CN110628567B - 超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，包括微孔阵列芯片和微流控封装结构，所述微孔阵列芯片设置在所述微流控封装结构内；所述微孔阵列芯片在其基底上设置有至少一个微孔阵列区，所述微孔阵列区具有多个微孔，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状，且所述微孔内壁上修饰有至少一个DNA探针。本发明通过设计具有十万量级、百万量级微孔的芯片，并通过在微孔内修饰DNA探针捕获细胞内的目标核酸分子，可实现十万量级、百万量级的单细胞捕获，并进一步实现原位裂解、核酸扩增，能为超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析提高芯片基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片。
背景技术
机体的生长、发育、分化、衰老和病理病变等均与基因的差异表达有关。肿瘤的发生发展及转移也与基因的突变和差异表达有关，肿瘤组织中心的细胞、周围的细胞、转移灶的细胞等，也因基因组和转录表达谱的差异，导致功能特性的不同，影响和决定肿瘤的治疗等结果。
传统的基因表达研究方法通常在mRNA水平来衡量某个基因的表达。对于mRNA水平的表达通常用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)来实现。当前的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)，只能在细胞群体水平观察多细胞平均的结果。在细胞群体水平上进行的，最终得到的结果，其实是多个细胞的平均，往往丢失了细胞异质性的信息及单细胞功能多样性的关键信息。
随着单细胞分析技术发展，单细胞多基因检测系统应运而生。其通常是利用微流控通道制作独立的单元，将单细胞单独隔离在独立单元中，并进行cDNA扩增，每次最多捕获几百至几千个单细胞，然后再配合仪器进行核酸扩增检测，但现有的微流控芯片的微孔通道数量一般仅为几百至几万，每次捕获的单细胞数量少，检测通量低，无法满足超高通量细胞核酸分子检测的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，包括微孔阵列芯片和微流控封装结构，所述微孔阵列芯片设置在所述微流控封装结构内；
所述微孔阵列芯片在其基底上设置有至少一个微孔阵列区，所述微孔阵列区具有多个微孔，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状，且所述微孔内壁上修饰有至少一个DNA探针。
优选的是，所述微孔的内表面经亲水处理，所述微孔阵列芯片除所述微孔内表面的其他表面经疏水处理。
优选的是，所述微孔阵列区包括一字排列在基底上的10个，单个所述微孔阵列区内包括的微孔数量不小于106个。
优选的是，所述微孔为通孔，且为正多边形结构。
优选的是，所述微孔形状为正六边形，其外接圆的直径为1-100μm。
优选的是，所述微流控封装结构包括底层基板和上层盖板，所述上层盖板的下表面中部开设有上芯片槽，所述上芯片槽的两侧对称设置有与之连通的进样流道槽和出样流道槽；所述底层基板上表面中部设置有下芯片槽，所述下芯片槽的一侧设置有与所述出样流道槽的结构相同的副流道槽；
所述上层盖板与底层基板贴合连接后，所述上芯片槽和下芯片槽位置正对形成用于容纳所述微孔阵列芯片的芯片安装槽，所述进样流道槽和所述底层基板的上表面之间形成进样流道，所述出样流道槽和副流道槽位置正对形成出样流道。
优选的是，所述上层盖板上设置有进样口、总出液口、缓冲液入口和缓冲液出口；所述进样流道槽和出样流道槽沿宽度方向设置在所述上层盖板的下表面两侧，所述进样口、总出液口沿宽度方向设置在所述上层盖板的两侧，所述缓冲液入口和缓冲液出口沿长度度方向设置在所述上层盖板的两侧。
优选的是，所述进样流道槽、出样流道槽和副流道槽结构相同，均为树状分叉结构流道，其具有一个树根节点端口和若干子节点端口；
所述进样流道槽的树根节点端口与所述进样口连通，其子节点端口连通至所述上芯片槽的靠近所述进样口的一侧；
所述出样流道槽的子节点端口与所述上芯片槽的靠近所述总出液口的一侧连通，其树根节点端口连通至所述总出液口；
所述副流道槽的子节点端口与所述下芯片槽的靠近所述总出液口的一侧连通，其树根节点端口连通至所述总出液口；
所述下芯片槽沿长度方向的两端分别与所述缓冲液入口和缓冲液出口连通。
优选的是，所述树状分叉结构流道的子节点端口的数量与所述微孔阵列芯片上的微孔阵列区的个数相同。
优选的是，所述树状分叉结构流道的子节点端口设置有V型导流槽，所述V型导流槽的数量和位置与所述微孔阵列芯片上的微孔阵列区一一对应；所述V型导流槽的尖口端与所述子节点端口连通，另一端与所述微孔阵列区的侧部连通。
本发明的有益效果是：
本发明通过设计具有十万量级、百万量级微孔的芯片，并通过在微孔内修饰DNA探针捕获细胞内的目标核酸分子，可实现十万量级、百万量级的单细胞捕获，并进一步实现原位裂解、核酸扩增，能为超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析提高芯片基础；
本发明通过对微孔阵列芯片进行亲、疏水处理，能增加微孔毛细力，利于单细胞吸入微孔，实现单细胞捕获；
本发明的微流控封装结构通过设计多歧路树状分叉结构的流道，能实现样品的均匀分布，并布满整个微孔阵列区，实现高效均匀进样，且能保证各个末端分支的流量基本一致，实现液面的平稳推进。
附图说明
图1为本发明的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片的分解结构示意图；
图2为本发明的上层盖板的下表面的结构示意图；
图3为本发明的上层盖板的下表面设置有微孔阵列芯片时的结构示意图；
图4为本发明的底层基板上表面的副流道槽的结构示意图；
图5为本发明的微流控封装结构内的整体流道的结构示意图。
附图标记说明：
1—微孔阵列芯片；2—微流控封装结构；10—微孔阵列区；20—底层基板；21—上层盖板；22—上芯片槽；23—进样流道槽；24—出样流道槽；25—副流道槽；26—下芯片槽；27—进样口；28—总出液口；29—缓冲液入口；30—缓冲液出口；31—树根节点端口；32—子节点端口；33—V型导流槽。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
如图1-5所示，本实施例的一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，包括微孔阵列芯片1和微流控封装结构2，微孔阵列芯片1设置在微流控封装结构2内；
微孔阵列芯片1在其基底上设置有至少一个微孔阵列区3，微孔阵列区3具有多个微孔，微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状，且微孔内壁上修饰有至少一个DNA探针。
其中，微孔阵列芯片1的基底可采用聚合物、Si等材料，通过刻蚀，可形成直径在1μm-100μm的微孔结构。且微孔为通孔，且为正多边形结构。单个微孔中只能容纳单个细胞，在本实施例中，微孔形状为正六边形，其外接圆的直径为1-100μm。且单个微孔阵列区3内包括的微孔数量不小于106个，单个微孔阵列区3能达到十万量级的单细胞捕获。进一步的，微孔阵列芯片1上设置有10个一字排列的微孔阵列区3，从而使微孔阵列芯片1能达到总量为百万量级的超高通量单细胞捕获。当然，单个微孔阵列区3的微孔数量以及微孔阵列芯片1上的微孔阵列区3的数量均可扩展，可扩展实现千万量级的超高通量单细胞捕获。其中的DNA探针用于捕获目标核酸分子，通过修饰多个DNA探针即可实现多个基因位点的检测。
其中，微孔的内表面经亲水处理，微孔阵列芯片1除微孔内表面的其他表面经疏水处理。通过微孔的内表面亲水处理，能增加微孔毛细力，利于单细胞吸入微孔；通过他表面疏水处理，能减少表面液体残留。处理后的微孔阵列芯片1能够通过微孔的毛细力吸入样本，实现单细胞捕获和原位观测。
其中，在一种优选的实施例中，微孔阵列芯片1的亲、疏水处理方法为：
1)亲水处理：将整个微孔阵列芯片1浸没在亲水试剂中反应一定时间，亲水试剂可采用双氧水、氨水、醋酸、浓硫酸、盐酸或氢氧化钠中的至少一种；
2)填充微孔：采用填充物填充微孔阵列芯片1的微孔，隔绝微孔内壁；填充物可采用水、三氯乙烯、正己烷、硅油、液体石蜡、固体石蜡、氟化油、蓝膜或PDMS中的至少一种；
3)疏水处理：将填充后的微孔阵列芯片1浸没在疏水试剂中反应一定时间，疏水化试剂可采用全氟癸基三甲氧基硅烷、十八烷基三氯硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、十六烷基三乙氧基硅烷、己基三乙氧基硅烷或辛基三氯硅烷中的至少一种；
4)去除微孔中的填充物：采用清洗试剂对微孔阵列芯片1进行超声清洗，将微孔中的填充物去除，然后烘干，得到处理完成的微孔阵列芯片1。清洗试剂可选用三氯乙烯、丙酮、乙醇或异丙醇。
本发明中主要为进行超高通量的单细胞核酸实时荧光定量分析提供一种超高通量的芯片，利用本发明的芯片进行荧光定量分析的主要步骤为：
1)制作本发明的芯片；
2)将待测样品加入微孔阵列芯片1中，通过微孔捕获单细胞，通过微孔中修饰的DNA探针捕获目标核酸分子；
3)进行PCR扩增检测，通过荧光定量分析，实现单细胞核酸实时荧光定量分析。
通过本发明的具有百万量级的微孔的芯片实现百万量级的超高通量单细胞捕获，从而为实现超高通量的单细胞核酸实时荧光定量分析方法和系统提供芯片支持。
本实施例中，微流控封装结构2包括底层基板20和上层盖板21，上层盖板21的下表面中部开设有上芯片槽22，上芯片槽22的两侧对称设置有与之连通的进样流道槽23和出样流道槽24；底层基板20上表面中部设置有下芯片槽26，下芯片槽26的一侧设置有与出样流道槽24的结构相同的副流道槽25；
上层盖板21与底层基板20贴合连接后，上芯片槽22和下芯片槽26位置正对形成用于容纳微孔阵列芯片1的芯片安装槽，进样流道槽23和底层基板20的上表面之间形成进样流道，出样流道槽24和副流道槽25位置正对形成出样流道。
本发明中利用微流控封装结构2封装微孔阵列芯片1，通过其流道的设计，可实现快速进样及样品的均匀分布。
其中，上层盖板21上设置有进样口27、总出液口28、缓冲液入口29和缓冲液出口30；进样流道槽23和出样流道槽24沿宽度方向设置在上层盖板21的下表面两侧，进样口27、总出液口28沿宽度方向设置在上层盖板21的两侧，缓冲液入口29和缓冲液出口30沿长度度方向设置在上层盖板21的两侧。
其中，进样流道槽23、出样流道槽24和副流道槽25结构相同，均为树状分叉结构流道，其具有一个树根节点端口31和若干子节点端口32；
进样流道槽23的树根节点端口31与进样口27连通，其子节点端口32连通至上芯片槽22的靠近进样口27的一侧；
出样流道槽24的子节点端口32与上芯片槽22的靠近总出液口28的一侧连通，其树根节点端口31连通至总出液口28；
副流道槽25的子节点端口32与下芯片槽26的靠近总出液口28的一侧连通，其树根节点端口31连通至总出液口28；
下芯片槽26沿长度方向的两端分别与缓冲液入口29和缓冲液出口30连通。
微流控封装结构2内的整体流道的结构如图5所示。
样品在驱动泵的作用下，由进样口27进入，通过进样流道槽23均匀、快速分布到微孔阵列芯片1上表面，样品通过微孔的毛细力吸入微孔，从而实现微孔对单细胞的捕获，多余的样品从微孔阵列芯片1另一侧的出样流道槽24，经由总出液口28排出。
缓冲液经由缓冲液入口29进入下芯片槽26，到达微孔阵列芯片1下表面，从微孔底部与微孔内进行物质交换，多余的缓冲液可从缓冲液出口30排出。
进样时，由于毛细力的原因，微孔阵列芯片1上表面流入进微孔的样品需要克服毛细力作用才能从微孔底部流出流入下方区域，此时驱动泵的给样流速不足以使样品能克服微孔的毛细力作用，所以样品不会从微孔下部流出，保证细胞能固定在微孔内，同时也实现了微孔阵列芯片1上下区域的分层，可以实现上下两层的独立控制，可通入不同的试剂。当需要对微孔阵列芯片1的微孔进行冲洗清空时，总出液口28连接真空泵，清洗液从进样口27进入通过进样流道槽23分布到微孔阵列芯片1上表面，真空泵的抽吸作用使清洗液能克服微孔的毛细力作用，微孔中的液体可从微孔底部流出进入副流道槽25，然后由总出液口28排出。
本发明中采用树状分叉结构的流道，能实现样品的均匀分布，并布满整个微孔阵列区3，使每个微孔均能进样，且能保证各个末端分支的流量基本一致，实现液面的平稳推进。
更进一步的实施例中，树状分叉结构流道的子节点端口32的数量与微孔阵列芯片1上的微孔阵列区3的个数相同，均为10个。其中，树状分叉结构流道的子节点端口32设置有V型导流槽33，V型导流槽33的数量和位置与微孔阵列芯片1上的微孔阵列区3一一对应，数量均为10个，每一个V型导流槽33对应于一个微孔阵列区3的侧部；V型导流槽33的尖口端与子节点端口32连通，另一端与微孔阵列区3的侧部连通。通过V型导流槽33的设置，能利于液体的快速、均匀流动，以及分布和汇集。对于进样流道槽23而言，其子节点端口32的V型导流槽33利于将进入的样品快速、均匀的导入微孔阵列区3的上方。对于出样流道槽24和副流道槽25而言，其子节点端口32的V型导流槽33利于芯片安装槽中的液体快速汇集至子节点端口32中，以高效排出。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (6)
1.一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，其特征在于，包括微孔阵列芯片和微流控封装结构，所述微孔阵列芯片设置在所述微流控封装结构内；
所述微孔阵列芯片在其基底上设置有至少一个微孔阵列区，所述微孔阵列区具有多个微孔，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状，且所述微孔内壁上修饰有至少一个DNA探针；
所述微流控封装结构包括底层基板和上层盖板，所述上层盖板的下表面中部开设有上芯片槽，所述上芯片槽的两侧对称设置有与之连通的进样流道槽和出样流道槽；所述底层基板上表面中部设置有下芯片槽，所述下芯片槽的一侧设置有与所述出样流道槽的结构相同的副流道槽；
所述上层盖板与底层基板贴合连接后，所述上芯片槽和下芯片槽位置正对形成用于容纳所述微孔阵列芯片的芯片安装槽，所述进样流道槽和所述底层基板的上表面之间形成进样流道，所述出样流道槽和副流道槽位置正对形成出样流道；
所述上层盖板上设置有进样口、总出液口、缓冲液入口和缓冲液出口；所述进样流道槽和出样流道槽沿宽度方向设置在所述上层盖板的下表面两侧，所述进样口、总出液口沿宽度方向设置在所述上层盖板的两侧，所述缓冲液入口和缓冲液出口沿长度方向设置在所述上层盖板的两侧；
所述进样流道槽、出样流道槽和副流道槽结构相同，均为树状分叉结构流道，其具有一个树根节点端口和若干子节点端口；
所述进样流道槽的树根节点端口与所述进样口连通，其子节点端口连通至所述上芯片槽的靠近所述进样口的一侧；
所述出样流道槽的子节点端口与所述上芯片槽的靠近所述总出液口的一侧连通，其树根节点端口连通至所述总出液口；
所述副流道槽的子节点端口与所述下芯片槽的靠近所述总出液口的一侧连通，其树根节点端口连通至所述总出液口；
所述下芯片槽沿长度方向的两端分别与所述缓冲液入口和缓冲液出口连通；
所述树状分叉结构流道的子节点端口设置有V型导流槽，所述V型导流槽的数量和位置与所述微孔阵列芯片上的微孔阵列区一一对应；所述V型导流槽的尖口端与所述子节点端口连通，另一端与所述微孔阵列区的侧部连通。
2.根据权利要求1所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，其特征在于，所述微孔的内表面经亲水处理，所述微孔阵列芯片除所述微孔内表面的其他表面经疏水处理。
3.根据权利要求2所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，其特征在于，所述微孔阵列区包括一字排列在基底上的10个，单个所述微孔阵列区内包括的微孔数量不小于106个。
4.根据权利要求3所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，其特征在于，所述微孔为通孔，且为正多边形结构。
5.根据权利要求4所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，其特征在于，所述微孔形状为正六边形，其外接圆的直径为1-100μm。
6.根据权利要求5所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析芯片，其特征在于，所述树状分叉结构流道的子节点端口的数量与所述微孔阵列芯片上的微孔阵列区的个数相同。
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