CN110709515A - 用于差异性诱导细胞死亡和干扰素表达的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于抑制细胞生长或诱导细胞死亡的组合物和方法。所述能够抑制细胞的生长或诱导细胞死亡的组合物包含5’‑三磷酸非线性RNA。所述RNA包含由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第一茎环，并且可以任选地包含由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第二茎环，以及第一茎环和第二个茎环之间的间隔子。抑制细胞生长或诱导细胞死亡的方法包括使细胞与所述组合物接触或将组合物施用于受试者，所述组合物的量为有效抑制细胞生长或诱导细胞死亡的量。

Description

用于差异性诱导细胞死亡和干扰素表达的组合物和方法

相关申请的交叉引用

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对序列表的说明

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发明领域

所公开的技术总体涉及用于诱导细胞死亡的组合物和方法。更具体地，所述技术涉及RNA组合物及其在诱导细胞死亡和差异性干扰素表达中的用途。

背景技术

模式识别受体(PRR)是免疫传感器，可启动宿主防御感染的反应。它们位于细胞表面，内体区室和细胞质中，在那里它们可以识别与入侵病原体相关的不同分子特征。 ¹ 已知病毒或细菌RNA是多种PRR的有效配体。 ¹ 维甲酸诱导基因-I(RIG-1)，黑素瘤分化相关基因5(MDA-5)，RNA活化的蛋白激酶R(PKR)，遗传和生理学实验室2(LGP2)，富含Nacht亮氨酸的重复蛋白3(NALP3)和具有四三肽重复序列1(IFIT1)的干扰素诱导蛋白位于细胞质中，它们感知RNA中特定的分子模式，例如5'三磷酸(5'ppp)，5'二磷酸(5'pp)和双链RNA(dsRNA)。 ^{2 , 3} Toll样受体(TLR)3、7和8位于内体区室中，并被dsRNA(TLR3)和单链RNA(ssRNA)(TLR7和TLR8).3活化)。 ³

除了抗感染免疫性，RNA传感PRR(RNA sensing PRR)的活化还可以介导感染细胞的程序性细胞死亡，这使得宿主可以通过牺牲感染细胞来有效地阻断病毒复制。 ⁴ 4PRR活化不仅导致感染细胞死亡，而且还导致未感染的恶性细胞的细胞死亡。用合成的病毒dsRNA类似物，聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyI:C)和含有5'ppp的短RNA双链体进行转染通过活化RNA传感PRR可诱导干扰素(IFN)-β的产生和各种人癌细胞的程序性细胞死亡，包括黑素瘤, ⁵ 肝细胞癌, ⁶ 胶质母细胞瘤, ⁷ 前列腺癌, ⁸ 卵巢癌, ⁹ 乳腺癌 ¹⁰ 和胰腺癌 ¹¹ 。有趣的是，RNA诱导的PRR活化在肿瘤细胞中上调了促凋亡分子，例如Noxa，Puma和TRAIL，但在非恶性细胞中却没有，这可能与PRR活化性RNA诱导的肿瘤选择性细胞死亡有关。 ^{5 , 12}

此外，PRR介导的细胞死亡导致释放损伤相关分子模式(DAMP)(例如，高迁移率组1蛋白(HMGB1))，钙网蛋白的表面易位，抗原摄取和树突状细胞(DC)的成熟，提示RNA诱导的肿瘤细胞死亡具有促免疫原性，并可产生抗肿瘤免疫。 ^{11 , 13 , 14} I型干扰素，例如IFN-α和IFN-β，具有广泛的免疫刺活化性，包括增强1型T辅助细胞响应，上调MHC I类分子，产生自然杀伤(NK)细胞和T细胞介导的细胞毒与抗肿瘤活性，包括抗增殖，抗血管生成和促凋亡作用。 ¹⁵ 因此，PRR介导的细胞死亡和I型IFN的释放可以协作并协同诱导针对肿瘤的治疗性和预防性细胞免疫应答。

目前，RNA传感PRR激动剂对癌症患者几乎没有或完全没有益处。 ^{16 , 17} 这种失败部分是由于非特异性诱导免疫反应所致的毒性。 ¹⁸ 所有PRR信号最终都活化MAP激酶，NF-κB和IFN调节因子(IRF)，其最终导致炎性细胞因子和IFN的产生。 ³ 这些细胞因子和IFN有助于诱导抗肿瘤免疫应答以及癌细胞死亡。另一方面，它们会导致正常组织的损伤和器官衰竭。 ¹⁵ 此外，肿瘤和肿瘤基质细胞产生的促炎细胞因子促进肿瘤的生长和存活，并导致抗肿瘤免疫力的失调， ¹⁹ 不利地影响抗癌PRR激动剂的治疗效果。因此，开发安全有效的RNA传感PRR激动剂对于使它们在临床上成为有用的药物是必要的。

已显示多种RNA传感PRR，包括RIG-I, ⁵ MDA5, ²⁰ TLR3 ¹⁰ 和TLR7, ²¹ 可诱导程序性细胞死亡以及细胞因子表达。尚不清楚这种RNA传感PRR的活化如何导致癌细胞的细胞死亡，以及PRR介导的细胞死亡和细胞因子表达是否可以被解偶联。最近，Yu等人证明缺乏N末端半胱天冬酶募集结构域(CARD)的MDA5突变体参与前列腺癌细胞中的程序性细胞死亡程序，但没有诱导IFN-22的表达。 ²² 然而，没有开发出可在癌细胞中差异性诱导细胞死亡以及IFN和促炎性细胞因子表达的RNA激动剂。

发明简述

本文公开了用于抑制细胞生长或诱导细胞死亡的组合物和方法。在本发明的一方面，能够抑制细胞生长或诱导细胞死亡的组合物包含5'-三磷酸非线性RNA。所述RNA可以包含由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第一茎环。所述RNA还可以包含由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第二茎环以及在所述第一茎环和所述第二茎环之间的间隔子。在一些实施方案中，所述RNA可以包含一种或多种2’-氟修饰的嘧啶或其他修饰，例如一或多种2’-氟修饰的嘌呤或硫代磷酸化的核苷酸。在一些实施方案中，所述第一茎环包含能够与其互补序列杂交以形成第一茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸和/或所述第二茎环包含能够与其互补序列杂交形成第二个茎环的5'-三磷酸修饰的末端核苷酸或3’末端核苷酸。

在一些实施方案中，所述RNA包含与ICR2(SEQ ID NO:8)具有至少50％，包括但不限于至少80％，85％，90％或95％的序列同一性的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA包含与ICR4(SEQ ID NO:15),ICR4A(SEQ ID NO:16),ICR5X(SEQ ID NO:17),或ICR5Y(SEQ IDNO:18)具有至少50％，包括但不限于至少80％，85％，90％或95％序列同一性的寡核苷酸。在具体实施方案中，所述RNA基本上由以下组成：ssRNA寡核苷酸，其与ICR4(SEQ ID NO:15)或ICR4A(SEQ ID NO:16)具有至少50％，包括但不限于至少80％，85％，90％或95％的序列同一性；或dsRNA，其包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少50％，包括但不限于至少80％，85％，90％或95％的序列同一性的第一寡核苷酸以及与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少50％，包括但不限于至少80％，85％，90％或95％的序列同一性的第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸完全或部分杂交。

在一些实施方案中，茎环由具有与ICR2(SEQ ID NO:8)具有至少50％，包括但不限于至少80％，85％，90％或95％的序列同一性的寡核苷酸形成，所述寡核苷酸包含能够与其互补核苷酸杂交以形成茎环的5'-三磷酸修饰的末端核苷酸。在具体的实施方案中，所述茎环由基本上由ICR2(SEQ ID NO:8)组成的寡核苷酸形成。

在一些实施方案中，所述间隔子包含RNA的单链区段。在具体的实施方案中，所述间隔子包含由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第三茎环。在其他实施方案中，所述间隔子包含RNA的双链区段。

所述组合物可以进一步包含一种或多种治疗剂。所述治疗剂可以选自化学治疗剂，抗癌生物制剂，免疫治疗剂或其任何组合。

所述组合物可以进一步包含一种或多种细胞质递送组合物。所述细胞质递送组合物可选自脂质体，合成聚合物，穿透细胞的肽，纳米颗粒，病毒颗粒，电穿孔缓冲液，核转染试剂或其任何组合。

本发明的另一方面是包含上述任何组合物的药物组合物。所述药物组合物可以包含治疗有效量的能够抑制细胞生长或诱导细胞死亡的组合物和一种或多种药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。

本发明的另一方面是抑制细胞生长或诱导细胞死亡的方法。该方法可以包括使细胞与有效抑制细胞生长或诱导细胞死亡的量的能够抑制细胞生长或诱导细胞死亡的前述任意组合物接触。

本发明的另一方面是在受试者中抑制细胞生长或诱导细胞死亡的方法。该方法可以包括以有效抑制细胞生长或诱导细胞死亡的量向需要这种治疗的受试者施用前述任意组合物。

在上述任一种方法中，所述细胞可以包括癌细胞。所述癌细胞可以包括黑素瘤细胞，脑癌细胞，前列腺癌细胞，乳腺癌细胞，肾癌细胞，肺癌细胞，肝癌细胞，结肠直肠癌细胞，白血病细胞，淋巴瘤细胞或卵巢癌细胞。

在上述任一种方法中，将所述组合物或至少所述RNA递送至至少多个细胞的细胞质中。

将参考附图通过示例的方式描述本发明的非限制性实施例，这些附图是示意性的并且不意图按比例绘制。在附图中，所示的每个相同或几乎相同的组件通常由单个数字表示。为了清楚起见，在不需要图示以使本领域普通技术人员理解本发明的地方，没有在每个附图中标记每个组件，也未示出本发明的每个实施方案的每个组件。

图1A说明了2’F修饰的5’ppp RNA以结构依赖性方式对生长抑制和IFN-β表达的差异诱导。设计并生成了2'F嘧啶掺入的5'ppp RNA，其包含5'ppp和各种二级结构，包括3’-悬垂的发夹(ICR1(SEQ ID NO:1)，ICR1A(SEQ ID NO:2)，ICR1B(SEQ ID NO:3)，ICR1C(SEQ IDNO:4))，平末端发夹(ICR2-3(SEQ ID NO:5)，ICR2(SEQ ID NO:8)，ICR2A(SEQ ID NO:9)，ICR2B(SEQ ID NO:10))，5’-悬垂的发夹(ICR3(SEQ ID NO:11)，ICR3A(SEQ ID NO:12)，ICR3B(SEQ ID NO:13)，ICR3C(SEQ ID NO:14)))和多个不同长度的茎环(ICR4(SEQ ID NO:15)，ICR4A(SEQ ID NO:16)，ICR5(SEQ ID NOS：17和18))。还产生了线性5’ppp ssRNA(ICR-L(SEQ ID NO:19))和长dsRNA(pIC)。RNA二级结构使用mFold预测。为了用这些RNA处理癌细胞，将WM266.4人黑素瘤细胞(1x104细胞/孔)在96孔板中用指定浓度的RNA转染4小时。RNA处理后72小时，收获细胞和培养上清液，并分别分析其生长抑制和IFN-β表达。数据代表两个单独的实验。误差线为S.D.。

图1B-1C示出(图1B)ICR4(SEQ ID NO:15)，ICR2(SEQ ID NO:8)，ICR2-1(SEQ IDNO:7)，ICR2-2(SEQ ID NO:6)，和ICR2-3(SEQ ID NO:5)的预测结构和(图1C)具有6-9bp茎的5'ppp 2’F发夹RNA的细胞毒。WM266-4细胞用指定的RNA转染4小时。转染后3天通过MTS测定法测定细胞生长速率。误差线为S.D.。

图2A-2E显示，与ICR2相比，ICR4在人癌细胞和先天免疫细胞中诱导降低的IFN-β和促炎细胞因子表达。WM266-4细胞(1x10⁴细胞/孔)(图2A)，人PBMC(1x10⁵细胞/孔)(图2B，图2E)和人DC(5x10⁴细胞/孔)(图2C-2D)在96孔板中分别用ICR2，ICR4，polyI:C(每种均为1μg/ml)或单独的转染剂(模拟)转染4小时。图2A-图2D，转染后24小时收获培养上清液。图2E，使用MTS测定法在转染后3天测定人PBMC的生长。数据是三个实验的平均值。误差线为S.D.。*：P<0.05。

图2F-2H显示了ICR2和ICR4对IFN-β表达的差异诱导和对人前列腺和人胰腺癌细胞的生长抑制。用ICR2，ICR4(分别为1μg/ml)或单独的转染剂(模拟)转染DU-145人前列腺癌细胞系(图2F)，PANC-1人胰腺癌细胞系(图2G)和BxPC3人胰腺癌细胞系(图2H)。通过MTS测定和ELISA分别测定细胞生长和IFN-β产生。误差线为S.D.。

图2I-2L显示了用ICR2，ICR4和polyI:C转染的小鼠癌细胞的细胞毒(图2I)和细胞因子产生(图2J-L)。B16小鼠黑素瘤细胞系和PANC-02小鼠胰腺癌细胞系分别用单独的转染剂(模拟)，ICR2，ICR4或polyI:C(pIC)(分别为1μg/ml)转染。转染后3天收获细胞和培养上清液。分别通过MTS测定法和ELISA测定细胞生长(图2I)和(图2J)IFN-β，(图2K)IL-6和(图2L)TNFα的产生。误差线为S.D.。

图3A-3E显示ICR4和polyI:C诱导急性细胞死亡，而ICR2诱导延迟细胞死亡。将WM266-4细胞(2x10⁵细胞/孔)在24孔板上分别用ICR2，ICR4，polyI:C(分别为1μg/ml)或单独的转染剂(模拟)转染4小时。转染后4小时(图3A)，24小时(图3B)和48小时(图3C)收获细胞和培养上清液。使用膜联蛋白V和7-AAD染色确定细胞死亡(图3D)。细胞死亡％＝(％膜联蛋白V+/7-AAD-)+(％膜联蛋白V-/7-AAD+)+(％膜联蛋白V+/7-AAD+)。通过ELISA确定IFN-β的产生(图3E)。图3A-3C数据代表三个单独的实验。图3D-3E数据是三个实验的平均值。误差线为S.D.。*：P<0.05。

图3F-3H显示ICR2而不是ICR4诱导IFN依赖性细胞死亡。将WM266-4细胞(1x10⁴个细胞/孔)在96孔板中用ICR2，ICR4(分别为0.2μg/ml)或单独的转染剂(模拟)转染4小时。重组人IFN-β(100ng/ml)用作阳性对照。转染后立即在存在或不存在B18R(1μg/ml)的情况下培养细胞3天。通过膜联蛋白V/7-AAD测定法在存在(图3F)或不存在(图3G)B18R(1μg/ml)的条件下以及MTS测定法(图3H)来测定细胞毒。图3F-3G数据代表两个单独的实验。图3H数据是三个实验的平均值。误差线为S.D.。*：P<0.05。

图3I-3K显示T7聚合酶诱导IVT副产物的产生。(图3I)由T7聚合酶诱导的IVT产生ICR2以及与ICR2互补的ICR2反义链。ICR2双链通过ICR2和ICR2反义链杂交产生。在20％聚丙烯酰胺凝胶上分析RNA。ICR2 IVT的(图3J)下部条带和(图3K)上部条带被纯化并转染到人黑素瘤细胞系WM266-4中。转染后一天，通过基于流式细胞术的膜联蛋白V-PE/7-AAD染色分析确定细胞死亡水平。

图4A-4C显示ICR2和ICR4触发细胞死亡和PRR信号通路的差异性活化。(图4A)WM266-4细胞(2x10⁵细胞/孔)与z-VAD-fmk、Nec-1、z-VAD-fmk和Nec-1的混合物或DMSO预温育6h，然后用ICR2，ICR4(各0.2微克/毫升)或单独的转染剂(模拟)转染4小时。将细胞在DMSO，z-VAD-fmk和/或Nec-1的存在下培养3天。转染后72小时，通过膜联蛋白V/7-AAD测定法测定细胞死亡。(图4B-4C)在用ICR2，ICR4或模拟转染后24小时收获WM266.4细胞。制备总细胞裂解物，线粒体裂解物和核提取物，并通过蛋白质印迹法进行分析。(图4B)评估了总细胞裂解物中细胞死亡相关分子的表达，包括裂解的胱天蛋白酶3和7，XIAP和TRAIL。β-微管蛋白表达用作上样对照。(图4C)测定了线粒体裂解物中的线粒体RIP1和细胞色素C氧化酶IV(COX IV)的表达，核提取物中的NF-κBp65和组蛋白H3的表达以及总细胞裂解物中的磷酸-IRF3的表达。误差线代表S.D.。图4A数据是三个实验的平均值。误差棒为S.D。图4B和图4C数据代表两个单独的实验。*P<0.05(vs DMSO)。

图5A-5F显示了ICR2和ICR4对RNA感应PRR介导的细胞毒的诱导。(图5A)Huh7.0(RIG-I野生型)和Huh7.5(RIG-I突变型)细胞(7x10³细胞/孔)用ICR2，ICR4(各1μg/ml)或模拟在96孔板中进行转染。转染后3天通过MTS测定法测定细胞毒。(图5B)用siRNA将WM266-4细胞中的RIG-1，PKR和MDA5敲低3倍。将细胞(1x10⁴个细胞/孔)重新接种在96孔板中，并用ICR2，ICR4(分别为0.2μg/ml)或模拟转染。转染后3天通过MTS测定法测定细胞毒性。(图5C)敲除人黑素瘤细胞中的RIG-1，MDA5和PKR。siRNA介导的敲除效率是在模拟转染(对照)或siRNA(缺失5'ppp)转染后4天通过Western印迹使用指定的siRNA相应抗体进行评估的。β-肌动蛋白抗体用作上样对照。(图5D)用ICR2，ICR4或polyI:C(pIC)(分别为0.5μg/ml)转染HEK-TLR3和HEK-TLR7报道子细胞(分别为4x10⁴细胞/孔)。未转染的polyI:C(polyI:C)和R848分别用作TLR3和TLR7的阳性对照。PBS处理用作阴性对照。通过用细菌碱性磷酸酶(BAP)处理使ICR2和ICR4去磷酸化，以研究INF-β(图5E)和生长抑制(图5F)。重复两次去磷酸化。用BAP处理和BAP未处理的ICR2或ICR4(分别为30nM)或模拟转染转染WM266-4细胞。转染后2天测定细胞毒和IFN-β产生。误差线代表S.D.。*：P＜0.05。

图5G-5H显示了含有2’F嘧啶或2’OH嘧啶的ICR2和ICR4的细胞死亡和IFN-β诱导活性的比较。用2’F ICR2、2’OH ICR2、2’F ICR4或2’OH ICR4(分别为35nM)转染WM266-4细胞。在转染后72小时评估(图5G)细胞毒和(图5H)IFN-β的产生。误差线代表S.D.。*P＜0.05。

图6A-6G显示了在用免疫原性细胞死亡诱导剂处理后，人类癌细胞释放出先天性免疫刺激性DAMP和钙网蛋白。(图6A)在24孔板上用ICR2或ICR4(分别为0.5μg/ml)转染WM266-4(2x10⁵个细胞/孔)细胞，并在转染后24小时收获。通过流式细胞术确定钙网蛋白的表面表达。(图6B)通过吞噬作用测定来确定DC对用ICR2，ICR4或阿霉素(Dox)处理的死亡/垂死WM266-4细胞的摄取。(图6C)通过ELISA确定从用ICR2，ICR4或Dox处理的细胞分泌的核蛋白HMGB1。(图6D-6F)从用单独的转染剂(模拟DAMP)，ICR2(ICR2 DAMP)，ICR4(ICR4DAMP)，polyI:C(pIC DAMP)或阿霉素(Dox DAMP)处理的WM266-4细胞中分离DAMP，如方法部分中所述。将HEK-TLR2，HEK-TLR3，HEK-TLR4和HEK-TLR9报道子细胞(5x10⁴细胞/孔)与DAMP(25％v/v)温育。通过比色测定法确定TLR4(图6D)，TLR3(图6E)，TLR2(图6F)和TLR9(图6G)的活化。Pam3CSK4，未转染的PolyI:C，LPS和CpG 2006用作TLR报告基因检测的阳性对照。图6A-6B数据代表两个单独的实验。图6C-6G数据是三个实验的平均值。误差线为S.D.。*P<0.05。

图6H显示了在用ICR2和ICR4转染的细胞中核蛋白HMGB1的细胞质移位。用ICR2，ICR4或单独的转染剂(模拟)转染WM266-4细胞4小时。转染后24小时收获细胞，并与抗HMGB1(绿色)和DAPI(蓝色)共同染色。荧光显微镜检测细胞核HMGB1和细胞质HMGB1以及核DAPI的表达。

图6I显示了用DAMP刺激的人DC产生的细胞因子。人PBMC衍生的未成熟DC用分离自以单独的转染剂(模拟DAMP)，ICR2(ICR2 DAMP)，ICR4(ICR4 DAMP)或阿霉素(Dox DAMP)处理的WM266-4细胞的DAMP进行激发。通过ELISA测定由激发的DC从头产生TNFα，IL-6和IL-8(从头(De Novo))和DAMP中预先存在的细胞因子(预先存在(Carryover))。

图6J显示了自免疫原性细胞死亡诱导剂处理的人癌细胞释放促凝DAMP。通过凝结测定法确定了从用单独的转染剂(模拟DAMP)，ICR2(ICR2 DAMP)，ICR4(ICR4 DAMP)，polyI:C(pIC DAMP)和阿霉素(Dox DAMP)处理的细胞释放的DAMP对人血浆凝结的增强。n＝3，误差线为S.D.。#P<0.05(指示的比较)。*P<0.05(相对于正常血浆凝结时间(无))。

图7A-7C显示了ICR2和ICR4对肿瘤生长的抑制。(图7A-7B)人黑素瘤WM266-4细胞(7x10⁵)皮下注射到裸鼠中。使用体内jetPEI(n＝9)，携带肿瘤的小鼠每天进行肿瘤内注射ICR2，ICR4或polyI:C(pIC)(分别为20μg/小鼠)，连续5天。每隔一天测量肿瘤生长(图7A)，并确定存活率(图7B)。(图7C)将B16-F0小鼠黑素瘤细胞(2×10⁵)皮下注射到同系C57BL/6小鼠中。连续4天(n＝5)肿瘤内施用ICR4或pIC(分别为20μg/小鼠)，并确定存活率(图7C)。误差线为S.D.。*P<0.05(载体相对于ICR2，ICR4，pIC)。

具体实施方式

本文公开了多种核酸酶抗性RNA分子，其可以差异性诱导免疫原性癌细胞死亡，而伴有或不伴有促炎性细胞因子包括INF-β，TNF-α或IL-6的表达。所述组合物包括5’三磷酸，2’氟修饰的嘧啶非线性单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)。如以下实施例所示，该组合物引起有效的细胞毒性。在某些情况下，组合物还诱导大量的I型IFN产生。然而，在其他情况下，该组合物不会诱导大量的细胞因子产生。因此，本文公开的组合物提供了有效的细胞毒同时差异性诱导细胞因子产生。

本文所述的RNA组合物具有茎环的共同结构基序。包含多个茎环的RNA组合物在最低检测浓度下显示出某些最高水平的细胞毒性或生长抑制作用，而没有大量诱导细胞因子的产生。尽管一些具有单个茎环的RNA组合物显示出实质性的细胞毒或生长抑制，而没有实质性诱导细胞因子的产生，但那些单茎组合物在与多茎组合物的相当的浓度下，往往表现出较低的细胞毒或生长抑制或更高的细胞因子产生。在某些情况下，单茎组合物在相当的浓度下显示出较低的细胞毒或生长抑制作用或较高的IFN产生。

细胞因子是免疫调节剂，其包含一系列蛋白质，例如干扰素，白介素，肿瘤坏死因子，趋化因子和淋巴因子。如在随后的实施例中所证明的，RNA组合物可以差异地诱导细胞因子例如INF-β，TNF-α或IL-6的产生。

茎环由核苷酸的完全或部分杂交形成，并产生发夹结构的基序。茎-环可从任何合适数量的核苷酸对形成，包括约5之间的任何数核苷酸配对的约30或约8至约25。在某些实施方案中，所述茎-环包含5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30个核苷酸对或其之间的任意数量的核苷酸对。仅具有部分杂交的茎环可具有任何数目的核苷酸对错配，其防止沿茎的互补核苷酸之间的核苷酸配对。优选地，所述茎环在生理条件下保持稳定。在某些情况下，所述茎环之间具有1、2、3、4或5个核苷酸对错配或任何范围的核苷酸对错配。所述茎内的不匹配可称为茎环中的凸起。本文中所述的稳定可以是热力学稳定性或动力学稳定性。

所述RNA组合物可能包含5’末端修饰。5’末端的修饰可以包含5’-三磷酸。当所述RNA组合物包含dsRNA时，可以修饰一条或两条链的5'末端以包含5'-三磷酸。

所述RNA组合物可包含2’-氟修饰的嘧啶或2’-氟代修饰的嘌呤。2'-氟修饰可以存在于至少一种嘧啶或嘌呤，并且可以存在任何数量的嘧啶或嘌呤上，包括所有嘧啶、所有嘌呤、或所有嘧啶和嘌呤。合适地，所述2’-氟修饰是存在于10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的嘧啶和/或嘌呤或其之间的任何范围。2-氟修饰可以存在于尿苷，胞苷，鸟嘌呤，腺嘌呤或其任何组合上。在一些实施方案中，仅尿苷被2’-氟修饰。在一个实施方案中，所述RNA中所有的尿苷是2’-氟修饰的，所述RNA中所有的胞苷都是2’-氟修饰的，所述RNA中所有的鸟嘌呤都是2’-氟修饰的，所述RNA中所有的腺嘌呤都是2’-氟修饰的，或其任何组合。

所述RNA组合物可包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸，其中硫原子取代了磷酸盐的非桥连氧。合适地，所述硫代磷酸酯修饰存在于10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的核苷酸中或它们之间的任何范围。在某些实施方案中，寡核苷酸的5’和/或3’末端的最后3至5个核苷酸被硫代磷酸酯修饰。在其他实施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷酸均被硫代磷酸酯修饰。

所述RNA组合物可包含平末端茎环，具有5’-突出端的茎环，具有3’-突出端的茎环或同时包含5’-突出端和3’-突出端两者。末端平直的茎环包含5’-末端核苷酸及其3’-末端互补序列，它们能够彼此杂交，形成茎环。仅具有5’突出端的茎环包含能够与其互补序列杂交形成茎环的3’末端核苷酸。仅具有3’突出端的茎环包含能够与其互补序列杂交形成茎环的5’末端核苷酸。对于同时具有5’突出端和3’突出端的茎环，所述5’端核苷酸和3’端核苷酸均不构成茎环的一部分。

5’或3’突出的长度可以是允许RNA组合物抑制细胞生长或诱导细胞死亡的任何长度。适当地，所述5’-和/或3’-突出端的长度可以是大约1至大约50个核苷酸。在一些实施方案中，所述5’-和/或3’-突出端的长度为约1至约10个核苷酸，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的长度或其之间的任何长度范围。在其他情况下，5’-和/或3’-突出端的长度约为10至约50个核苷酸，包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45，46、47、48、49或50个核苷酸或其之间的任何长度范围。本领域技术人员将能够选择合适的突出端长度以产生期望的活性。如实施例所示，包含较短突出端，尤其是3’突出端的RNA组合物更可能显示出抑制细胞生长或诱导细胞死亡并诱导细胞因子产生的能力。相反，包含更长突出端的RNA组合物更可能表现出抑制细胞生长或诱导细胞死亡而不诱导细胞因子产生的能力。

在某些实施方案中，所述RNA组合物包含多个茎环。如以下实施例所示，令人惊奇地，包含两个或三个茎环的RNA组合物在抑制细胞生长或诱导细胞死亡的同时还不诱导大量IFN的产生。具有多个茎环的RNA组合物最少包含第一茎环，第二茎环和茎环之间的间隔子。所述的茎环可以与实施例中所述相同，但是并非必须如实施例中所示那样。

所述RNA组合物可包含允许末端核苷酸与其互补核苷酸杂交以形成第一茎环，第二茎环或两者的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述RNA组合物包含能够与其互补核苷酸杂交以形成第一或第二茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA组合物包含能够与其互补核苷酸杂交以形成任一茎环的3’末端核苷酸。如实施例中所示，所述RNA组合物可以包含能够与其互补核苷酸杂交形成第一茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸和能够与其互补核苷酸杂交形成第二茎环的3’末端核苷酸。也如实施例中所示，所述RNA组合物可以是双链的并且包含能够与其互补核苷酸杂交以形成第一茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸和能够与其互补核苷酸杂交形成第二个茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸。

所示RNA组合物可包含与第一茎环和第二茎环中的一个或两个相结合的5’-或3’-突出端。与第一个茎环或第二个茎环相结合的5’-或3’-突出端可以是允许RNA组合物抑制细胞生长或诱导细胞死亡的任何长度。适当地，所述5’-和/或3’-突出端的长度可以是大约1至大约50个核苷酸。在一些实施方案中，所述5’-和/或3’-突出端的长度为约1至约10个核苷酸，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸的长度或它们之间的任何长度范围。在其他情况下，所述5’-和/或3’-突出端的长度约为10至约50个核苷酸，包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45，46、47、48、49或50个核苷酸或它们之间的任何长度范围。本领域技术人员将能够选择合适的突出端长度以产生期望的活性。

间隔子连接多茎环组合物中的茎环。在一些实施方案中，所述间隔子包含ssRNA的片段，dsRNA的片段或其组合。dsRNA片段可以包含第一核苷酸序列的片段与第二核苷酸序列的完全或部分杂交的片段。仅具有部分杂交的间隔子可具有任何数目的核苷酸对错配，其防止沿着间隔子的互补核苷酸之间的核苷酸配对。优选地，所述间隔子在生理条件下保持热力学或动力学稳定。在某些情况下，所述茎环具有1、2、3、4、5或更多个核苷酸对错配。

所述间隔子可以是任何合适的长度，以提供细胞毒的益处而基本上不诱导IFN的产生。适当地，所述间隔子的长度可包括沿ssRNA片段的约5至约100个核苷酸，沿dsRNA片段的约5至约100个杂交或错配的核苷酸对，或其组合。在一些实施方案中，所述间隔子的长度是约5至约50个核苷酸，包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19的长度，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 45、46、47、48、49或50个核苷酸或它们之间的任何长度范围。

在一些实施方案中，所述间隔子不与二级结构相结合。在其他实施方案中，所述间隔子与二级结构相关联。结构化的间隔子可包含茎环，导致RNA组合物至少包含第三茎环。所述第三茎环可由核苷酸的完全或部分杂交形成，并导致发夹结构基序。所述茎-环可从任何合适数量的核苷酸配对形成，包括约5至约30或约8至约25之间的任何数核苷酸配对。在某些实施方案中，所述茎-环包含5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30个核苷酸配对或它们之间的任意数量的核苷酸配对。只要茎环在生理条件下保持稳定，仅具有部分杂交的茎环可具有任何数量的核苷酸对错配，所述的核苷酸对错配可防止沿所述茎的互补核苷酸之间的核苷酸配对。在某些情况下，所述茎环之间具有1、2、3、4或5个核苷酸对错配或它们之间的任何范围的核苷酸对错配。

表1中提供了示例性的RNA寡核苷酸。包含掺入2'F嘧啶的5'ppp RNA的RNA组合物(称为免疫原性癌细胞杀伤RNA(ICR))被设计并生成为包含5'ppp以及各种预测的二级结构，包括3’悬垂的发夹(ICR1，ICR1A，ICR1B，ICR1C)，平末端发夹(ICR2-3，ICR2，ICR2A，ICR2B)，5’悬垂的发夹(ICR3，ICR3A，ICR3B，ICR3C)，包含多个茎环的ssRNA(ICR4，ICR4A)和包含各种长度的多个茎环的dsRNA(ICR5，其由ICR5X和ICR5Y杂交形成)。还生成了线性5‘ppp ssRNA(ICR-L)和长dsRNA(pIC)进行比较。对于本领域技术人员而言显而易见的是，ICR1、ICR1A、ICR1B、ICR1C、ICR2A、ICR2B、ICR3、ICR3A、ICR3B、ICR3C、ICR4、ICR4A、ICR5X和ICR5Y中的每一个都包含ICR2的寡核苷酸序列。

表1：单链RNA

在一些实施方案中，所述RNA组合物包含能够形成茎环的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA组合物包含由与ICR2具有至少50％序列同一性的寡核苷酸的完全或部分杂交形成的一个或多个茎环。在具体实施方案中，所述RNA组合物包含一个或多个茎环，该茎环由与ICR2具有至少60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的寡核苷酸的完全或部分杂交形成。所述RNA组合物还可基本上由一个或多个茎环组成，所述茎环由与ICR2具有至少50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性的寡核苷酸的完全或部分杂交形成。

在一些实施方案中，所述RNA组合物包含与ICR1，ICR1A，ICR1B，ICR1C，ICR2A，ICR2B，ICR3，ICR3A，ICR3B，ICR3C，ICR4，ICR4A，ICR5X或ICR5Y具有至少50％序列同一性的一或多种寡核苷酸。在具体实施方案中，所述RNA组合物包含与ICR1，ICR1A，ICR1B，ICR1C，ICR2A，ICR2B，ICR3，ICR3A，ICR3B，ICR3C，ICR4，ICR4A，ICR5X或ICR5Y中的任意序列具有至少60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性的一或多种寡核苷酸。所述RNA组合物还可基本上由与ICR1，ICR1A，ICR1B，ICR1C，ICR2A，ICR2B，ICR3，ICR3A，ICR3B，ICR3C，ICR4，ICR4A，ICR5X或ICR5Y中的任意序列具有至少50％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性的一或多种寡核苷酸组成。

如实施例1所示，除线性ICR和含有最短茎环的ICR外，ICR显示出剂量依赖性的细胞毒。对于那些表现出细胞毒的ICR，细胞因子的表达是差异性诱导的。在9-12bp长茎环上具有平末端的ICR诱导人黑素瘤细胞产生的IFN-β比polyI:C高2至3倍，其5’和3’突出端的长度以及茎环的数目和长度与IFN-β表达呈负相关。

如本文所用，如果在相同条件下诱导的细胞因子产生至少与polyI:C一样多，或者与在未经处理的对照细胞中产生的IFN相比细胞因子的产生增加5、6、7、8、9、10倍或更多倍，则所述的RNA组合物诱导大量或显著量的细胞因子。在某些情况下，测定的细胞因子是INF-β、TNF-α或IL-6。

PRR诱导的癌细胞死亡伴随着多种免疫和止血调节剂的释放，例如干扰素，炎性细胞因子，DAMP的结合，旨在刺激针对癌症的先天性和适应性免疫反应，还可能引起针对正常组织和血栓性并发症的破坏性炎症反应。长期以来一直有人问，如何有利地修饰PRR诱导的癌细胞死亡所产生的二分反应，以增强抗癌治疗效果和PRR治疗剂的整体效益。如下所示，ICR2和ICR4都是新型PRR刺激ssRNA，与polyI:C相比，可激发人类癌细胞的强烈免疫原性细胞死亡，并明显降低人类癌症和免疫细胞产生的TNF-α。ICR2诱导人癌细胞的IFN依赖性程序性坏死，并比ICR4诱导更多的I型IFN。相反，与ICR2相比，ICR4诱导RIG-I依赖性凋亡细胞死亡，并产生明显更少的炎症性和更少的凝结DAMP。

有教导认为生理细胞死亡(例如凋亡)是弱免疫原性或弱致耐受性的，而病理性死亡(例如坏死)是免疫原性的。 ³⁷ 然而，还显示某些凋亡剂(例如阿霉素)比坏死剂会诱导更多的免疫原性癌细胞死亡。 ^{34 , 38} 尚不清楚免疫系统对不同的癌细胞死亡做出何种不同的反应。尽管ICR4产生的DAMP所刺激的TLR的类型与ICR2和polyI:C产生的DAMP所刺激的TLR的类型相似，但ICR4产生的DAMP所刺激的TLR的信号强度明显低于ICR2-产生的DAMP和poly:C-产生的DAMP所刺激的TLR的信号强度。与TLR信号强度一致，与ICR2和polyI:C诱导的细胞死亡相比，ICR4诱导的细胞死亡释放的内源性TLR4配体HMGB1明显更少。

DAMP的水平并不总是与细胞死亡的免疫原性和TLR刺激活性直接相关。ICR4和阿霉素均诱导凋亡性癌细胞死亡，并且它们产生可比数量的HMGB1释放。但是，TLR4报告细胞被ICR4产生的DAMP刺激，但不被阿霉素产生的DAMP刺激。根据氧化状态，HMGB1显示出差异性诱导先天和炎症反应。 ³⁹ 还原的HMGB1能够刺激TLR4并具有免疫刺激活性，但是氧化的HMGB1不能刺激TLR4并具有致耐受活性。 ^{39 , 40} 这些数据表明不同类型的细胞死亡可能在数量和质量上产生不同的DAMP，并导致不同的TLR刺激和不同的免疫反应。

Kohlway等人证明，双链体长度为10bp的5'ppp RNA发夹可在体外有效刺激RIG-IATPase活性，并且利用该RNA发夹的转染可诱导表达RIG-I的293T细胞系产生IFN-β。 ²⁴ ICR2是2’F修饰的5'ppp RNA发夹，双链体长度为9bp。ICR2的二级结构与Kohlway的RNA发夹非常相似。但是，ICR2不包含已知的RIG-I刺激基序，例如U/UC， ⁴¹ 而Kohlway的RNA具有U/UC基序。我们证明了用ICR2处理显示其对Huh7.0缺陷的Huh7.5细胞系和RIG-I缺陷的Huh7.5细胞系具有可比的细胞毒。此外，ICR2诱导的癌细胞死亡和IFN-α表达不明显受个体RIG-1，MDA5和PKR缺乏的影响。不希望受到理论的束缚，一种可能性是ICR2可能被其他RNA传感PRR识别。例如，TLR13是内体TLR，其功能和配体仍然知之甚少。最近的研究表明，病毒来源的16-ntssRNA预计会形成茎环结构激活的小鼠TLR13。 ⁴² 人TLR13基因的及其抗癌活性尚未阐明。核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)是另一种胞质PRR，其可识别细菌肽聚糖和病毒ssRNA。 ⁴³ NOD2触发IRF3的活化以及人和小鼠细胞中IFN-β的表达。 ⁴⁴ 此外，IFIT1以不依赖序列的方式选择性结合5'ppp RNA并诱导抗病毒反应。 ² 另一种可能性是，多个RNA感应PRR可能同时识别ICR2，并在ICR2诱导的IFN-β表达和细胞死亡中起补偿作用。

本文所述的RNA组合物可以与一种或多种治疗剂组合。该治疗剂可以是用于治疗受试者中的癌症的抗癌治疗剂。合适的抗癌治疗剂可包括但不限于放射，化学治疗剂，抗癌生物制剂或免疫治疗剂。

化学治疗剂是可用于治疗癌症的化学治疗化合物。合适的化学治疗剂可包括但不限于5-氟尿嘧啶，阿克拉霉素，活化的细胞黄素，比生群(Bisantrene)，博来霉素，卡莫氟(carmofur)，CCNU，顺铂，柔红霉素，阿霉素，DTIC，美法仑，甲氨蝶呤，米洛霉素，丝裂霉素，丝裂霉素C，培洛霉素(peplomycin)，哌泊溴烷(pipobroman)，普卡霉素(plicamycin)，甲基苄肼(procarbazine)，视黄酸，他莫昔芬，紫杉醇，替加氟(tegafur)，VP16或VM25。

抗癌生物制剂是可用于治疗癌症的生物分子(例如，多核苷酸，多肽，脂质或碳水化合物)。抗癌生物制剂可以包括但不限于细胞因子，诸如IL-1α，IL-2，IL-2β，IL-3，IL-4，CTLA-2，IFN-α，IFN-γ，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，IL-12，IL-23，IL-15，IL-7或其任何组合；或抗癌抗体，例如利妥昔单抗，曲妥珠单抗(Trastuzumab)，吉姆妥珠单抗(Gemtuzumab)，阿仑单抗(Alemtuzumab)，依布单抗(Ibritumomab)，替妥西坦(tiuxetan)，托西妥玛单抗(Tositumomab)，西妥昔单抗(Cetuximab)，贝伐单抗(Bevacizumab)，帕尼单抗(Panitumumab)，奥法木单抗(Ofatumumab)，Brentuximab Vedotin，帕妥珠单抗(Pertuzumab)，曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Adotrastuzumab emtansine)和阿多曲妥单抗(Obinutuzumab)。

术语“免疫疗法剂”是指用于通过在受试者中诱导和/或增强免疫应答来治疗受试者中的癌症的任何疗法。免疫治疗剂可包括但不限于检查点抑制剂，癌症疫苗，免疫细胞，例如工程化的T细胞，抗癌病毒或双特异性抗体。检查点抑制剂是这样的治疗剂，例如抗体，其可阻断免疫细胞中负责维持自身耐受性并调节免疫反应的程度的免疫检查点途径。肿瘤通常利用某些免疫检查点途径作为针对肿瘤抗原特异性T细胞的免疫抵抗的主要机制。许多免疫检查点是由受体-配体相互作用引发的，因此可能被针对配体或受体的抗体所阻断，或者可能被配体或受体的可溶性重组形式所调节。这种免疫检查点封锁允许肿瘤特异性T细胞在其他免疫抑制性肿瘤微环境中继续发挥作用。

示例性的检查点抑制剂包括但不限于这样的抗体活其他治疗剂，其靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD1，也称为CD279)，程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274)，PD-L2，细胞毒T-淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)，A2AR，CD27，CD28，CD40，CD80，CD86，CD122，CD137，OX40，GITR，ICOS，TIM-3，LAG3，B7-H3，B7-H4，BTLA，IDO，KIR或VISTA。合适的抗PD1抗体包括但不限于lambrolizumab(Merck MK-3475)，nivolumab(Bristol-Myers SquibbBMS-936558)，AMP-224(Merck)和pidilizumab(CureTech CT-011)。合适的抗PD-L1抗体包括但不限于MDX-1105(Medarex)，MEDI4736(Medimmune)，MPDL3280A(Genentech/Roche)和BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)。示例性的抗CTLA4抗体包括但不限于伊匹木单抗(Bristol-Myers Squibb)和曲美单抗(Pfizer)。

一项最新研究表明，免疫原性诱导细胞死亡的癌症治疗药和检查点抑制剂的组合，例如抗CTLA4和抗PD-L1，协同增强抗肿瘤应答和抗肿瘤免疫力。 ⁴⁵ ICR2和ICR4是针对人类癌症的有效的PRR刺激型细胞毒剂。ICR2和ICR4具有独特的免疫刺激和止血活性。本文所述的检查点抑制剂和RNA组合物的组合将是针对晚期癌症的强力且有效的抗癌疗法。

癌症疫苗刺激人体的免疫系统攻击癌细胞。癌症疫苗通常在免疫原性制剂中包括肿瘤抗原，其活化肿瘤抗原特异性辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞和B细胞。疫苗可以是多种制剂，包括但不限于树突细胞，单核细胞，病毒，脂质体和DNA疫苗。示例性的癌症疫苗包括但不限于Sipuleucel-T(

或APC8015)。Sipuleucel-T是由FDA批准的癌症疫苗，由自体树突状细胞(DC)开发而成，该树突状细胞负载了前列腺酸磷酸酶(PAP)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的工程化融合蛋白。

免疫治疗剂可以包括被过继转移(adoptively transferred)到受试者体内以攻击或减少癌细胞或癌细胞生长的免疫细胞(即，T细胞或B细胞)。免疫细胞可以是自体的，或者源自与接受免疫细胞的受试者不同的受试者并且经过修饰以减少排斥。所述免疫细胞也可对受试者的癌症有天然的或遗传改造的反应性。例如，已经显示天然自体T细胞在治疗转移性癌症中是有效的。参见例如Rosenberg SA等人，Nat.Rev.Cancer 8(4):299-308(2008)。天然的自体T细胞可在切除的受试者的肿瘤内找到。使用高浓度的IL-2，抗CD3和同种反应性饲养细胞可以诱导此类T细胞在体外繁殖。然后将这些T细胞与例如IL-2的外源给药一起转移回受试者中以进一步增强其抗癌活性。

本文所述的组合物还可包含细胞质递送机制。这样的递送机制是本领域技术人员可获得的，并且包括所有基因递送机制，包括但不限于合成聚合物(例如用于siRNA递送的那些)，细胞穿透肽(例如VP16)，纳米颗粒，病毒或脂质体递送至细胞质(脂质转染)，通过基因枪转运，或者也可以包括转染，核转染或电穿孔。可以靶向细胞质递送机制以仅将组合物递送至需要细胞生长抑制或诱导程序性细胞死亡的细胞。例如，细胞递送机制可以将RNA特异性靶向癌细胞或病毒感染的细胞。该组合物也可通过受体介导的内吞作用被摄取而靶向细胞。另外，可以对细胞进行遗传改造以表达本文所述的RNA组合物。所述RNA可以可操作地连接至启动子，例如诱导型启动子，以仅在适当刺激下才允许RNA的表达。

本文所述的组合物还可用于抑制癌细胞生长或诱导癌细胞的程序性细胞死亡，从而导致治疗受试者的癌症。该组合物还可用于治疗其他非癌性增生性疾病或用于治疗被感染的细胞，例如被病毒或其他细胞内病原体感染的细胞。本文提供的组合物也可以作为佐剂给药以刺激对抗原，病原体或癌细胞的免疫应答。可以施用本文所述的组合物的受试者包括但不限于哺乳动物，驯养的动物和人，并且可以具体包括狗，猫，鱼，鸡，牛，猪，绵羊，山羊。

由此，还提供了使用包含本文所述的ssRNA或dsRNA的组合物抑制细胞生长或诱导程序性细胞死亡的方法。所述方法包括使细胞与所述组合物接触或任选地向受试者施用可有效抑制细胞生长、诱导细胞程序性细胞死亡或增加细胞的炎性细胞因子产生的量的所述组合物。所述细胞可以是黑素瘤细胞或其他癌细胞，包括但不限于脑、前列腺、卵巢、肾、肺、肝、结直肠和乳腺癌细胞或白血病或淋巴瘤的细胞。

合适地，将所述组合物递送至细胞的细胞质。所述组合物可通过上述细胞质递送机制递送，包括但不限于脂质体，合成聚合物，细胞穿透肽，纳米颗粒，病毒包封，受体介导的内吞作用，电穿孔或将所述组合物递送至所述细胞的细胞质的任何其他方式。

细胞可以在体内，体外或离体条件下直接或间接与组合物接触。接触包括施用于细胞，组织，哺乳动物，患者或人。此外，接触细胞包括通过细胞质递送机制将组合物添加至细胞培养物中或通过任何可用手段将组合物引入细胞的细胞质中。其他合适的方法可包括使用如下定义的合适的方法和给药途径将组合物引入或给予细胞，组织，哺乳动物或患者。

给予本文所述的组合物可抑制癌细胞的生长或治疗癌症。该作用可能是由于施用所述组合物的一般性免疫刺激作用或由于与所述组合物接触引发的程序性细胞死亡。与对照处理的细胞相比，本文所述的组合物的施用可以抑制细胞生长20％，30％，40％，50％，60％，65％，70％，75％，80％或更高。本文所述组合物的施用还可以诱导细胞死亡，适宜地在5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％或超过75％的已处理细胞中的程序性细胞死亡。程序性细胞死亡包括由细胞内程序介导的任何细胞死亡方式，包括但不限于凋亡，自噬，坏死性凋亡，无神经或其他非凋亡形式的程序性细胞死亡。

可将本文所述的组合物施用于受试者以治疗受试者中的癌症。治疗癌症包括但不限于减少受试者中癌细胞的数量或肿瘤的大小，减慢癌症发展成更具侵略性的形式的进展，减少癌细胞的增殖(抑制癌细胞的生长)或减少肿瘤生长的速度，杀死癌细胞(通过任何方式)，减少癌细胞的转移或降低受试者中癌症复发的可能性。如本文所述，治疗受试者是指使受疾病折磨或有患疾病风险的受试者受益的任何类型的治疗，包括受试者状况(例如，一种或多种症状)的改善，延迟在疾病的进展，延迟症状的发作或减缓症状的进展等。

所述组合物可用于制备药物组合物。提供了包含上述RNA和组合物以及可药用载体的药物组合物。药学上可接受的载体是适合体内施用的任何载体。适用于该组合物的药学上可接受的载体的实例包括但不限于水，缓冲溶液，葡萄糖溶液，油核苷酸化的(oil-nucleotided)或细菌培养液。所述组合物的其他组分可以适当地包括例如赋形剂，诸如稳定剂，防腐剂，稀释剂，乳化剂和润滑剂。药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括稳定剂，例如碳水化合物(例如山梨糖醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，葡萄糖，右旋糖酐)，蛋白质例如白蛋白或酪蛋白，含蛋白质的试剂例如牛血清或脱脂乳以及缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液)。特别是当将所述稳定剂加入组合物中时，该组合物适合于冷冻干燥或喷雾干燥。该组合物也可以被乳化。

如本文所用，有效量或治疗有效量是指当施用于对象以治疗诸如癌症的状态、疾病或病况时足以实现治疗的组合物的量(如上所定义)。所述治疗有效量将根据组成、疾病及其严重程度，以及待治疗受试者的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。

本文所述的组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方式施用，包括但不限于口服，局部，鼻内，腹膜内，肠胃外，静脉内，颅内，肿瘤内，肌肉内，皮下，鞘内，经皮，经鼻咽或跨粘膜吸收。因此，可以将组合物配制成可摄入，可注射，局部或栓剂的制剂。所述组合物还可以与脂质复合物，多聚复合物(polyplex)，靶标特异性纳米颗粒或定时释放载体一起递送。根据本发明将组合物给予受试者似乎表现出剂量依赖性的有益作用。因此，在较宽的范围内，与给予较小量相比，预期给予较大量的组合物将获得增强的有益生物学作用。而且，还考虑了在低于可见到毒性的水平之下的剂量的药效。

应当理解，在任何给定情况下给予的具体剂量将根据所给予的组合物，要治疗或抑制的疾病，受试者的状况以及可能改变所述组合物的活性或所述受试者反应的其他相关医学因素进行调整，其为本领域技术人员所熟知。例如，针对特定受试者的具体剂量取决于年龄，体重，总体健康状况，饮食，给药时间和方式，排泄率，组合使用的药物以及所述治疗应用的具体疾病的严重程度。可以使用常规考虑因素确定给定患者的剂量，例如通过适当的常规药理或预防方案。

受试者的最大剂量是不会引起不良或不可忍受的副作用的最高剂量。关于个体预防或治疗方案的变量的数目很大，并且预期剂量范围很大。给药途径也会影响剂量要求。预期与预处理症状或不进行处理的症状相比，所述组合物的剂量将减少疾病症状的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。具体认为，药物制剂和组合物可以减轻或缓解疾病的症状而不提供治愈，或者在一些实施方案中，可以用于治愈疾病或病症。

施用组合物的合适有效剂量可以由本领域技术人员确定，但是通常为每周每千克体重约1微克至约100,000微克，尽管它们通常为每周每千克体重约1,000微克或更少。在一些实施方案中，所述有效剂量为每周每千克体重约10至约10,000微克。在另一个实施方案中，所述有效剂量为每周每千克体重约50至约5,000微克。在另一个实施方案中，所述有效剂量为每周每千克体重约75至约1,000微克。本文所述的有效剂量是指施用的总量，即，如果施用超过一种组合物，则有效剂量对应于施用的总量。该组合物可以单剂量或分开的剂量施用。例如，所述组合物可施用两次或更多次，间隔4小时，6小时，8小时，12小时，一天，两天，三天，四天，一周，两周或三周或更长时间。

其它内容

本公开不限于本文阐述的构造，各元素的排列或方法步骤的具体细节。根据以下公开内容，本文公开的组合物和方法能够以对于本领域技术人员显而易见的各种方式来制造，实践，使用，执行和/或形成。本文所使用的措词和术语仅出于描述的目的，并且不应被视为限制权利要求的范围。在说明书和权利要求书中使用的诸如第一，第二和第三的顺序指示符指代各种结构或方法步骤，并不意图被解释为指示任何具体的结构或步骤，或所述结构或步骤的任何特定的顺序或配置。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另作要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在促进本公开，并不意味着对本公开的范围进行任何限制。说明书中的语言以及附图中示出的结构都不应被解释为说明任何未要求保护的要素对于所公开的主题的实施是必不可少的。本文中术语“包括”，“包含”或“具有”及其变体的使用意在涵盖其后列出的要素及其等同物以及其他要素。列举为“包括”，“包含”或“具有”某些元件的实施方案也可能被认为是“基本上由这些元件组成”和“由这些元件组成”。

除非在此另外指出，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独列出一样。例如，如果将浓度范围规定为1％至50％，则意图在说明书中明确列举诸如2％至40％，10％至30％或1％至3％等的值。这些仅是具体意图的示例，并且在所列举的最小值和最大值之间(包括所述最小值和最大值)的数值的所有可能的组合应被认为在本公开中明确地说明。使用术语“约”来描述特定叙述的量或量的范围意在表示该量中包括非常接近所述量的值，例如由于制造公差，形成测量时的仪器误差和人为误差等而可以或被当然地考虑的值。除非另有说明，所有涉及量的百分数均以重量计。

不承认包括本说明书中引用的任何非专利或专利文件在内的任何参考文献构成现有技术。特别地，将理解的是，除非另有说明，否则本文中的任何文件的引用并非构成下述的承认，即不承认这些文件中的任何文件成为美国或任何其他国家的本领域公知常识的一部分。对参考文献的任何讨论均陈述其作者的主张，并且申请人保留质疑本文引用的任何文件的准确性和相关性的权利。除非另外明确指出，否则本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。如果在引用的参考文献中发现任何定义和/或描述之间存在任何差异，则以本公开的内容为准。

除非另有说明或上下文指示，否则术语“一种”和“所述”表示“一或多种”。例如，“蛋白质”或“RNA”应解释为表示“一或多种蛋白质”或“一或多种RNA”。

以下实施例仅是说明性的，并不意图限制本发明或所附权利要求的范围。

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实施例

材料和方法

细胞培养

将人黑素瘤细胞系WM266-4(ATCC，Manassas,VA)维持在Eagle基本必需培养基中，该培养基中添加了10％FBS，1X非必需氨基酸(NEAA)和1mM丙酮酸钠(均来自Invitrogen，Carlsbad，CA)。将人类前列腺癌细胞系DU145(ATCC)在补充有1X NEAA和1mM丙酮酸钠，10％FBS的Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)中进行培养。人肝癌细胞株Huh7.0和Huh7.5由杜克大学的Stacy M.Horner博士友情提供。将Huh7.0，Huh7.5，人胰腺癌细胞系PANC-1(ATCC)，鼠胰腺癌细胞系PANC-02(NIH)和鼠黑素瘤细胞系B16.F0(ATCC)在补充10％FBS的DMEM中维持。将人胰腺癌细胞系BxPC3细胞保持在含10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Invitrogen)中。TLR报告细胞系，HEK-Blue Null，HEK-Blue hTLR2，HEK-Blue hTLR3，HEK-Blue hTLR4和HEK-Blue hTLR9细胞(均购自加利福尼亚圣地亚哥的InvivoGen)稳定表达NF-kB/AP-1诱导型分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)和相应的TLR，并按照制造商的说明维持这些细胞。在含有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640中培养人正常外周血单核细胞(PBMC)(Stemcell Technologies，加拿大温哥华)。如先前所述 ⁴⁶ ，从PBMC中产生未成熟的树突状细胞(DC)。所有细胞均在37℃含5％CO₂的潮湿环境中温育。

生成ICR

如前所述，所有的ICR都是通过使用Y639F突变T7 RNA聚合酶从DNA模板进行体外转录而产生的，然后进行凝胶纯化。 ²⁸ ICR中的所有嘧啶均为2’氟修饰的。

体外RNA处理和PRR刺激

根据制造商的说明，利用脂质体转染试剂(ThermoScientific，Waltham，MA)以3：1的转染试剂(μl):RNA(μg)的比例转染ICR和polyI:C。RNA转染到80-90％的融合细胞中。将细胞与RNA转染剂复合物温育4小时，然后补充新鲜培养基。在不同时间点收集细胞和培养上清液。将Pam3CSK4，CpG 2006，PolyI:C，R848(均来自InvivoGen)和LPS(Sigma)用作对照TLR和PRR激动剂。

定量细胞生长抑制和细胞死亡

根据制造商的说明，在处理后72小时使用Celltiter

MTS细胞增殖测定试剂盒(Promega，Madison,WI)，定量相对于未处理细胞的生长抑制。使用以下公式计算生长抑制百分比：％生长抑制＝([OD]_未处理–[OD]_处理)/[OD]_未处理x100。使用PE Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I(BD Biosciences,San Jose,CA)测量细胞死亡。

抑制I型干扰素，RIPK和胱天蛋白酶

在RNA处理之前和之后立即用I型IFN诱饵受体B18R(1μg/ml)(eBioscience，SanDiego，CA)，RIP激酶抑制剂necrostatin-1(100μM)(Sigma，Saint Louis，MO)和泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-fmk(50μM)(InvivoGen)处理细胞6小时。为了诱导IFN-β依赖性细胞死亡，细胞用重组人IFN-β(100ng/ml)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)处理。

RIG-1，PKR和MDA5表达的siRNA敲低

如前所述进行RIG-1，PKR和MDA5的瞬时敲低。²⁸在第二次siRNA转染后5小时，收集细胞，重新接种到96孔板中，温育过夜。然后用PRR活化RNA处理细胞。

DAMP的产生

为了产生DAMP，将5x10⁵ WM266-4细胞用RNA(1μg/ml)转染或与阿霉素(7.5μM)(Sigma)一起温育。4小时后，将细胞用新鲜培养基洗涤5次，并在1ml培养基中温育2-3天。使用锥虫蓝计数死细胞。当超过95％的细胞死亡时，通过以1200RPM离心5分钟收集培养上清液，并在-80℃保存直至使用。

吞噬作用测定

使用PKH67绿色荧光细胞接头试剂盒(Sigma)标记细胞。使用RNA或阿霉素(7.5μM)(Sigma)杀死PKH67标记的细胞。处理后48小时，收集死亡/即将死亡的细胞，并与未成熟的DC温育1小时。通过流式细胞术确定PKH67标记的死亡/即将死亡细胞的吞噬作用。

DAMP诱导的TLR活化和DC刺激

用完全培养基将DAMP稀释至25％(v/v)。将5x10⁴ TLR报告细胞或1x10⁵未成熟DC与稀释的DAMP在96孔板中温育过夜。为了确定TLR活化，使用比色测定法确定SEAP释放的水平。简而言之，收获40μl培养上清液，并在平底96孔板中与180μl QUANTI-Blue^TM(InvivoGen)温育3小时。通过使用BioTek Power Wave XS2 ELISA酶标仪(BioTek，Winooski，VT)读取650nm处的光密度(OD)来访问SEAP活性。Pam3CSK4(TLR2激动剂)，CpG2006(TLR9激动剂)，PolyI：C(TLR3激动剂)和LPS(均来自InvivoGen)用作对照TLR刺激物。为了确定DC刺激，通过ELISA确定DC的细胞因子产生。

体内抗肿瘤治疗

从杰克逊实验室(Bar Harbor，ME)获得5-6周龄的NU/J小鼠。将7x10⁵WM266-4人黑素瘤细胞皮下植入NU/J裸鼠的右胁腹。当小鼠出现可触摸的肿瘤时，荷瘤小鼠使用N-P＝8的

(Polyplus转染，New York，NY)每日瘤内注射20μg RNA分子，连续5日。每两天通过使用卡尺测量肿瘤直径来评估肿瘤生长。肿瘤体积定义为[(宽度)²X(长度)]/2。对携带肿瘤体积超过2000mm³的小鼠实施安乐死。所有涉及使用小鼠的实验程序均按照指南并遵守杜克大学动物护理和使用委员会进行。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

使用BD OptEIA TM ELISA装置(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)测定TNF-α，IL-6和IL-8。使用IFN-βELISA试剂盒(PBL Biomedical Laboratories，Piscataway，NJ)确定IFN-β的产生。使用HMGB1 ELISA试剂盒(Tecan，莫里斯维尔，北卡罗来纳州)，按照制造商的说明确定HMGB-1的分泌。

免疫印迹分析和抗体

分别使用线粒体分离试剂盒和NE-PER核提取试剂(均来自Thermo Scientific)分离线粒体和细胞核级分。在完整的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma)存在下，在1x RIPA缓冲液(Sigma，St.Louis，MO)中制备线粒体裂解物，细胞核裂解物和总细胞裂解物。在4-20％的Mini-

TGX^TM聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上电泳分离30μg蛋白质裂解物，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(

PerkinElmer)上。在TBST20中冲洗后，将膜在TBTS20中的5％干奶中封闭1h，然后与初级抗体抗XIAP(1:1000)(3B6；Cell Signaling，Danvers，MA)，抗TRAIL(1:1000)(C92B9；CellSignaling)，抗磷(p)-IRF-3(1:500)(4D4G；Cell Signaling)，抗裂解的caspase-3(1:200)(D3E9；Cell Signaling)，抗caspase-7(1:200)(Cell Signaling)，抗NF-κB p65(1:1,000)(L8F6；Cell Signaling)，抗RIP(1：1,000)(Cell Signaling)，抗RIG-I(1:500)(D14G6；Cell Signaling，Danvers，MA)，抗MDA5(1:500)(D74E4；Cell Signaling)和抗PKR(1:350)(产品目录号3072；Cell Signaling)。当在同一膜上依次检测到不同的蛋白质时，如上所述，用Restore Western Blot Stripping缓冲液(Thermo Scientific，Rockford，IL)将膜处理8分钟，清洗，封闭并再次探测。初级抗体使用偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗兔(1:2,000)(Cell Signaling)或抗小鼠(1:2,000)(Cell Signaling)二级抗体进行检测。抗β-微管蛋白(1:1,000)(9F3；Cell Signaling)，抗CoxIV(1:1,000)(3E11；Cell Signaling)和抗组蛋白H3(1:1,000)(D1H2；Cell Signaling)被用作加样对照。使用Western LightningPlus试剂盒(PerkinElmer，Waltham，MA)观察HRP活性。

表面钙网蛋白和细胞质HMGB-1的检测

在与抗钙网蛋白-PE(1/100稀释)(Abcam，Cambridge，MA)和7-AAD(BDBiosciences)共染色后，通过流式细胞术确定表面钙网蛋白的表达。为了检测HMGB1，将细胞用4％多聚甲醛溶液固定，然后用5％BSA，0.2％Triton X-100的PBS封闭和通透，并用抗HMGB1(1/1000稀释)(Abcam)染色过夜，使用Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG(1/1000稀释)(Abcam)作为二级抗体。利用DAPI(4’,6-二mid基-2-苯基吲哚)(Sigma)进行核复染。在Zeiss Axio Observer显微镜下观察HMGB1和DAPI的表达，并使用MetaMorph软件(Sunnyvale,CA)分析图像。

凝血测定

将5μl DAMPs或培养基与50μL正常合并的人血浆(George King Bio-MedicalInc.,Overland Park,KS)混合。将混合物在37℃温育3分钟，然后添加50μLCaCl₂(25mM)。使用

止血分析仪(Diagnostica Stago，Parsippany,NJ)记录凝血时间。

统计分析

使用双尾学生t检验比较实验组之间的细胞生长，细胞死亡，细胞因子产生和肿瘤体积的差异。通过log-rank(Mantel-Cox)检验确定存活率的显著性。小于0.05(p<0.05)的概率具有统计学意义。

实施例1：筛选用于差异诱导癌细胞死亡以及IFN-β和促炎细胞因子表达的RNA分子

5'(p)pp和由链间或链内碱基对(10-20bp)组成的短RNA双链是RIG-1识别的众所周知的基序。 ^{23 , 24} 长dsRNA(0.5-6kb) ²⁵ 和短dsRNA(>21bp) ²⁶ 分别以不依赖序列的方式活化MDA5和TLR3，而TLR7被富含AU和GU的短ssRNA以序列依赖的方式活化。 ²⁷ 然而，可能存在由RIG-I，MDA5，TLR3和TLR7识别的其他基序。我们最近发现，用含有5'ppp和茎环的RNA适体转染能以RIG-I和IPS-I依赖性方式诱导人黑素瘤细胞中的细胞死亡和IFN-β表达。 ²⁸ 使用这些RNA配体的结构和序列信息，我们首先设计了包含5'ppp，AU和GU基序以及各种长度和数量的茎环的ssRNA，以确定用于增强人癌症细胞中PRR介导的免疫原性细胞死亡和I型IFN表达的最佳RNA结构(图1A和表1)。为了增加RNA配体的稳定性和细胞半衰期，我们将2’氟(2’F)嘧啶掺入了RNA中。这些RNA称为免疫原性癌细胞杀伤RNA(ICR)。

用包含至少一种长于9bp的茎结构的ICR进行的转染以剂量依赖的方式诱导人黑素瘤细胞的细胞毒性，而线性ICR和含有短于9bp的茎结构的ICR在这些细胞中没有细胞毒性(图1A-1C)。有趣的是，5’突出长度而不是3'突出长度与细胞毒性成反比。与细胞毒性不同，在9-12bp长茎环上具有平末端的ICR诱导人黑素瘤细胞产生的IFN-β比polyI:C高2到3倍，而5’和3’突出的长度以及茎环的数目和长度与人黑素瘤细胞中IFN-β的表达呈负相关(图1A和2A)。为了阐明不同ICR的细胞毒性和IFN-β表达模式之间的差异，我们进一步研究了两种代表性的ICR，即ICR2和ICR4。ICR2是一种平末端的发夹RNA，长度为23nt并诱导高细胞毒和高IFN-α表达，而ICR4预计会形成一个长度为55nt的双茎环结构并诱导高细胞毒和低IFN-β表达(图1A-1C)。

实施例2：ICR2和ICR4在人和小鼠癌细胞和先天免疫细胞中差异性诱导促炎细胞因子和IFN-β表达

接下来，我们研究ICR2和ICR4是否在黑素瘤细胞以外的不同类型的癌细胞中差异性诱导细胞毒和IFN-β表达。ICR2和ICR4均可诱导人前列腺癌细胞(DU-145)和人胰腺癌细胞(PANC-1和BxPC3)的增殖降低70％以上。在这些细胞中，与ICR4相比，ICR2诱导IFN-β表达增加超过两倍以上(图2F-2G)。在包括人PBMC和DC在内的先天免疫细胞中也观察到了ICR2和ICR4对IFN-β表达的差异诱导(图2B-2C)。除IFN-β外，人DC中促炎细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TNF)1和白介素(IL)-6的表达被ICR4诱导的程度明显小于ICR2(图2D)。有趣的是，与多聚polyI:C转染相比，用ICR2转染在人癌细胞和DC中诱导的IFN-β表达明显更高，但与polyI：C转染相比，用ICR2转染诱导的TNFα和IL-6表达明显降低(图2A，2C和2D)。与癌细胞相反，ICR2和ICR4不在人PBMC中诱导细胞毒(图2E)。出人意料的是，ICR2在小鼠癌细胞中不诱导细胞毒也不诱导IFN-β，TNFα和IL-6的表达。在小鼠黑素瘤和小鼠胰腺癌细胞中ICR4诱导细胞毒和IFN-β表达，尽管与人对应细胞相比，小鼠癌细胞中的细胞毒作用要小得多(48.11±5.365％(B16)相对于92.7075±1.223％(WM266-4)；41.59±7.809％(PANC-02)相对于88.39±4.470％(PANC-1)(图2F-2H和2I-2L)。

实施例3：ICR2诱导迟发型IFN依赖性细胞死亡，而ICR4诱导急性IFN依赖性细胞急性死亡

接下来，我们说明ICR2和ICR4在人癌细胞中诱导细胞毒的机制。膜联蛋白V单阳性细胞代表早期凋亡，而膜联蛋白V和7-AAD双阳性细胞是原代和继发性坏死细胞。 ²⁹ 用ICR4或polyI:C转染后4h出现早期凋亡，并且早期凋亡以及原发和继发坏死在培养过程中在这些细胞中逐渐增加(图3A-3G)。在用ICR2转染的细胞中，在4小时没有出现明显的细胞死亡，而在24小时仅出现了极少的早期细胞凋亡和坏死。有趣的是，在48小时，用ICR2转染的细胞显示出比早期凋亡事件多得多的坏死事件(图3A-3E)。已显示T7 RNA聚合酶具有RNA依赖性RNA聚合酶活性，并且T7 RNA聚合酶诱导的IVT可能形成非模板的自互补产物。 ²³ 我们观察到T7 RNA聚合酶诱导的IVT产生的ICR2包含预期长度的ICR2 RNA和比预期长度长的ICR2 IVT产物(图3I)。以更长的ICR2 IVT产物长度进行转染可在转染后24小时诱导明显的细胞死亡(图3J-3K)。为避免IVT副产物诱导的非特异性细胞死亡，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化预期长度的ICR。与细胞死亡不同，在用ICR2，ICR4或polyI:C转染4小时后，未观察到人黑素瘤细胞产生的IFN-β。转染后24小时和48小时连续检测到IFN-β。用ICR2转染的细胞产生的IFN-β的量比用ICR4转染的细胞高8至10倍(图3H)。已知IFN-β可通过多种机制诱导细胞死亡，包括caspase依赖性凋亡 ³⁰ 和程序性坏死，称为坏死病。 ³¹ 因此，我们推测ICR2诱导IFN依赖性癌细胞死亡，而ICR4诱导IFN非依赖性癌细胞死亡。为了进一步阐明ICR2和ICR4引起的IFN依赖性或非依赖性细胞死亡的机制，用ICR2或ICR4转染人黑素瘤细胞，然后用编码的干扰素α和β诱饵受体B18R的痘苗病毒处理。B18R明显抑制ICR2和IFN-β诱导的细胞死亡，但不抑制ICR4诱导的细胞死亡(图3F-3H)。该数据表明ICR2至少部分以IFN依赖性方式诱导细胞死亡，而ICR4以IFN非依赖性方式诱导细胞凋亡。

实施例4：ICR2和ICR4触发了人类癌细胞中不同的细胞死亡机制

接下来，我们研究了用ICR2和ICR4处理的人类癌细胞中的细胞死亡机制和信号通路。Z-VAD-fmk是泛胱天蛋白酶抑制剂，因此被认为是凋亡抑制剂。Necrostatin-1(Nec-1)是与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIP1)的抑制剂，通常用作坏死病抑制剂。由ICR4诱导的细胞死亡受z-VAD-fmk抑制的程度要高于受Nec-1的抑制作用，而相反，对于ICR2而言，Nec-1抑制细胞死亡的作用要大于z-VAD-fmk的抑制作用(图4A)。与单独使用z-VAD-fmk或Nec-1的治疗相比，共同使用z-VAD-fmk和Nec-1的治疗对癌细胞死亡的抑制程度更大(图4A)。这些数据表明，ICR2诱导的细胞死亡比Rasp1更依赖RIP1，而ICR4诱导的细胞死亡比RIP1更依赖于Caspases。与该结果一致，发现用ICR4处理的黑素瘤细胞中裂解的Caspases 3和7的表达水平比用ICR2处理的细胞中的表达水平高得多(图4B)。相比之下，用ICR2处理的细胞与用ICR4处理的细胞相比，转移到线粒体中的RIP1明显更多(图4C)。有趣的是，在人黑素瘤细胞中，ICR2和ICR4均明显下调抗凋亡蛋白X连锁的凋亡抑制剂(XIAP)，并上调促凋亡蛋白TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)(图4B)。这些观察结果表明，ICR2和ICR4都通过下调XIAP和上调TRAIL使人类癌细胞对程序性细胞死亡敏感。

实施例5：在用ICR2和ICR4处理的癌细胞中NF-κB的差异性活化

用ICR2处理的细胞比用ICR4处理的细胞产生更多的IFN-β和促炎细胞因子(图2A-2D)。我们推测，ICR2和ICR4差异性活化NF-kB和IRF信号通路，分别导致炎症细胞因子和IFN的表达。在ICR2转染的细胞的核级分中检测到了NF-κB，但在ICR4转染的细胞的核级分中仅检测到了极少量，而在用ICR2或ICR4转染的细胞中类似地检测到了磷酸化的IRF3(图4C)。已知IRF3的活化在抗病毒反应中具有双重作用，包括诱导凋亡和I型IFN基因的表达。 ³² 尽管IRF3在人黑素瘤细胞中同样被ICR2和ICR4活化，但IRF3在ICR2和ICR4转染的细胞中可能发挥不同的作用。需要进一步研究阐明IRF3在用ICR2和ICR4转染的细胞中的功能活性。

实施例6：ICR2和ICR4活化RNA感应PRR

我们最近的研究表明，含有5'ppp和茎环的2’F修饰的RNA适体以RIG-I依赖的方式诱导了人黑素瘤和肝癌细胞的程序性细胞死亡和IFN-β产生。 ²⁸ 为了解ICR2和ICR4是否诱导人癌细胞的RIG-I依赖性细胞死亡，我们用ICR2或ICR4处理了RIG-I野生型人肝癌细胞系Huh7.0和RIG-I突变型Huh7.0细胞系Huh7.5。ICR4对Huh7.0细胞具有细胞毒性，但对Huh7.5没有细胞毒性(图5A)。有趣的是，ICR2在Huh7.0和Huh7.5中诱导了相似的细胞毒。此外，，ICR4而非ICR2明显降低了具有siRNA介导的RIG-I敲除的人黑素瘤细胞中的细胞毒，而在敲除了其他细胞质RNA感应PRR(包括PKR和MDA5)的人黑素瘤细胞中，ICR4和ICR2导致水平相似的细胞毒(图5B-5C)。此外，人TLR3和TLR7报告细胞不受ICR2和ICR4刺激(图5D)。通过细菌碱性磷酸酶(BAP)诱导的去磷酸化去除ICR2和ICR4的5'ppp，可明显预防人黑素瘤细胞的细胞死亡和IFN-β的产生(图5E-5F)。有趣的是，与掺入2’F嘧啶的ICR4相比，掺入2’OH嘧啶的ICR4明显降低细胞毒而非IFN-β的活性，而掺入2’OH嘧啶的ICR2则完全消除了细胞毒性和IFN-β的诱导活性(图5G-5H)。因此，ICR4以RIG-I依赖性但不依赖PKR和MDA5的方式诱导抗癌反应。相反，ICR2诱导的抗癌反应似乎不受RIG-1，MDA5或PKR缺失的影响。

实施例7：ICR2和ICR4诱导的钙网蛋白和HMGB1易位

某些类型的抗癌药，例如阿霉素，可以诱导免疫原性细胞死亡，其特征为释放DAMP，表面表达“吃我(eat-me)”信号(例如内质网-驻留蛋白钙网蛋白)和活化先天免疫细胞诸如DC和NK细胞。 ³³ 这种免疫原性细胞死亡通过诱导抗肿瘤免疫反应，大大促进了癌症治疗的总体治疗效果。ICR2和ICR4均轻微诱导钙网蛋白的表面易位(图6A)。已显示表面钙网蛋白促进DC对阿霉素处理的癌细胞的吞噬作用。 ³⁴ 为了研究DC对ICR2和ICR4处理的癌细胞的吞噬作用，将未成熟的人DC与被ICR2和ICR4杀死的人黑素瘤细胞一起温育，如图6B所示。这些死亡/垂死的癌细胞可有效地被DC吸收，与用阿霉素杀伤细胞同样有效。在用ICR2和ICR4处理的人黑素瘤细胞中也观察到了HMGB1从细胞核到细胞质的易位(图6H)。有趣的是，用ICR2处理诱导的自人黑素瘤细胞的HMGB1释放水平明显高于用ICR4或阿霉素处理的水平，与用polyI:C处理的高水平相似(图6C)。与HMGB1释放增加相一致，由ICR2诱导的黑素瘤细胞死亡产生的DAMP诱导HMGB1识别型TLR4的活化明显高于由ICR4诱导的细胞死亡产生的DAMP(图6D)，尽管由ICR4诱导的细胞死亡释放的DAMPs在刺激TLR4方面比由阿霉素诱导的细胞死亡释放的DAMP明显更有效。

实施例8：ICR2和ICR4诱导人癌细胞释放先天性免疫刺激和促凝血DAMP

为了阐明从用ICR2和ICR4处理的癌细胞释放的DAMP是否刺激其他TLR，我们收集了从死亡/垂死的人黑素瘤细胞释放的DAMP，并与TLR2，TLR3和TLR9报告细胞一起温育。这些TLR报告基因细胞的活化水平在ICR2处理的细胞释放的DAMP和polyI:C处理的细胞释放的DAMP之间没有明显差异。然而，从ICR2处理的细胞释放的DAMP比从ICR4处理的细胞释放的DAMP更有效地活化TLR报告基因细胞。与阿霉素处理的细胞相比，ICR4处理的细胞诱导的TLR3活化明显更高(图6E)，而与阿霉素处理的细胞相比，ICR4处理的细胞诱导的TLR2和TLR9活化明显更少(图6F-6G)。这些从ICR2和ICR4处理的癌细胞释放的DAMP刺激未成熟的人DC产生细胞因子(图6I)。除了免疫刺激活性外，已知DAMP还可以促进止血和血栓形成 ³⁵ ，并且可能在在抗癌治疗后的肿瘤复发和转移中起重要作用。 ³⁶ 有趣的是，从ICR2-和polyI:C处理的人黑素瘤细胞中释放的DAMP与从模拟转染的细胞释放的DAMP相比活化血浆的凝血，而从ICR4-处理的黑素瘤细胞和阿霉素处理的黑素瘤细胞释放的DAMP不明显改变血浆的凝血时间(图6J)。这些数据表明，用ICR4处理的癌细胞比用ICR2处理的细胞释放的先天免疫刺激剂和促凝剂的量更低。

实施例9：用ICR2和ICR4进行的体内转染延长了患有黑素瘤的小鼠的存活

最后，我们评估了人黑素瘤异种移植模型中ICR2和ICR4的体内治疗效果。用ICR2或ICR4重复进行肿瘤内治疗抑制肿瘤生长(图7A)，并明显提高具有皮下人黑素瘤异种移植物的裸鼠的存活率(图7B)。与ICR2和金标准PRR刺激性RNA激动剂polyI:C相比，观察到ICR4的治疗效果有降低的趋势；但是，ICR2、ICR4和polyI:C之间的差异在统计学上并不显著。在携带B16小鼠黑素瘤的免疫活性小鼠中，ICR4治疗的治疗有效性似乎明显低于polyI:C治疗(图7C)。

序列表

<110> 杜克大学

李在元

布鲁斯·A·萨兰格

Y·李

<120> 用于差异性诱导细胞死亡和干扰素表达的组合物和方法

<130> 5667-00429

<150> US 62/480,780

<151> 2017-04-03

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR1

<400> 1

ggaugcggua ccugacagca uccua 25

<210> 2

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR1A

<400> 2

ggaugcggua ccugacagca uccuaaagug 30

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR1B

<400> 3

ggaugcggua ccugacagca uccuaaagug guggaaguga g 41

<210> 4

<211> 56

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR1C

<400> 4

ggaugcggua ccugacagca uccuaaagug guggaaguga gugagugaaa uaaaaa 56

<210> 5

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR2-3

<400> 5

ggacguaccu gacgucc 17

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR2-2

<400> 6

ggaucguacc ugacgaucc 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR2-1

<400> 7

ggaucgguac cugacagauc c 21

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR2

<400> 8

ggaugcggua ccugacagca ucc 23

<210> 9

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR2A

<400> 9

ggacgaugcg guaccugaca gcaucgucc 29

<210> 10

<211> 51

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR2B

<400> 10

ggaugcggua ccugacagca uccaccuggg augcugucag guaccgcauc c 51

<210> 11

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR3

<400> 11

ggagcggaug cgguaccuga cagcaucc 28

<210> 12

<211> 35

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR3A

<400> 12

ggggaggaca gcggaugcgg uaccugacag caucc 35

<210> 13

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR3B

<400> 13

ggaaugaggg gaggacagcg gaugcgguac cugacagcau cc 42

<210> 14

<211> 49

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR3C

<400> 14

ggguaaguga augaggggag gacagcggau gcgguaccug acagcaucc 49

<210> 15

<211> 55

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR4

<400> 15

ggaugcggua ccugacagca uccuaaacuc augguccaug uuuguccaug gacca 55

<210> 16

<211> 86

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR4A

<400> 16

ggaugcggua ccugacagca uccuaaacuc augguccaug uuuguccaug gaccaacuac 60

cgacauugua uguguugaua uaaugu 86

<210> 17

<211> 39

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR5X

<400> 17

ggaugcggua ccugacagca uccugaguuu aguuguugu 39

<210> 18

<211> 39

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR5Y

<400> 18

ggaugcggua ccugacagca uccacaacaa cuaaacuca 39

<210> 19

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成: ICR-L

<400> 19

gguuuuuuuu uuuuuuuuuu uuu 23

Claims (45)

1.能够诱导细胞死亡的组合物，其包含5'-三磷酸，2'-氟修饰的嘧啶非线性RNA，

其中所述RNA包括：

(a)由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第一茎环；

(b)由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第二茎环；和

(c)在所述第一茎环和所述第二茎环之间的间隔子。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA包含与ICR2(SEQ ID NO:8)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述RNA包含与ICR4(SEQ ID NO:15)、ICR4A(SEQID NO:16)、ICR5X(SEQ ID NO:17)或ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

4.权利要求3的组合物，其中所述RNA包含与ICR4(SEQ ID NO:15)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

5.权利要求3的组合物，其中所述RNA包含与ICR4A具有至少80％序列同一性的寡核苷酸(SEQ ID NO:16)。

6.权利要求3的组合物，其中所述RNA包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

7.权利要求3的组合物，其中所述RNA包含与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

8.权利要求3的组合物，其中所述RNA包含：

与ICR5X(SEQ ID NO:17)或ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的第一寡核苷酸和

与第一寡核苷酸的一部分完全或部分杂交的第二寡核苷酸。

9.权利要求8的组合物，

其中所述第一寡核苷酸包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸，和

其中所述第二寡核苷酸包含与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

10.权利要求2-9中任一项的组合物，其中所述第一茎环由基本上由ICR2(SEQ ID NO:8)组成的寡核苷酸形成。

11.权利要求1的组合物，其中所述RNA基本上由以下组成：

(i)ssRNA寡核苷酸，其与ICR4(SEQ ID NO:15)或ICR4A(SEQ ID NO:16)具有至少80％序列同一性；或

(ii)dsRNA，其包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少80％序列同一性的第一寡核苷酸以及与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸完全或部分杂交。

12.权利要求11的组合物，其中所述RNA基本上由与ICR4(SEQ ID NO:15)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸组成。

13.权利要求11的组合物，其中所述RNA基本上由与ICR4A(SEQ ID NO:16)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸组成。

14.权利要求11的组合物，其中所述RNA基本上由包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少80％序列同一性的第一寡核苷酸以及与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的第二寡核苷酸的dsRNA组成，其中所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸完全或部分杂交。

15.前述权利要求中任一项的组合物，

其中所述第一茎环包含能够与其互补序列杂交形成所述第一个茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸，或

其中所述第二茎环包含能够与其互补序列杂交以形成所述第二茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸或3’末端核苷酸。

16.权利要求15的组合物，

其中所述第一茎环包含能够与其互补核苷酸杂交形成所述第一个茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸，或

其中所述第二茎环包含能够与其互补核苷酸杂交以形成所述第二茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸或3’末端核苷酸。

17.权利要求15的组合物，

其中所述第一茎环包含能够与其互补核苷酸杂交形成所述第一个茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸，或

其中所述第二茎环包含能够与其互补核苷酸杂交以形成所述第二茎环的3’末端核苷酸。

18.权利要求15的组合物，

其中所述第一茎环包含能够与其互补核苷酸杂交形成所述第一个茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸，或

其中所述第二茎环包含能够与其互补核苷酸杂交以形成所述第二茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸。

19.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述间隔子包含RNA的单链区段。

20.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述间隔子包含由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第三茎环。

21.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述间隔子包含RNA的双链区段。

22.一种能够诱导细胞死亡的组合物，其包含2’-氟修饰的嘧啶非线性RNA，所述RNA包含由与ICR2(SEQ ID NO:8)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸形成的茎环，所述寡核苷酸包含能够与其互补核苷酸杂交形成所述茎环的5’-三磷酸修饰的末端核苷酸。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述RNA进一步包含由至少8个核苷酸对的完全或部分杂交形成的第二茎环以及由与ICR2(SEQ ID NO:8)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸形成的茎环与所述第二茎环之间的间隔子。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述RNA包含与ICR4(SEQ ID NO:15)、ICR4A(SEQ ID NO:16)、ICR5X(SEQ ID NO:17)或ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述RNA包含与ICR4(SEQ ID NO:15)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

26.根据权利要求24所述的组合物，其中所述RNA包含与ICR4A(SEQ ID NO:16)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

27.根据权利要求24所述的组合物，其中所述RNA包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

28.根据权利要求24所述的组合物，其中所述RNA包含与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

29.根据权利要求24所述的组合物，其中所述RNA包含：

与ICR5X(SEQ ID NO:17)或ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的第一寡核苷酸和

与第一寡核苷酸的一部分完全或部分杂交的第二寡核苷酸。

30.根据权利要求29所述的组合物，

其中所述第一寡核苷酸包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸和

其中所述第二寡核苷酸包含与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸。

31.根据权利要求23-30中任一项所述的组合物，其中所述茎环由基本上由ICR2(SEQID NO:8)组成的寡核苷酸形成。

32.根据权利要求23所述的组合物，其中所述RNA基本上由以下组成：

(i)ssRNA寡核苷酸，其与ICR4(SEQ ID NO:15)或ICR4A(SEQ ID NO:16)具有至少80％序列同一性；或

(ii)dsRNA，其包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少80％序列同一性的第一寡核苷酸，以及与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸完全或部分杂交。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述RNA基本上由与ICR4(SEQ ID NO:15)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸组成。

34.根据权利要求32所述的组合物，其中所述RNA基本上由与ICR4A(SEQ ID NO:16)具有至少80％序列同一性的寡核苷酸组成。

35.根据权利要求32所述的组合物，其中所述RNA基本上由下述dsRNA组成，所述的dsRNA包含与ICR5X(SEQ ID NO:17)具有至少80％序列同一性的第一寡核苷酸以及与ICR5Y(SEQ ID NO:18)具有至少80％序列同一性的第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸完全或部分杂交。

36.前述权利要求中任一项的组合物，其还包含治疗剂。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述治疗剂包括选自化学治疗剂、抗癌生物制剂、免疫治疗剂及其任意组合的组中的物质。

38.前述权利要求中任一项的组合物，其还包含细胞质递送组合物。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述细胞质递送组合物包含选自脂质体、合成聚合物、细胞穿透肽、纳米颗粒、病毒颗粒、电穿孔缓冲液、或核转染试剂、及其任何组合组成的组的物质。

40.一种药物组合物，其包含治疗有效量的前述权利要求中任一项的组合物和一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

41.一种抑制细胞生长或诱导细胞死亡的方法，所述方法包括使细胞与有效抑制细胞生长或诱导细胞死亡的量的前述权利要求中任一项的组合物接触。

42.一种在受试者中抑制细胞生长或诱导细胞死亡的方法，其包括以有效抑制细胞生长或诱导细胞死亡的量向需要这种治疗的受试者施用如前述权利要求中任一项所述的组合物。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述细胞包括癌细胞。

44.权利要求43的方法，其中所述癌细胞包括黑素瘤细胞、脑癌细胞、前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、结肠直肠癌细胞、白血病癌细胞、淋巴瘤细胞或卵巢癌细胞。

45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中将所述组合物递送到至少多个细胞的细胞质中。

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