CN110607271B - 一种基于微加工技术的体外血管化3d组织的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于微加工技术的体外血管化3D组织的制备方法，属于微流控技术、组织工程、材料化学等领域。该方法包括软模板的制备、内皮组织的预成型、体外3D组织块的成型、体外3D组织块的培养等步骤。本发明利用精准可控的微加工技术来制作模板，并将生物相容性和可加工性极佳的甲基丙烯酰化明胶与聚乙二醇二丙烯酸酯作为支架材料，制备内皮细胞和其他组织细胞的共培养组织块，该方法在血管化体外微组织构建和组织生理病理研究等方面具有极大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术、组织工程、材料化学等领域，具体涉及一种基于微加工技术的体外血管化3D组织的制备方法。
背景技术
体外3D组织的构建和培养，细胞共培养体系建立、干细胞定向诱导分化、体外器官模型构建和再生医学等方面得到了广泛的应用。然而，利用传统技术所得到的体外3D组织，往往因为材料尺寸及形貌可控性差、内部营养物质和排泄废物交换不畅等，影响了细胞的长期存活和功能状态，从而对下游的应用产生了不利的影响和极大的限制。为了使得体外3D组织也能像体内的组织一样长期存活并保持功能状态，在体外组织块中引入内皮细胞模拟体内血管的物质交换功能成为了一种很好的方式。
体外血管化3D组织的构建主要有两类方式，第一类是直接利用干细胞进行分化，同时分化得到内皮细胞和组织细胞，但由于目前干细胞定向分化仍存在难度，这样得到的3D组织，其细胞纯度难以保证。另一种方式则是分别将干细胞来源的或者细胞系来源的内皮细胞和组织细胞，通过工程学的方式在体外构建仿生的血管化形态。该类方法可以较为有效地将内皮细胞和组织细胞构建成具有一定形貌和功能的3D组织块，且细胞纯度、空间位置等能得到控制。由于细胞在体外状态下只能以2D的方式生长，因此在构建3D组织的过程中，需要利用支架材料来支撑和构型。这些支架材料一般是高分子或者水凝胶等一些生物相容性好的物质，如PEG基材料、海藻酸钠、明胶、胶原、琼脂等。
另外，由于血管组织的尺度很小，需要更为精准的控制才能构建血管化体外组织。近年来，随着微加工技术的不断发展和完善，加工尺度越来越小，精度控制越来越好，非常适合构建血管化的组织。其中较为成功的是3D打印的技术，但由于打印过程中细胞受到的损伤过大，打印完成的体外组织其功能和活性也会变差。为了改善这一现状，本发明致力于提供一种对于细胞状态影响更小、制备方式更为温和的利用微模板来制备体外血管化3D组织的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于微加工技术的模板化体外血管化3D组织的制备方法，致力于为组织工程、再生医学等的发展提供前期技术支持。
本发明的技术解决方案是：一种基于微加工技术的体外血管化3D组织的制备方法，包括下列步骤：
(1)软模板的制备：利用常规软光刻的方法，制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板；分为模板1和模板2，如图1所示，其中模板1用于制备分支状的内皮细胞结构，模板2用于制备块状的组织细胞结构；
模板1为多级分支状结构，可模拟体内的多级分支状血管网络，包括细胞入口，主通道一级分支通道，二级分支通道和出口组成；
模板2为可以完全将模板1的结构包含的块状结构，可模拟体内块状的生理组织，包括细胞入口，腔室和出口；
(2)内皮组织的预成型：利用所述的模板1进行。首先将内皮细胞和由GelMA及PEGDA两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板1和载玻片贴合，将混合液由模板1的入口注入，依次流经主通道、一级分支通道、二级分支通道至注满模板，多余的液体由出口流出。最后把注满细胞的模板1放入4℃冰箱3-10min，使水凝胶预聚体低温凝固，从玻璃上取下模板1，由于玻璃比PDMS更亲水，凝固的水凝胶留在了载玻片上；
(3)体外3D组织块的成型：首先将组织细胞和由GelMA及PEGDA两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板2贴合在上述已有水凝胶的载玻片上，模板2应完全覆盖已有水凝胶，在把组织细胞由入口注入模板2，液体充满腔室后，多余的液体由出口流出。将上述内部有两次灌注水凝胶预聚体的模板2整体放在紫外光源下照射，使其中的预聚体全部聚合，取下模板2，将留在载玻片上的3D组织块取下；
(4)体外3D组织块的培养：上述取下的3D组织块应置于两种细胞的混合培养基中，比例1:1，按照常规的哺乳动物细胞培养条件进行培养，但在培养基中需加入血管生成因子，促进内皮细胞形成血管化组织。培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征；
所述的模板1主通道(2)宽度500-1500μm，长度2-10mm，高度300-600μm；
所述一级分支通道(3)宽度300-500μm，长度500-5000μm，高度300-600μm；
所述二级分支通道(4)宽度100-300μm，长度300-5000μm，高度300-600μm。
所述模板2则应完全覆盖模板1的轮廓，高度比模板1高200-300μm。
所述内皮细胞和组织细胞的浓度均为105-107个/ml，细胞来源可以是干细胞分化，原代细胞提取或者购买细胞系。
所述所述水凝胶预聚体中GelMA浓度：4-16％g/ml；PEGDA分子量：600-1000Da，浓度：1-4％g/ml。
本发明利用精准可控的微加工技术来制作模板，并将生物相容性和可加工性极佳的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)作为支架材料，制备内皮细胞和其他组织细胞的共培养组织块，该方法在血管化体外微组织构建和组织生理病理研究等方面具有极大的应用价值。
附图说明
图1两个软模板的示意图，其中：a模板1示意图；b模板2示意图，
其中：1内皮细胞入口；2主通道；3一级分支通道；4二级分支通道；5内皮细胞出口；6组织细胞入口；7腔室；8组织细胞出口。
图2是用含有墨水的水凝胶预聚体表征的水凝胶支架的一角。
图3是实施例2中负载脐静脉内皮细胞和干细胞来源的胎盘滋养层细胞的体外3D组织的一角，其中：a明场表征图(标尺：1000μm)；b荧光表征图(标尺：1000μm，插图标尺200μm)；c血管化实验组于非血管的对照组细胞存活率统计图。
具体实施方式
利用微加工技术制得两个PDMS软模板，并依次将含有内皮细胞和组织细胞的水凝胶预聚体溶液灌注到两个模板中，然后利用紫外光聚合的方式制得体外3D组织，并进行后续培养和表征。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种基于微加工技术的模板化体外血管化3D组织的制备方法，包括下列步骤：
(1)软模板的制备：利用常规软光刻的方法，制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板；分为模板1和模板2其中模板1用于制备分支状的内皮细胞结构，模板2用于制备块状的组织细胞结构。
如图1所示，模板1为多级分支状结构，包括细胞入口1，主通道2一级分支通道3，二级分支通道4和出口5组成；其中主通道2宽度1000μm，长度4mm，高度300μm；一级分支通道3宽度500μm，长度2000μm，高度300μm；二级分支通道4宽度250μm，长度2000μm，高度300μm。
模板2为可以完全将模板1的结构包含的块状结构，包括细胞入口6，腔室7和出口8。可完全覆盖模板1的轮廓，高度比模板1高200μm。
(2)内皮组织的预成型：利用所述的模板1进行。首先将密度为3*106的脐静脉内皮细胞和由8％(g/ml)的GelMA及2％(g/ml)的PEGDA(600Da)两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板1和载玻片贴合，将混合液由模板1的入口1注入，依次流经主通道2、一级分支通道3、二级分支通道4至注满模板，多余的液体由出口5流出。最后把注满细胞的模板1放入4℃冰箱5min，使水凝胶预聚体低温凝固，从玻璃上取下模板1，由于玻璃比PDMS更亲水，凝固的水凝胶留在了载玻片上；
(3)体外3D组织块的成型：首先将密度为5*106的肺上皮细胞和由8％(g/ml)的GelMA及2％(g/ml)的PEGDA(600Da)两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板2贴合在上述已有水凝胶的载玻片上，模板2应完全覆盖已有水凝胶，在把组织细胞由入口6注入模板2，液体充满腔室7后，多余的液体由出口8流出。将上述内部有两次灌注水凝胶预聚体的模板2整体放在紫外光源下照射，使其中的预聚体全部聚合，取下模板2，将留在载玻片上的3D组织块取下。另外，在2中的预聚体溶液中混入少量红色墨水，可以进行水凝胶支架的形貌表征，如图2所示。
(4)体外3D组织块的培养：上述取下的3D组织块应置于两种细胞的混合培养基中，比例1:1，按照常规的哺乳动物细胞培养条件进行培养，但在培养基中需加入血管生成因子，促进内皮细胞形成血管化组织。培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。
实施例2
一种基于微加工技术的模板化体外血管化3D组织的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)软模板的制备：利用常规软光刻的方法，制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板；分为模板1和模板2,如图1所示。其中模板1为多级分支状结构，用于制备分支状的内皮细胞结构，模板2为可以完全将模板1的结构包含的块状结构，用于制备块状的组织细胞结构。
模板1包括细胞入口1，主通道2一级分支通道3，二级分支通道4和出口5组成；其中主通道2宽度1000μm，长度4mm，高度300μm；一级分支通道3宽度500μm，长度2000μm，高度300μm；二级分支通道4宽度250μm，长度2000μm，高度300μm。
模板2包括细胞入口6，腔室7和出口8。可完全覆盖模板1的轮廓，高度比模板1高200μm。
(2)内皮组织的预成型：利用所述的模板1进行。首先将红色荧光标记的密度为3*106的脐静脉内皮细胞和由8％(g/ml)的GelMA及2％(g/ml)的PEGDA(600Da)两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板1和载玻片贴合，将混合液由模板1的入口1注入，依次流经主通道2、一级分支通道3、二级分支通道4至注满模板，多余的液体由出口5流出。最后把注满细胞的模板1放入4℃冰箱6min，使水凝胶预聚体低温凝固，从玻璃上取下模板1，由于玻璃比PDMS更亲水，凝固的水凝胶留在了载玻片上；另设置对照组，即不在水凝胶预聚体中加入内皮细胞；
(3)体外3D组织块的成型：首先将绿色荧光标记的密度为6*106的人潜能干细胞来源胎盘滋养层细胞和由8％(g/ml)的GelMA及2％(g/ml)的PEGDA(600Da)两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板2贴合在上述已有水凝胶的载玻片上，模板2应完全覆盖已有水凝胶，在把组织细胞由入口6注入模板2，液体充满腔室7后，多余的液体由出口8流出。将上述内部有两次灌注水凝胶预聚体的模板2整体放在紫外光源下照射，使其中的预聚体全部聚合，取下模板2，将留在载玻片上的3D组织块取下，形成可血管化的组织。对照组进行相同的操作，形成非血管化的组织。
(4)体外3D组织块的培养：上述取下的3D组织块应置于两种细胞的混合培养基中，比例1:1，按照常规的哺乳动物细胞培养条件进行培养，但在培养基中需加入血管生成因子，促进内皮细胞形成血管化组织。培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养。如图3a和b所示，利用荧光显微镜可以观察两种细胞在3D组织中的空间分布，其中标记为红色的内皮细胞呈分支状贯穿分布于标记为绿色的块状滋养层细胞中。另外，在培养72小时后，对血管化和非血管化的体外3D组织进行细胞存活率的统计，如图3c所示，血管化的体外3D组织中细胞存活率更高。
实施例3
一种基于微加工技术的模板化体外血管化3D组织的制备方法，包括下列步骤：
(1)软模板的制备：利用常规软光刻的方法，制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板；分为模板1和模板2其中模板1用于制备分支状的内皮细胞结构，模板2用于制备块状的组织细胞结构。
如图1所示，模板1为多级分支状结构，包括细胞入口1，主通道2一级分支通道3，二级分支通道4和出口5组成；其中主通道2宽度1500μm，长度10mm，高度600μm；一级分支通道3宽度500μm，长度5000μm，高度600μm；二级分支通道4宽度300μm，长度5000μm，高度600μm。
模板2为可以完全将模板1的结构包含的块状结构，包括细胞入口6，腔室7和出口8。可完全覆盖模板1的轮廓，高度比模板1高300μm。
(2)内皮组织的预成型：利用所述的模板1进行。首先将经红色细胞膜染料标记的密度为1*107的脐静脉内皮细胞和由16％(g/ml)的GelMA及4％(g/ml)的PEGDA(1000Da)两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板1和载玻片贴合，将混合液由模板1的入口1注入，依次流经主通道2、一级分支通道3、二级分支通道4至注满模板，多余的液体由出口5流出。最后把注满细胞的模板1放入4℃冰箱5min，使水凝胶预聚体低温凝固，从玻璃上取下模板1，由于玻璃比PDMS更亲水，凝固的水凝胶留在了载玻片上；
(3)体外3D组织块的成型：首先将绿色细胞膜染料标记的密度为1.2*107的肝癌细胞(HepG2)和由16％(g/ml)的GelMA及4％(g/ml)的PEGDA(1000Da)两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板2贴合在上述已有水凝胶的载玻片上，模板2应完全覆盖已有水凝胶，在把组织细胞由入口6注入模板2，液体充满腔室7后，多余的液体由出口8流出。将上述内部有两次灌注水凝胶预聚体的模板2整体放在紫外光源下照射，使其中的预聚体全部聚合，取下模板2，将留在载玻片上的3D组织块取下。另外，在2中的预聚体溶液中混入少量红色墨水，可以进行水凝胶支架的形貌表征，如图2所示。
(4)体外3D组织块的培养：上述取下的3D组织块应置于两种细胞的混合培养基中，比例1:1，按照常规的哺乳动物细胞培养条件进行培养，但在培养基中需加入血管生成因子，促进内皮细胞形成血管化组织。培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。两种细胞在水凝胶支架中的形貌与图3b中相似。
实施例4
一种基于微加工技术的模板化体外血管化3D组织的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)软模板的制备：利用常规软光刻的方法，制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)模板；分为模板1和模板2,如图1所示。其中模板1为多级分支状结构，用于制备分支状的内皮细胞结构，模板2为可以完全将模板1的结构包含的块状结构，用于制备块状的组织细胞结构。
模板1包括细胞入口1，主通道2一级分支通道3，二级分支通道4和出口5组成；其中主通道2宽度500μm，长度2mm，高度300μm；一级分支通道3宽度300μm，长度500μm，高度300μm；二级分支通道4宽度100μm，长度300μm，高度300μm。
模板2包括细胞入口6，腔室7和出口8。可完全覆盖模板1的轮廓，高度比模板1高200μm。
(2)内皮组织的预成型：利用所述的模板1进行。首先将密度为2*105的脐静脉内皮细胞和由4％(g/ml)的GelMA及1％(g/ml)的PEGDA(600Da)两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板1和载玻片贴合，将混合液由模板1的入口1注入，依次流经主通道2、一级分支通道3、二级分支通道4至注满模板，多余的液体由出口5流出。最后把注满细胞的模板1放入4℃冰箱6min，使水凝胶预聚体低温凝固，从玻璃上取下模板1，由于玻璃比PDMS更亲水，凝固的水凝胶留在了载玻片上；另设置对照组，即不在水凝胶预聚体中加入内皮细胞；
(3)体外3D组织块的成型：首先将密度为3*105的肝癌细胞(HepG2)和由4％(g/ml)的GelMA及1％(g/ml)的PEGDA(600Da)两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀。然后把模板2贴合在上述已有水凝胶的载玻片上，模板2应完全覆盖已有水凝胶，在把组织细胞由入口6注入模板2，液体充满腔室7后，多余的液体由出口8流出。将上述内部有两次灌注水凝胶预聚体的模板2整体放在紫外光源下照射，使其中的预聚体全部聚合，取下模板2，将留在载玻片上的3D组织块取下，形成可血管化的组织。对照组进行相同的操作，形成非血管化的组织。
(4)体外3D组织块的培养：上述取下的3D组织块应置于两种细胞的混合培养基中，比例1:1，按照常规的哺乳动物细胞培养条件进行培养，但在培养基中需加入血管生成因子，促进内皮细胞形成血管化组织。培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养。在培养72小时后，对血管化和非血管化的体外3D组织进行细胞存活率的统计，结果与如图3c中类似，即血管化的体外3D组织中细胞存活率更高。
Claims (3)
1.一种基于微加工技术的体外血管化3D组织的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)软模板的制备：利用常规软光刻的方法，制备聚二甲基硅氧烷模板；分为模板1和模板2；其中模板1用于制备分支状的内皮细胞结构，模板2用于制备块状的组织细胞结构；
所述模板1为多级分支状结构，可模拟体内的多级分支状血管网络，由细胞入口(1)，主通道(2)，一级分支通道(3)，二级分支通道(4)和出口(5)组成；其中，主通道(2)宽度500-1500μm，长度2-10mm，高度300-600μm；一级分支通道(3)宽度300-500μm，长度500-5000μm，高度300-600μm；二级分支通道(4)宽度100-300μm，长度300-5000μm，高度300-600μm；
模板2为可以完全将模板1的结构包含的块状结构，可模拟体内块状的生理组织，包括细胞入口(6)，腔室(7)和出口(8)；模板2应完全覆盖模板1的轮廓高度比模板1高200-300μm；
(2)内皮组织的预成型：利用所述的模板1，首先将内皮细胞和由GelMA及PEGDA两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀；然后把模板1和载玻片贴合，将混合液由模板1的入口(1)注入，依次流经主通道(2)、一级分支通道(3)、二级分支通道(4)至注满模板，多余的液体由出口(5)流出；最后把注满细胞的模板1放入4℃冰箱3-10min，使水凝胶预聚体低温凝固，从玻璃上取下模板1，由于玻璃比PDMS更亲水，凝固的水凝胶留在了载玻片上；
(3)体外3D组织块的成型：首先将组织细胞和由GelMA及PEGDA两种高分子组成的水凝胶预聚体混均匀；然后把模板2贴合在上述已有水凝胶的载玻片上，模板2应完全覆盖已有水凝胶，在把组织细胞由入口(6)注入模板2，液体充满腔室(7)后，多余的液体由出口(8)流出；将上述内部有两次灌注水凝胶预聚体的模板2整体放在紫外光源下照射，使其中的预聚体全部聚合，取下模板2，将留在载玻片上的3D组织块取下；
(4)体外3D组织块的培养：上述取下的3D组织块应置于两种细胞的混合培养基中，比例1:1，按照常规的哺乳动物细胞培养条件进行培养，但在培养基中需加入血管生成因子，促进内皮细胞形成血管化组织；培养期间每隔1-3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。
2.根据权利要求1所述的一种基于微加工技术的体外血管化3D组织的制备方法，其特征在于：内皮细胞和组织细胞的浓度均为105-107个/ml，细胞来源是干细胞分化、原代细胞提取或者购买细胞系。
3.根据权利要求1所述的一种基于微加工技术的体外血管化3D组织的制备方法，其特征在于：所述水凝胶预聚体中GelMA浓度：4-16％g/ml；PEGDA分子量：600-1000Da，浓度：1-4％g/ml。
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