CN110713550B - 一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法及其应用。本发明以虫草培养物为原料，提取粗多糖，采用大孔树脂吸附法和Sevag法两种方法相结合的手段去除粗多糖中的蛋白质而得到精多糖。进而采用分步醇沉得到了对三种革兰氏阴性植物病原细菌具有抑制活性的95%乙醇醇沉虫草精多糖CP95。本发明的制备方法具有操作简单、性能稳定、成本低廉的特点，本发明对更好地开发利用虫草培养物，以及降低虫草废弃培养基的清理成本具有重要的经济意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法及其应用。
背景技术
虫草(Cordyceps)是一类复杂的虫菌复合体，包括蝉花虫草、冬虫夏草、蛹虫草等，其含有多种生物活性成分，具有重要的保健和药用价值。蝉花虫草(OphiocordycepsSobolifera，无性世代为蝉棒束孢Isaria cicadae)是由麦角菌科真菌浸染同翅目蝉科蝉类若虫形成的虫菌复合体，因其头部长菌丝形成的无性子实体(又名孢梗束)似花蕾故名蝉花，是中医学中有着悠久药用历史的优质虫草。研究发现蝉花虫草含有多种生物活性物质，主要成分有虫草多糖(Cordyceps polysaccharide,CP)、虫草素、虫草酸、甾醇、尿嘧啶、维生素、生物碱、无机盐矿质元素等，具有调节免疫、抗疲劳、保肾、改善睡眠、抗肿瘤、保肝、抗辐射和明目等多重作用。冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)是冬虫夏草菌寄生于虫草蝙蝠蛾幼虫体后发育成的真菌子座和充满菌丝的僵死幼虫的复合体，含有虫草素、虫草多糖、甾醇、氨基酸等物质，具有免疫调节、抗癌、调节内分泌、抗菌、促进造血、抗病毒和护肝、镇静和抗惊厥作用。蛹虫草(Cordyceps militaris L Link)又名北冬虫夏草、北虫草，具有和冬虫夏草相似的活性成分和药理作用。
天然虫草非常稀少，近年来，人工培养的发展实现了虫草的大规模工厂化培育。虫草培养基是以大米、小麦等粮食作物为主原料，接种虫草菌种，通过固体发酵培养获得虫草培养物，培养物包括上部的无性子实体和底部的培养残基两部分，培养残基由已被转化利用的培养料、菌丝体及分生孢子组成。在实际应用中，一般以采摘开发虫草无性子实体为上品，从而产生了大量的培养残基。经检测，子实体采收后的培养残基因含有大量菌丝体和孢子，富含腺苷、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、多糖、氨基酸及钙、镁、钾、亚油酸等多种物质，也具有一定的应用价值。
发明内容
本发明公开了一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法及其应用。本发明以虫草培养物为原料，提取粗多糖，采用大孔树脂吸附法和Sevag法两种方法相结合的手段去除粗多糖中的蛋白质而得到精多糖。进而采用分步醇沉纯化，揭示了从虫草培养物中提取的95％乙醇醇沉虫草精多糖在抑制革兰氏阴性植物病原细菌方面的用途。
本发明的目的之一是提供一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法。
作为优选的方案，所述方法包括如下步骤：
(1)粗多糖提取：取适量虫草培养物于70℃烘干，按照培养物质量与提取液体积比加入10倍量50％乙醇，于80℃提取两次，每次搅拌0.5h，保温2h，过滤得到50％乙醇提取液；50％乙醇两次提取后的滤渣中加入10倍量水溶液，于100℃提取，搅拌0.5h，保温1h，过滤得到水提取液。将50％乙醇提取液和水提液分别浓缩，得到50％醇提浓缩液和水提浓缩液。两种浓缩液分别加入3倍量95％乙醇，静置过夜，沉淀多糖，分别得到50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖。合并50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖，喷雾干燥，得到虫草粗多糖；
(2)粗多糖脱蛋白：用去离子水溶解粗多糖，将配制的粗多糖溶液上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，收集洗脱液；将收集的洗脱液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作2次；水相层浓缩得到精多糖CP；
(3)乙醇分步醇沉：精多糖浓缩液用体积比终浓度为50％乙醇搅拌均匀，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP50；上清液调节乙醇体积至75％，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP75；上清液浓缩旋干，用95％乙醇进行溶解，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP95。
作为优选的另一种方案，所述方法包括如下步骤：
(1)粗多糖提取：取适量虫草培养物于70℃烘干，按照培养物质量与提取液体积比加入10倍量50％乙醇，于80℃提取两次，每次搅拌0.5h，保温2h，过滤得到50％乙醇提取液；50％乙醇两次提取后的滤渣中加入10倍量水溶液，于100℃提取，搅拌0.5h，保温1h，过滤得到水提取液。将50％乙醇提取液和水提液分别浓缩，得到50％醇提浓缩液和水提浓缩液。两种浓缩液分别加入3倍量95％乙醇，静置过夜，沉淀多糖，分别得到50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖。合并50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖，喷雾干燥，得到虫草粗多糖；
(2)粗多糖脱蛋白：用去离子水溶解粗多糖粉末，将配制的粗多糖溶液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作3次；将Sevag法处理后的水相层上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，水相浓缩得到精多糖CP；
(3)乙醇分步醇沉：精多糖浓缩液用体积比终浓度为50％乙醇搅拌均匀，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP50；上清液调节乙醇体积至75％，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP75；上清液浓缩旋干，用95％乙醇进行溶解，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP95。
作为优选，所述CP95具有制备用于抗革兰氏阴性植物病原细菌药剂的用途。
作为优选，所述革兰氏阴性植物病原菌为水稻细菌性褐条病RS-1菌株、番茄青枯病MYA-1菌株或甘薯茎腐病Dd-1菌株。
作为优选，所述虫草培养物包括蝉花虫草、冬虫夏草或蛹虫草等虫草培养物。
作为优选，所述虫草培养物包括培养残基、子实体、液体发酵菌丝体或液体发酵菌丝体滤液。
本发明的另一个目的是提供一种95％乙醇醇沉虫草精多糖CP95在制备用于抗革兰氏阴性植物病原细菌药剂中的用途。
作为优选，所述CP95为利用虫草培养物制备得到。
作为优选，所述CP95的制备方法包括如下步骤：
(1)粗多糖提取：取适量虫草培养物于70℃烘干，按照培养物质量与提取液体积比加入10倍量50％乙醇，于80℃提取两次，每次搅拌0.5h，保温2h，过滤得到50％乙醇提取液；50％乙醇两次提取后的滤渣中加入10倍量水溶液，于100℃提取，搅拌0.5h，保温1h，过滤得到水提取液。将50％乙醇提取液和水提液分别浓缩，得到50％醇提浓缩液和水提浓缩液。两种浓缩液分别加入3倍量95％乙醇，静置过夜，沉淀多糖，分别得到50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖。合并50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖，喷雾干燥，得到虫草粗多糖；
(2)粗多糖脱蛋白：用去离子水溶解粗多糖，将配制的粗多糖溶液上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，收集洗脱液；将收集的洗脱液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作2次；水相层浓缩得到精多糖CP；
(3)乙醇分步醇沉：精多糖浓缩液用体积比终浓度为50％乙醇搅拌均匀，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP50；上清液调节乙醇体积至75％，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP75；上清液浓缩旋干，用95％乙醇进行溶解，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP95。
作为优选，所述CP95的制备方法包括如下步骤：
(1)粗多糖提取：取适量虫草培养物于70℃烘干，按照培养物质量与提取液体积比加入10倍量50％乙醇，于80℃提取两次，每次搅拌0.5h，保温2h，过滤得到50％乙醇提取液；50％乙醇两次提取后的滤渣中加入10倍量水溶液，于100℃提取，搅拌0.5h，保温1h，过滤得到水提取液。将50％乙醇提取液和水提液分别浓缩，得到50％醇提浓缩液和水提浓缩液。两种浓缩液分别加入3倍量95％乙醇，静置过夜，沉淀多糖，分别得到50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖。合并50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖，喷雾干燥，得到虫草粗多糖；
(2)粗多糖脱蛋白：用去离子水溶解粗多糖粉末，将配制的粗多糖溶液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作3次；将Sevag法处理后的水相层上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，水相浓缩得到精多糖CP；
(3)乙醇分步醇沉：精多糖浓缩液用体积比终浓度为50％乙醇搅拌均匀，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP50；上清液调节乙醇体积至75％，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP75；上清液浓缩旋干，用95％乙醇进行溶解，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP95。
作为优选，所述革兰氏阴性植物病原菌为水稻细菌性褐条病RS-1菌株、番茄青枯病MYA-1菌株或甘薯茎腐病Dd-1菌株。
作为优选，所述虫草培养物包括蝉花虫草、冬虫夏草或蛹虫草等虫草培养物。
作为优选，所述虫草培养物包括培养残基、子实体、液体发酵菌丝体或液体发酵菌丝体滤液。
本发明提供了一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法以及其应用。该制备方法具有操作简单、性能稳定、成本低廉的特点，Sevag法和大孔树脂吸附法相结合脱蛋白的方法可以减少Sevag法脱蛋白次数3～4次，不仅节省了Sevag试剂使用量，降低了处理成本，并且能够有效去除多糖中的蛋白质，蛋白质去除率达到96％以上，为多糖组份的进一步分离纯化及生理功能研究打下了良好基础。本发明所制备的虫草精多糖CP95对农业生产中危害大、防治难的三种重要的革兰氏阴性植物病原细菌具有较强的抑制作用，其抑菌活性显著高于5％氨基寡糖素和5％壳聚糖，这对更好地开发利用虫草培养物，以及降低虫草废弃培养基的清理成本具有重要的经济意义。
附图说明
图1是利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的制备过程示意图。
图2是粗多糖脱蛋白效果图，其中，(A)表示采用Sevag法脱蛋白，(B)表示采用大孔树脂吸附法脱蛋白，(C)表示先大孔树脂吸附，后Sevag法脱蛋白，(D)表示先Sevag法脱蛋白，后大孔树脂吸附。
图3是蝉花虫草多糖溶液大孔树脂洗脱曲线，(A)和(B)表示多糖含量的变化，(C)和(D)表示蛋白质含量的变化。
图4是蝉花虫草粗多糖对水稻细菌性褐条病菌RS-1抑菌效果图，其中1代表2000mg/mL蝉花虫草粗多糖溶液，2代表1000mg/mL蝉花虫草粗多糖溶液，3代表500mg/mL蝉花虫草粗多糖溶液，4代表100mg/mL蝉花虫草粗多糖溶液，5代表阴性对照灭菌水。
图5是蝉花虫草精多糖OSP95对三种革兰氏阴性植物病菌的抑制效果图，其中，(A)为OSP95对水稻细菌性褐条病RS-1菌株的抑菌效果，(B)为OSP95对番茄青枯病MYA-1菌株的抑菌效果，(C)为OSP95对甘薯茎腐病Dd-1菌株的抑菌效果，1代表25mg/ml OSP95-A，2代表80mg/ml OSP95-A，3代表20mg/ml OSP95-B，3’代表40mg/ml OSP95-B，4代表40mg/ml 5％氨基寡糖素，5代表灭菌蒸馏水，6代表20mg/ml 5％氨基寡糖素。
图6是不同浓度5％氨基寡糖素和OSP95对番茄青枯病MYA-1菌株抑菌生测效果图，其中，(A)为不同浓度5％氨基寡糖素，(B)为不同浓度的OSP95-A，(C)为不同浓度的OSP95-B，0～6分别表示浓度为0、0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
本发明所用蝉花虫草培养基的主料为小麦，蝉花虫草人工栽培采用的菌种为蝉花虫草(O.sobolifera)022007-9菌株，由浙江省亚热带作物研究所植物保护与虫生真菌研究室分离获得，并保存于中国微生物菌种保藏管委会普通微生物中心(CGMCC No:8989)。
本发明所用LB固体培养基的组成是5.0g酵母粉，10.0g蛋白胨，5.0g NaCl，17.0g琼脂粉，1000mL蒸馏水，pH 7.0-7.2，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)；NA固体培养基的组成是3.0g牛肉浸膏，1g酵母浸膏，5g蛋白胨，10g葡萄糖(或蔗糖)，15g琼脂粉，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0。本发明所用水稻细菌性褐条病(Acidovorax avenae sub sp.avenae)RS-1菌株由浙江大学生物技术研究所李斌教授赠送，甘薯茎腐病(Dickeya dadantii)Dd-1菌株由浙江省农业科学院微生物与植物保护研究所王艳丽研究员赠送，番茄青枯病(Ralstoniasolanacearum)MYA-1菌株由浙江省亚热带作物研究所本研究室采集并分离自瑞安马屿镇基地的番茄青枯病植物病株。Sevag试剂是氯仿与正丁醇按4:1的体积比混合而成，大孔吸附树脂AB-8购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。
实施例1利用蝉花虫草培养残基提取粗多糖及多糖含量测定
取一定量的蝉花虫草子实体采摘后的培养残基经70℃烘箱烘干，投料入10吨提取罐，按照培养残基质量与提取液体积比加入10倍量50％乙醇，加热至微沸状态(80℃-90℃)，搅拌0.5h，保温2h，过滤得到乙醇提取液，滤渣继续加入10倍量50％乙醇进行二次提取，合并两次滤液得到50％乙醇提取液；50％乙醇两次提取后的滤渣中加入10倍量水溶液，加热至沸腾(90℃-100℃)，搅拌0.5h，保温1h，过滤得到水提取液。将50％乙醇提取液和水提液分别浓缩，得到50％醇提浓缩液和水提浓缩液。两种浓缩液分别加3倍量95％乙醇，静置过夜，沉淀多糖，得到50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖。合并50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖进行喷雾干燥，得到蝉花虫草粗多糖粉末。
在虫草培养过程中，构成培养基的主料已被虫草转化利用，因此，所提取的多糖主要源自虫草菌丝体及分生孢子。
采用苯酚-硫酸法检测多糖含量。准确称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg配制成标准葡萄糖溶液0.1mg·mL-1，分别吸取标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于试管中，各管用蒸馏水加至1.0mL，再分别加入5％苯酚试剂1mL混匀，然后快速加入浓硫酸5.0mL，静置10min，振摇混合，置30℃水浴中反应20min，紫外分光光度计测定490nm吸光度，以葡萄糖浓度和吸光度为横纵坐标制标准曲线，得到回归方程。分别取一定量的50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖溶于水得到样品溶液，取样品溶液1mL按上述方法进行多糖含量测定。测得50％醇提沉淀多糖含量为44.7％，水提浓缩沉淀多糖含量为45.3％。
通过称量得到的粗多糖粉末，计算得到利用蝉花虫草培养残基制备得到的粗多糖得率为14.2％。
实施例2蝉花虫草精多糖的制备
分别采用Sevag法、大孔树脂吸附法以及Sevag法和大孔树脂吸附法相结合的方法对粗多糖进行脱蛋白而得到精多糖。
1、Sevag法脱蛋白
按5％质量浓度比例用去离子水溶解粗多糖粉末，配制的粗多糖溶液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm转速下离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层。重复上述操作多次直至中间变性蛋白层不再出现为止，每次留样测定蛋白的含量。
采用考马斯亮蓝法含量蛋白质测定：配制牛血清白蛋白(BSA)标准溶液1mg·mL-1，分别吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL标准BSA，用蒸馏水添加至1.0mL，充分摇匀，加入5mL考马氏亮蓝G-250溶液，放置30min，然后紫外分光光度计测定595nm吸光度。以A595对BSA的毫克数作标准曲线，得到回归方程。取合适浓度的样品溶液1.0mL，按上述方法进行测定。其中蛋白去除率计算公式如下：
其中：M0是处理前样品的蛋白质质量，M1是处理后样品的蛋白质含量。
从图2A可以看出，蝉花虫草粗多糖经Sevag法脱蛋白1次蛋白去除率约为40％，脱2次蛋白去除率约为79％，脱3次蛋白去除率约为80％，之后4～6次效果不明显，说明Sevag法并不能完全将蝉花虫草粗多糖中的蛋白质去除。
2、大孔树脂吸附法脱蛋白
选用弱极性大孔吸附树脂AB-8，装柱(柱径长50mm×600mm)。大孔树脂预处理与再生：预处理先用95％乙醇浸泡12h，用去离子水清洗至无醇味，再用质量分数5％的盐酸溶液浸泡4h，去离子水清洗至pH6.0左右；再用质量分数2％的氢氧化钠溶液浸泡4h，然后用去离子水清洗至pH8.0左右。将蝉花粗多糖溶液上柱，用3倍体积去离子水进行洗脱，收集洗脱液进行蛋白质含量测定；将收集的洗脱液进一步上柱，分别测定其蛋白含量。
从图2B可以看出，蝉花虫草培养基粗多糖经大孔树脂吸附脱蛋白1次后蛋白质去除率约为86％，洗脱液继续上柱1次并没有取得明显效果，说明大孔树脂吸附法并不能完全将蝉花虫草粗多糖中的蛋白质去除。
3、先大孔树脂吸附法脱蛋白，后Sevag法脱蛋白(方法一)
按5％质量浓度比例用去离子水溶解粗多糖粉末，将配制的粗多糖溶液上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，收集洗脱液进行蛋白质含量测定。将收集的洗脱液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm转速下离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作2次，每次收集水相层进行蛋白质含量测定。从图2C可以看出，用大孔树脂吸附法脱1次后蛋白质去除率约为86％，再结合Sevag法脱1次后蛋白质去除率达到96％，结合Sevag法脱2次后蛋白质去除率达到97％以上，说明粗多糖中的蛋白质几乎去除完全。此外，大孔树脂吸附后的多糖颜色由棕褐色变浅为黄褐色，脱色明显。
将上述有效去除蛋白质后的水相层浓缩得到蝉花虫草精多糖OSP，此处命名为OSP-A。
4、先Sevag法脱蛋白，后大孔树脂吸附法脱蛋白(方法二)
按5％质量浓度比例用去离子水溶解粗多糖粉末，配制的粗多糖溶液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm转速下离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作3次，收集水相层进行蛋白质含量测定；将Sevag法处理后的水相层上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，收集洗脱液进行蛋白质含量测定。从图2D可以看出，用Sevag法脱3次后蛋白质去除率约为80％，再结合一次大孔树脂吸附，蛋白质去除率达到98％，说明粗多糖中的蛋白质几乎去除完全。此外，大孔树脂吸附后的多糖颜色由棕褐色变浅为黄褐色，脱色明显。
将上述有效去除蛋白质后的水相浓缩得到蝉花虫草精多糖OSP，此处命名为OSP-B。
实施例3大孔树脂吸附法和Sevag法相结合的两种处理方法对蝉花虫草多糖组分
的影响
设置A、B两个处理组，其中，A处理组为未脱蛋白的粗多糖溶液直接上样于大孔树脂，B处理组为利用Sevag法脱蛋白3次后所收集的多糖溶液上样于大孔吸附树脂，依次用3倍体积去离子水、20％乙醇和70％乙醇进行洗脱，最后用95％乙醇清洗，收集洗脱液，每份收集250ml，分别测定所收集的溶液中多糖和蛋白质含量，得到多糖洗脱曲线。
从图3A和图3B的多糖变化曲线可知，A处理组和B处理组的多糖经大孔树脂吸附洗脱均能分离获得水相部位和20％乙醇部位两个主要多糖显示峰，以及70％乙醇部位的一个多糖小峰，且分离的多糖峰型相似，表明粗多糖在上样于大孔树脂前是否进行Sevag法脱蛋白，对多糖组份影响不大，也说明Sevag法脱蛋白对多糖作用温和。并且也可以看出蝉花虫草多糖组份极易溶于水，极有可能有糖蛋白组份存在。
从A、B处理组对应的蛋白变化曲线图3C和图3D可见，A处理组分离的蛋白组分较B处理组的要多、杂，两处理组各自分离的两个主要多糖组分即水相部位和20％乙醇部位中都检测有少量蛋白，其中A处理组分离的这两个多糖组份中还明显杂有部分游离蛋白。大孔树脂在多糖的分离过程中通过对其中相杂的不同蛋白的不同吸附程度从而达到较好的去蛋白效果，而Sevag法能去除粗多糖中绝大多数游离蛋白。因此，未经Sevag法脱蛋白处理的粗多糖直接经大孔树脂分离的各多糖组份还须进行Sevag法去除部分游离蛋白才能达到较为理想脱蛋白效果。
实施例4蝉花虫草精多糖的分步醇沉
将实施例2所得的蝉花虫草精多糖OSP-A和精多糖OSP-B依次用体积比为50％、75％、95％乙醇分步醇沉，即精多糖浓缩液先用体积终浓度为50％乙醇搅拌均匀，4℃静置过夜，离心分离(8000r/min，15min)，收集沉淀物低温冻干，上清液调节乙醇体积至75％，4℃静置过夜离心(8000r/min，15min)，收集沉淀物低温冻干，上清液浓缩旋干后，用95％乙醇进行溶解，4℃静置过夜离心(8000r/min，15min)，收集沉淀物，低温冻干。上述三级醇沉收集的沉淀即为三种分子量段的蝉花虫草精多糖，分别记为50％乙醇醇沉蝉花虫草精多糖OSP50(命名为OSP50-A和OSP50-B)、75％乙醇醇沉蝉花虫草精多糖OSP75(命名为OSP75-A和OSP75-B)、95％乙醇醇沉蝉花虫草精多糖OSP95(命名为OSP95-A和OSP95-B)。
实施例5蝉花虫草粗多糖对水稻细菌性褐条病菌RS-1抑菌的抑菌效果
将固体LB培养基融化冷却至约45℃，分别加入供试细菌生测菌液(OD600＝0.3)30μL，混均，在菌平板凝固前，每个平板用5个牛津杯嵌入其中，等凝固后，用镊子取出牛津杯及圆孔中的培养基。再向圆孔中分别加入蝉花虫草粗多糖溶液100mg/mL、500mg/mL、1000mg/mL和2000mg/mL各100μL，以无菌水处理为对照，3次重复，室温下待样品完全扩散后，放置于30℃的培养箱中培养48h，取出观察并测量抑菌圈直径。
从图4可见，蝉花虫草粗多糖(浓度≥100mg/mL)对水稻细菌性褐条病菌RS-1具有一定程度的抑制作用，且抑菌效果和粗多糖浓度呈正相关性；高浓度(2000mg/mL)时，能达到较好的抑菌效果，抑菌圈内光滑，基本没有菌落出现，但随着多糖浓度的降低，抑菌效果减弱，表现为抑菌圈变小且边缘清晰度变差，随着培养时间的延长，抑菌圈内菌落数量也不断增多，阴性对照无菌水处理则不出现抑菌圈。
实施例6分步醇沉得到的三种分子量段的蝉花虫草精多糖、粗多糖、氨基寡糖素及
壳聚糖的抑菌效果
将固体LB和NA培养基融化冷却至约45℃，分别加入供试细菌生测菌液(OD600＝0.3)30μL(其中，水稻细菌性褐条病RS-1菌株接种于LB培养基，甘薯茎腐病Dd-1菌株和番茄青枯病MYA-1菌株接种于NA培养基)，混均，在菌平板凝固前，每个平板用5个牛津杯嵌入其中，等凝固后，用镊子取出牛津杯及圆孔中的培养基。再向圆孔中分别加入蝉花虫草多糖溶液100μL，实验设置3次重复，室温下待样品完全扩散后，放置于30℃的培养箱中培养48h，取出观察并测量抑菌圈直径。并灭菌水作为阴性对照，以5％氨基寡糖素水溶液和壳聚糖水溶液作为阳性对照，实验结果如下表所示：
表1 OSP50、OSP75、OSP95、粗多糖、氨基寡糖素及壳聚糖对三种菌株的抑制效果
注：“ND”表示未见抑菌圈。
从上述结果可知，95％乙醇醇沉所得的精多糖OSP95-A和OSP95-B对水稻细菌性褐条病RS-1菌株、番茄青枯病MYA-1菌株和甘薯茎腐病Dd-1菌株具有较强的抑制作用，而同样浓度的50％醇沉精多糖(OSP50-A和OSP50-B)和75％醇沉精多糖(OSP75-A和OSP75-B)对番茄青枯病MYA-1菌株和甘薯茎腐病Dd-1菌株均未表现出抑菌效果。
而没有进行脱蛋白的粗多糖对三种菌株也显示出了一定的抑制效果，但效果明显低于精多糖OSP95，可能是因为其中混杂有蛋白质等杂质而影响其效果，也有可能是因为其中混杂有不具有抑菌活性的多糖而影响其效果，具体原因有待进一步分析。并且，OSP95的抑菌效果显著高于壳聚糖，也高于5％氨基寡糖素。
一般来说，乙醇浓度越低，沉淀出来的多糖分子量越大，乙醇浓度越高，小分子量多糖才可以沉淀出来。发明人发现分步醇沉中95％乙醇醇沉的蝉花虫草精多糖OSP95对三种革兰氏阴性植物病原细菌显示出了较强的抑菌活性，再加上该多糖组份极易溶于水，说明蝉花虫草多糖中对革兰氏阴性植物病原细菌发挥抑菌作用的多糖可能是水溶性小分子多糖。
实施例7不同浓度OSP95-A和OSP95-B对三种革兰氏阴性植物细菌的抑制效果
分别采用不用浓度的OSP95-A和OSP95-B处理三种革兰氏阴性植物病毒细菌，实验方法同实施例6所述，设置三次重复，灭菌水作阴性对照，常规对照药剂为5％氨基寡糖素水剂，实验结果见图5，具体抑制圈直径数据如下表所示：
表2不同浓度的OSP95对三种菌株的抑制效果
注：“ND”表示未见抑菌圈；“-”表示未试验；大写字母表示差异极显著(P＜0.05)，小写
字母表示差异显著。
从上述结果可知，蝉花虫草精多糖分步醇沉获得的95％乙醇醇沉蝉花虫草精多糖OSP95-A和OSP95-B对水稻细菌性褐条病RS-1菌株、番茄青枯病MYA-1菌株和甘薯茎腐病Dd-1菌株均具有较强的抑制作用，并随着多糖浓度的增加抑菌效果增强(图5)。
对于水稻细菌性褐条病RS-1菌株，显著性方差分析结果表明OSP95-A(25mg/ml)抑菌圈直径约达10.83mm，与常规对照5％氨基寡糖素(40mg/ml)抑菌圈直径10.67mm之间差异不显著；OSP95-A(80mg/ml)和OSP95-B(40mg/ml)抑菌圈直径分别达14.00mm和13.17mm，两者之间差异也不显著，但两者均极显著水平高于低浓度处理和常规对照处理组。
同样，对于番茄青枯病MYA-1菌株和甘薯茎腐病Dd-1菌株，显著性方差分析结果表明OSP95-A(25mg/ml)和对照5％氨基寡糖素(40mg/ml)抑菌效果相当，之间不存在显著性差异，但两者极显著水平优于OSP95-B(20mg/ml)，同时极显著水平低于OSP95-A(80mg/ml)。
实施例8不同浓度OSP95-A、OSP95-B和5％氨基寡糖素对番茄青枯病MYA-1菌株的
抑制效果
分别采用浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/ml的OSP95-A、OSP95-B和5％氨基寡糖素处理番茄青枯病MYA-1菌株，结果显示，对于番茄青枯病MYA-1菌株，OSP95-A和OSP95-B在5mg/ml浓度下仅表现极微弱的抑菌圈效果，高于10mg/ml以上的OSP95-A和OSP95-B抑菌圈则较为清晰；而5％氨基寡糖素在5mg/ml浓度下没有抑菌效果，10mg/ml浓度时的抑菌圈边界线有点模糊，抑制效果低于OSP95(见表3和图6)。以上结果说明OSP95-A和OSP95-B对番茄青枯病MYA-1菌株具有较强的抑制活性，浓度大于10mg/ml即可实现明显抑菌，可以用来制备用于抗番茄青枯病的药剂。
表3不同浓度OSP95-A、OSP95-B和5％氨基寡糖素对MYA-1菌株的抑制
通过上述实施例，发明人发现利用蝉花虫草培养残基制备的精多糖分级醇沉获得的95％乙醇醇沉蝉花虫草精多糖OSP95对水稻细菌性褐条病RS-1菌株、番茄青枯病MYA-1菌株和甘薯茎腐病Dd-1菌株具有较强的抑制作用，可用来制备用于抗革兰氏阴性植物病原细菌的药剂。通过对所得的沉淀物进行称重，从培养残基中分离获得具有抗菌活性多糖OSP95的得率约为4.52％-4.63％。
表4具有抑菌活性的抑菌多糖(OSP95)的得率
发明人分别采用蝉花虫草子实体、蛹虫草培养残基、蛹虫草子实体、冬虫夏草培养残基、冬虫夏草子实体以及虫草液体发酵菌丝液进行实验，得到了类似的实验效果，此处不再一一描述。
以上是对本发明的较佳实施方式的具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围。
Claims (5)
1.一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)粗多糖提取：取适量虫草培养物于70℃烘干，按照培养物质量与提取液体积比加入10倍量50％乙醇，于80℃提取两次，每次搅拌0.5h，保温2h，过滤得到50％乙醇提取液；50％乙醇两次提取后的滤渣中加入10倍量水溶液，于100℃提取，搅拌0.5h，保温1h，过滤得到水提取液；将50％乙醇提取液和水提液分别浓缩，得到50％醇提浓缩液和水提浓缩液；两种浓缩液分别加入3倍量95％乙醇，静置过夜，沉淀多糖，分别得到50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖；合并50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖，喷雾干燥，得到虫草粗多糖；
(2)粗多糖脱蛋白：用去离子水溶解粗多糖，将配制的粗多糖溶液上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，收集洗脱液；将收集的洗脱液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作2次；水相层浓缩得到精多糖CP；
(3)乙醇分步醇沉：精多糖浓缩液用体积比终浓度为50％乙醇搅拌均匀，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP50；上清液调节乙醇体积至75％，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP75；上清液浓缩旋干，用95％乙醇进行溶解，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP95。
2.一种利用虫草培养物制备具有抑菌活性精多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)粗多糖提取：取适量虫草培养物于70℃烘干，按照培养物质量与提取液体积比加入10倍量50％乙醇，于80℃提取两次，每次搅拌0.5h，保温2h，过滤得到50％乙醇提取液；50％乙醇两次提取后的滤渣中加入10倍量水溶液，于100℃提取，搅拌0.5h，保温1h，过滤得到水提取液；将50％乙醇提取液和水提液分别浓缩，得到50％醇提浓缩液和水提浓缩液；两种浓缩液分别加入3倍量95％乙醇，静置过夜，沉淀多糖，分别得到50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖；合并50％醇提沉淀多糖和水提沉淀多糖，喷雾干燥，得到虫草粗多糖；
(2)粗多糖脱蛋白：用去离子水溶解粗多糖粉末，将配制的粗多糖溶液与Sevag试剂按体积比5:1混合均匀，剧烈振荡30min，于4000rpm离心15min，置于分液漏斗分液除去中间变性蛋白层与下层有机溶液层，重复上述操作3次；将Sevag法处理后的水相层上样于大孔树脂，用3倍体积去离子水进行洗脱，水相浓缩得到精多糖CP；
(3)乙醇分步醇沉：精多糖浓缩液用体积比终浓度为50％乙醇搅拌均匀，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP50；上清液调节乙醇体积至75％，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP75；上清液浓缩旋干，用95％乙醇进行溶解，4℃静置过夜，8000r/min离心15min，收集沉淀物，低温冻干沉淀得到CP95。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述虫草培养物包括蝉花虫草培养物、冬虫夏草培养物或蛹虫草培养物。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述虫草培养物包括培养残基、子实体、液体发酵菌丝体或液体发酵菌丝体滤液。
5.一种如权利要求1或2所述的方法制备的CP95在制备用于抗革兰氏阴性植物病原细菌药剂中的应用。
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