CN110742906A - 一种间充质干细胞旁分泌因子在制备疼痛药中的应用 - Google Patents

Abstract

一种间充质干细胞旁分泌因子在制备疼痛药中的应用，涉及生物干细胞技术领域在疼痛中的应用。本发明一方面提供了间充质干细胞旁分泌因子的制备方法；另一方面，本发明发现这种方法制备的旁分泌因子可以用于各种疼痛的治疗，具体疼痛包括关节痛、炎性疼痛、癌症疼痛等一切患者主观感觉的疼痛，具有制备疼痛药物的应用前景。本发明能够有效缓解各种原因导致的疼痛。本发明的细胞蛋白制剂在治疗疼痛方面呈现优异的生物学效果。

Description

一种间充质干细胞旁分泌因子在制备疼痛药中的应用

技术领域

本发明涉及生物干细胞技术领域在疼痛中的应用，具体涉及一种用于治疗各种疼痛的间充质干细胞旁分泌因子的制备方法及其应用。

背景技术

疼痛是组织损伤或潜在组织损伤所引起的不愉快感觉和情感体验，是一种主观感受。疼痛和人体呼吸、血压、脉搏、体温四大生命体征一起被列入第五大生命体征。已知，可使用一些按摩、红外等理疗的方法，或者使用抗炎、镇痛药物来改善和治疗疼痛。理疗的方法只能短暂的缓解症状，而药物镇痛不仅产生依赖，而且具有较大的副作用，以上这些方式均无法较长期的改善疼痛症状。

间充质干细胞是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。目前，间充质干细胞移植已经成功应用于包括神经系统、消化系统、免疫系统等多个系统的疾病治疗。

近年来，间充质干细胞已经作为生物制药成功应用于膝关节疾病的治疗，但治疗目的均以增强和改善膝关节活动为主，或以再生膝关节软骨细胞为目的，以治疗疼痛为目的的没有人提出。另外，在间充质干细胞对于疼痛治疗的领域尚属于空白，没有人发现其具备抗疼痛的功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，首先提供了一种更多获取间充质干细胞旁分泌因子的方法，其次，提供了间充质干细胞旁分泌因子在用于制备治疗疼痛药物中的应用。其中间充质干细胞包括了脐带、脐带血、脂肪、骨髓、羊膜等所有哺乳动物尤其人来源培养获取的间充质干细胞。该间充质干细胞为自体或者同种异体来源的间充质干细胞。

不同组织来源的间充质干细胞组织处理方法不同，但从原代细胞培养后的方法均相同。

本发明以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞旁分泌因子的制备方法，包括以下步骤：

(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；

(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；

(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；

优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；

(4)组织块制备

剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；

(5)接种

将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；

(6)脐带华通氏胶的培养

平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物(优选商品名称：Ultroser G serumsubstitute；货号：15950-017；购自美国pall公司)的基础培养基(高糖DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；

培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；

(7)换液

第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有10％血清替代物的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；

第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；

第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；

(8)收获原代细胞

细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；

原代细胞收获

配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。

去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；

洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；

消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；

终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入间充质干细胞培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管如50ml离心管中离心；

(9)原代细胞传代(P0传P1)

将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；

将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的干细胞培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。

种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml。

按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为治疗疼痛的干细胞旁分泌因子的来源。所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)。

间充质干细胞旁分泌因子的获取：

选取P3-P6代次的间充质干细胞，除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水，加入含有5wt％血清替代物的高糖DMEM培养基(同上)，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度(优先培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％)的低氧的培养箱中，继续培养48h，后收集间充质干细胞旁分泌因子悬液；

将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入离心管，离心收取上清液，然后无菌滤器除菌过滤，即得所述用于治疗疼痛的间充质干细胞旁分泌因子。

本发明上述间充质干细胞旁分泌因子的获取方法并不是常规培养的培养液中提取，本方法是对间充质干细胞进行低氧联合低营养双重刺激促进间充质干细胞释放出大量的旁分泌因子，包含了数百种蛋白的组合成分。

间充质干细胞旁分泌因子获取的方法是采用低氧加上低营养双重处理方式，其中低氧采用低氧培养箱培养，氧气的浓度范围从1％-15％不等，低营养的方式是添加入血清或者生长因子组合的比例从1％-5％不等，经过摸索对比发现，当氧气浓度在2％，营养成分占无血清培养基的5％的时候可以最大限度的促进间充质干细胞的旁分泌作用，同时又保证了间充质干细胞的活性。包括人体胎盘、脐带、脐带血、脂肪以及骨髓等所有人体各组织来源的间充质干细胞。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现了间充质干细胞旁分泌因子在治疗疼痛药物上的新用途，且适合治疗各种不同病因导致的疼痛，具体包括：①、炎症、风湿、劳累等所有因素导致的颈、肩、腰、腿、膝关节疼痛；②、不明原因导致的神经疼痛；③、肌肉疼痛；④、各种因素导致的头痛；⑤、各种肿瘤伴随的疼痛。

本发明所述的疼痛药的用法为：直接疼痛部位注射，静脉注射，肌肉注射，骨内注射，关节腔内注射，皮下注射或皮内注射。其中该间充质干细胞旁分泌因子通过直接移植而施用。其中该间充质干细胞旁分泌因子进一步包含一种可注射载体。其中可注射载体可选自透明质酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、或者其他治疗相关的药物。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的脐带间充质干细胞的照片。

图2为本发明实施例1制得的脐带间充质干细胞的流式细胞仪鉴定照片。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。但本发明并不限于以下实施例。

实施例1脐带间充质干细胞的制备

本发明所述的脐带间充质干细胞主要来源于人脐带间充质干细胞，但干细胞来源不仅限于脐带，可来源于人体胎盘、骨髓、牙髓、脂肪等多个人体组织来源。

其中，脐带间充质干细胞的制备过程如下：见见发明内容的步骤(1)-步骤(9)；

剪取新鲜脐带，用无菌生理盐水清洗干净后，进一步去除可见血管及华氏胶组织，将脐带剪碎至大小约1mm3大小后放入细胞培养皿中，加入含有10wt％血清替代物(商品名称：Ultroser G serum substitute；货号：15950-017；购自美国pall公司)的基础培养基(高糖DMEM培养基)至刚好覆盖组织块，置于37℃二氧化碳培养基中培养。约10-14天后可见梭型细胞从组织块中爬出，此即为脐带间充质干细胞，经过几次传代，当到3-6代的时候即可使用来制备用于疼痛治疗的细胞药物。如图1和图2所示，图1和图2分别是脐带间充质干细胞的培养图片和流式细胞仪鉴定图片。

(2)脐带间充质干细胞旁分泌因子作为疼痛治疗药物的配置：选取P3-P6代次的间充质干细胞，除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水，加入含有5wt％血清替代物的高糖DMEM培养基(同上)，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度(优先培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％)的低氧的培养箱中，继续培养48h，后收集间充质干细胞旁分泌因子悬液；将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入离心管，以1000rpm离心5分钟后收取上清液，然后0.22无菌滤器除菌过滤，即得所述用于治疗疼痛的间充质干细胞旁分泌因子。

具体选择细胞注射数量根据疼痛的部位、疼痛的程度不同而定，其中注射载体可选自透明质酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、或者其他治疗相关的药物。细胞用于治疗的方式为：直接疼痛部位注射，静脉注射，肌肉注射，骨内注射，关节腔内注射，皮下注射，皮内注射。

实施例2间充质干细胞旁分泌因子对落枕疼痛的评价实验

落枕是一种常见病，好发于青壮年，以冬春季多见。落枕的常见发病经过是入睡前并无任何症状，晨起后却感到项背部明显酸痛，颈部活动受限。一般落枕患者需要3-7天恢复正常。选取10例落枕的患者，均于落枕发生后第二天进行间充质干细胞旁分泌因子的局部多点皮下注射，在疼痛评价后，通过局部多点注射总量为2ml的人脐带间充质干细胞旁分泌因子，分别在注射后的第2、4、7天让患者填写疼痛评估量表。10例患者在注射后第2天均有疼痛改善减轻，其中7例患者疼痛全部消失。另外3例患者疼痛评分从5±2降低至1±1分，注射后第4天所有患者疼痛均消失，第7天，所有患者进行疼痛评价时均未再有痛感。干细胞旁分泌因子对患者的疼痛症状进行缓解。

实施例3间充质干细胞对颈椎病疼痛的评价实验

慢性疼痛是指持续一个月以上(以前为三个月或半年)的疼痛，随着社会的进步和电脑网络的发达，颈椎病导致的慢性疼痛越来越多发。选取8例颈椎病慢性疼痛的患者，使用数字疼痛评估量表评价所述个体的疼痛。在疼痛评价后，通过局部多点注射总量为2ml的人脐带间充质干细胞旁分泌因子。分别在注射后第3天，第7天，14天以及30天后让患者填写疼痛评估量表。8例患者在注射后第二2天均有疼痛改善减轻，疼痛评分从7±3降低至6±2分，第7天后疼痛评分继续进一步减轻至4±2分，第14天后疼痛评分继续进一步减轻至2±1分，其中4位患者14天时痛感消失，剩余4位患者1个月评分时痛感消失。由于干细胞旁分泌因子对患者的疼痛症状进行缓解，对颈椎病没有治愈。

实施例4间充质干细胞旁分泌因子治疗膝关节炎形成导致的疼痛。

膝关节炎是一种以退行性病理改变为基础的疾患，多患于中老年人群，其症状多表现为膝盖红肿痛、上下楼梯痛、坐起立行时膝部酸痛不适等，严重影响患者的生活质量。选取10例膝关节疼痛的患者，平均疼痛周期为12±2月，给于膝关节腔注射2ml干细胞旁分泌因子，5例患者于10天后出现疼痛症状明显改善，疼痛评分4±2分由减轻至2±1分，20d后，这5例患者疼痛均获得改善。另外5例患者疼痛程度较重，严重影响了行走，治疗前疼痛评分为6±3分，给于第一次治疗后疼痛改善减轻5±2分，2周后给于患者重复注射2ml间充质干细胞旁分泌因子，术后10天患者的疼痛评分减轻至3±1分，术后20天3例患者痛感消失，另外2例患者再给于第三次注射2ml干细胞旁分泌因子，10天后这2例患者的痛感也消失。可以看出，间充质干细胞旁分泌因子与膝关节炎的严重程度直接相关，病情较重的需要多次注射后改善。

以上所述间充质干细胞旁分泌因子在疼痛领域的应用仅为本发明的较佳实施例，故不能依此限定本发明实施的范围，即根据本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞旁分泌因子的应用，用于制备治疗疼痛药物的应用。

2.按照权利要求1所述的应用，所述的间充质干细胞为来源于任意组织的间充质干细胞。来源包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等一切哺乳动物尤其人的各组织来源的间充质干细胞。

3.按照权利要求1所述的应用，所述的疼痛药物适合治疗各种不同病因导致的疼痛，具体包括：①、炎症、风湿、劳累等所有因素导致的颈、肩、腰、腿、膝关节疼痛；②、不明原因导致的神经疼痛；③、肌肉疼痛；④、各种因素导致的头痛；⑤、各种肿瘤伴随的疼痛。

4.按照权利要求1所述的应用，疼痛药的用法为：直接疼痛部位注射，静脉注射，肌肉注射，骨内注射，关节腔内注射，皮下注射或皮内注射。

5.按照权利要求4所述的应用，注射时载体可选自透明质酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、或者其他治疗相关的药物。

6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞旁分泌因子的制备方法，包括以下步骤：

(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；

(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；

(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；

优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；

(4)组织块制备

剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；

(5)接种

将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；

(6)脐带华通氏胶的培养

平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物的基础培养基即高糖DMEM培养基，然后缓慢让它浸润整个组织块；

培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；

(7)换液

第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有10％血清替代物的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；

第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；

第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；

(8)收获原代细胞

细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；

原代细胞收获

配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。

去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；

洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；

消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；

终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入间充质干细胞培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管如50ml离心管中离心；

(9)原代细胞传代(P0传P1)

将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；

将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的干细胞培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。

种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml；

按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞；

间充质干细胞旁分泌因子的获取：

选取P3-P6代次的间充质干细胞，除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水，加入含有5wt％血清替代物的高糖DMEM培养基，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度的低氧的培养箱中，培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％，继续培养48h，后收集间充质干细胞旁分泌因子悬液；

将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入离心管，离心收取上清液，然后无菌滤器除菌过滤，即得所述用于治疗疼痛的间充质干细胞旁分泌因子。

7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，选取P3-P6代次的间充质干细胞，所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)。

8.一种疼痛药，其特征在于，包括间充质干细胞旁分泌因子；其中间充质干细胞包括了脐带、脐带血、脂肪、骨髓、羊膜等所有哺乳动物尤其人来源培养获取的间充质干细胞；该间充质干细胞为自体或者同种异体来源的间充质干细胞。

9.按照权利要求8所述的疼痛药，其特征在于，间充质干细胞旁分泌因子是作为镇痛的成分的。

10.一种疼痛药的制备方法，以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞旁分泌因子的制备方法，包括以下步骤：

(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；

(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；

(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；

优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；

(4)组织块制备

剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；

(5)接种

将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；

(6)脐带华通氏胶的培养

平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物的基础培养基即高糖DMEM培养基，然后缓慢让它浸润整个组织块；

培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；

(7)换液

第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有10％血清替代物的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；

第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；

第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；

(8)收获原代细胞

细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；

原代细胞收获

配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。

去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；

洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；

消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；

终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入间充质干细胞培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管如50ml离心管中离心；

(9)原代细胞传代(P0传P1)

将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；

将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的干细胞培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。

种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml；

按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞；

间充质干细胞旁分泌因子的获取：

选取P3-P6代次的间充质干细胞，所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)；

选取P3-P6代次的间充质干细胞，除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水，加入含有5wt％血清替代物的高糖DMEM培养基，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度的低氧的培养箱中，培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％，继续培养48h，后收集间充质干细胞旁分泌因子悬液；

将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入离心管，离心收取上清液，然后无菌滤器除菌过滤，即得所述用于治疗疼痛的间充质干细胞旁分泌因子。

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