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CN110452984A - 一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN110452984A
CN110452984A CN201910687592.1A CN201910687592A CN110452984A CN 110452984 A CN110452984 A CN 110452984A CN 201910687592 A CN201910687592 A CN 201910687592A CN 110452984 A CN110452984 A CN 110452984A
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znf671
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Abstract

本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法，属于医学基因检测技术领域。本发明基于实时荧光PCR技术，在FAM19A4、has‑miR‑124‑2、ZNF671基因的启动子区设计特异性的甲基化检测的引物和探针，并配制成PCR反应液去扩增硫化后的样本DNA，通过与内参基因β‑actin对样本的质量进行控制，判断样本是否甲基化。与常规的方法相比，本方法具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，对宫颈癌的早期诊断及预后判断起重要作用。

Description

一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针 组合、试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及医学基因检测技术领域，尤其涉及一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法。
背景技术
宫颈癌一直是困扰女性的重要恶性肿瘤。正常的宫颈细胞经过癌前病变发展成为宫颈癌，可能长达几十年。在这整个过程中部分HPV病毒的感染可被自身免疫系统修复而自动转归为正常，而另外一部分与宫颈癌联系更紧密的癌前病变则需及时进行干预来阻止癌前病变发展成为宫颈癌。
目前我国临床上应用的主要筛查手段为细胞学检测方法，包括巴氏涂片法和液基细胞学(TCT)。但细胞学检测方法的检测流程包括取样-抹片制备-观察-结果判读等多个环节，易受到人为影响的可能性较大，造成漏检的几率较高。并且，自从宫颈癌归因于HPV病毒持续感染后发展起来的HPV-DNA检测。因为其检测的仅仅是HPV病毒的存在与否，而HPV病毒的存在，大部分是一过性的，也就是意味着这些被自体免疫清除掉的HPV感染也会被判定为阳性，导致过度治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法，所述试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合，包括以下甲基化基因：FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671。
本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，所述引物和探针用于检测上述方案所述FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671；所述引物和探针组合包括FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P；
所述FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：9所示。
优选的，所述FAM19A4探针P和has-miR-124-2探针P、ZNF671探针P的5’端采用FAM标记；所述FAM19A4探针P、ZNF671探针P和has-miR-124-2探针P的3’端采用MGB标记。
本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述的引物和探针组合、β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P；所述β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～SEQID NO：12所示。
优选的，所述β-actin探针P的5’端采用VIC标记；所述β-actin探针P的3’端采用MGB标记。
优选的，所述试剂盒还包括10×PCR Buffer，Taq酶、dNTPs、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照。
优选的，所述阳性对照包括宫颈癌细胞株CaSki；所述阴性对照包括宫颈癌细胞株C33A。
本发明还提供了上述方案所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取待检样本DNA；
2)将所述待检样本DNA经亚硫酸盐转化处理，得到转化后的DNA；
3)以所述转化后的DNA为模板，利用上述方案所述的引物和探针组合进行PCR扩增反应，得到荧光检测结果；
4)根据所述荧光检测结果，对待检样本进行判定，当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4或miR-124-2任一基因ΔCt≦9，则判定待检样本为宫颈癌甲基化阳性；当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因ΔCt＞9，则判定待检样本为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671甲基化阴性；当β-actin＞35，则判定样本不足或有抑制物存在，PCR反应无效，需重复实验或采样；
所述ΔCt＝FAM Ct-VIC Ct。
优选的，步骤3)中所述PCR扩增反应使用的反应体系包括FAM19A4扩增体系、has-miR-124-2扩增体系和ZNF671扩增体系；
所述FAM19A4扩增体系以20μL计包括：FAM19A4PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述FAM19A4PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer 1×、dNTP0.25mM、FAM19A4正向引物F 0.4uM、FAM19A4反向引物R 0.4uM、FAM19A4探针P 0.4uM、β-actin-F 0.4uM、β-actin-R 0.4uM和β-actin-MP 0.4uM；
所述has-miR-124-2扩增体系以20μL计包括：has-miR-124-2 PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述has-miR-124-2 PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer 1×、dNTP 0.25mM、has-miR-124-2正向引物F 0.4uM、has-miR-124-2反向引物R0.4uM、has-miR-124-2探针P0.4uM、β-actin-F 0.4uM、β-actin-R 0.4uM和β-actin-MP0.4uM；
所述ZNF671扩增体系以20μL计包括：ZNF671PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述ZNF671PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer 1×、dNTP 0.25mM、ZNF671正向引物F 0.4uM、ZNF671反向引物R 0.4uM、ZNF671探针P 0.4uM、β-actin-F0.4uM、β-actin-R 0.4uM和β-actin-MP 0.4uM。
优选的，步骤3)中所述PCR扩增反应的程序为：95℃5min，[95℃15s、60℃30s，50个循环]，反应结束；所述60℃30s过程中采集荧光。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合，包括以下甲基化基因：FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671。本发明中，所述FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671基因均与宫颈癌的进程密切相关。每个靶基因的甲基化区域检测均针对核心调控区域多个CpG，相对单个碱基的检测减少了碱基变化的随机性。目标基因的甲基化判断并不局限于一两个碱基，高密度甲基化致使蛋白表达明显减低。
本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，本发明采用的探针具有高特异性和高敏感性的优势，可准确稳定的检测出低至浓度1ng/μL，5％甲基化率；并且所述探针具有单碱基分辨率，可特异区分甲基化和未甲基化的DNA。
本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒及其使用方法。本发明所述试剂盒使用管家基因β-actin作为内参基因对样本的质量进行控制，考虑到管家基因可能甲基化的情况，在设计内参引物探针时选择没有CpG岛的位置。保证管家基因既可对样本进行质量控制，又可在一定程度上对样本的甲基化水平进行评价。并且，宫颈癌的发生是个多诱因多步骤的过程，本发明对多基因甲基化联合检测，通过独特的算法综合评价，灵敏度、特异性均要优于单基因检测。此外，本发明所述试剂盒的使用方法无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，同时整个PCR过程在1h内完成。其快速、便捷的特点适用于临床检测。
附图说明：
图1为宫颈癌组织FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因甲基化分布状况。
具体实施方式
本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合，包括以下甲基化基因：FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671。
本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，所述引物和探针用于检测上述方案所述FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671；所述引物和探针组合包括FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P；
所述FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：9所示，具体参见表1：
表1宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合
名称 具体核苷酸序列 编号
FAM19A4正向引物F CGGCGGGTTCGGTTT SEQ ID NO：1
FAM19A4反向引物R CGCAACTAACAATACGAAACCG SEQ ID NO：2
FAM19A4探针P TACGAAACCGAACCCA SEQ ID NO：3
has-miR-124-2正向引物F TAATTTGGATTTACGTCGTTATTTGA SEQ ID NO：4
has-miR-124-2反向引物R GTAAAAATATAAACGATACGTATACCTACGTA SEQ ID NO：5
has-miR-124-2探针P TACAACACACGCCTAA SEQ ID NO：6
ZNF671正向引物F GTTTTCGGTAGTTGTTCGCGTT SEQ ID NO：7
ZNF671反向引物R AAAATAACTAAAAACCCGAAAAACG SEQ ID NO：8
ZNF671探针P TCCGCCATAAAACCGTAAA SEQ ID NO：9
本发明中，所述引物和探针组合是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列，使用Primer Premier3.0及Methyl Primerpress v1.0设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
本发明中，所述FAM19A4扩增后的靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，具体为：CGGCGGGTTCGGTTTTTTTTGGTTAGCGCGTTAGTTGGGTTCGGTTTCGTATTGTTAGTTGCG；所述has-miR-124-2扩增后的靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，具体为：TAATTAATTTGGATTTACGTCGTTATTTGAAAATTAGATTTATAGGTTTATGTATGTTTTTAGGCGTGTGTTGTAAATGGTATGGAGATATATGTATATGTATACGTAGGTATACGTATCGTTTATATTTTTAC；所述ZNF671扩增后的靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，具体为：GTTTTCGGTAGTTGTTCGCGTTTACGGTTTTATGGCGGAGTTAACGGATTTCGCGCGGGTGGGTGTTGCGTTTTTCGGGTTTTTAGTTATTTT。
本发明中，所述FAM19A4探针P和has-miR-124-2探针P、ZNF671探针P的5’端优选的采用FAM标记作为发光基团；所述FAM19A4探针P和has-miR-124-2探针P、ZNF671探针P的3’端优选的采用MGB标记作为淬灭基团。
本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述的引物和探针组合、β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P；所述β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～SEQID NO：12所示，具体如下：β-actin正向引物F：GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT；β-actin反向引物R：ATCATCTTTCCCACCAAACTATAACC；β-actin探针P：CCCATTAACTAAACACAACCT；
本发明中，所述β-actin探针P的5’端优选的采用VIC标记作为发光基团；所述β-actin探针P的3’端优选的采用MGB标记作为淬灭基团。
本发明中，所述试剂盒优选的还包括10×PCR Buffer，Taq酶、dNTPs、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照；所述阳性对照优选的包括宫颈癌细胞株CaSki(人宫颈鳞状上皮癌细胞系，FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671甲基化率100％)；所述阴性对照优选的包括宫颈癌细胞株C33A(p53+，pRB+，在273位密码子发生点突变。乳头状瘤病毒DNA、RNA阴性，FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671甲基化率0％)。
本发明中，所述无核酸酶水、10×PCR Buffer、Taq酶和dNTPs优选的购自于宝生物(大连)有限公司；所述Taq酶优选为HS Taq酶。
本发明还提供了上述方案所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取待检样本DNA；
2)将所述待检样本DNA经亚硫酸盐转化处理，得到转化后的DNA；
3)以所述转化后的DNA为模板，利用上述方案所述的引物和探针组合进行PCR扩增反应，得到荧光检测结果；
4)根据所述荧光检测结果，对待检样本进行判定，当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4或miR-124-2任一基因ΔCt≦9，则判定待检样本为宫颈癌甲基化阳性；当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因ΔCt＞9，则判定待检样本为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671甲基化阴性；当β-actin＞35，则判定样本不足或有抑制物存在，PCR反应无效，需重复实验或采样；
所述ΔCt＝FAM Ct-VIC Ct。
本发明首先提取待检样本DNA；所述待测样本包括组织样本、FFPE(福尔马林固定石蜡包埋组织)和宫颈脱落细胞；所述待测样本优选的来自于湘雅医学检验所；本发明对所述提取待检样本DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可，本发明具体实施过程中优选的采用湖南百伯基因技术有限公司的《核酸提取纯化试剂》进行提取。
在得到待检样本DNA后，本发明将所述待检样本DNA经亚硫酸盐转化处理，得到转化后的DNA；本发明对将所述待检样本DNA经亚硫酸盐转化处理的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可，本发明具体实施过程中优选的采用EZ DNA MethylationTMKits转化试剂盒进行处理。
得到转化后的DNA后，本发明以所述转化后的DNA为模板，利用上述方案所述的引物和探针组合进行PCR扩增反应，得到荧光检测结果；所述PCR扩增反应使用的反应体系包括FAM19A4扩增体系、has-miR-124-2扩增体系和ZNF671扩增体系；
所述FAM19A4扩增体系以20μL计包括：FAM19A4PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述FAM19A4PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer 1×、dNTP0.25mM、FAM19A4正向引物F 0.4uM、FAM19A4反向引物R 0.4uM、FAM19A4探针P 0.4uM、β-actin-F 0.4uM、β-actin-R 0.4uM和β-actin-MP 0.4uM；
所述has-miR-124-2扩增体系以20μL计包括：has-miR-124-2 PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述has-miR-124-2 PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer 1×、dNTP 0.25mM、has-miR-124-2正向引物F 0.4uM、has-miR-124-2反向引物R0.4uM、has-miR-124-2探针P0.4uM、β-actin-F 0.4uM、β-actin-R 0.4uM和β-actin-MP0.4uM；
所述ZNF671扩增体系以20μL计包括：ZNF671PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述ZNF671PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer 1×、dNTP 0.25mM、ZNF671正向引物F 0.4uM、ZNF671反向引物R 0.4uM、ZNF671探针P 0.4uM、β-actin-F0.4uM、β-actin-R 0.4uM和β-actin-MP 0.4uM。
本发明中，所述PCR扩增反应的程序优选为：95℃5min，[95℃15s、60℃30s，50个循环]，反应结束；所述60℃30s过程中采集荧光。
得到得到荧光检测结果后，本发明根据所述荧光检测结果，对待检样本进行判定，当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4或miR-124-2任一基因ΔCt≦9，则判定待检样本为宫颈癌甲基化阳性；当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因ΔCt＞9，则判定待检样本为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671甲基化阴性；当β-actin＞35，则判定样本不足或有抑制物存在，PCR反应无效，需重复实验或采样；所述ΔCt＝FAM Ct-VICCt；所述FAM的阈值为120000，VIC的阈值为80000。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1本发明的试剂盒在诊断人宫颈癌中的应用
本发明采用的无核酸酶水、10×PCR Buffer、HS Taq酶、dNTPs购自于宝生物(大连)有限公司；
阳性对照(宫颈癌细胞株(CaSki))，阴性对照(宫颈癌细胞株(C33A))。
DNA提取试剂盒为：湖南百伯基因技术有限公司的《核酸提取纯化试剂》；
转化试剂盒为，EZ DNA MethylationTMKits。
本发明所采用的生物材料均来自湘雅医学检验所。
方法：
一、生物样本：
为2017年1-2017年6月期间在湘雅一医院就诊的33例C1N1宫颈脱落细胞、30例C1N2患者宫颈脱落细胞、30例C1N3+宫颈癌患者宫颈脱落细胞、90例正常人群的宫颈脱落细胞。
二、提取组织DNA：
以下提取样本组织DNA所用的试剂成分均选自湖南百伯基因技术有限公司的《核酸提取纯化试剂》。
1)将取回的样本充分震荡1min，取出宫颈刷。
2)取无菌的1.5mL EP管，加入1.5ml样品，12000rpm离心1.5min；倒掉上部废液，收集管底沉淀。
3)重复步骤2)将所有的样本处理完。
4)依次加入20μL蛋白酶K、250μL裂解液ABL，涡旋振荡10s，65℃水浴15min，期间振荡混匀2-3次。
5)取出后加入250μL无水乙醇，涡旋振荡10sec，短暂离心5sec。
6)将吸附柱插入收集管中，将上一步所得混合液转移至吸附柱中。10,000rpm离心1min。
7)弃收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500μL洗液I，10,000rpm，离心1min。
8)弃收集管中废液，加入700μL洗液II，10,000rpm，离心1min，。弃废液。(洗液II使用前需加入无水乙醇至80％)
9)重复步骤8)一次。
10)弃流出液，将吸附柱插回收集管，空转离心，13,000rpm，2min。
11)将吸附柱插入到新的EP管中。加入30-100μL DNA溶解液(65℃预热可提高DNA获得率)，室温静置5min。
12)再次10,000rpm，离心1min。弃吸附柱，EP管内液体即为DNA溶液。2-8℃保存，若需长期保存则置于-20℃或更低温度。
三、DNA转化的流程
1.将提取的DNA配置亚硫酸盐转化体系配置：
将提取的DNA按照表2的转化体系配置：(转化反应液配制：取1管Solution 1，加入300μLSolution 2和790μL Solution 3，充分震荡混匀8-10min至晶体完全溶解；加入160μLSolution 4，震荡混匀，待用；未用完的转化反应液请于2～8℃保存，保存不超过1个月)
表2提取的DNA配置亚硫酸盐转化体系
成分 反应体积(μL)
提取的待转化DNA 1～20μL(200ng～2ug)
RNase-freeWater 补足20μL
转化反应液 130μL
总计 150μL
2.亚硫酸盐转化运行体系参见表3：
表3亚硫酸盐转化运行体系
反应温度 反应时间
98℃ 8min
64℃ 3.5h
20℃ ≤20h
3.亚硫酸盐转化后DNA纯化：
1)取纯化柱加入600μL BufferA，再将转化产物转移至纯化柱中，颠倒混匀数次；
2)10000rpm离心30s，弃流出液；
3)加100μLBufferB，10000rpm离心30s，弃流出液；
4)加入200μLBufferC，室温静置15min，10000rpm离心30s，弃流出液；
5)加200μLBufferB，10000rpm离心30s，弃流出液；
6)重复步骤5；阿
7)10000rpm空转离心2min；
8)将纯化柱插入到一新的EP管中，加入20μL Elution Buffer，室温静置1min；
9)10000rpm离心1min收集流出液即为已转化的DNA溶液，保存于-20℃。
四、PCR流程
1、使用的PCR仪器为ABI 7500,反应体系为20μL；
2、PCR反应体系配制及条件见如下表4和表5所示：
表4 PCR反应体系的配制
成分 反应体积(μL)
PCR反应液 18.3μL
Taq酶 0.2μL
亚硫酸盐转化后的DNA模板 1.5μL
表5 PCR反应程序
五、结果分析
阈值FAM的阈值为120000，VIC的阈值为80000，ΔCt＝FAM Ct-VIC Ct。
试剂盒检测结果满足质控要求，根据检测结果对样本进行判断。判定标准参见表6。β-actin≤35，样本检测结果为任2个基因ΔCt≦9(ΔCt＝FAM Ct-VIC Ct。)，则判定样本为甲基化阳性；β-actin≤35，样本检测结果为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因≤1个基因ΔCt≦9；则判样本为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671甲基化阴性，β-actin＞35，则样本不足或有抑制物存在PCR反应无效，需重复实验或采样。
表6检测结果判定标准
六、宫颈癌组织FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因甲基化分布状况(见表7和图1)
FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因甲基化在99例正常人群中均未检出，在24例宫颈癌脱落细胞中检出30例(占90.9％，与正常组相比P<0.001)，FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因的甲基化比例随着宫颈癌病程的加重而升高。
表7宫颈癌脱落细胞的FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因甲基化检测统计结果
Norma(99) LSIL(59) HSIL(48) CA(44)
FAM19A4 0.00％ 10.17％ 36.84％ 61.53％
Mir-124-2 2.00％ 5.08％ 42.11％ 76.92％
ZNF671 4.00％ 13.56％ 68.42％ 90.31％
Cervi-safe 4.00％ 28.81％ 84.21％ 100.00％
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 韩林志
<120> 一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 1
cggcgggttc ggttt 15
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 2
cgcaactaac aatacgaaac cg 22
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 3
tacgaaaccg aaccca 16
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 4
taatttggat ttacgtcgtt atttga 26
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 5
gtaaaaatat aaacgatacg tatacctacg ta 32
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 6
tacaacacac gcctaa 16
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 7
gttttcggta gttgttcgcg tt 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 8
aaaataacta aaaacccgaa aaacg 25
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 9
tccgccataa aaccgtaaa 19
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 10
ggttaggaag gaggttgttt gtttt 25
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 11
atcatctttc ccaccaaact ataacc 26
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 12
cccattaact aaacacaacc t 21
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 13
cggcgggttc ggtttttttt ggttagcgcg ttagttgggt tcggtttcgt attgttagtt 60
gcg 63
<210> 14
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 14
taattaattt ggatttacgt cgttatttga aaattagatt tataggttta tgtatgtttt 60
taggcgtgtg ttgtaaatgg tatggagata tatgtatatg tatacgtagg tatacgtatc 120
gtttatattt ttac 134
<210> 15
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence )
<400> 15
gttttcggta gttgttcgcg tttacggttt tatggcggag ttaacggatt tcgcgcgggt 60
gggtgttgcg tttttcgggt ttttagttat ttt 93

Claims (10)

1.一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合，包括以下甲基化基因：FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671。
2.一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针用于检测权利要求1所述FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671；所述引物和探针组合包括FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P；
所述FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：9所示。
3.根据权利要求2所述的引物和探针组合，其特征在于，所述FAM19A4探针P、ZNF671探针P和has-miR-124-2探针P的5’端采用FAM标记；所述FAM19A4探针P、ZNF671探针P和has-miR-124-2探针P的3’端采用MGB标记。
4.一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3所述的引物和探针组合、β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P；所述β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～SEQID NO：12所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述β-actin探针P的5’端采用VIC标记；所述β-actin探针P的3’端采用MGB标记。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10×PCRBuffer，Taq酶、dNTPs、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括宫颈癌细胞株CaSki；所述阴性对照包括宫颈癌细胞株C33A。
8.权利要求4～7任意一项试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取待检样本DNA；
2)将所述待检样本DNA经亚硫酸盐转化处理，得到转化后的DNA；
3)以所述转化后的DNA为模板，利用权利要求2或3所述的引物和探针组合进行PCR扩增反应，得到荧光检测结果；
4)根据所述荧光检测结果，对待检样本进行判定，当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4或miR-124-2任一基因ΔCt≦9，则判定待检样本为宫颈癌甲基化阳性；当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因ΔCt＞9，则判定待检样本为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671甲基化阴性；当β-actin＞35，则判定样本不足或有抑制物存在，PCR反应无效，需重复实验或采样；
所述ΔCt＝FAM Ct-VIC Ct。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR扩增反应使用的反应体系包括FAM19A4扩增体系、has-miR-124-2扩增体系和ZNF671扩增体系；
所述FAM19A4扩增体系以20μL计包括：FAM19A4 PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述FAM19A4 PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer1×、dNTP0.25mM、FAM19A4正向引物F0.4uM、FAM19A4反向引物R0.4uM、FAM19A4探针P0.4uM、β-actin-F0.4uM、β-actin-R0.4uM和β-actin-MP0.4uM；
所述has-miR-124-2扩增体系以20μL计包括：has-miR-124-2 PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述has-miR-124-2 PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer1×、dNTP0.25mM、has-miR-124-2正向引物F0.4uM、has-miR-124-2反向引物R0.4uM、has-miR-124-2探针P0.4uM、β-actin-F0.4uM、β-actin-R0.4uM和β-actin-MP0.4uM；
所述ZNF671扩增体系以20μL计包括：ZNF671 PCR反应液18.3μL、Taq酶0.2μL和转化后的DNA1.5μL；所述ZNF671 PCR反应液包括以下浓度的组分：PCRbuffer1×、dNTP0.25mM、ZNF671正向引物F0.4uM、ZNF671反向引物R0.4uM、ZNF671探针P0.4uM、β-actin-F0.4uM、β-actin-R0.4uM和β-actin-MP0.4uM。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述PCR扩增反应的程序为：95℃5min，[95℃15s、60℃30s，50个循环]，反应结束；所述60℃30s过程中采集荧光。
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