CN110494449B - Alt-803与抗cd38抗体组合用于癌症治疗 - Google Patents

Abstract

本发明的特征在于使用基于IL‑15的超激动剂复合物和抗体的组合疗法，以有效治疗患有癌症和感染性疾病的受试者。

Description

ALT-803与抗CD38抗体组合用于癌症治疗

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年3月31日提交的美国临时申请号62/480,339；和于2018年3月27日提交的美国申请15/937,493的权益，这些专利的内容通过援引以其全文并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及治疗癌症和自身免疫疾病和炎性疾病的疗法领域。

背景技术

在本文所述的发明之前，迫切需要开发新策略以增大和/或指导针对癌症的免疫活性并改善自身免疫疾病和炎性疾病。

发明内容

本发明至少部分基于以下令人惊讶的发现：抗CD38抗体与ALT-803(ALT-803是白介素-15(IL-15)超激动剂突变体和二聚体IL-15受体α/Fc融合蛋白的复合物)组合可用于增强针对瘤形成(例如，血液学癌症、B细胞赘生物、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B和T急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病、华氏巨球蛋白血症、原发性系统性淀粉样变性、套细胞淋巴瘤、NK细胞白血病、NK或T细胞淋巴瘤、浆细胞白血病、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和实体瘤)的免疫应答或用于抑制与抗体相关性自身免疫疾病和炎性疾病(例如，系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎、自身免疫性血细胞减少症、类风湿性关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病和过敏反应)相关的免疫应答。

用于治疗受试者的瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病的方法通过给予受试者有效量的抗CD38抗体(或抗体样分子)和有效量的包含IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物(ALT-803)的药物组合物来进行，其中ALT-803包含二聚体IL-15RαSu/Fc和两个IL-15N72D分子。在一个方面，该IL-15N72D分子包含SEQ ID NO:3。示例性IL-15RαSu/Fc包含SEQ ID NO:6。

受试者优选是需要这种治疗的哺乳动物，例如，已被诊断为患有瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病或其易感性的受试者。该哺乳动物是任何哺乳动物，例如人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马，以及生长为食品消费的牲畜或动物，例如牛、羊、猪、鸡、和山羊。在优选的实施例中，该哺乳动物是人。

用本文所述方法治疗的合适瘤形成包括：血液学癌症、B细胞赘生物、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B和T急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病、华氏巨球蛋白血症、原发性系统性淀粉样变性、套细胞淋巴瘤、NK细胞白血病、NK或T细胞淋巴瘤、浆细胞白血病、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和实体瘤。使用本文所述方法治疗的示例性自身免疫疾病/炎性疾病包括系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎、自身免疫性血细胞减少症、类风湿性关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、移植物抗宿主病、严重过敏反应和哮喘(van de Donk等人，2016.ImmunolRev.[免疫学综述]270:95-112)。

优选地，给予本文所述的组合物还预防疾病治疗后瘤形成或自身免疫疾病/炎性疾病的未来复发。本文所述的治疗方法还可以与已经显示有效治疗MM的其他药剂组合，这些其他药剂包括但不限于地塞米松、硼替佐米、来那度胺、沙利度胺、硼替佐米/阿霉素、卡非佐米、泊马度胺、帕比司他(panobinostat)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、伊沙佐米(ixazomib)、和糖基化的美法仑(melphalan)。本发明的治疗方法还可以与以下任何疗法组合：放射、化学疗法、手术、治疗性抗体、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂、泛DAC抑制剂、H-DAC抑制剂、检查点抑制剂、过继性细胞疗法包括CAR T和NK细胞疗法和疫苗。此外，这些疗法可用于治疗初始患者或患有复发或难治性疾病的患者。

另外，使用类固醇(即皮质类固醇、退热药和抗组胺药)的给药前和给药后策略通常与ALT-803加抗CD38抗体疗法联合使用。给予抗CD38抗体通常导致显着的输注反应，其可延迟或终止治疗并引起患者的疼痛和不适。类固醇用于减少这些影响，但也可以抑制治疗益处所必需的免疫应答。令人惊讶的是，在存在和不存在类固醇预处理的情况下，发现ALT-803加抗CD38抗体疗法在动物肿瘤模型中同样有效。

ALT-803的示例性有效剂量包括在0.1μg/kg至100mg/kg体重之间，例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、或900μg/kg体重或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100mg/kg体重。

在某些情况下，每日给予ALT-803，例如每24小时。或者，每天连续或数次给予ALT-803，例如，每1小时、每2小时、每3小时、每4小时、每5小时、每6小时、每7小时、每8小时、每次9小时、每10小时、每11小时或每12小时。

ALT-803的示例性有效日剂量包括在0.1μg/kg至100μg/kg体重之间，例如，0.1、0.3、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或99μg/kg体重。

可替代地，约每周一次给予ALT-803，例如约每7天一次。或者，每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、或每周七次给予ALT-803。ALT-803的示例性有效每周剂量包括0.0001mg/kg与4mg/kg体重之间，例如0.001、0.003、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、或4mg/kg体重。例如，ALT-803的有效每周剂量为0.1μg/kg体重与400μg/kg体重之间。可替代地，ALT-803以固定剂量或基于体表面积(即，每m²)的剂量给予。

在一些情况下，受试者接受两个6周的周期，该6周的周期由每周4次ALT-803静脉内给药，然后是2周的休息期。最终地，主治医生或兽医决定适当的量以及给药方案。

本文所述的组合物全身、静脉内、皮下、肌内、腹膜内、膀胱内或通过滴注给药。可以同时或依次给予该抗体和ALT-803。

优选地，本发明的抗体(Ab)特异性结合CD38蛋白(环状ADP核糖水解酶)上的一个或多个表位。优选的抗体由重链和轻链免疫球蛋白(Ig)蛋白构成，其可包括啮齿动物、人、嵌合和人源化形式。另外，本文所述的方法可以利用抗体样分子，例如包含抗原结合结构域的分子(例如，单链抗体、Fab、Fv、T细胞受体结合结构域、配体结合结构域或受体结合结构域)。在一些情况下，这些结构域优选与Fc结构域连接。Ig可以是任何已知的同种型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG2a、IgG2b、和IgM)。在本文所述的使用抗CD38抗体(或抗体样分子)的一些应用中，该抗体(或抗体样分子)含有能够与Fc受体相互作用以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的重链或Fc结构域。在其他情况下，可以使用与效应分子缀合的抗体。在其他应用中，优选的抗体(或抗体样分子)含有不能有效介导ADCC或ADCP的重链或Fc结构域(例如IgG4 Fc)。该抗CD38抗体包括但不限于达雷妥木单抗(daratumumab)艾萨妥昔单抗(isatuximab)(SAR650984)、MOR202、Ab79、AB19、和MT-4019。

在一个方面，在体外或体内向抗-CD38抗体处理添加ALT-803增加免疫细胞对患病细胞或疾病相关细胞的细胞毒性。在一些情况下，ALT-803能够刺激免疫细胞以增大由CD38特异性抗体(或抗体样分子)介导的针对肿瘤细胞或自身免疫疾病相关细胞的ADCC或ADCP活性。在一个实施例中，用ALT-803治疗免疫细胞使由抗CD38抗体介导的针对患病细胞或疾病相关细胞的ADCC或ADCP活性增加至少5％，例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一个优选的实施例中，免疫细胞用ALT-803处理并用于通过由抗CD38抗体介导的ADCC或ADCP杀伤肿瘤细胞，其中肿瘤细胞死亡水平比未用ALT-803处理的免疫细胞所见的肿瘤细胞死亡水平高至少5％，例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在优选的实施例中，ALT-803和抗体给药后，受试者中的肿瘤特异性ADCC或ADCP增大至少5％，例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在特定实施例中，通过ALT-803治疗增大基于NK细胞的ADCC活性。

在其他情况下，ALT-803刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞以杀伤患病细胞或疾病相关细胞，例如肿瘤细胞或感染的细胞。优选地，ALT-803处理刺激免疫细胞细胞溶解活性，并且抗CD38抗体靶向疾病细胞，使得这些处理组合提供针对肿瘤细胞或自身免疫相关免疫细胞的高效和/或持久活性。在一些实施例中，ALT-803增加干扰素γ(IFN-γ)和/或IL-6的血清水平，刺激NK和T细胞增殖并上调活化标记物(包括CD25、CD69、穿孔素和颗粒酶)的NK和T细胞表达。诱导这些标记物可以增强免疫细胞对患病细胞的应答性或细胞溶解活性。例如，本文所述的方法刺激NK细胞以杀伤肿瘤细胞或自身免疫相关的免疫细胞。

在其他实施例中，ALT-803直接或间接诱导其他先天免疫细胞(包括中性粒细胞或单核细胞)的活性和/或水平。已知此类细胞介导针对患病细胞(例如，肿瘤细胞)的治疗性抗体的ADCC和ADCP(Golay等人Blood.[血液]2013 122:3482-91,Richards等人,MolCancer Ther[分子癌症治疗学]2008 7:2517-27)。优选地，ALT-803和抗CD38抗体的组合疗法通过至少部分由先天免疫细胞介导的机制为患有癌症或自身免疫疾病/炎性疾病的患者提供改善的临床应答。例如，本文所述的方法刺激中性粒细胞或单核细胞以杀伤肿瘤或自身免疫/炎症相关的免疫细胞。在一个实例中，ALT-803能够刺激产生细胞因子或活化巨噬细胞应答(包括ADCP)的其他介质的NK细胞，从而提供通过抗CD38抗体介导的更有效的肿瘤细胞杀伤。

优选地，与给予本文的组合物之前的肿瘤或自身免疫/炎症相关免疫细胞的数量相比，本文所述的方法导致肿瘤或自身免疫/炎症相关免疫细胞的数量减少/降低。可替代地，本文所述的方法导致瘤形成或自身免疫疾病/炎性疾病的疾病进展减慢。优选地，与未治疗的受试者相比，本文所述的方法导致受试者的存活延长。

还提供了用于治疗瘤形成的试剂盒，该试剂盒包含有效量的ALT-803、抗体和使用该试剂盒治疗瘤形成的说明。

用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病的试剂盒包含有效量的ALT-803、抗体、以及使用该试剂盒治疗自身免疫疾病或炎性疾病的说明。

在本发明的可溶性融合蛋白复合物的某些方面，IL-15多肽是具有与天然IL-15多肽不同的氨基酸序列的IL-15变体。人IL-15多肽在本文中被称为huIL-15、hIL-15、huIL15、hIL15、IL-15野生型(wt)，并且其变体是指使用天然氨基酸、其在成熟序列中的位置和变体氨基酸。例如，huIL15N72D是指包含在位置72处N至D的取代的人IL-15。在一个方面，IL-15变体起IL-15激动剂的作用，例如通过与天然IL-15多肽相比增加的IL-15RβγC受体结合活性来证明。可替代地，例如，通过与天然IL-15多肽相比，IL-15RβγC受体的降低的结合活性证明了作为IL-15拮抗剂的IL-15变体功能。

通过使多个细胞与抗体和ALT-803接触来进行的靶细胞的杀伤方法，其中多个细胞进一步包括携带由IL-15结构域识别的IL-15R链的免疫细胞、或携带由Fc结构域识别的Fc受体链的免疫细胞，并靶向携带由抗CD38抗体识别的CD38抗原的细胞，并杀伤靶细胞。例如，该靶细胞是与自身免疫疾病或炎性疾病相关的肿瘤细胞或免疫细胞。

通过以下进行杀伤表达CD38抗原的患病细胞的方法：用有效量的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物(ALT-803)处理免疫细胞，并将ALT-803处理的免疫细胞与抗CD38抗体和表达CD38抗原的患病细胞混合，并经由由ALT-803处理的免疫细胞和CD38特异性抗体介导的ADCC或ADCP杀伤患病细胞。在该方法的一个方面，该ALT-803处理的免疫细胞(即NK细胞)能够经由抗CD38抗体活化巨噬细胞以介导针对肿瘤细胞的ADCP。在一个方面，与未用ALT-803处理的免疫细胞介导的相比，患病细胞杀伤的水平增加至少5％，例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。

本发明还提供了用于预防或治疗患者的疾病的方法，其中患者体内患病细胞表达CD38抗原，该方法包括以下步骤：使多个细胞与抗CD38抗体和ALT-803接触，并破坏或杀伤足以预防或治疗患者疾病的疾病细胞。在优选的实施例中，与ALT-803和抗CD38抗体的组合疗法可以减少疾病进展和/或延长患者存活。

本发明提供了通过给予哺乳动物有效量的抗CD38抗体和有效量的ALT-803来刺激哺乳动物免疫应答的方法。

具体地，用于治疗受试者的瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病的方法通过给予受试者有效量的抗CD38抗体(或抗体样分子)和有效量的包含IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物(ALT-803)的药物组合物来进行，其中ALT-803包含二聚体IL-15RαSu/Fc和两种IL-15N72D分子，从而治疗瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病。在一些情况下，该方法进一步包括在给予所述抗体或所述ALT-803之前、期间或之后用类固醇治疗，其中该类固醇选自由皮质类固醇、退热药和抗组胺药组成的组。在一个方面，该IL-15N72D分子包含SEQ ID NO:3。在另一方面，该IL-15RαSu/Fc包含SEQ ID NO:6。例如，该瘤形成选自下组，该组由以下组成：血液学癌症、B细胞赘生物、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B和T急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病、华氏巨球蛋白血症、原发性系统性淀粉样变性、套细胞淋巴瘤、NK细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、浆细胞白血病、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和实体瘤。

优选地，每天或每周一次或两次给予有效量的ALT-803。任选地，所述ALT-803的有效量为在0.1μg/kg至100mg/kg之间。例如，该药物组合物全身、静脉内、皮下、肌内、腹膜内、膀胱内或通过滴注给药。示例性的抗CD38抗体包括达雷妥木单抗、艾萨妥昔单抗(isatuximab)(SAR650984)和MOR202。

受试者中由针对肿瘤或自身免疫/炎症相关免疫细胞的抗体介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)在给药后增大至少5％，例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少100％。

优选地，该抗体和ALT-803增加血液NK细胞、T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞或单核细胞计数或活性的水平。在一些情况下，该抗体和ALT-803刺激CD4⁺或CD8⁺T细胞以杀伤肿瘤细胞或自身免疫/炎症相关免疫细胞。在另一种情况下，该抗体和ALT-803刺激NK细胞杀伤肿瘤细胞或自身免疫/炎症相关免疫细胞。该抗体和ALT-803刺激中性粒细胞或单核细胞以杀伤肿瘤细胞或自身免疫/炎症相关免疫细胞。给予抗体和ALT-803导致肿瘤细胞或自身免疫/炎症相关免疫细胞数量的减少。可替代地或另外地，抗体和ALT-803的给药导致瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病的疾病进展减慢。与未治疗的受试者相比，给予该抗体和ALT-803导致该受试者的存活延长。优选地，该受试者是人。

在一个方面，同时给予该抗体和ALT-803。在另一方面，依次给予该抗体和ALT-803。优选地，给药预防瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病的未来复发。

还提供了用于治疗瘤形成的试剂盒，该试剂盒包含有效量的ALT-803、抗CD38抗体和使用该试剂盒治疗瘤形成的说明。类似地，提供了用于治疗自身免疫疾病或炎性疾病的试剂盒，该试剂盒包含有效量的ALT-803、抗CD38抗体、以及使用该试剂盒治疗自身免疫疾病或炎性疾病的说明。

通过以下进行杀伤表达CD38抗原的患病细胞或疾病相关细胞的方法：用有效量的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc复合物(ALT-803)处理免疫细胞，并将ALT-803处理的免疫细胞与抗CD38抗体和表达CD38抗原的患病细胞或疾病相关细胞混合，并杀伤患病细胞或疾病相关细胞。例如，与未用ALT-803治疗的免疫细胞介导的相比，患病细胞杀伤的水平增加至少5％，例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。ALT-803处理的免疫细胞直接杀伤患病细胞或疾病相关细胞。在一个方面，ALT-803处理的免疫细胞刺激其他免疫细胞以杀伤患病细胞或疾病相关细胞。例如，经由ALT-803处理的免疫细胞和抗CD38抗体通过ADCC或ADCP介导患病细胞或疾病相关细胞的杀伤。示例性疾病相关细胞包括肿瘤细胞。在一些情况下，该疾病相关细胞与自身免疫疾病或炎性疾病有关。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有由本发明所属领域技术人员通常所理解的意义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典](第2版.1994)；The Cambridge Dictionary of Science andTechnology[剑桥科学技术词典](Walker编辑,1988)；The Glossary of Genetics[遗传学术语],第5版,R.Rieger等人(编辑),Springer Verlag[施普林格出版社](1991)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology[哈珀柯林斯生物学词典](1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有下文所赋予的含义。

“药剂”是指肽、核酸分子、或小化合物。示例性治疗剂是ALT-803。

“ALT-803”是指包含与二聚体IL-15RαSu/Fc融合蛋白非共价缔合的IL-15N72D并具有免疫刺激活性的复合物。在一个实施例中，该IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白相对于参考序列包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸变化。以下提供示例性IL-15N72D氨基酸序列。

“改善”意指减少、压制、减弱、减轻、阻止或稳定疾病的发展或进展。

所谓“类似物”意指不是相同的但是具有类似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留了对应的天然存在的多肽的生物活性，同时相对于天然存在的多肽具有某些增强该类似物的功能的生物化学修饰。此类生物化学修饰可以增加该类似物的蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然氨基酸。

本发明包括抗体或此类抗体的片段，只要它们表现出所希望的生物活性。还包括在本发明中的是嵌合抗体，例如人源化抗体。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。例如，可以使用本领域所述的方法，通过用啮齿动物互补决定区的至少一部分取代人抗体的相应区域进行人源化。

本文中使用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们展现所需生物活性即可。术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”在本文中可互换地使用。

“抗体样”分子是指与抗体相比具有相似结构和/或类似功能的分子。示例性抗体样分子包括包含抗原结合结构域的分子(例如，单链抗体、Fab、Fv、T细胞受体结合结构域、配体结合结构域或受体结合结构域)。

“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰该抗体的诊断或治疗应用的材料，并且可以包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施例中，该抗体是纯化至：(1)通过Lowry法测定的抗体重量大于95％，且最优选重量大于99％；(2)通过使用旋转杯测序仪，其程度足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基；或者(3)使用考马斯蓝或优选银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE测定的均匀。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。

基本的四链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元连同另外的称为J链的多肽组成，并且因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合以形成包含2-5个基本的4链单元与J链的多价组合。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条轻L链与H链通过一个共价二硫键连接，而两条H链通过一个或多个二硫键(取决于H链同种型)相互连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端具有可变结构域(V_H)，随后是α和γ链中每一条的三个恒定结构域(C_H)，以及μ和ε同种型的四个C_H结构域。每条L链在N末端具有可变结构域(V_L)，在其另一端具有恒定结构域(C_L)。V_L与V_H对齐，并且C_L与重链的第一恒定结构域(C_H1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。V_H和V_L的配对一起形成单个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见，例如，Basic andClinical Immunology[基础免疫学和临床免疫学],第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑),Appleton&Lange[阿普尔顿和兰格出版社],诺瓦克,康涅狄格州,1994,第71页,和第6章。

来自任何脊椎动物物种的L链基于其恒定结构域(C_L)的氨基酸序列可以被指定为两种明显相异的类型之一，称为κ和λ。取决于其重链(C_H)的恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于C_H序列和功能的相对较小差异，γ和α类进一步分为亚类，例如，人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。

术语“可变”是指V结构域的某些区段在抗体之间的序列差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性不是均匀分布在可变结构域的110个氨基酸跨度上。相反，V区由15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变的区段组成，这些区域由被称为“高变区”的较短区域(每个区域长9-12个氨基酸)分隔。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用β片层构型的四个FR，其通过三个高变区连接，这三个高变区连接形成连接β片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区由FR维持密切接近地在一起，并且与来自另一链的高变区一起对形成抗体的抗原结合部位作出贡献(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)[“具有免疫学目的蛋白的序列”，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，1991年])。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，V_L中的残基约24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，和V_H中的残基约31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近(根据Kabat编号系统的编号)；Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)[“具有免疫学目的蛋白的序列”，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，1991年])；和/或来自“高变环”的那些残基(例如，V_L中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和V_H中的26-32(H1)、52-56(H2)和95-101(H3)(根据Chothia编号系统的编号)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))；和/或来自“高变环”/CDR的那些残基(例如，V_L中的残基27-38(L1)、56-65(L2)和105-120(L3)，和V_H中的27-38(H1)、56-65(H2)和105-120(H3)(根据IMGT编号系统的编号)；Lefranc,M.P.等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]27:209-212(1999),Ruiz,M.等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]28:219-221(2000))。任选地，抗体在V_L中的以下点28、36(L1)、63、74-75(L2)和123(L3)，以及在V_H中的以下点28、36(H1)、63、74-75(H2)和123(H3)中的一个或多个处具有对称插入，(根据AHo编号)；Honneger,A.和Plunkthun,A.J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]309:657-670(2001))。

如本文使用的，术语“单克隆抗体”指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即构成群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原性位点。此外，与多克隆抗体制剂(其包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以不被其他抗体污染地合成。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，可用于本发明中有用的单克隆抗体可以通过Kohler等人，Nature[自然],256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用细菌、真核动物或植物细胞中的重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。还可以使用例如，在Clackson等人,Nature[自然]352:624-628(1991))和Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222:581-597(1991))中描述的技术自噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。

单克隆抗体包括“嵌合的”抗体，其中重和/或轻链的一部分与对应的衍生自一个特定种类的抗体或属于一个特定抗体种类或亚类的序列相同或同源，而该一个或多个链的其余部分是与衍生自另一个种类的抗体的或属于另一个抗体种类或亚类的抗体连同此种抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可(参见美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:6851-6855(1984))。还提供了衍生自人抗体的可变结构域抗原结合序列。因此，本文主要感兴趣的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(例如，CDR)并含有一个或多个衍生自非人抗体的序列(例如，FR或C区序列)的抗体。另外，本文主要感兴趣的嵌合抗体包括包含一个抗体类别或亚类的人可变结构域抗原结合序列和另一个序列(例如衍生自另一抗体类别或亚类的FR或C区序列)的嵌合抗体。本文感兴趣的嵌合抗体还包括含有与本文所述的嵌合抗体相关的或衍生自不同物种(例如非人灵长类动物(例如，旧大陆猴，猿等))的可变结构域抗原结合序列的嵌合抗体。嵌合抗体还包括灵长类化和人源化抗体。

另外，嵌合抗体可以包括未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。作出这些修饰以进一步改进抗体性能。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然]321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然]332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[当前结构生物学观点]2:593-596(1992)。

通常，“人源化抗体”被认为是具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基的人源化抗体。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们是典型地取自一种“输入”可变结构域。可遵循Winter和合作者(Jones等人,Nature[自然]321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature[自然]332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science[科学]239:1534-1536(1988))的方法，通过将输入高变区序列取代为相应的人抗体序列传统地进行人源化。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。

“人抗体”是仅含有存在于人天然产生的抗体中的序列的抗体。然而，如本文所用，人抗体可包含在天然存在的人抗体中未发现的残基或修饰，包括本文所述的那些修饰和变体序列。这些通常用于进一步改善或增强抗体性能。

“完整”抗体是包含抗原结合位点以及C_L和至少重链恒定结构域C_H 1，、C_H 2和C_H 3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870；Zapata等人，Protein Eng.[蛋白质工程]8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。

短语抗体的“功能片段或类似物”是具有与全长抗体相同的定性生物学活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能片段或类似物是能够以以下方式结合IgE免疫球蛋白的抗体，该方式使得防止或基本上降低此类分子具有结合高亲和力受体(Fc_εRI)的能力的能力。

木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残留的“Fc”片段(此名称反映了易于结晶的能力)。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(V_H)以及一条重链(C_H 1)的第一恒定结构域组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生了单个大的F(ab’)₂片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的区别在于在包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸的C_H1结构域的羧基末端具有另外的残基。Fab'-SH是本文对于Fab'的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离巯基。F(ab')₂抗体片段最初是作为Fab'片段对(在其之间有铰链半胱氨酸)生产的。抗体片段的其他化学偶联反应也是已知的。

“Fc”片段包含通过二硫化物维持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定，该区也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。

“Fv”是最小抗体片段，其含有完整抗原识别位点和抗原结合位点。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(来自H链和L链的各三个环)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体与抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含3个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然通常以比完整结合位点更低的亲和力进行。

“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的V_H和V_L抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含在V_H和V_L结构域之间的一种多肽接头，该多肽接头使得sFv形成所希望的用于抗原结合的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun的ThePharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约,第269-315页(1994)；Borrebaeck1995,下文。

术语“双抗体”是指通过以下制备的小抗体片段：构建具有V_H和V_L结构域之间的短接头(约5-10个残基)的sFv片段(参见前段)，使得V结构域的链间但不是链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的V_H和V_L结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更全面地描述于，例如，EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],90:6444-6448(1993)。

如本文所用，“内化”的抗体是在与哺乳动物细胞(例如细胞表面多肽或受体)上的抗原结合后被细胞摄取(即进入)的抗体。内化抗体当然包括抗体片段、人或嵌合抗体和抗体缀合物。对于某些治疗应用，考虑了体内内化。内化的抗体分子的数量足以或充分以杀伤细胞或抑制其生长，尤其是受感染的细胞。取决于抗体或抗体偶联物的效力，在一些情况下，将单个抗体分子吸收到细胞中足以杀灭该抗体所结合的靶细胞。例如，某些毒素在杀伤时高度有效，使得与抗体缀合的一个毒素分子的内化足以杀伤受感染的细胞。

如本文所用，如果抗体以可检测的水平与抗原以如下亲和常数K_a反应，则抗体被称为“免疫特异性的”，对于抗原“特异性的”或“特异性结合”至抗原的，所述亲和常数K_a大于或等于约10⁴M^-1、或大于或等于约10⁵M^-1、大于或等于约10⁶M^-1、大于或等于约10⁷M^-1、或大于或等于10⁸M^-1。抗体对其同源抗原的亲和力通常也表示为解离常数K_D，并且在某些实施方案中，如果HuM2e抗体结合的K_D小于或等于10^-4M、小于或等于约10^-5M、小于或等于约10^-6M、小于或等于10^-7M、或小于或等于10^-8M，则HuM2e抗体特异性结合M2e。抗体的亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如，由Scatchard等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA[美国纽约科学院年刊]51:660(1949))等人描述的那些。

抗体与其抗原、细胞或组织的结合特性通常可以使用免疫检测方法(包括例如基于免疫荧光的测定，例如免疫组织化学(IHC)和/或荧光活化细胞分选(FACS))确定和评估。

具有指定抗体的“生物学特征”的抗体是具有指定抗体的一种或多种生物学特征的抗体，该一种或多种生物学特征使该抗体与其他抗体区分开。例如，在某些实例中，具有指定抗体的生物学特征的抗体将结合与指定抗体结合的表位相同的表位和/或具有与指定抗体共同的效应子功能。术语“拮抗剂”抗体以最广泛的含义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制或中和其特异性结合的表位、多肽或细胞的生物活性的抗体。鉴定拮抗剂抗体的方法可包括使候选拮抗剂抗体特异性结合的多肽或细胞与候选拮抗剂抗体接触，并测量通常与多肽或细胞相关的一种或多种生物活性的可检测变化。

抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；和B细胞活化。

“与分子结合”意指对于该分子具有物理化学亲和力。

“对照”或“参考”意指对比的标准。在一个方面，如本文所用，“与对照相比改变的”样品或受试者被理解为具有与来自正常、未处理或对照的样品在统计学上不同的水平。对照样品包括例如培养的细胞、一种或多种实验室测试动物、或一种或多种人类受试者。选择和测试对照样品的方法在本领域技术人员的能力范围内。分析物可以是由细胞或生物特征性表达或产生的天然存在的物质(例如，抗体、蛋白质)或由报道构建体产生的物质(例如，β-半乳糖苷酶或荧光素酶)。根据用于检测的方法，变化的量和测量值可以改变。统计显着性的确定在本领域技术人员的能力范围内，例如，构成阳性结果的平均值的标准偏差的数值。

“检测”是指识别待检测的分析物的存在、不存在或量。

所谓“疾病”意指损害或妨碍细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或障碍。疾病的实例包括瘤形成和自身免疫疾病和炎性疾病。

术语配制品或配制品组分的“有效量”和“治疗有效量”是指单独地或呈组合形式的配制品或组分的以提供所希望的效果的足够的量。例如，“有效量”是指相对于未经治疗的患者，改善疾病症状所需的单独地或呈组合形式的化合物的量。用于实施本发明以治疗性地处理疾病的一种或多种活性化合物的有效量随给药方式，受试者的年龄、体重以及总体健康状况而变化。最终地，主治医生或兽医会决定适当的量以及给药方案。这样的量被称为“有效”量。

所谓“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。此部分优选地包含参考核酸分子或多肽的整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。例如，片段可以包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个核苷酸或氨基酸。然而，本发明还包含多肽和核酸片段，只要它们分别展现出全长多肽和核酸的所希望的生物活性。使用几乎任何长度的核酸片段。例如，具有总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对长度(包括所有中间长度)的说明性的多核苷酸区段包括在本发明的许多实施方式中。类似地，使用几乎任何长度的多肽片段。例如，具有总长度为约10,000、约5,000、约3,000、约2,000、约1,000、约5,000、约1,000、约500、约200、约100、或约50个氨基酸长度(包括所有中间长度)的说明性的多肽区段包括在本发明的许多实施方式中。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指不同程度上不含在天然状态下发现的通常伴随其的组分的物质。“分离”表示与原始来源或周围环境的分离程度。“纯化”表示高于分离的分离度。

“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质充分地不含其他物质，使得任何杂质不会实质上影响蛋白质的生物学特性或引起其他不利后果。换言之，当通过重组DNA技术产生时，如果本发明的核酸或肽基本上不含细胞物质、病毒物质、或培养基时，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品时，则本发明的核酸或肽是纯化的。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以进行修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，这些蛋白质可以被单独纯化。

类似地，“基本上纯的”意指已经从天然伴随其的组分分离的核苷酸或多肽。典型地，当核苷酸和多肽按重量计至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％不含与它们天然关联的蛋白质和天然存在的有机分子时，它们是基本上纯的。

“分离的核酸”是指核酸，其不含在衍生其的生物的天然存在的基因组中与其侧翼的基因。该术语涵盖例如：(a)DNA，该DNA是天然存在的基因组DNA分子的一部分，但侧翼不是如下两个核酸序列，所述两个核酸序列在天然存在该分子的该部分的生物的基因组中侧翼于该分子的该部分；(b)核酸，其以某种方式掺入载体或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中，使得所得分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不同；(c)单独的分子，例如cDNA，基因组片段，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，或限制性片段；和(d)重组核苷酸序列，该重组核苷酸序列是杂交基因(即，编码融合蛋白的基因)的一部分。根据本发明分离的核酸分子进一步包括合成产生的分子，以及已经被化学改变和/或具有经修饰的骨架的任何核酸。例如，分离的核酸是经纯化的cDNA或RNA多核苷酸。分离的核酸分子还包括信使核糖核酸(mRNA)分子。

所谓“分离的多肽”意指从天然伴随它的组分中分离的本发明的多肽。典型地，当该多肽以重量计为至少60％时，将它与它天然关联的蛋白质和天然存在的有机分子分离。优选地，该制剂是以重量计至少75％，更优选是至少90％，并且最优选是至少99％的本发明的多肽。本发明的分离的多肽可以例如通过从天然源提取、通过表达编码这样一种多肽的重组核酸或通过化学合成该蛋白而获得。可以通过任何适当的方法测量纯度，例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析。

“标志物”是指具有在与疾病或障碍相关的表达水平或活性方面改变的任何蛋白质或多核苷酸。

“瘤形成”是指特征在于过度增殖或凋亡减少的疾病或障碍。可以使用本发明的示例性肿瘤包括但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、华氏巨球蛋白血症、重链病和实体瘤例如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和食道癌、头颈癌、直肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、成肾细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤及成视网膜细胞瘤)。在特别的实施例中，瘤形成是多发性骨髓瘤、β细胞淋巴瘤、尿路上皮/膀胱癌、或黑色素瘤。如本文所使用的，如在“获得药剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方式获得药剂。

“减少”是指至少5％、10％、25％、50％、75％、或100％的负的改变。

“参考序列”是定义的用作序列比较的基础的序列。参考序列可以是指定序列的亚集或整体；例如，全长cDNA或基因序列的区段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽而言，参考多肽序列的长度将通常是至少约16个氨基酸、优选至少约20个氨基酸、更优选至少约25个氨基酸，并且甚至更优选约35个氨基酸、约50个氨基酸、或约100个氨基酸。对于核酸而言，参考核酸序列的长度通常是至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，并且甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或它们附近的或者它们之间的任一整数。

“特异性结合”意指一种化合物或抗体识别并且结合本发明的多肽，但是基本上并不识别并且结合样品(例如，天然包含本发明的多肽的生物样品)中的其他分子。

在本发明的方法中有用的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％一致，但是将典型地展示出基本一致性。与内源序列具有“基本一致性”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。在本发明的方法中有用的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％一致，但是将典型地展示出基本一致性。与内源序列具有“基本一致性”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。所谓“杂交”意指在不同的严格条件下进行配对以在互补的多核苷酸序列(例如，在此描述的基因)或其部分之间形成双链分子。(参见，例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.[酶学方法]152:507)。

例如，严格的盐浓度通常将是小于约750mM的NaCl和75mM的柠檬酸三钠，优选小于约500mM的NaCl和50mM的柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mM的NaCl和25mM的柠檬酸三钠。在缺少有机溶剂(例如，甲酰胺)下可以获得低严格杂交，而在至少约35％甲酰胺，并且更优选至少约50％甲酰胺存在下可以获得高严格杂交。严格的温度条件将通常包括至少约30℃，更优选至少约37℃，并且最优选至少约42℃的温度。不同的另外的参数，如杂交时间、清洁剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度以及载体DNA的包含或排除，对本领域的普通技术人员是熟知的。根据需要通过组合这些不同的条件实现不同的严格水平。在一个优选实施例中，杂交将会在30℃下，在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在一个更优选的实施例中，杂交将在37℃，在500mM的NaCl、50mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、35％的甲酰胺以及100mu.g/ml的变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中发生。在一个最优选的实施例中，杂交将会在42℃下，在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺以及200μg/ml ssDNA中发生。这些条件的有用变化对于本领域的普通技术人员应是容易地显而易见的。

对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤也将会在严格度方面不同。可以通过盐浓度和温度限定洗涤严格条件。如上所述，通过降低盐浓度或通过增加温度可以增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度将为优选地小于约30mM的NaCl和3mM的柠檬酸三钠，并且最优选地小于约15mM的NaCl和1.5mM的柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件将通常包括至少约25℃，更优选至少约42℃，并且甚至更优选至少约68℃的温度。在一个优选实施例中，洗涤步骤将会在25℃下，在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将在42℃、在15mM的NaCl、1.5mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将会在68℃下，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。这些条件的另外的变化对于本领域的普通技术人员应是容易地显而易见的。杂交技术是本领域的技术人员熟知的并且描述于例如Benton和Davis(Science[科学]196:180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA[美国国家科学院院刊]72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验手册]，Wiley Interscience[威利国际科学]，纽约,2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques[分子克隆技术指南],1987,Academic Press[学术出版社],纽约)；以及Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆实验指南],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约中。

所谓“基本上一致”意指相对于参考氨基酸序列(例如，在此描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，在此描述的任一核酸序列)，一种多肽或核酸分子展示出至少50％一致性。优选地，这样的一个序列与用于比较的序列在氨基酸水平或核酸上至少60％，更优选80％或85％，并且更优选90％、95％或甚至99％一致。

典型地使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心(麦迪逊大学道1710，威斯康星州53705(1710University Avenue，Madison，Wis.53705))遗传计算组的序列分析软件包，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列一致性。这种软件可以通过对不同取代、缺失和/或其他修饰的同源性程度进行赋值而将相同或相似的序列进行匹配。保守取代典型地包括在以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。在一种确定一致性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中在e^-3与e^-100之间的概率得分指示紧密相关的序列。

“受试者”是指哺乳动物，包括但不局限于，人或非人类哺乳动物，如牛、马、犬、绵羊、或猫。受试者优选是需要这种治疗的哺乳动物，例如，已被诊断为患有B细胞淋巴瘤或其易感性的受试者。该哺乳动物是任何哺乳动物，例如人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马，以及生长为食品消费的牲畜或动物，例如牛、羊、猪、鸡、和山羊。在优选的实施例中，该哺乳动物是人。

在此提供的范围被理解为对该范围内的所有值的简写。例如，1到50的范围应当被理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，该组由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50。

如本文所使用的术语“治疗(“treating”和“treatment”)”是指将药剂或配制品给予患有不良病症、障碍或疾病的临床症状性个体，以便实现症状严重性和/或频次的降低、消除症状和/或其潜在原因、和/或促进损害的改善或补救。应理解的是，尽管不能排除，治疗障碍或病症并不要求完全地消除该障碍、病症或与其相关的症状。

具有瘤形成的患者的治疗可包括以下任何一种：辅助疗法(也称为辅助治疗或辅助性治疗)，以消除在通过初始疗法(例如手术)移除已知肿瘤后可能存在的残留肿瘤细胞，从而防止可能的癌症再次发生；在外科手术之前给予的新辅助疗法以缩小癌症；诱导疗法，以引起缓解，通常针对急性白血病；一旦达到缓解就给予的巩固疗法(也称为强化疗法)，以维持缓解；以较低或较少频次的剂量给予的维持疗法，以协助延长缓解；一线疗法(还称为标准疗法)；如果疾病在一线治疗后没有应答或复发，则给予二(或三、四等)线疗法(还被称为挽救疗法)；以及解决症状管理而不期望显着减少癌症的姑息性疗法(还被称为支持性疗法)。

术语“预防(“preventing”和“prevention”)”是指将药剂或组合物给予易感或易患特定不良病症、障碍或疾病的临床无症状的个体，并因此涉及预防症状的发生和/或其潜在原因。

除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“一个、一种(a、an)”和“该(the)”被理解为单数的或复数的。

除非明确规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的，术语“约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。约可以被理解为在规定的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非另外从上下文清楚可见，否则在此提供的所有数值均被术语约修饰。

在此的变量的任何定义中，化学基团列表的陈述包括该变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。针对在此的变量或方面的实施例的陈述包括该实施例作为任何单一实施例或与任何其他实施例或其部分的组合。

在此提供的任何组合物或方法可以与在此提供的一个或多个任何其他组合物和方法进行组合。

过渡性术语“包括”(comprising)与“包括”(including)、“含有”(containing)或“由……表征”(characterized by)同义，是包含性的或开放性的，并且不排除另外的未列举的元件或方法步骤。相比之下，过渡性短语“由……组成”排除在权利要求书中未指定的任何元件、步骤或成分。过渡性短语“基本上由……组成”将一项权利要求的范围限制到指定的材料或步骤、“以及本质上不影响所要求保护的本发明的一个或多个基本和新颖特征的那些”。

本发明的其他特征和优点将从下面对其优选实施例的描述以及从权利要求书中显而易见。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似或等同于本文中描述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文引用的所有公开的外文专利和专利申请都通过引用并入本文。由本文引用的登录号指示的Genbank和NCBI提交内容通过引用并入本文。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献都通过引用并入。在发生冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。此外，这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。

附图说明

图1是证明ALT-803对人外周血单核细胞(PBMC)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)定向的抗CD38抗体对抗血液肿瘤细胞的作用的条形图。人PBMC用作效应细胞，CellTrace紫(CellTrace Violet)标记的Daudi细胞是靶标(E:T比例5:1)，其中无刺激(未处理)、ALT-803(10nM)、抗CD38抗体(10nM)或ALT-803(10nM)加抗CD38抗体(10nM)。2天后，通过流式细胞术确定Daudi细胞死亡(用碘化丙锭染色阳性)。条形代表来自4个独立供体的PMBC的平均值±SEM。

图2A是证明ALT-803对人PBMC ADCC定向的抗CD38抗体对抗血液肿瘤细胞的浓度依赖性作用的条形图。将新鲜分离的PBMC与不同浓度的ALT-803(含有和不含10nM抗CD38抗体)一起孵育。2天后，如图1中所述确定针对Daudi肿瘤靶细胞(E:T比例2:1)的ADCC活性。条形代表来自4个独立供体的PMBC的平均值±SEM。图2B是证明使用图2A中描述的方法具有或不具有10nM ALT-803的抗CD38抗体对针对Daudi细胞的人PBMC ADCC的浓度依赖性作用的线形图。显示了来自2个不同供体的结果，图2C是证明ALT-803对人自然杀伤(NK)细胞ADCC定向的抗CD38抗体对抗血液肿瘤细胞的浓度依赖性作用的条形图。将新鲜纯化的人NK细胞(>90％CD56⁺CD3^-)与不同浓度的ALT-803(含有和不含10nM抗CD38抗体)一起孵育。2天后，如图1中所述确定针对Daudi肿瘤靶细胞(E:T比例2:1)的ADCC活性。条形代表来自4个独立供体的NK细胞的平均值±SEM。

图3是显示ALT-803加抗CD38抗体治疗在减轻荷Daudi细胞肿瘤的小鼠的骨髓中的肿瘤负荷方面的功效的条形图。在第0天，用1x 10⁷个Daudi细胞注射(i.v.)严重组合免疫缺陷(SCID)小鼠。用PBS(载体，i.v.)、抗CD38抗体(10mg/kg，i.v.)、ALT-803(0.2mg/kg，皮下)或抗CD38抗体(10mg/kg)加ALT-803(0.2mg/kg，皮下)i.v.处理荷瘤小鼠(每组6只小鼠)。在肿瘤细胞接种后第5天给予抗CD38抗体(Dara)，并且在肿瘤细胞接种后第17天给予ALT-803。如所示，在第15天，一些小鼠也用类固醇(0.2μg氢化可的松/剂i.p.)处理。通过流式细胞仪定量注射后第22天骨髓(BM)中Daudi细胞(human HLA-DR⁺)的百分比。*，P<0.05；****P<0.0001。

图4是证明ALT-803和抗CD38抗体的组合能够延长荷Daudi细胞肿瘤的小鼠的存活的线形图。在第0天，用1x 10⁷个Daudi细胞注射(i.v.)SCID小鼠。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(载体，i.v.)、抗CD38抗体(10mg/kg，i.v.)、ALT-803(0.2mg/kg，皮下)或抗CD38抗体(10mg/kg)加ALT-803(0.2mg/kg，皮下)i.v.处理荷瘤小鼠(每组6只小鼠)。PBS组小鼠除外，所有组的小鼠均接受类固醇(0.2mg/小鼠，腹膜内)以减少输注前反应。在肿瘤细胞接种后第5天给予抗CD38抗体(DARA)，并且在肿瘤细胞接种后第17天给予ALT-803。在第22天，各组接受PBS(载体，i.v.)、抗CD38抗体(10mg/kg，i.v.)、ALT-803(0.2mg/kg，皮下)或抗CD38抗体(10mg/kg)加ALT-803(0.2mg/kg，皮下)的第二处理。在第22天，小鼠未用类固醇治疗。监测小鼠存活并显示Kaplan-Meier分析。****P<0.0001。

图5显示了一系列流式细胞术图，证明了ALT-803与抗CD38抗体组合对巨噬细胞介导的体内Daudi肿瘤细胞吞噬作用的影响。将PKH67标记的人THP-1巨噬细胞和CellTrace紫(CellTrace Violet)标记的Daudi细胞与PBS(US)、10nM抗CD38抗体和/或10nM ALT-803在存在或不存在NK-92细胞(aNK细胞)下共培养(E:T比例为1:1)。24小时后，通过流式细胞术测量吞噬的Daudi肿瘤细胞(由右上象限中PKH67⁺CellTrace紫⁺THP-1细胞代表)的百分比。

具体实施方式

本发明至少部分基于以下惊人发现：抗体与ALT-803(白介素-15(IL-15)超激动剂突变体和二聚体IL-15受体α/Fc融合蛋白的复合物)组合，可用于增强针对瘤形成(例如，胶质母细胞瘤、前列腺癌、血液学癌症、B细胞赘生物、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、实体瘤、尿路上皮/膀胱癌、黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌、头颈癌、结肠直肠癌和卵巢癌)或自身免疫疾病或炎性疾病的免疫应答。

ALT-803

ALT-803包含IL-15突变体，该突变体具有增加的结合IL-2Rβγ的能力和增强的生物活性(美国专利号8,507,222，通过引用并入本文)。IL-15的这种超激动剂突变体描述于出版物(J Immunol[免疫学杂志]2009 183:3598)且美国专利商标局公告了有关超激动剂的专利，并且有几项专利申请正在审批中(例如，美国序列号12/151,980和13/238,925)。与可溶性IL-15α受体融合蛋白(IL-15RαSu/Fc)组合的这种IL-15超激动剂形成具有在体外和体内高效IL-15活性的蛋白复合物(Han等人,2011,Cytokine[细胞因子],56:804-810；Xu,等人.,2013Cancer Res.[癌症研究]73:3075-86,Wong,等人.,2013,Oncolmmunology[肿瘤免疫学]2:e26442)。该IL-15超激动剂复合物(IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc)称为ALT-803。药代动力学分析表明，复合物在小鼠静脉内给予后具有25小时的半衰期。ALT-803对免疫活性小鼠中侵袭性实体瘤和血液瘤模型表现出令人印象深刻的抗肿瘤活性。使用每周两次或每周一次的静脉内剂量方案，它可以作为单一疗法被给予，或作为与抗体的组合疗法被给予。ALT-803抗肿瘤应答也是持久的。在ALT-803治疗后治愈的荷瘤小鼠对用相同肿瘤细胞再次攻击也具有高度抗性，表明ALT-803诱导针对重新引入的肿瘤细胞的有效免疫记忆应答。

白介素-15

白介素-15(IL-15)是用于效应子NK细胞和CD8⁺记忆T细胞的发育、增殖和活化的重要细胞因子。IL-15与IL-15受体a(IL-15Rα)结合并反式呈递给效应子细胞上的IL-2/IL-15受体β-共γ链(IL-15Rβγ_c)复合物。IL-15和IL-2共享与IL-15Rβγ_c的结合，并通过STAT3和STAT5途径发信号。然而，IL-2还支持CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节性T(Treg)细胞的维持并诱导活化的CD8⁺T细胞的细胞死亡。这些作用可能限制IL-2对肿瘤的治疗活性。IL-15不与IL-2共享这些免疫抑制活性。另外，IL-15是已知为效应子CD8⁺T细胞以提供抗调亡信号传导的唯一细胞因子。IL-15，无论单独给予还是作为与IL-15Rα的复合物给予，在实验动物模型中显示出针对已确认的实体瘤的有效抗肿瘤活性，并因此，已被鉴定为可以潜在治愈癌症的最有希望的免疫治疗药物之一。

为促进基于IL-15的癌症治疗剂的临床开发，鉴定了与IL-15相比具有增加的生物活性的IL-15突变体(IL-15N72D)(Zhu等人,J Immunol[免疫学杂志],183:3598-3607,2009)。通过产生IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合复合物(ALT-803)进一步改善该IL-15超激动剂(IL-15N72D)的药代动力学和生物活性，使得该超激动剂复合物具有体内天然细胞因子活性的至少25倍(Han等人,Cytokine[细胞因子],56:804-810,2011)。

IL-15:IL-15Rα蛋白质复合物

如上所述，IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合物可以指具有与天然IL-15Rα的可溶性IL-15Rα结构域非共价结合的IL-15的复合物。在一些情况下，该可溶性IL-15Rα与生物活性多肽和/或与IgG Fc结构域共价连接。IL-15可以是与第二生物活性多肽共价连接的IL-15或IL-15。IL-15:IL-15Rα蛋白质复合物的晶体结构显示在Chirifu等人,2007Nat Immunol[自然免疫学]8,1001-1007，通过引用并入本文。

在本文描绘的本发明的上述方面或任何其他方面的不同实施例中，该IL-15Rα融合蛋白包含可溶性IL-15Rα，例如，与生物活性多肽(例如，IgG的重链恒定结构域、IgG的重链恒定结构域的Fc结构域、或细胞因子)共价连接的IL-15Rα。在以上方面的本发明的其他实施例中，IL-15包含IL-15，例如，与第二生物活性多肽(例如，细胞因子)共价连接的IL-15。在其他实施例中，从宿主细胞或培养基纯化IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合物涉及在亲和试剂上捕获IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合物，该亲和试剂特异性结合IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合物。在其他实施例中，IL-15Rα融合蛋白包含IL-15Rα/Fc融合蛋白，并且亲和试剂特异性结合Fc结构域。在其他实施例中，亲和试剂是蛋白质A或蛋白质G。在其他实施例中，亲和试剂是抗体。在其他实施例中，从宿主细胞或培养基纯化IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合物包括离子交换色谱法。在其他实施例中，从宿主细胞或培养基纯化IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合物包括尺寸排阻色谱法。

在其他实施例中，IL-15Rα包含IL-15RαSushi(IL-15RαSu)。在其他实施例中，IL-15是变体IL-15(例如，IL-15N72D)。在其他实施例中，IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合物的IL-15结合位点被完全占据。在其他实施例中，IL-15:IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合物的IL-15结合位点被完全占据。在其他实施例中，基于融合蛋白复合物电荷或大小特性，将IL-15:IL-15Rα融合蛋白复合物纯化。在其他实施例中，基于融合蛋白复合物电荷特性，通过离子交换色谱法，将完全占据的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合物进行纯化。在其他实施例中，使用基于季胺的树脂(其中使用低离子强度中性pH缓冲液的结合条件和使用增加离子强度的缓冲液的洗脱条件)纯化完全占据的IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合蛋白复合物。

在本发明的可溶性融合蛋白复合物的某些实施例中，IL-15多肽是具有与天然IL-15多肽不同的氨基酸序列的IL-15变体。人IL-15多肽在本文中被称为huIL-15、hIL-15、huIL15、hIL15、IL-15野生型(wt)，并且其变体是指使用天然氨基酸，成熟序列中的其位置和变体氨基酸。例如，huIL15N72D是指包含在位置72处N至D的取代的人IL-15。在某些实施例中，例如，通过与天然IL-15多肽相比IL-15RβγC受体的增加的结合活性，证明了作为IL-15激动剂的IL-15变体功能。在某些实施例中，通过例如，与天然IL-15多肽相比IL-15RβγC受体的降低的结合活性，证明了作为IL-15拮抗剂的IL-15变体功能。在某些实施例中，与天然IL-15多肽相比，IL-15变体针对IL-15RβγC受体具有增加的结合亲和力或降低的结合活性。在某些实施例中，与天然IL-15序列相比，IL-15变体的序列具有至少一个(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个)氨基酸变化。氨基酸变化可包括在与IL-15Rβ和/或IL-15RγC相互作用的IL-15的结构域中氨基酸取代或缺失中的一种或多种。在某些实施例中，氨基酸变化是在成熟人IL-15序列的位置8、61、65、72、92、101、108、或111处的一个或多个氨基酸取代或缺失。例如，氨基酸变化是在成熟人IL-15序列的位置8处D取代为N或A、在位置61处D取代为A、在位置65处N取代为A、在位置72处N取代为R、或在位置108处Q取代为A，或这些取代中的任何组合。在某些实施例中，氨基酸变化是成熟人IL-15序列的位置72处N取代为D。

Fc结构域

ALT-803包含IL-15N72D:IL-15RαSu/Fc融合复合物。已经报道了将IgG的Fc区与另一种蛋白质(例如各种细胞因子和可溶性受体)的结构域组合的融合蛋白(参见，例如，Capon等人,Nature[自然],337:525-531,1989；Chamow等人.,Trends Biotechnol.[生物技术趋势],14:52-60,1996)；美国专利号5,116,964和5,541,087)。原型融合蛋白是通过IgGFc铰链区中的半胱氨酸残基连接的同源二聚体蛋白，产生类似于没有重链可变和C_H1结构域和轻链的IgG分子的分子。包含Fc结构域的融合蛋白的二聚体性质可在提供与其他分子的更高级相互作用(即二价或双特异性结合)中是有利。由于结构同源性，Fc融合蛋白显示出与具有相似同种型的人IgG相当的体内药代动力学特征。IgG类免疫球蛋白是人体血液中含量最丰富的蛋白质，其循环半衰期可长达21天。为延长IL-15或IL-15融合蛋白的循环半衰期和/或增加其生物活性，已经制备了含有与IL-15RαSu非共价结合的IL-15结构域的融合蛋白复合物(例如，ALT-803)，该IL-15RαSu与人重链IgG蛋白质的Fc部分共价连接。

术语“Fc”意指抗体的非抗原结合片段。此类“Fc”可以是单体或多聚体形式。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选是人来源的，并且可以是任何免疫球蛋白，尽管IgG1和IgG2是优选的。天然Fc’由单体多肽组成，这些单体多肽可通过共价(即二硫键)和非共价缔合而连接成二聚体或多聚体形式。取决于类(例如，IgG、IgA、IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)，天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目在从1至4的范围内。天然Fc的一个实例是由IgG的木瓜蛋白酶消化产生的二硫键连接的二聚体(参见Ellison等人(1982),Nucleic Acids Res.[核酸研究]10:4071-9)。如本文所使用的术语“天然Fc”对于单体、二聚体和多聚体形式是通用的。Fc结构域含有蛋白质A、蛋白质G、各种Fc受体和补体蛋白的结合位点。

在一些实施例中，术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰的分子或序列，但仍包含针对补救受体FcRn的结合位点。国际申请WO 97/34631(1997年9月25日公开的)和WO 96/32478描述了示例性Fc变体，以及与补救受体的相互作用，并且特此通告引用并入。因此，术语“Fc变体”包含从非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被去除的位点，因为它们提供了对于本发明的融合分子不需要的结构特征或生物活性。因此，在某些实施例中，术语“Fc变体”包含缺乏一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列，这些分子或序列影响或参与：(1)二硫键形成；(2)与所选的宿主细胞的不相容性；(3)在所选的宿主细胞中表达后的N-末端异质性；(4)糖基化；(5)与补体的相互作用；(6)与补救受体以外的Fc受体的结合；(7)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；或(8)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。Fc变体在下文中被进一步详细描述。

术语“Fc结构域”涵盖如上定义的天然Fc和Fc变体分子以及序列。与Fc变体和天然Fc’的变体一样，术语“Fc结构域”包括呈单体或多聚体形式的分子，无论从完整抗体消化的还是通过重组基因表达或通过其他方式产生的。

接头

在一些情况下，本发明的融合蛋白复合物还包括插入IL-15或IL-15Rα结构域之间的柔性接头序列。接头序列应允许多肽关于IL-15或IL-15Rα结构域的有效定位，以允许两个结构域的功能活性。

在某些情况下，可溶性融合蛋白复合物具有接头，其中第一多肽通过多肽接头序列与IL-15(或其功能片段)共价连接。在其他方面，如本文所述的可溶性融合蛋白复合物具有接头，其中第二多肽通过多肽接头序列与IL-15Rα多肽(或其功能片段)共价连接。

接头序列优选由核苷酸序列编码，该核苷酸序列产生可以有效定位用于识别呈递抗原的TCR分子的或用于识别抗原的抗体分子的结合结构域的结合槽的肽。如本文所用，短语“生物活性多肽关于IL-15或IL-15Rα结构域的有效定位”或其他类似短语旨在表示与IL-15或IL-15Rα结构域连接的生物活性多肽被定位，使得IL-15或IL-15Rα结构域能够彼此相互作用以形成蛋白质复合物。例如，IL-15或IL-15Rα结构域被有效定位以允许与免疫细胞相互作用以启动或抑制免疫反应，或抑制或刺激细胞发育。

本发明的融合蛋白复合物优选地还包括插入IL-15或IL-15Rα结构域和免疫球蛋白Fc结构域之间的柔性接头序列。接头序列应允许Fc结构域、生物活性多肽和IL-15或IL-15Rα结构域的有效定位以允许每个结构域的功能性活性。例如，Fc结构域被有效定位以允许适当的融合蛋白复合物形成和/或与在补体系统的免疫细胞或蛋白质上的Fc受体相互作用以刺激Fc介导的作用，包括调理素作用，细胞裂解，肥大细胞、嗜碱性粒细胞、和嗜酸性粒细胞的脱粒，以及其他的Fc受体依赖性过程；补体途径的活化；以及融合蛋白复合物的增强的体内半衰期。

还可以将接头序列用于连接生物活性多肽的两个或更多个多肽，以产生具有所需功能活性的单链分子。

优选地，接头序列包含从约7至20个氨基酸，更优选从约10至20个氨基酸。接头序列优选是柔性的，以便不将生物活性多肽或效应子分子以单一的不希望的构象保持。可以使用接头序列，例如使识别位点与经融合的分子间隔开。具体地，可以将肽接头序列在生物活性多肽和效应子分子之间定位，例如，以将其化学交联并提供分子柔性。接头优选主要包含具有小侧链的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，以提供柔性。优选地，约80％或90％或更多的接头序列包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基(特别是甘氨酸和丝氨酸残基)。

可以使用不同的接头序列，包括已成功用于将抗体可变区连接在一起的许多柔性接头设计中的任何一种(参见，Whitlow,M.等人,(1991)Methods:A Companion to Methodsin Enzymology[方法：与酶学方法的比较],2:97-105)。

融合蛋白复合物

本发明提供了ALT-803，它是IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc之间的蛋白复合物。在某些实施例中，该ALT-803多肽可以用作与其他蛋白结构域融合的支架。在此类融合蛋白复合物中，第一融合蛋白质包含与白介素-15(IL-15)或其功能片段共价连接的第一生物活性多肽；且第二融合蛋白包含与可溶性白介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其功能片段共价连接的第二生物活性多肽，其中第一融合蛋白的IL-15结构域与第二融合蛋白的可溶性IL-15Rα结构域结合以形成可溶性融合蛋白复合物。本发明的融合蛋白复合物还包含与第一和第二融合蛋白中的一者或两者连接的免疫球蛋白Fc结构域或其功能片段。优选地，第一和第二融合蛋白连接的Fc结构域相互作用以形成融合蛋白复合物。可以通过免疫球蛋白Fc结构域之间的二硫键形成来稳定此类复合物。在某些实施例中，本发明的可溶性融合蛋白复合物包括IL-15多肽、IL-15变体或其功能片段和可溶性IL-15Rα多肽或其功能片段，其中IL-15和IL-15Rα多肽中的一者或两者进一步包括免疫球蛋白Fc结构域或其功能片段。

在另外的实施例中，第一和第二生物活性多肽中的一者或两者包含抗体或其功能片段。

在另一个实施例中，针对抗体结构域的抗原包含细胞表面受体或配体。

在另外的实施例中，抗原包含CD抗原、细胞因子或趋化因子受体或配体、生长因子受体或配体、组织因子、细胞黏附分子、MHC/MHC样分子、Fc受体、Toll样受体、NK受体、TCR、BCR、阳性/阴性共刺激受体或配体、死亡受体或配体、肿瘤相关抗原、或病毒编码的抗原。

如本文使用的，术语“生物活性多肽”或“效应子分子”意指氨基酸序列，例如蛋白质、多肽或肽；糖或多糖；脂质或糖脂、糖蛋白、或脂蛋白，它们可以产生如本文所讨论的所希望的作用。效应子分子还包括化学药剂。还考虑了编码生物活性或效应子蛋白、多肽、或肽的效应子分子核酸。因此，适合的分子包括调节因子、酶、抗体、或药物以及DNA、RNA、和寡核苷酸。生物活性多肽或效应子分子可以是天然存在的或可以从已知的组分合成，例如，通过重组或化学合成，并且可以包括异源组分。如通过标准分子定量技术(例如，离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)的判断，生物活性多肽或效应子分子通常在约0.1KD至100KD之间或更高至约1000KD，优选地在约0.1KD、0.2KD、0.5KD、1KD、2KD、5KD、10KD、20KD、30KD和50KD之间。本发明的所希望的效果包括但不限于例如，形成具有增加的结合活性的本发明的融合蛋白复合物，杀伤靶细胞，例如诱导细胞增殖或细胞死亡，引发免疫应答，预防或治疗疾病，或作为用于诊断目的的检测分子。为了此类检测，可以使用测定，例如包括培养细胞以增殖细胞的连续步骤的测定。

根据本发明，将效应子分子与本发明的融合蛋白复合物共价连接提供了许多显着的优点。可以产生包含单个效应子分子(包括此类已知结构的肽)的本发明的融合蛋白复合物。另外，在类似的DNA载体中可以产生多种效应子分子。换言之，不同效应子分子文库可以与融合蛋白复合物连接用于识别感染的细胞或患病细胞。此外，对于治疗应用，不是向受试者给予本发明的融合蛋白复合物，而是可以给予编码融合蛋白复合物的DNA表达载体用于融合蛋白复合物的体内表达。这种方法避免了通常与重组蛋白质的制备相关联的昂贵纯化步骤，并避免了与常规方法相关联的抗原摄取和加工的复杂性。

正如所指，本文披露的融合蛋白和抗体的组分(例如，效应子分子缀合物，如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质毒素、免疫球蛋白结构域或其他生物活性分子和任何肽接头)可以按几乎任何方式组织(条件是该融合蛋白或抗体具有预期的功能)。特别地，如果需要，融合蛋白的每个组分可以通过至少一个适合的肽接头序列与另一个组分隔开。另外，融合蛋白可以包括标签，例如，以促进修饰、鉴定和/或纯化融合蛋白。

药物治疗剂

本发明提供了包含ALT-803的药物组合物，该组合物用作治疗剂。在一方面，ALT-803被全身给予，例如，配制在药学上可接受的缓冲液(如生理盐水)中。优选的给予途径包括，例如，滴注到膀胱中，皮下、静脉内、腹膜内、肌内、或皮内注射，其在患者体内提供连续、持续水平的组合物。使用在生理学上可接受的运载体中的治疗有效量的本文鉴定的治疗剂进行人患者或其他动物的治疗。适合的运载体和其配制品描述于例如，由E.W.Martin编辑的Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]中。待给予的治疗剂的量根据给予方式，患者的年龄和体重以及瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病的临床症状而变化。通常，量将在其他药剂的使用的量的范围内，这些其他药剂在治疗与瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病相关联的其他疾病中使用，尽管在某些情况下由于化合物的特异性增加将需要较低的量。如通过本领域技术人员已知的方法测定，按以下剂量给予化合物，该量增强受试者的免疫应答，或降低瘤形成细胞的增殖、存活或侵袭性。可替代地，该化合物以减少由疾病相关免疫应答引起的自身免疫疾病或炎性疾病的剂量给药。

药物组合物的配制品

通过任何适合的方式给予用于治疗瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病的ALT-803，所述方式导致与其他组分组合的治疗剂的浓度在改善、减少或稳定瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病中是有效的。ALT-803可以按任何合适的量包含在任何合适的运载体物质中，并且通常按组合物总重量的重量计以1％-95％的量存在。可以按适合于肠胃外(例如、皮下、静脉内、肌内、囊内或腹膜内)给予途径的剂型提供组合物。根据常规的药物实践配制药物组合物(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践](第20版),编辑A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology[药物技术百科全书],编辑.J.Swarbrick和J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York[马塞尔·德克尔出版社，纽约])。

人体剂量最初可以通过从小鼠或非人灵长类动物中使用的化合物的量外推来确定，因为技术人员认识到与动物模型相比，修饰人的剂量在本领域中是常规的。在某些实施例中，设想剂量可以从在约0.1μg化合物/kg体重至约5000μg化合物/kg体重之间变化；或者从在约1μg/kg体重至约4000μg/kg体重或从约10μg/kg体重至约3000μg/kg体重变化。在其他实施例中，该剂量可以是约0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、或5000μg/kg体重。在其他实施例中，设想剂量可以为约0.5μg化合物/kg体重至约20μg化合物/kg体重的范围。在其他实施例中，该剂量可以是约0.5、1、3、6、10、或20mg/kg体重。当然，取决于初始临床试验的结果和特定患者的需要，如在这样的治疗方案中常规进行的那样，该剂量可以向上或向下调整。

在特定的实施例中，将ALT-803配制在适于肠胃外给药的赋形剂中。在特定的实施例中，ALT-803以0.5μg/kg-约15μg/kg(例如，0.5、1、3、5、10或15μg/kg)给予。

对于膀胱癌的治疗，通过滴注给予ALT-803至膀胱中。滴注方法是已知的。参见，例如，Lawrencia,等人,Gene Ther[基因疗法]8,760-8(2001)；Nogawa,等人,J Clin Invest[临床研究杂志]115,978-85(2005)；Ng,等人,Methods Enzymol[酶学方法]391,304-132005；Tyagi,等人,J Urol[泌尿外科杂志]171,483-9(2004)；Trevisani,等人,JPharmacol Exp Ther[药理学和实验治疗学杂志]309,1167-73(2004)；Trevisani,等人,Nat Neurosci[自然神经科学]5,546-51(2002))；(Segal,等人,1975)。(Dyson,等人,2005)。(Batista,等人,2005；Dyson,等人,2005)。在某些实施例中，设想用于滴注的ALT-803剂量可以在约5μg/剂和1000μg/剂之间变化。

将药物组合物与适合的赋形剂一起配制成药物组合物，该药物组合物在给予后以受控方式释放治疗剂。实例包括单或多单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。

肠胃外组合物

将包含ALT-803的药物组合物通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌内、囊内、腹膜内等)，以剂型、配制品或经由适合的递送装置或包含常规无毒性药学上可接受的运载体和佐剂的植入物肠胃外给予。此类组合物的配制品和制剂对于药物配制品领域的技术人员是熟知的。可以在Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],同上中发现配制品。

包含用于肠胃外使用的ALT-803的组合物可以以单位剂型(例如，在单剂量安瓿、注射器或袋中)提供，或者在含有几个剂量的小瓶中提供，并且其中可以添加合适的防腐剂(参见下文)。组合物可以呈溶液、悬浮液、乳液、输注装置或用于植入的递送装置的形式，或可以呈现为在使用前用水或另一种适合的媒介物重构的干粉末。除了减少或改善瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病的活性剂外，该组合物还可包括适合的肠胃外可接受的运载体和/或赋形剂。可以将一种或多种活性治疗剂掺入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中用于控制释放。此外，该组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂和/或分散剂。

如上所述，包含ALT-803的药物组合物可以呈适合于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将一种或多种适合的活性抗瘤形成/抗感染治疗剂溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体媒介物中。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水，通过添加适量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲液调节至合适的pH的水，1,3-丁二醇，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液和右旋糖溶液。水性配制品还可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中一种化合物仅微量或微溶于水的情况下，可以添加溶解增强剂或增溶剂，或溶剂可以包括10％w/w-60％w/w的丙二醇等。

本发明提供治疗瘤形成或感染性疾病和/或障碍或其症状的方法，该方法包括向受试者(例如哺乳动物，如人)给予治疗有效量的包含本文通式化合物的药物组合物。因此，一个实施例是治疗患有或易患瘤形成或感染性疾病或障碍或其症状的受试者的方法。该方法包括以下步骤：在治疗疾病或障碍的条件下，向哺乳动物给予治疗量的足以治疗疾病或障碍或其症状的量的化合物。

本文的方法包括向受试者(包括鉴定为需要这种治疗的受试者)给予有效量的本文所述化合物或本文所述的组合物以产生这种效果。鉴定需要这种治疗的受试者可以是受试者或健康护理专业人员的判断，并且可以是主观的(例如意见)或客观的(例如通过测试或诊断方法可测量)。

本发明的治疗方法(包括预防性治疗)通常包括将治疗有效量的本文的化合物(例如本文通式的化合物)给予对其有需要的受试者(例如，动物，人，包括哺乳动物，特别是人)。这种治疗将被适当地给予患有、具有、易患瘤形成、或感染性疾病、障碍或其症状或处于患赘生性、或感染性疾病、障碍或其症状的风险中的受试者(特别是人)。可通过诊断测试或受试者或健康护理提供者的意见(例如，基因测试、酶或蛋白质标志物、标志物(如本文所定义的)、家族史等)进行任何客观或主观确定可以做出对“处于风险中”的受试者的确定。ALT-803可用于治疗任何其他的障碍(其中需要增加免疫应答)。

在一个实施例中，本发明提供了一种监测治疗过程的方法。该方法包括以下步骤：在患有或易患与瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病相关联的障碍或其症状的受试者中，测定诊断标志物(标志物)(例如，由本文化合物调节的本文描绘的任何靶标、蛋白质或其指示物等)或诊断测量(例如，筛选，测定)的水平，其中该受试者已经被给予足以治疗疾病或其症状的治疗量的本文的化合物。可以将该方法中确定的标志物的水平与健康正常对照或其他患病患者中的标志物的已知水平进行比较，以确定受试者的疾病状态。在优选的实施例中，在比第一水平的确定更晚的时间点处确定受试者中的标志物的第二水平，并且比较这两个水平以监测疾病的进程或治疗的功效。在某些优选的实施例中，根据本发明在开始治疗之前确定受试者中的标志物的治疗前水平；然后可以将标志物的治疗前水平与治疗开始后受试者中标志物的水平进行比较，以确定治疗的功效。

组合疗法

优选地，ALT-803与抗瘤形成或抗炎治疗剂例如抗体(例如肿瘤特异性抗体或免疫检查点抑制剂)组合给予。可以同时或依次给予该抗体和ALT-803。在一些实施例中，抗体治疗是针对疾病适应症的既定疗法，并且向抗体方案添加ALT-803治疗改善了对患者的治疗益处。此类改善可以测量为每个患者的应答增加或患者群体的应答增加。组合疗法还可以在较低或更低频率的抗体剂量下提供改善的应答，从而产生耐受更好的治疗方案。如所指出的，ALT-803和抗体的组合疗法可通过各种机制提供增强的临床活性，包括增大的ADCC、ADCP和/或NK细胞、T细胞、中性粒细胞或单核细胞水平或免疫应答。

如果需要，ALT-803与任何常规疗法组合给予，包括但不限于手术、放射疗法、化学疗法、基于蛋白质的疗法或生物疗法。化学疗法药物包括烷化剂(例如，基于铂的药物、四嗪、氮丙啶、亚硝基脲、氮芥)、抗代谢物(例如，抗叶酸、氟尿嘧啶、脱氧核苷类似物、巯嘌呤)、抗微管剂(例如，长春花生物碱、紫杉烷类)、拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑异构酶I和II抑制剂)、细胞毒性抗生素(例如，蒽环类)和免疫调节药物(例如，沙利度胺和类似物)。

试剂盒或药物系统

包含ALT-803的药物组合物可以组装成试剂盒或药物系统，用于治疗瘤形成或自身免疫疾病或炎性疾病。根据本发明该方面的试剂盒或药物系统包括在其中的限定空间中具有一个或多个容器装置(例如小药瓶、管、安瓿、瓶、注射器、或袋)的载体手段(例如盒子、纸箱、管)。本发明的试剂盒或药物系统还可包含用于使用ALT-803的相关说明书。

重组蛋白质表达

通常，本发明的融合蛋白复合物(例如，ALT-803的组分)的制备可以通过本文披露的方法和通过公认的重组DNA技术完成。

通常，通过在合适的表达载体中的全部或部分的编码多肽的核酸分子或其片段转化适合的宿主细胞来产生重组多肽。分子生物学领域的技术人员将理解，可以使用多种表达系统中的任何一种来提供重组蛋白。使用的明确宿主细胞对本发明并不重要。可以在几乎任何真核宿主(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；昆虫细胞(例如，Sf21细胞)；或哺乳动物细胞(例如，NIH 3T3、HeLa、COS或优选地CHO细胞))中产生重组多肽。此类细胞可从多种来源获得(例如，American Type Culture Collection[美国种质保存中心],罗克兰,马里兰州.；还参见，例如，Ausubel等人,Current Protocol in MolecularBiology[分子生物学现代方法],New York:John Wiley and Sons[纽约:约翰威利父子出版公司],1997)。转染方法和表达载体的选择取决于所选择的宿主系统。转化方法描述于例如，Ausubel等人(同上)；表达载体可选自在例如，Cloning Vectors:A Laboratory Manual[克隆载体：实验室手册](P.H.Pouwels等人,1985,增刊1987)中提供的那些。

存在多种用于产生重组多肽的表达系统。可用于产生此类多肽的表达载体包括但不限于染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、衍生自噬菌体、衍生自转座子、衍生自酵母附加体、衍生自插入元件、衍生自酵母染色体元件的载体；衍生自病毒(如杆状病毒、乳多孔病毒(papova病毒)(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体，以及衍生自其组合的载体。

一旦表达重组多肽后，例如使用亲和色谱法分离。在一个实例中，针对多肽产生的(例如，如本文所述产生的)抗体可以附接到柱上并用于分离重组多肽。在亲和色谱之前，可以通过标准方法进行携带多肽的细胞的裂解和分级(参见，例如，Ausubel等，同上)。一旦分离，如果需要，可以例如通过高效液相色谱法进一步纯化重组蛋白(参见，例如，Fisher,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology[生物化学和分子生物学实验室技术],编辑,Work和Burdon,爱思唯尔出版公司(Elsevier),1980)。

如本文所使用的，本发明的生物活性多肽或效应子分子可以包括以下因子，例如细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质毒素、免疫球蛋白结构域，或其他生物活性蛋白质(如酶)。同样，生物活性多肽可包括与其他化合物(例如非蛋白毒素、细胞毒性剂、化学治疗剂、可检测标记、放射性物质等)的缀合物。

本发明的细胞因子由细胞(其影响其他细胞的并且负责细胞免疫的许多多重作用中的任何一种)产生的任何因子定义。细胞因子的实例包括但不限于IL-2家族、干扰素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF和TNF细胞因子家族，并且不限于IL-1到IL-35、IFN-α、IFN-β、IFNγ、TGF-β、TNF-α、和TNFβ。

在本发明的一方面，第一融合蛋白包含与白介素-15(IL-15)结构域或其功能片段共价连接的第一生物活性多肽。IL-15是影响T细胞活化和增殖的细胞因子。影响免疫细胞活化和增殖的IL-15活性在一些方面与IL-2类似，尽管已经很好地表征了基本差异(Waldmann,T A,2006,Nature Rev.Immunol.[自然综述免疫学]6:595-601)。

在本发明的另一方面，第一融合蛋白包含白介素-15(IL-15)结构域，该结构域是IL-15变体(本文中还被称为IL-15突变体)。该IL-15变体优选地包含与天然(或野生型)IL-15蛋白质不同的氨基酸序列。该IL-15变体优选地结合IL-15Rα多肽，并且作为IL-15激动剂或拮抗剂起作用。优选地，具有激动剂活性的IL-15变体具有超激动剂活性。在一些实施例中，IL-15变体可以不依赖于其与IL-15Rα的缔合，作为IL-15激动剂或拮抗剂起作用。与野生型IL-15相比，通过相当或增加的生物活性例证IL-15激动剂。通过与野生型IL-15相比降低的生物活性或通过抑制IL-15介导的应答的能力例证IL-15拮抗剂。在一些实例中，IL-15变体以增加或降低的活性与IL-15RβγC受体结合。在一些实施例中，与天然IL-15序列相比，IL-15变体的序列具有至少一个氨基酸变化(例如取代或缺失)，此类变化导致IL-15激动剂或拮抗剂活性。优选地，氨基酸取代/缺失在与IL-15Rβ和/或γC相互作用的IL-15的结构域中。更优选地，氨基酸取代/缺失不影响与IL-15Rα多肽的结合或产生IL-15变体的能力。可以基于推定的或已知的IL-15结构鉴定，通过如本文提供的合理或随机诱变和功能测定或其他经验方法将IL-15与具有已知结构的同源分子(例如IL-2)进行比较来鉴定产生IL-15变体的适合的氨基酸取代/缺失。另外，适合的氨基酸取代可以是保守的或非保守的变化和另外的氨基酸的插入。优选地，本发明的IL-15变体在成熟人IL-15序列的位置6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111、或112处包含一个或多于一个氨基酸取代/缺失；特别地，D8N(“D8”是指天然成熟人IL-15序列中的氨基酸和残基位置，并且“N”是指在IL-15变体中位置处的取代的氨基酸残基)、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A取代形成具有拮抗剂活性的IL-15变体，并且N72D取代形成具有激动剂活性的IL-15变体。

类似于细胞因子的趋化因子被定义为任何化学因子或分子，当其暴露于其他细胞时负责细胞免疫的许多多重作用中的任何一种。适合的趋化因子可以包括但不限于CXC、CC、C、和CX.sub.3C趋化因子家族，并且不限于CCL-1到CCL-28、CXC-1到CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-1b、IL-8、MCP-1和Rantes。

生长因子包括当暴露于特定细胞时诱导受影响的细胞的增殖和/或分化的任何分子。生长因子包括蛋白质和化学分子，其中一些包括：GM-CSF、G-CSF、人生长因子和干细胞生长因子。另外的生长因子也可适用于本文所述的用途。

毒素或细胞毒性剂包括任何物质，当其暴露于细胞时对生长具有致死作用或抑制作用。更具体地，效应子分子可以是例如植物或细菌来源的细胞毒素，例如白喉毒素(DT)、志贺毒素、相思豆毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、皂草素、假单胞菌外毒素(PE)、美洲商陆抗病毒蛋白、或白树毒素。此类毒素的生物活性片段是本领域熟知的，并且包括例如，DT A链和蓖麻毒素A链。另外，毒素可以是在细胞表面有活性的药剂，例如像磷脂酶(例如，磷脂酶C)。

此外，效应子分子可以是化学治疗药物，例如像长春地辛、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、阿霉素、博来霉素或顺铂。

另外，效应子分子可以是适于诊断或成像研究的可检测地标记的分子。此类标记包括生物素或链霉亲和素/抗生物素蛋白、可检测的纳米颗粒或晶体、酶或其催化活性片段、荧光标记(例如绿色荧光蛋白质)、FITC、藻红蛋白、cychome、德克萨斯红或量子点；放射性核素(例如，碘-131、钇-90、铼-188或铋-212)；磷光或化学发光分子或通过PET、超声或MRI可检测的标记(例如基于Gd或顺磁性金属离子的造影剂)。针对关于制备和使用包含效应子或标签的蛋白质的披露内容，参见，例如，Moskaug,等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]264,15709(1989)；Pastan,I.等人.Cell[细胞]47,641,1986；Pastan等人.,RecombinantToxins as Novel Therapeutic Agents[作为新颖治疗性药剂的重组毒素],Ann.Rev.Biochem[生物化学年鉴].61,331,(1992)；“Chimeric Toxins[嵌合毒素]”Olsnes和Phil,Pharmac.Ther.[药理学与治疗学],25,355(1982)；公开的PCT申请号WO94/29350；公开的PCT申请号WO 94/04689；公开的PCT申请号WO2005046449和美国专利号5,620,939。

包括共价连接的IL-15和IL-15Rα结构域的蛋白融合或缀合复合物具有几个重要用途。易被损伤或杀伤的细胞或组织可通过本文公开的方法容易地测定。

本发明的IL-15和IL-15Rα多肽在氨基酸序列方面适当地对应于天然存在的IL-15和IL-15Rα分子，例如人、小鼠或其他啮齿动物、或其他哺乳动物的IL-15和IL-15Rα分子。这些多肽和编码核酸的序列在文献中是已知的，包括人白介素15(IL15)mRNA-GenBank:U14407.1、小家鼠白介素15(IL 15)mRNA--GenBank:U14332.1、人白介素-15受体α链前体(IL15RA)mRNA-GenBank:U31628.1、小家鼠白介素15受体α链-GenBank:BC095982.1。

在一些情况下，使本发明的蛋白质融合物或缀合物复合物多价化是有用的，例如，以增加sc-TCR或sc-抗体的化合价。特别地，融合蛋白复合物的IL-15和IL-15Rα结构域之间的相互作用提供了产生多价复合物的方式。此外，可以通过使用例如标准生物素-链霉亲和素标记技术，或通过与适合的固体支持物(例如乳胶珠)缀合，通过在一个和四个蛋白质(相同或不同)之间共价或非共价连接而制备多价融合蛋白。化学交联的蛋白质(例如与纳米颗粒交联)也是适合的多价物质。例如，可以通过包括编码可以被修饰的标签序列(例如生物素化BirA标签)的序列或具有化学反应性侧链的氨基酸残基(如Cys或His)来修饰蛋白质。此类氨基酸标签或化学反应性氨基酸可位于融合蛋白或抗体的多个位置中，优选位于生物活性多肽或效应子分子的活性位点的远端。例如，可溶性融合蛋白的C-末端可以与标签或包含一个或多个这种反应性氨基酸的其他融合蛋白共价连接。可以包括适合的侧链以将两个或更多个融合蛋白化学与适合纳米颗粒连接，以产生多价分子。示例性纳米颗粒包括树状聚合物、脂质体、核-壳颗粒或基于PLGA的颗粒。

在本发明的另一个实施例，融合蛋白复合物的一个或两个多肽包含免疫球蛋白结构域。可替代地，蛋白质结合结构域-IL-15融合蛋白可以进一步与免疫球蛋白结构域连接。优选的免疫球蛋白结构域包含允许与其他免疫球蛋白结构域相互作用的区域，从而形成如上所提供的多链蛋白质。例如，免疫球蛋白重链区(例如IgG1 C_H2-C_H3)能够稳定地相互作用以产生Fc区。包括Fc结构域的优选的免疫球蛋白结构域还包含具有效应子功能(包括Fc受体或补体蛋白结合活性)和/或具有糖基化位点的区域。在一些实施例中，融合蛋白复合物的免疫球蛋白结构域包含降低或增大Fc受体或补体结合活性或糖基化的突变，从而影响所得蛋白质的生物活性。例如，可以将含有降低与Fc受体结合的突变的免疫球蛋白结构域用于产生本发明的融合蛋白复合物，该复合物对携带Fc受体的细胞具有较低的结合活性，这对于被设计为用于识别或检测特定抗原的试剂可能是有利的。

核酸和载体

本发明进一步提供了核酸序列，并且特别是编码本发明蛋白(例如ALT-803的组分)的DNA序列。优选地，DNA序列由适合于染色体外复制的载体(例如噬菌体、病毒、质粒、噬菌粒、粘粒、YAC或附加体)携带。特别地，可以将编码所希望的融合蛋白的DNA载体用于促进本文所述的制备方法并获得显着量的融合蛋白。可以将DNA序列插入适合的表达载体中，即含有针对所插入的编码蛋白质的序列的转录和翻译所必需的元件的载体。可利用多种宿主-载体系统来表达编码蛋白质的序列。这些包括感染病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物(如含有酵母载体的酵母，或用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌)。取决于所利用的宿主-载体系统，可以使用许多适合的转录和翻译元件中的任何一种。参见，Sambrook等人，同上和Ausubel等人，同上。

本发明包括用于制备可溶性融合蛋白复合物的方法，该方法包括向宿主细胞中引入编码第一和第二融合蛋白的如本文所述的DNA载体；在足以在细胞或培养基中表达融合蛋白并允许第一融合蛋白的IL-15结构域和第二融合蛋白的可溶性IL-15Rα结构域之间缔合以形成可溶性融合蛋白复合物的条件下，在培养基中培养该宿主细胞；从这些宿主细胞或培养基纯化可溶性融合蛋白复合物。

通常，根据本发明的优选DNA载体包含通过以5'至3'方向的磷酸二酯键连接的核苷酸序列，其中用于引入编码生物活性多肽的第一核苷酸序列的第一克隆位点与编码效应子分子的序列可操作地连接。

由DNA载体编码的融合蛋白组分可以按盒式形式提供。术语“盒”是指每种组分可通过标准重组方法容易地取代另一种组分。特别地，当编码的融合复合物有待被用于对抗可能具有血清型或具有发展为血清型的能力的病原体时，特别需要以盒式形式配置的DNA载体。

为了使载体编码融合蛋白复合物，通过使用适合的连接酶将编码生物活性多肽的序列与编码效应子肽的序列连接。可以通过从天然来源(例如从适合的细胞系)中分离DNA或通过已知的合成方法(例如磷酸三酯法)来获得编码呈递肽的DNA。参见，例如，Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成],IRL出版社(M.J.Gait,编辑,1984)。还可以使用可商购的自动寡核苷酸合成仪制备合成的寡核苷酸。一旦分离，编码生物活性多肽的基因可通过聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其他方法扩增。用于扩增生物活性多肽基因的适合的PCR引物可以向PCR产物中加入限制性位点。PCR产物优选包括用于效应子肽和适当表达和分泌生物活性多肽-效应子融合复合物所必需的前导序列的剪接位点。PCR产物还优选地包括编码接头序列的序列，或用于连接这种序列的限制酶位点。

本文描述的融合蛋白优选地通过标准重组DNA技术产生。例如，一旦分离出编码生物活性多肽的DNA分子，就可以将序列连接到编码效应多肽的另一DNA分子上。可以将编码生物活性多肽的核苷酸序列与编码效应子肽的DNA序列直接连接，或更典型地，如本文所述编码接头序列的DNA序列可以在编码生物活性多肽的序列和编码效应子肽的序列之间插入，并使用适合连接酶连接。所得杂交DNA分子可以在适合的宿主细胞中表达以产生融合蛋白复合物。DNA分子以5'至3'方向彼此连接，使得在连接后，编码的多肽的翻译框架不被改变(即，DNA分子在框内彼此连接)。所得DNA分子编码框内融合蛋白。

其他核苷酸序列也可以包括在基因构建体中。例如，控制与效应子肽融合的编码生物活性多肽的序列表达的启动子序列，将融合蛋白导向细胞表面或培养基的前导序列，可以包括在构建体中，或存在于插入构建体的表达载体中。免疫球蛋白或CMV启动子是特别优选的。

在获得变体生物活性多肽、IL-15、IL-15Rα或Fc结构域编码序列时，本领域普通技术人员将认识到可以在不损失或减少生物活性情况下通过某些氨基酸取代、添加、缺失和翻译后修饰来修饰多肽。特别地，众所周知，保守氨基酸取代，即用一个氨基酸取代具有相似大小、电荷、极性和构象的另一个氨基酸不可能显着改变蛋白质功能。作为蛋白质成分的20种标准氨基酸可被大致分类为如下的四组保守氨基酸：非极性(疏水)组包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸；极性(不带电荷的，中性的)组包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；带正电荷的(碱性)组包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸；和带负电荷的(酸性)组包括天冬氨酸和谷氨酸。将蛋白质中的一种氨基酸替换为在同一组中的另一种氨基酸不太可能对蛋白质的生物活性产生不利影响。在其他情况下，可以对氨基酸位置进行修饰以降低或增强蛋白质的生物活性。此类变化可以基于一个或多个靶残基的已知或假定的结构或功能特性被随机引入或经由位点特异性突变被引入。在表达变体蛋白质后，可以使用结合或功能测定容易地评估由于修饰引起的生物活性的变化。

可以通过DNA杂交分析来确定核苷酸序列之间的同源性，其中双链DNA杂交体的稳定性取决于发生的碱基配对的程度。高温和/或低盐含量的条件降低了杂交体的稳定性，并且可以改变以防止具有低于所选同源性程度的序列的退火。例如，对于具有约55％G-C含量的序列，40℃-50℃、6x SSC(氯化钠/柠檬酸缓冲液)和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的杂交和洗涤条件表明约60％-70％同源性；50℃-65℃、1x SSC和0.1％SDS的杂交和洗涤条件表明约82％-97％同源性；并且52℃、0.1x SSC和0.1％SDS的杂交和洗涤条件表明约99％-100％同源性。还可获得用于比较核苷酸和氨基酸序列(并且测量同源性程度)的各种计算机程序，并且在Ausubel等人(1999)的文献中发现了提供可商购和免费软件来源的列表。易于获得的序列比较和多序列比对算法分别是基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人,1997)和ClustalW程序。BLAST可在万维网ncbi.nlm.nih.gov上的获得，并且ClustalW的版本可在2.ebi.ac.uk上获得。

融合蛋白的组分可以按几乎任何顺序组织，只要每个组分能够进行其预期的功能。例如，在一个实施例中，生物活性多肽位于效应分子的C或N末端。

本发明的优选效应分子将具有有助于这些结构域所预期的功能的大小。可以通过多种方法(包括众所周知的化学交联方法)制备本发明的效应分子并与生物活性多肽融合。参见，例如，Means,G.E.和Feeney,R.E.(1974)在Chemical Modification of Proteins[蛋白质的化学修饰],Holden-Day。还参见，S.S.Wong(1991)in Chemistry of ProteinConjugation and Cross-Linking[蛋白质缀合物和交联化学],CRC出版社。然而通常优选使用重组操作来制备框内融合蛋白。

如上所述，根据本发明的融合分子或缀合物分子可以按若干种方式组织。在示例性构型中，生物活性多肽的C末端与效应子分子的N末端可操作地连接。如果需要，可以通过重组方法实现该连接。然而，在另一种构型中，生物活性多肽的N-末端与效应子分子的C-末端连接。

可替代地或另外地，可根据需要将一种或多种另外的效应子分子插入生物活性多肽或缀合物复合物中。

载体和表达

可以采用许多策略来表达ALT-803。例如，可以使用限制酶以在载体中形成用于插入构建体的切口然后连接来将编码ALT-803的构建体掺入适合的载体中。然后将包含基因构建体的载体引入适合宿主中用于表达融合蛋白。通常参见，Sambrook等人，同上。可以基于与克隆方案有关的因素凭经验做出对适合的载体的选择。例如，载体应与正在使用的宿主兼容，并具有针对该宿主的适当的复制子。载体必须能够容纳编码待表达的融合蛋白复合物的DNA序列。适合的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞，优选那些易于转化并在培养基中表现出快速生长的细胞。具体地，优选的宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)等)，以及真核生物(如动物细胞和酵母菌株，如酿酒酵母)。哺乳动物细胞通常是优选的，特别是J558、NSO、SP2-O或CHO。其他适合宿主包括例如，昆虫细胞，如Sf9。采用常规培养条件。参见，Sambrook，同上。然后可以选择稳定转化或转染的细胞系。可以通过已知的方法测定表达本发明的融合蛋白复合物的细胞。例如，可以通过对连接的免疫球蛋白特异的ELISA和/或通过免疫印迹来确定与免疫球蛋白连接的融合蛋白复合物的表达。在实施例中披露了用于检测融合蛋白表达的其他方法，这些融合蛋白包含与IL-15或IL-15Rα结构域连接的生物活性多肽。

通常如上所述，可以将宿主细胞用于制备目的以繁殖编码所希望的融合蛋白的核酸。因此，宿主细胞可包括其中特别预期产生融合蛋白的原核或真核细胞。因此，宿主细胞特别包括酵母、苍蝇、蠕虫、植物、蛙、哺乳动物细胞以及能够使编码融合物的核酸增殖的器官。可以使用的哺乳动物细胞系的非限制性实例包括CHO dhfr细胞(Urlaub和Chasm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],77:4216(1980)),293cells[细胞](Graham等人,J Gen.Virol.[普通病毒学杂志],36:59(1977))或骨髓瘤细胞(如SP2或NSO(Galfre和Milstein,Meth.Enzymol.[酶学方法],73(B):3(1981))。

能够使编码所希望的融合蛋白复合物的核酸增殖的宿主细胞涵盖非哺乳动物真核细胞，也包括昆虫(例如，草地贪夜蛾(Sp.frugiperda))、酵母(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(P.pastoris)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)；如由Fleer,R.,Current Opinion inBiotechnology[当代生物技术观点],3(5):486496(1992)一般综述)、真菌和植物细胞。还考虑了某些原核生物(例如大肠杆菌和芽孢杆菌)。

可以通过用于转染细胞的标准技术将编码所希望的融合蛋白的核酸引入宿主细胞中。术语“转染(“transfecting”或“transfection”)”旨在涵盖用于将核酸引入宿主细胞的所有常规技术，包括磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、显微注射、病毒转导和/或整合。用于转染宿主细胞的适合的方法可以在Sambrook等人，同上，和其他实验室教材中发现。

根据本发明可以使用各种启动子(转录起始调节区)。适合的启动子的选择取决于所提出的表达宿主。可以使用来自异源的启动子，只要它们在所选的宿主中起作用即可。

启动子的选择还取决于所希望的效率和肽或蛋白质产生的水平。通常使用诱导型启动子(如tac)，以显着增加大肠杆菌中蛋白质表达的水平。蛋白质的过量表达可能对宿主细胞有害。因此，宿主细胞生长可能是受限的。诱导型启动子系统的使用允许在诱导基因表达之前将宿主细胞培养至可接受的密度，从而促进更高的产物产量。

根据本发明可以使用各种信号序列。可以使用与生物活性多肽编码序列同源的信号序列。可替代地，还可以使用已经被选择或被设计为用于在表达宿主中有效分泌和加工的信号序列。例如，适合的信号序列/宿主细胞对包括用于在枯草芽孢杆菌中分泌的枯草芽孢杆菌sacB信号序列，和酿酒酵母α配对因子或用于毕赤酵母分泌的毕赤酵母酸性磷酸酶phol信号序列。可以通过编码信号肽酶切割位点的序列将信号序列与蛋白质编码序列直接连接，或通过由通常少于10个密码子组成的短核苷酸桥直接连接，其中该桥确保下游蛋白序列的正确阅读框。

已经鉴定了针对真核蛋白质表达系统的用于增强转录和翻译的元件。例如，将花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子定位在异源启动子任一侧的1000bp可以在植物细胞中将转录水平提高10至400倍。表达构建体还应包括适合的翻译起始序列。修饰表达构建体以包括用于适当翻译起始的Kozak共有序列可以将翻译水平提高10倍。

通常使用选择性标志物，该标志物可以是表达构建体的一部分或与其分开(例如，由表达载体携带)，使得该标志物可以在与目的基因不同的位点处整合。实例包括赋予抗生素抗性(例如，对于大肠杆菌宿主细胞，bla赋予氨苄青霉素抗性；对于多种原核和真核细胞，nptII赋予卡那霉素抗性)或允许宿主在基本培养基上生长(例如，HIS4使毕赤酵母或His^-酿酒酵母在缺乏组氨酸的情况下生长)的标志物。选择性标志物具有其自身的转录和翻译起始和终止调节区，以允许标志物的独立表达。如果使用抗生素抗性作为标志物，则用于选择的抗生素的浓度将根据抗生素而变化，范围通常为从10至600μg抗生素/mL培养基。

通过使用已知的重组DNA技术组装表达构建体(Sambrook等人,1989；Ausubel等人,1999)。限制酶消化和连接是用于连接DNA的两个片段的基本步骤。DNA片段的末端可能需要在连接之前进行修饰，并且这可以通过以下各项来实现：填充突出端、用核酸酶(例如，ExoIII)使一个或多个片段的末端部分缺失、定点诱变或通过PCR添加新的碱基对。可以使用多聚接头和衔接子来促进所选片段的连接。表达构建体通常在使用多轮限制、连接和大肠杆菌转化的阶段中组装。适用于构建表达构建体的许多克隆载体是本领域已知的(λZAP和pBLUESCRIPT SK-1,Stratagene,La Jolla,CA,pET,诺瓦根公司(Novagen Inc.),麦迪逊，威斯康辛州，在Ausubel等人,1999中引用)并且特定的选择对于本发明并不重要。克隆载体的选择将受所选择的用于将表达构建体引入宿主细胞的基因转移系统的影响。在每个阶段结束时，可以通过限制、DNA序列、杂交和PCR分析来分析所得构建体。

可以将表达构建体作为克隆载体构建体(可以是线性的或环状的)转化到宿主中，或者可以从克隆载体中去除并按原样使用或引入到递送载体上。递送载体有助于在所选的宿主细胞类型中引入和维持表达构建体。通过许多已知的基因转移系统(例如，天然感受态、化学介导的转化、原生质体转化、电穿孔、生物射弹转化、转染或缀合)中的任何一种将表达构建体引入宿主细胞中(Ausubel等人,1999；Sambrook等人.,1989)。取决于所用的宿主细胞和载体系统选择基因转移系统。

例如，通过原生质体转化或电穿孔可以将表达构建体引入酿酒酵母细胞中。酿酒酵母的电穿孔很容易完成，并产生与原生质球转化相当的转化效率。

本发明进一步提供了用于分离目的融合蛋白的生产方法。在该过程中，其中已经引入与调节序列可操作地连接的编码目的蛋白质的核酸的宿主细胞(例如，酵母、真菌、昆虫、细菌或动物细胞)在培养基中以生产规模生长，以刺激编码目的融合蛋白的核苷酸序列的转录。随后，从收获的宿主细胞或从培养基中分离目的融合蛋白。可以将标准蛋白质纯化技术用于从培养基或从收获的细胞中分离目的蛋白质。特别地，可以将纯化技术用于从各种实施装置(包括转瓶、旋式烧瓶、组织培养平板、生物反应器、或发酵罐)大规模地表达和纯化所希望的融合蛋白(即，以至少毫克的量)。

可以通过已知方法分离和纯化表达的蛋白质融合复合物。通常将培养基离心或过滤，并然后通过亲和色谱法或免疫亲和色谱法(例如蛋白质-A或蛋白质-G亲和力色谱法或包括使用结合表达的融合复合物的单克隆抗体的免疫亲和方案)纯化上清液。可以通过已知技术的适当组合分离和纯化本发明的融合蛋白。这些方法包括，例如，利用溶解度的方法(例如盐沉淀和溶剂沉淀)；利用分子量差异的方法(例如透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)；利用电荷差异的方法(例如离子交换柱色谱法)；利用特异性亲和力的方法(例如亲和色谱法)；利用疏水性差异的方法(例如反相高效液相色谱法)；和利用等电点差异的方法(例如等电点聚焦电泳)，金属亲和柱(例如Ni-NTA)。对于涉及这些方法的披露内容一般参见Sambrook等人和Ausubel等人，同上。

优选本发明的融合蛋白基本上是纯的。换言之，融合蛋白已经与天然伴随其的细胞取代物分离，使得这些融合蛋白优选以至少80％或90％至95％均质性(w/w)存在。具有至少98％至99％均质性(w/w)的融合蛋白对于许多药物、临床和研究应用是最优选的。一旦基本上纯化，融合蛋白应基本上不含对于治疗应用的污染物。一旦部分纯化或达到基本纯度，可以将可溶性融合蛋白用于治疗，或用于进行本文披露的体外或体内测定。可通过多种标准技术(如色谱法和凝胶电泳)确定基本纯度。

本发明的融合蛋白复合物适用于体外或体内与多种细胞使用，这些细胞是癌细胞或被感染或可能被一种或多种疾病感染。

通过在抗原呈递细胞上表达的人IL-15受体α链(hIL-15Rα)，将人白介素-15(hIL-15)反式呈递至免疫效应子细胞。IL-15Rα主要通过细胞外sushi结构域(hIL-15RαSu)以高亲和力(38pM)结合hIL-15。如本文所述的，可以将IL-15和IL-15RαSu结构域用以产生可溶性的复合物(例如，ALT-803)或用作构建多结构域融合复合物的支架。

IgG结构域(特别是Fc片段)已经被成功用作针对许多治疗分子(包括批准的生物药物)的二聚体支架。例如，依那西普是与人IgG1的Fc结构域连接的可溶性人p75肿瘤坏死因子-a(TNF-α)受体(sTNFR)的二聚体。这种二聚化使依那西普在抑制TNF-α活性方面的效力比单体sTNFR高1,000倍，并提供具有比单体形式长五倍的血清半衰期的融合物。因此，依那西普在体内中和TNF-α的促炎活性方面和改善许多不同自身免疫适应症的患者结果方面是有效的。

除了其二聚化活性，通过补体活化和与在自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞、单核细胞、吞噬细胞和树突细胞上展示的Fcγ受体相互作用，Fc片段还提供了细胞毒性效应子功能。在抗癌治疗性抗体和其他抗体结构域-Fc融合蛋白的背景下，这些活性可能在动物肿瘤模型和癌症患者中观察到的功效中起重要作用。然而，这些细胞毒性效应子应答在许多治疗应用中可能不足。因此，对改善和扩增Fc结构域的效应子活性以及对开发经由免疫疗法分子在疾病部位增加细胞溶解性免疫应答(包括NK细胞和T细胞)的活性和募集细胞溶解性免疫应答(包括NK细胞和T细胞)的其他方法产生了相当大的兴趣。

为试图开发人衍生的免疫刺激疗法，使用人IL-15(hIL-15)和IL-15受体结构域。hIL-15是细胞因子的小四α-螺旋束家族的成员，其以高结合亲和力(平衡解离常数(KD)约10^-11M)与hIL-15受体α-链(hIL-15Rα)相缔合。然后将所得复合物反式呈递至在T细胞和NK细胞的表面上展示的人IL-2/15受体β/共γ链(hlL-15RβγC)复合物。这种细胞因子/受体相互作用导致效应子T细胞和NK细胞的扩增和活化，这些细胞在根除病毒感染和恶性细胞中起重要作用。通常，hIL-15和hIL-15Rα在树突细胞中共同产生以在细胞内形成复合物，这些复合物随后被分泌并在细胞表面上显示为异二聚体分子。因此，hIL-15和hIL-15Rα相互作用的特征表明这些链间结合结构域可以用作人衍生的免疫刺激复合物并作为支架，以制备能够靶特异性结合的可溶性二聚体分子。

除非另外指明，本发明的实施采用完全处于本领域技术人员的见识范围之内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在以下文献中加以充分解释，如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验手册]”，第二版(Sambrook，1989)；“Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]”(Gait，1984)；“Animal Cell Culture[动物细胞培养]”(Freshney，1987)；“Methods inEnzymology[酶学方法]”“Handbook of Experimental Immunology[实验免疫学手册]”(Weir，1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[哺乳动物细胞用基因转移载体]”(Miller和Calos，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南]”(Ausubel，1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应])”，(Mullis，1994)；“Current Protocols in Immunology[免疫学实验指南]”(Coligan，1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的产生，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。

本文描述了使用ALT-803(一种IL-15超激动剂)在体外和实验动物肿瘤模型中增强抗CD38抗体的抗肿瘤活性。达雷妥木单抗是一种抗CD38抗体，最近已被FDA批准用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤患者。已经证明达雷妥木单抗通过靶向表达CD38的肿瘤细胞来减轻肿瘤负荷。类似地，已经显示其他抗CD38抗体，例如艾萨妥昔单抗(isatuximab)(SAR650984)、MOR202、Ab79、AB19和MT-4019，在血液肿瘤患者中具有针对表达CD38肿瘤细胞的抗肿瘤活性和/或临床活性。在下面的实例中所述的，检查了ALT-803(一种新颖的IL-15超激动剂复合物)增强达雷妥木单抗在组合疗法中的抗CD38抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的体外和体内能力。使用新鲜分离的PBMC，证明ALT-803显着增强达雷妥木单抗针对Daudi细胞(人B淋巴瘤细胞)的ADCC活性。如下文实例中所述，通过ALT-803活化的纯化的人NK细胞增强了达雷妥木单抗介导的针对原代人B淋巴瘤细胞的ADCC活性。还在SCID异种移植模型中检查了ALT-803对达雷妥木单抗介导的针对Daudi细胞的抗肿瘤活性的体内作用。观察到单独的ALT-803和单独的达雷妥木单抗都能够减少荷瘤小鼠中的Daudi肿瘤负荷。然而，ALT-803与达雷妥木单抗的组合增加了抗肿瘤活性，这显着减少了骨髓中的Daudi细胞。这些观察结果表明，与单独的达雷妥木单抗相比，在达雷妥木单抗治疗中添加ALT-803可增强达雷妥木单抗的抗肿瘤功效。另外，如本文所述，ALT-803还增大了达雷妥木单抗针对肿瘤细胞的吞噬作用的抗体依赖性细胞毒性。在目前的临床研究中，相关研究还表明ALT-803增大了达雷妥木单抗针对Daudi细胞的ADCC活性。这也证明ALT-803具有在体内与肿瘤特异性抗体的协同抗肿瘤活性。

给出以下实例是为了给本领域普通技术人员提供如何进行和使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完整披露和描述，而不是旨在限制诸位发明人认为是自己的发明的范围。

实例1：通过ALT-803与抗CD38抗体的组合诱导细胞介导的细胞毒性

在该实例中，“ALT-803”是指包含与二聚体IL-15RαSu/Fc融合蛋白非共价缔合的IL-15N72D的复合物，其中所述复合物表现出免疫刺激活性。任选地，该IL-15N72D和/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白相对于参考序列包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸变化。以下提供示例性IL-15N72D氨基酸序列。(参见，例如，U.S.S.N.13/769,179，通过引用并入本文)。

以下提供了示例性IL-15N72D核酸序列(具有前导肽)(SEQ ID NO:1)：

(前导肽)

(IL-15N72D)

(终止密码子)

taa

以下提供了示例性IL-15N72D氨基酸序列(具有前导肽)(SEQ ID NO:2)：

(前导肽)

METDTLLLWVLLLWVPGSTG-

(IL-15N72D)

在一些情况下，该前导肽从成熟IL-15N72D多肽(SEQ ID NO:3)切割下来：

(IL-15N72D)

以下提供了示例性IL-15RαSu/Fc核酸序列(具有前导肽)(SEQ ID NO:4)：

(前导肽)

(IL-15RαSu)

(IgG1 CH2-CH3(Fc结构域))

(终止密码子)

taa

以下提供了示例性IL-15RαSu/Fc氨基酸序列(具有前导肽)(SEQ ID NO:5)：

(前导肽)

MDRLTSSFLLLIVPAYVLS-

(IL-15RαSu)

(IgG1 CH2-CH3(Fc结构域))

在一些情况下，成熟的IL-15RαSu/Fc蛋白缺乏前导序列(SEQ ID NO:6)：

(IL-15RαSu)

(IgG1 CH2-CH3(Fc结构域))

为了评估ALT-803与抗CD38抗体的组合是否会影响细胞介导的针对癌细胞的细胞毒性，将来自血沉棕黄层的分离的人PBMC用作效应细胞。人B细胞淋巴瘤细胞用作靶细胞，并如制造商所述在37℃下在RPMI-10(RPMI-1640、2-巯基乙醇、青霉素-链霉素-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、和10％胎牛血清)中用CellTrace^TM紫以5μM标记20分钟。将效应细胞与CellTrace^TM紫标记的靶肿瘤细胞以5:1的比例混合，并在含有和不含ALT-803或与抗CD38抗体(达雷妥木单抗)组合的RPMI-10中在5％CO₂下37℃下孵育两天。然后通过离心收获混合物并重悬于含有2mg/ml碘化丙锭的RPMI-10中。通过流式细胞术通过测定碘化丙锭染色后死亡的CellTrace^TM紫标记的靶细胞的百分比来评估效应细胞对靶细胞的细胞毒性。如图1所示，在不存在ALT-803的情况下，新鲜人PBMC对Daudi细胞具有弱的细胞毒性。相反，在10nM的ALT-803存在下，PBMC对Daudi肿瘤靶细胞具有强烈的细胞毒性。Daudi肿瘤细胞表达CD38分子，其可被抗CD38抗体(达雷妥木单抗)识别。人PBMC能够通过仅由抗CD38抗体介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)裂解Daudi细胞(图1)。重要的是，添加ALT-803能够显着增大人PBMC针对Daudi肿瘤细胞的抗CD38抗体介导的ADCC活性。

研究了人PBMC针对Daudi细胞的细胞毒性的ALT-803浓度依赖性诱导。将新鲜人PBMC与具有不同浓度(从1nM至25nM)的ALT-803和固定浓度的抗CD38抗体(10nM)的RPMI-10培养基中的CellTrace紫标记的Daudi细胞混合，然后孵育2天。如上所述，通过流式细胞术评估人PBMC针对靶细胞的细胞毒性。与图1中的结果一致，ALT-803能够在低至1nM时增大人PBMC针对Daudi细胞的抗CD38抗体介导的细胞毒性(图2A)。在该ADCC测定中也进行剂量应答研究，其中使用不同浓度的抗CD38抗体(从0.1nM至50nM)和固定的10mM的ALT-803(图2B)，在低至0.1nM的抗CD38抗体和每个抗体浓度处观察到Daudi细胞杀伤增加，通过添加ALT-803进一步增强肿瘤细胞杀伤。

为了鉴定负责观察到的靶肿瘤细胞杀伤的免疫效应细胞，通过MACS从人PBMC分离NK细胞，并将其用作上述ADCC测定中的效应细胞。类似地，对于在总人PBMC情况下的结果，NK细胞能够经由抗CD38抗体介导的ADCC活性杀伤Daudi肿瘤细胞，所述ADCC活性通过添加ALT-803而增强(图2C)。与总PBMC相比，用ALT-803加抗CD38抗体孵育的NK细胞观察到针对肿瘤靶标的更大细胞毒性。

实例2：在荷血液肿瘤的小鼠中ALT-803加抗CD38抗体处理的抗肿瘤活性

在荷Daudi肿瘤的SCID小鼠中进一步评估ALT-803增大抗CD38抗体的抗肿瘤功效的能力。此外，在用类固醇预处理后，在荷瘤小鼠中评估ALT-803与抗CD38抗体组合的效果。类固醇通常与抗CD38抗体疗法联合用作抗炎剂以减少输注反应。然而，还担心这些类固醇的免疫抑制作用也可能限制抗CD38抗体疗法的免疫介导功效。对于该研究，用Daudi细胞(每只小鼠10x 10⁶)(6只小鼠/组)静脉内(i.v.)接种Fox Chase SCID雌性小鼠(哈兰实验室(Harlan)，C.B-17/IcrHsd-Prkdc-scid：6周龄)。这些小鼠具有功能性NK细胞，其可能介导针对肿瘤的ADCC应答。在一些组中，在第15天(肿瘤接种后)在用PBS或抗CD38抗体(10mg/kg)静脉内处理前1小时用类固醇(氢化可的松，0.2mg/小鼠，腹膜内)处理荷瘤小鼠。在第17天(在PBS或抗CD38抗体治疗两天后)，取决于处理组，用ALT-803(0.2mg/kg，皮下)进一步处理小鼠。抗CD38抗体处理后7天，处死小鼠并确定骨髓中Daudi细胞的水平。在用PE缀合的抗人HLA-DR抗体(BioLegend公司)和流式细胞术分析评估染色后股骨骨髓细胞的Daudi细胞的百分比。如图3所示，ALT-803和抗CD38抗体单一疗法能够降低荷瘤小鼠骨髓中Daudi细胞的百分比。然而，ALT-803加抗CD38抗体的组合提供了最大的抗肿瘤活性，将骨髓Daudi细胞从对照小鼠中的62％减少至ALT-803+抗CD38抗体处理的小鼠中的10％。在ALT-803加抗CD38抗体疗法之前用类固醇处理的荷瘤小鼠中也观察到这种增强功效。事实上，在使用或不使用类固醇预处理的ALT-803加抗CD38抗体处理的小鼠中观察到类似的抗肿瘤活性。

实例3.ALT-803与抗CD38抗体组合延长荷血液肿瘤的小鼠的存活

还评估了ALT-803加抗CD38抗体延长荷Daudi细胞肿瘤的小鼠存活的能力。对于该研究，用Daudi细胞(每只小鼠10x 10⁶)静脉内(i.v.)接种Fox Chase SCID雌性小鼠。十五天后，用PBS或抗CD38抗体(10mg/kg，i.v.)处理荷瘤小鼠。PBS处理的小鼠除外，所有小鼠都用类固醇(氢化可的松，0.2mg/小鼠，腹膜内)预处理以减少输注反应。在第17天，ALT-803组和ALT-803与抗CD38抗体组合的组的小鼠用ALT-803(0.2mg/kg，皮下)处理。在第22天，与第15天和第17天类似地处理ALT-803组、抗CD38抗体组和ALT-803与抗CD38抗体组合的组。监测小鼠的存活(包括基于后腿麻痹的发病率)。如图4所示，用PBS、ALT-803和抗CD38抗体单一疗法治疗的荷瘤小鼠组显示中位数存活为31-41天，而用抗CD38抗体治疗的所有荷瘤小鼠存活超过45天，表明组合治疗显着延长了荷B细胞淋巴瘤的小鼠的存活。总之，这些结果证实了ALT-803与抗CD38抗体组合在体内的协同抗肿瘤作用。在类固醇预处理的存在下观察到这些结果。

实例4.ALT-803刺激的NK细胞增强抗CD38介导的针对肿瘤细胞的巨噬细胞活性

治疗性抗体可部分通过巨噬细胞针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)活性介导抗肿瘤活性。反过来，巨噬细胞活性可被细胞因子和其他免疫效应细胞释放的其他介质刺激。为了获得ALT-803影响巨噬细胞抗肿瘤活性的能力，我们建立了基于流式细胞仪的吞噬作用测定，其使用人巨噬细胞系THP-1作为主要效应细胞，人NK-92细胞系(NK细胞系)作为第二效应细胞以及Daudi细胞作为靶肿瘤细胞。在该研究中，使用Trans well^TM系统将NK-92细胞(aNK细胞)与THP-1和Daudi细胞分离。将NK-92细胞(1x 10⁵)培养在Transwell^TM插入物(康宁公司(Corning))的顶部孔中，而THP-1细胞(1x 10⁵)(根据制造的方案-σ用PKH67标记)和Daudi细胞(1x 10⁵)(根据制造的方案-分子探针用CellTrace紫标记)在24孔板的底部孔中。在每个孔中，用单独的培养基或含有10nM ALT-803、10nM抗CD38抗体或10nM ALT-803加10nM抗CD38抗体的培养基(总体积为1ml)处理细胞。24小时后，通过离心收获THP-1和Daudi细胞，并重悬于流式细胞仪缓冲液中，通过测定用PKH67和CellTrace紫标记的细胞百分比来评估吞噬作用(图5中所示的代表性流式细胞术图)。这种双阳性细胞代表PKH67标记的THP-1巨噬细胞，其吞噬了CellTrace紫标记的Daudi细胞。与仅用ALT-803或抗CD38抗体孵育的细胞相比较，ALT-803加抗CD38抗体的组合增加了巨噬细胞介导的肿瘤细胞的吞噬作用，如PKH67⁺CellTrace紫⁺细胞百分比的增加所示(图5)。这种增强的活性取决于NK细胞和ALT-803的存在，这表明

NK细胞的ALT-803依赖性活化导致抗体定向的巨噬细胞对患病细胞(例如，肿瘤细胞)的吞噬作用的刺激。

其他实施方案

虽然本发明已经结合其详细的描述进行了描述，但是前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修饰都在以下权利要求书的范围之内。

本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可用的知识。本文引用的所有美国专利和公开的或未公开的美国专利申请都通过引用而并入。本文引用的所有公开的外文专利合专利申请都通过引用特此并入。本文引用的登录号指示的Genbank和NCBI提交内容通过引用特此并入。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献都通过引用特此并入。

虽然本发明参考其优选实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。

序列表

<110> 艾尔特生物科技公司

<120> ALT-803与抗CD38抗体组合用于癌症治疗

<130> 048277-531001WO

<140> PCT/US2018/025366

<141> 2018-03-30

<150> 15/937,493

<151> 2018-03-27

<150> 62/480,339

<151> 2017-03-31

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

核苷酸

<400> 1

atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccaccggt 60

aactgggtga atgtaataag tgatttgaaa aaaattgaag atcttattca atctatgcat 120

attgatgcta ctttatatac ggaaagtgat gttcacccca gttgcaaagt aacagcaatg 180

aagtgctttc tcttggagtt acaagttatt tcacttgagt ccggagatgc aagtattcat 240

gatacagtag aaaatctgat catcctagca aacgacagtt tgtcttctaa tgggaatgta 300

acagaatctg gatgcaaaga atgtgaggaa ctggaggaaa aaaatattaa agaatttttg 360

cagagttttg tacatattgt ccaaatgttc atcaacactt cttaa 405

<210> 2

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile

20 25 30

Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu

35 40 45

Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu

50 55 60

Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His

65 70 75 80

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser

85 90 95

Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu

100 105 110

Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln

115 120 125

Met Phe Ile Asn Thr Ser

130

<210> 3

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

核苷酸

<400> 3

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 4

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

核苷酸

<400> 4

atggacagac ttacttcttc attcctgctc ctgattgtcc ctgcgtacgt cttgtccatc 60

acgtgccctc cccccatgtc cgtggaacac gcagacatct gggtcaagag ctacagcttg 120

tactccaggg agcggtacat ttgtaactct ggtttcaagc gtaaagccgg cacgtccagc 180

ctgacggagt gcgtgttgaa caaggccacg aatgtcgccc actggacaac ccccagtctc 240

aaatgtatta gagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 300

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 360

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 420

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 480

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 540

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 600

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 660

cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 720

ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 780

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 840

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 900

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaata a 951

<210> 5

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 5

Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Val Leu Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp

20 25 30

Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys

35 40 45

Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys

50 55 60

Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu

65 70 75 80

Lys Cys Ile Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

85 90 95

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

100 105 110

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

115 120 125

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

130 135 140

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

145 150 155 160

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

165 170 175

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

180 185 190

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

195 200 205

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

210 215 220

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

225 230 235 240

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

245 250 255

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

260 265 270

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

275 280 285

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

290 295 300

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

305 310 315

<210> 6

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 6

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1 5 10 15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

20 25 30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

35 40 45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

50 55 60

Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

65 70 75 80

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

85 90 95

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

100 105 110

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

115 120 125

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

130 135 140

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

145 150 155 160

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

165 170 175

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

180 185 190

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

195 200 205

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

210 215 220

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

225 230 235 240

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

245 250 255

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

260 265 270

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

275 280 285

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

Claims (3)

1.一种包含1)抗CD38抗体和2)IL-15:IL-15Rα复合物的组合物用于制造治疗受试者的表达CD38的瘤形成的药物的用途，其中该IL-15:IL-15Rα复合物包含二聚体IL-15RαSu/Fc分子和两个IL-15N72D分子之间的复合物，其中该IL-15N72D分子由SEQ ID NO:3的氨基酸序列所组成，以及其中该IL-15RαSu/Fc分子由SEQ ID NO:6的氨基酸序列所组成。

2.如权利要求1所述的用途，该用途进一步包括：在给予该抗体或该IL-15:IL-15Rα复合物之前、期间或之后给予该受试者类固醇，优选其中该类固醇选自包含皮质类固醇、退热药和抗组胺药的组。

3.一种试剂盒或药物组合物，该试剂盒或药物组合物包含：1)抗CD38抗体和2)IL-15:IL-15Rα复合物，其中该IL-15:IL-15Rα复合物包含二聚体IL-15RαSu/Fc分子和两个IL-15N72D分子之间的复合物，其中该IL-15N72D分子由SEQ ID NO:3的氨基酸序列所组成，以及其中该IL-15RαSu/Fc分子由SEQ ID NO:6的氨基酸序列所组成。