿主的稀有密码子，为了避免表达水平的降低，则应考虑与宿主的表达体系尽量相适应，使用宿主的偏爱密码子替换限速密码子。因此，本发明提供一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法，包括以下步骤：
第一步，对目的基因和宿主基因组的密码子进行密码子偏爱性分析；
第二步，比较并总结密码子使用差异，找出可能的限速密码子；
第三步，将目的基因编码序列中的限速密码子进行替换优化；
第四步，编码序列前后分别连接宿主管家基因的5’UTR和3’UTR；
第五步，对起始密码子上游30bp附近的碱基进行优化；
第六步，对DNA甲基化寡片段进行优化；
第七步，排除优化后目的基因中的常见限制性内切酶位点；
第八步，对优化结果表达水平进行预测。
作为本发明进一步的方案：步骤八、根据CAI、CBI、GC％、Nc值以及RNA二级结构预测对优化结果表达水平进行预测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明为一种融合多维度信息的莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因以及大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因及其基因近端调控序列优化方法，所述的基因分别为SEQ ID：EF110555、EF632325和L43920的核苷酸编码序列；本发明的优化方法可以为跨物种转基因提供一种优化方法，通过该方法的优化，能提高目的基因在宿主内的表达水平。
附图说明
图1为提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
请参阅图1，一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法，包括以下步骤：
第一步，对目的基因和宿主基因组的密码子进行密码子偏爱性分析；
第二步，比较并总结密码子使用差异，找出可能的限速密码子；
第三步，将目的基因编码序列中的限速密码子进行替换优化；
第四步，编码序列前后分别连接宿主管家基因的5’UTR和3’UTR；
第五步，对起始密码子上游30bp附近的碱基进行优化；
第六步，对DNA甲基化寡片段进行优化；
第七步，排除优化后目的基因中的常见限制性内切酶位点；
第八步，根据CAI、CBI、GC％、Nc值以及RNA二级结构预测对优化结果表达水平进行预测。
实施例2
本发明利用以上方法对莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因以及大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因进行了人源化优化，具体操作如下：
第一步：对目的基因和宿主基因组的密码子进行密码子偏爱性分析；人类基因组密码子使用情况的统计可由在线软件Codon Usage Database得到；对于莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因以及大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因编码序列RNA，可以使用CodonW软件分析得到其密码子的使用情况；
第二步：比较并总结密码子使用差异，找出可能的限速密码子；将上述的三条目的基因的编码序列的密码子使用情况与人类的密码子偏好性进行统计比较，列表并整理出最优密码子、次优密码子以及稀有密码子；如果目的基因序列中的最优密码子和次优密码子是相应人类基因组中的稀有密码子，则将其归为可能的限速密码子；
第三步：将目的基因中的限速密码子进行替换优化；用人类基因组中相应的最优密码子代替可能的限速密码子；这一步可通过结合UltraEdit和Office Word的查找替换功能实现，同时也可以利用网上在线软件Codon Optimization更简易的操作，打开密码子优化页面，粘贴待优化序列并选择目标宿主物种的拉丁名，在页面下方选择尽构建密码子地图，就可以在地图上找到相应位置的限速密码子并进行对应同义密码子的更替；
第四步，编码序列前后分别连接宿主管家基因的5’UTR和3’UTR；根据实验设计中的宿主，选取其管家基因的5’UTR和3’UTR分别连接在优化后的目的基因的前后两端；管家基因的选取可以考虑ACTB或GAPDH；
第五步，对起始密码子上游30bp附近的碱基进行优化；
第六步，对DNA甲基化寡片段进行优化；
第七步：排除优化后目的基因中的常见限制性内切酶位点；将优化后的序列用BioEdit软件翻译并进行序列对比，比较优化前后蛋白质序列；在确认了氨基酸序列没有改变的前提下，用BioEdit软件识别其中的常见酶切位点，并通过替换相应使用频率较高的同义密码子，在不改变氨基酸序列的前提下排除一些常见的酶切位点；
第八步，根据CAI、CBI、GC％、Nc值以及RNA二级结构预测对优化结果表达水平进行预测；应用软件CodonW分别计算优化前后的基因序列CDS的CBI值、CG％、GC3s、Nc值和CAI值；并使用在线软件ViennaRNA Services(http://rna.tbi.univie.ac.at/)中的RNAfoldWebServer获得优化前后基因序列的RNA二级结构及最小自由能；列表比较预测其表达水平是否有提高。
通过以上的操作，预测结果显示本发明涉及的优化方法可以适当的提高目的基因的表达水平。
本发明为一种融合多维度信息的莱茵衣藻ω-3脂肪酸脱氢酶基因以及大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因及其基因近端调控序列优化方法，所述的基因分别为SEQ ID：EF110555、EF632325和L43920的核苷酸编码序列；本发明的优化方法可以为跨物种转基因提供一种优化方法，通过该方法的优化，能提高目的基因在宿主内的表达水平。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 内蒙古大学
<120> 一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3564
<212> DNA
<213> 脱氧核糖核酸(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgcagtgcc tgagcagatc cagcctgcgg gctcccaccc tcagcaccag agctagagca 60
gcacctgtcc tccggagatc cgtggtgaag gtcgccaacg tcgctgctat ccctgaggca 120
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Claims (2)
1.一种提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，对目的基因和宿主基因组的密码子进行密码子偏爱性分析；
第二步，比较并总结密码子使用差异，找出可能的限速密码子；
第三步，将目的基因编码序列中的限速密码子进行替换优化；
第四步，编码序列前后分别连接宿主管家基因的5’UTR和3’UTR；
第五步，对起始密码子上游30bp附近的碱基进行优化；
第六步，对DNA甲基化寡片段进行优化；
第七步，排除优化后目的基因中的常见限制性内切酶位点；
第八步，对优化结果表达水平进行预测。
2.根据权利要求1所述的提高目的基因在宿主体内表达水平的密码子优化方法，其特征在于，步骤八、根据CAI、CBI、GC%、Nc值以及RNA二级结构预测对优化结果表达水平进行预测。
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| 孙晗笑等: "《转基因技术理论与应用》", 河南医科大学出版社, pages: 252 * |
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