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CN110777147A - 一种ikzf3基因沉默的t细胞及其应用 - Google Patents

一种ikzf3基因沉默的t细胞及其应用 Download PDF

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CN110777147A
CN110777147A CN201911202225.4A CN201911202225A CN110777147A CN 110777147 A CN110777147 A CN 110777147A CN 201911202225 A CN201911202225 A CN 201911202225A CN 110777147 A CN110777147 A CN 110777147A
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cell
ikzf3
ikzf3 gene
gene
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朱学锴
邹晏
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University of Shanghai for Science and Technology
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Abstract

本发明提供一种IKZF3基因干扰的核酸分子，所述IKZF3基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示，所述核酸分子为sgRNA，所述核酸分子的序列选自SEQ ID NO：2~4中的任意一种或多种。本发明还提供一种T细胞，所述T细胞的IKZF3基因沉默。本发明提供了增强工程化T细胞功能的方法以及该方法所获得的细胞药物，使用该方法，可以使得工程化T细胞分泌更多细胞因子、使工程化T细胞具有更强的细胞杀伤能力、以及使工程化T细胞具有更高的细胞扩增倍数和更久的细胞存续。

Description

一种IKZF3基因沉默的T细胞及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地属于肿瘤的免疫治疗领域，涉及一种IKZF3基因沉默的T细胞及其应用。
背景技术
CAR-T细胞疗法是一种使用基因修饰后表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞清除肿瘤细胞的免疫疗法。CAR是CAR-T细胞的核心部件，它由抗原结合域(通常为来源于抗体的scFv)、铰链和跨膜区、T细胞受体的胞内信号区和共刺激受体的胞内信号区串联组成，单链抗体scFv能够特异性结合肿瘤相关抗原，跨膜区和胞内信号结构域可以帮助T细胞激活，而共刺激信号可以维持T细胞的增殖。
目前的研究和临床试验表明CAR-T细胞在血液恶性肿瘤的治疗中取得了优异的成绩，但是未能在实体瘤治疗中有所进展。CAR-T细胞疗法在实体肿瘤的治疗应用中主要遇到三个障碍:首先难以获得适当的肿瘤特异性或相关抗原；其次过继输注的CAR-T细胞难以向肿瘤位点转移；最后肿瘤位点存在免疫抑制作用的肿瘤微环境又会对进入肿瘤微环境中的T细胞造成免疫抑制，因此CAR-T细胞治疗在实体瘤中仅体现出有限的治疗效果。
CAR-T细胞在产生免疫应答过程中会与环境中的不同细胞或者不同因子发生相互作用，其功能由CAR-T细胞膜上受体和细胞内的多种分子共同参与进行调控。比如近期发现，CAR的结构、腺苷A2A受体、蛋白激酶PKA、TET2、转录因子Runx3、转录因子NR4A等均显著影响CAR-T细胞的抗肿瘤功能。发现调控CAR-T细胞功能的新靶点并阐明其作用机制是提高CAR-T细胞治疗实体瘤疗效的关键突破口。
转录因子Ikaros和Aiolos分别由IKZF1和IKZF3基因编码，属于Ikaros家族蛋白。主要在造血谱系细胞中表达，为造血特异性锌指转录因子。它们是淋巴细胞分化的重要调节剂，在调节B和T细胞发育中起关键作用。Ikaros家族成员可以在不同环境中充当转录激活因子或抑制因子。比如，Aiolos和Ikaros通过与编码IL-2的基因座相互作用并触发表观遗传变化来限制其对其他转录因子的可及性，是T细胞中IL2启动子的负调节剂，抑制小鼠T细胞和人类T细胞中IL-2的表达。实验表明，下调T细胞中的IKZF1或者IKZF3基因表达后，可以增强T细胞的IL-2分泌。
Ikaros家族的蛋白质N末端共享一个DNA结合结构域，该结构域识别包含GGGA核心基序的DNA序列。Ikaros家族的蛋白质C末端对其二聚化至关重要，可以彼此相互作用形成异二聚体，这可能是调节其功能所必需的。Ikaros家族的转录因子控制着其靶基因的表观遗传状态，通过锚定一组调节目标基因中染色质重塑和组蛋白去乙酰化的蛋白质复合物来控制基因表达，也可以通过独立于染色质重塑和组蛋白脱乙酰化的机制抑制基因表达。
人类Aiolos位于13、17号染色体上，由509个氨基酸组成。Aiolos在淋巴祖细胞中微弱表达，当这些祖细胞被限制在T或B淋巴细胞分化路径时Aiolos表达会上调。在正常B细胞和白血病B细胞中都发现了人类Aiolos的多种异构体。Aiolos在造血作用的不同阶段的表达方式与Ikaros不同，二者相对量的变化对于T或B淋巴分化阶段的进展可能很重要。
Aiolos在DNA结合、激活和二聚化结构域方面与Ikaros具有高度相似性，但对转录的影响是不同的，Aiolos在哺乳动物细胞中是更强的激活剂。Aiolos可以形成同源二聚体，也可以通过在其C末端域的锌指介导的相互作用与其他蛋白质形成复合物。Aiolos同二聚体是有效的转录激活因子，而Aiolos-Ikaros异二聚体的活性范围表现为从低活性到活性无法检测。另外，Aiolos可以通过其C末端锌指介导的相互作用与Foxp3形成复合物。
关于Aiolos失调对人类恶性肿瘤的影响尚不明确。在敲除Aiolos的小鼠中，淋巴样细胞数量正常，但B细胞前体会增加，长期活化的B细胞会产生自体抗体，并且有很高可能性会发展出B细胞淋巴瘤。临床上，在用骨髓瘤药物来那度胺治疗的原代人T细胞中，IKaro和Aiolos蛋白水平均显着降低，似乎说明在成熟T细胞中缺失Aiolos是安全的。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种IKZF3基因沉默的T细胞及其应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种IKZF3基因干扰的核酸分子，所述IKZF3基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二方面提供了一种IKZF3基因干扰核酸构建体，含有编码前述所述的核酸分子中的基因片段，能表达所述核酸分子。
本发明的第三方面提供了一种IKZF3基因干扰慢病毒，由前述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
本发明的第四方面提供了前述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或前述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或前述的IKZF3基因干扰慢病毒在制备T细胞活性促进剂中的用途。
本发明的第五方面提供了一种T细胞活性促进剂，其有效物质含有前述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或前述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或前述的IKZF3基因干扰慢病毒。
本发明的第六方面提供了一种T细胞的制备方法或提高T细胞活性的方法，为将T细胞的IKZF3基因沉默。
本发明的第七方面提供了一种T细胞，所述T细胞的IKZF3基因沉默。
本发明的第八方面提供了前述的IKZF3基因干扰的核酸分子，或前述的IKZF3基因干扰核酸构建体，或前述的IKZF3基因干扰慢病毒施用于T细胞，或前述的T细胞，在以下任一种或多种用途中的应用：(1)制备肿瘤治疗药物；(2)提高T细胞分泌细胞因子的能力；(3)提高T细胞的杀伤效率；(4)增加T细胞扩增倍数；(5)延长T细胞存续时间。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了增强工程化T细胞功能的方法以及该方法所获得的细胞药物，使用该方法，可以使得工程化T细胞分泌更多细胞因子、使工程化T细胞具有更强的细胞杀伤能力、以及使工程化T细胞具有更高的细胞扩增倍数和更久的细胞存续。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明中使用的CD133-CAR PiggyBac transposon表达载体结构图。
图2为本发明中使用的特异性敲除人IKZF3基因的pGL3-U6-IKZF3sgRNA(2+3)表达载体结构图。
图3为本发明中使用的pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP表达载体结构图。
图4为本发明中使用的HER2-CAR PiggyBac transposon表达载体结构图。
图5本发明中使用的T7E1酶切鉴定sgRNA/Cas9介导的人IKZF3基因特异性切割结果图。
图6为本发明实施例7中制得的未进行IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞(图6a,CD133-CAR)、HER2-CAR T细胞(图6b,HER2-CAR)和IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞(图6a,CD133-CAR-IKZF3ko)、IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞(图6b,HER2-CAR-IKZF3ko)中CAR表达率的对比结果图。
图7为本发明实施例7中制得的IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞(图7a,CD133-CAR-IKZF3ko)和IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞(图7b,HER2-CAR-IKZF3ko)中IKZF3基因特异性切割结果测序图。
图8a为本发明实施例7中制得的IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞和未进行IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞与靶细胞U251-CD133OE共培养24小时后检测上清中细胞因子IL-2，TNF-α，GM-CSF的分泌情况。
图8b为本发明实施例7中制得的IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞和未进行IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞与靶细胞MDA-MB-453共培养24小时后检测上清中细胞因子IL-2，TNF-α的分泌情况。
图9a为本发明实施例7中制得的IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞和未进行IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞与靶细胞U251-CD133OE-luc共培养3,5,7天后检测靶细胞裂解情况。
图9b为本发明实施例7中制得的IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞和未进行IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞与靶细胞453-luc共培养1,2,3天后检测靶细胞裂解情况。
图10为本发明实施例7中制得的IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞和未进行IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞与辐照后靶细胞U251-CD133OE共培养4天后通过CFSE标记检测两种CAR T细胞的体外增殖情况。
图11a为本发明实施例7中制得的IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞和未进行IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞与靶细胞U251-CD133OE-luc共培养7天后通过RTCAxCELLigence系统检测两种CAR T细胞体外长时间抑瘤情况。
图11b为本发明实施例7中制得的IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞和未进行IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞与靶细胞453-luc共培养7天后通过RTCA xCELLigence系统检测两种CAR T细胞体外长时间抑瘤情况。
ns代表无明显差异,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术、基因突变技术及相关领域的常规技术。
本发明提供了IKZF3基因干扰的核酸分子。
所述IKZF3基因的Genbank号为22806。
所述IKZF3基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示。
具体的，
ATGGAAGATATACAAACAAATGCGGAACTGAAAAGCACTCAGGAGCAGTCTGTGCCCGCAGAAAGTGCAGCGGTTTTGAATGACTACAGTTTAACCAAATCTCATGAAATGGAAAATGTGGACAGTGGAGAAGGCCCAGCCAATGAAGATGAAGACATAGGAGATGATTCAATGAAAGTGAAAGATGAATACAGTGAAAGAGATGAGAATGTTTTAAAGTCAGAACCCATGGGAAATGCAGAAGAGCCTGAAATCCCTTACAGCTATTCAAGAGAATATAATGAATATGAAAACATTAAGTTGGAGAGACATGTTGTCTCATTCGATAGTAGCAGGCCAACCAGTGGAAAGATGAACTGCGATGTGTGTGGATTATCCTGCATCAGCTTCAATGTCTTAATGGTTCATAAGCGAAGCCATACTGGTGAACGCCCATTCCAGTGTAATCAGTGTGGGGCATCTTTTACTCAGAAAGGTAACCTCCTCCGCCACATTAAACTGCACACAGGGGAAAAACCTTTTAAGTGTCACCTCTGCAACTATGCATGCCAAAGAAGAGATGCGCTCACGGGGCATCTTAGGACACATTCTGTGGAGAAACCCTACAAATGTGAGTTTTGTGGAAGGAGTTACAAGCAGAGAAGTTCCCTTGAGGAGCACAAGGAGCGCTGCCGTACATTTCTTCAGAGCACTGACCCAGGGGACACTGCAAGTGCGGAGGCAAGACACATCAAAGCAGAGATGGGAAGTGAAAGAGCTCTCGTACTGGACAGATTAGCAAGCAATGTGGCAAAACGAAAAAGCTCAATGCCTCAGAAATTCATTGGTGAGAAGCGCCACTGCTTTGATGTCAACTATAATTCAAGTTACATGTATGAGAAAGAGAGTGAGCTCATACAGACCCGCATGATGGACCAAGCCATCAATAACGCCATCAGCTATCTTGGCGCCGAAGCCCTGCGCCCCTTGGTCCAGACACCGCCTGCTCCCACCTCGGAGATGGTTCCAGTTATCAGCAGCATGTATCCCATAGCCCTCACCCGGGCTGAGATGTCAAACGGTGCCCCTCAAGAGCTGGAAAAGAAAAGCATCCACCTTCCAGAGAAGAGCGTGCCTTCTGAGAGAGGCCTCTCTCCCAACAATAGTGGCCACGACTCCACGGACACTGACAGCAACCATGAAGAACGCCAGAATCACATCTATCAGCAAAATCACATGGTCCTGTCTCGGGCCCGCAATGGGATGCCACTTCTGAAGGAGGTTCCCCGCTCTTACGAACTCCTCAAGCCCCCGCCCATCTGCCCAAGAGACTCCGTCAAAGTGATCAACAAGGAAGGGGAGGTGATGGATGTGTATCGGTGTGACCACTGCCGCGTCCTCTTCCTGGACTATGTGATGTTCACGATTCACATGGGCTGCCACGGCTTCCGTGACCCTTTCGAGTGTAACATGTGTGGATATCGAAGCCATGATCGGTATGAGTTCTCGTCTCACATAGCCAGAGGAGAACACAGAGCCCTGCTGAAGTGA(SEQ ID NO：1)
所述IKZF3基因来源于人。
进一步的，所述核酸分子为sgRNA，所述核酸分子的序列选自SEQ ID NO：2-4中中的任一种或多种。
具体的，GTTTTAAAGTCAGAACCCAT(SEQ ID NO：2)；
GAATAGCTGTAAGGGATTTC(SEQ ID NO：3)；
GATAGTAGCAGGCCAACCAG(SEQ ID NO：4)
将所述sgRNA和CAS9蛋白在细胞内表达后，CAS9和sgRNA组成RNA-protein复合体(RNP)。其中所述sgRNA通过RNA-DNA碱基互补配对原则，将此RNP定位到IKZF3基因的特定位置，这时，CAS9将发挥其核酸内切酶的特性，在碱基互补配对的位置上对IKZF3基因进行切割，形成DNA双链断裂。进而，特异性敲除细胞内源性IKZF3基因表达。
本发明的IKZF3基因干扰核酸构建体，含有编码前述所述的核酸分子中的基因片段，能表达所述核酸分子。
所述的人IKZF3基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人IKZF3基因sgRNA的基因片段克隆入已知载体获得。
进一步地，所述IKZF3基因干扰核酸构建体选自病毒载体或质粒载体。
本发明实施例具体列举了以pGL3-U6-IKZF3sgRNA1、pGL3-U6-IKZF3sgRNA2和pGL3-U6-IKZF3sgRNA3质粒为载体构建的人IKZF3基因干扰质粒。
更进一步地，所述IKZF3基因干扰核酸构建体选自IKZF3基因干扰慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、AAV。
本发明的IKZF3基因干扰慢病毒载体是将编码前述IKZF3基因sgRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述IKZF3基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染细胞，进而通过转录、通过酶切加工等步骤，最终获得所述sgRNA，用于特异性沉默IKZF3基因的表达。
进一步的，所述IKZF3基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。
本发明的IKZF3基因sgRNA可用于敲低T胞的IKZF3，进一步地可以用作提高T细胞活性的促进剂。IKZF3基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述IKZF3基因sgRNA。当用作提高T细胞活性的促进剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于免疫细胞。具体剂量还应考虑具体情况，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的IKZF3基因干扰慢病毒，由前述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
本发明的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或前述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或前述的IKZF3基因干扰慢病毒可用于制备T细胞活性促进剂。
所述T细胞活性促进剂是指对T细胞具有活性促进效果的分子。具体的，相比促进前，T细胞活力提高至少10％，较佳的提高至少30％，再佳的提高至少50％，更佳的提高至少70％，最佳的提高至少90％。
所述T细胞活性的促进剂用于作用于T细胞，降低T细胞中IKZF3基因的表达，获得的T细胞具有以下功能中的一种或多种：(1)提高T细胞分泌细胞因子的能力；(2)提高T细胞的杀伤效率；(3)增加T细胞扩增倍数；(4)延长T细胞存续时间。
所述T细胞可以选自嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞，T细胞受体T(TCR-T)细胞或肿瘤浸润T细胞(TIL)。
所述T细胞为工程化T细胞。
所述T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)分子。
进一步的，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区中的至少一种。
所述的胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤抗原的抗体。
所述的肿瘤抗原包括(但不限于)：CD133和HER2中的至少一种。
本发明的T细胞活性促进剂，其有效物质含有前述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或前述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或前述的IKZF3基因干扰慢病毒。
所述T细胞活性促进剂还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在制备这些促进剂时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
本发明的T细胞的制备方法或提高T细胞活性的方法，为将T细胞的IKZF3基因沉默。
基因沉默(gene silencing)是指生物体中特定基因不表达或者是表达减少的现象。
进一步的，可以通过反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA、大范围核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR系统靶向IKZF3基因中的靶序列使IKZF3基因沉默。
所述IKZF3基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示。
在一种实施方式中，可以将前述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或前述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或前述的IKZF3基因干扰慢病毒施用于T细胞，降低T细胞中IKZF3基因的表达。从而制备出所述T细胞或提高T细胞的活性。
在一种实施方式中，可以将SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中的任一种或多种核酸分子施用于T细胞。
所述提高T细胞活性包括但不限于以下功能的一种或多种：(1)增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤力；2)提高T细胞分泌细胞因子的能力；(3)提高T细胞的杀伤效率；(4)增加T细胞扩增倍数；(5)延长T细胞存续时间。
本发明的T细胞，所述T细胞的IKZF3基因沉默。
可以通过反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA、大范围核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR系统靶向IKZF3基因中的靶序列使IKZF3基因沉默。
在一种实施方式中，所述T细胞中含有如前述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或前述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或前述的IKZF3基因干扰慢病毒。
所述T细胞选自嵌合抗原受体T细胞，T细胞受体T细胞或肿瘤浸润T细胞。
所述T细胞为工程化T细胞。
所述T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)分子。
进一步的，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区中的至少一种。
所述的胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤抗原的抗体。
所述的肿瘤抗原包括(但不限于)：CD133和HER2中的至少一种。
所述T细胞可通过CAR-T技术用于治疗肿瘤或自身免疫疾病。
前述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或前述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或前述的IKZF3基因干扰慢病毒施用于T细胞，和/或前述的T细胞，可用于以下任一种或多种用途中：(1)制备肿瘤治疗药物；(2)提高T细胞分泌细胞因子的能力；(3)提高T细胞的杀伤效率；(4)增加T细胞扩增倍数；(5)延长T细胞存续时间。
采用所述肿瘤治疗药物，作用于待测对象，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
所述药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述药物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
本发明的用于疾病治疗的细胞药物，其包括所述的IKZF3基因沉默的工程化T细胞。
所述的疾病具备难治或者复发的特征。
经过所述的细胞药物治疗，可以延长病人的生存期。
所述的疾病可为肿瘤或者癌症。
采用该药物作用于待测对象，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
所述药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述药物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
本发明还提供一种治疗方法，包括给病人施加前述的细胞药物。
所述的细胞药物可通过静脉注射或者原位给药提供给病人。
所述的细胞药物按照能够增强治疗效果的量提供。
本发明还提供一种提高免疫治疗效果的方法，包括使用所述的增强工程化T细胞功能的方法或者给病人所述的细胞药物。
采用本发明所述的提高的T细胞活性方法、提高免疫治疗效果的方法可被用于治疗的或非治疗目的。
实施例1
本实施例提供CRISPR/Cas9特异性敲除人IKZF3基因中用于特异性靶向IKZF3基因的sgRNA的设计和合成
1.靶向人IKZF3基因的sgRNA的设计
(1)在IKZF3基因上选择5’-N(21)GG的序列。
(2)sgRNA在IKZF3基因上的靶向位点位于基因的外显子，这样更容易引起片段的缺失或移框突变，从而达到基因完全失活的目的。
(3)sgRNA在IKZF3基因上的靶向位点位于不同剪切子的共有外显子上。
(4)在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一，减少潜在的脱靶位点。
基于以上原则，本领域专业人员可以自行设计若干条靶向人IKZF3基因的sgRNA。
2.靶向人IKZF3基因的sgRNA的选择
(1)靶向人IKZF3基因的sgRNA的靶序列在IKZF3基因上不能离ATG起始子太近，防止转录会从下游另一个ATG开始而出现一个被截短的转录子，不能保证基因完全失活。
(2)sgRNA在IKZF3基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能结构域中。
(3)在IKZF3基因上选择相隔一定距离(10～100)成对的位点，利于形成特异性的片段缺失和降低脱靶效应。
根据以上方法，在靶向人IKZF3基因的包含PAM序列的sgRNA中我们选择了3个(分别如序列表SEQ ID NO.2、3、4所示)进行后续实验。
3.靶向人IKZF3基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和构建
根据选择的3个序列(分别如序列表SEQ ID NO.2、3、4所示)，在其5’加上ACCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)；根据选择的sgRNA，获得其互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)。正向寡核苷酸和反向寡核苷酸由苏州金唯智生物科技有限公司采用常规方法合成。将合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward oligo和Reverseoligo成对变性、退火，形成可以连入U6真核表达载的双链sgRNA寡聚核苷酸。
变性、退火体系为：
2.5μl Forward oligo(100uM)
2.5μl Reverse oligo(100uM)
1μl NEB buffer2
4μl灭菌水
在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。
选择的第1个sgRNA(如序列表SEQ ID NO.2所示)，其Forward oligo和Reverseoligo(分别如序列表SEQ ID NO.5、6所示)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
选择的第2个sgRNA(如序列表SEQ ID NO.3所示)，其Forward oligo和Reverseoligo(分别如序列表SEQ ID NO.7、8所示)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
选择的第3个sgRNA(如序列表SEQ ID NO.4所示)，其Forward oligo和Reverseoligo(分别如序列表SEQ ID NO.9、10所示)成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
实施例2
利用CRISPR/Cas9特异性敲除人IKZF3基因(用于靶向IKZF3基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO.2所示)
1.线性化序列如序列表SEQ ID NO.11所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA
1μl CutSmart Buffer
1μl BsaI(NEB,R0535V)
补水至50ul,37℃孵育3-4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切完成后用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化回收至20-50μl灭菌水中。
2.将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.5、6所示)与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-IKZF3sgRNA1质粒。
连接体系如下：
3μl,50μM退火产物(双链sgRNA寡聚核苷酸，其Forward oligo如序列表SEQ IDNO.5所示，其Reverse oligo如序列表SEQ ID NO.6所示)
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA(25ng/μl)
1μl T4ligation buffer
0.5μl T4ligase(NEB,M0202S)
0.45μl灭菌水
16℃孵育1小时
3.将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞(Takara,9057)并涂Amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。
4. 37℃摇床摇菌过夜培养，并用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN,12123)抽提质粒。
5.用序列表SEQ ID NO.12所示的通用引物RVP3，用常规测序方法鉴定获得序列正确的pGL3-U6-IKZF3sgRNA1质粒(如序列表SEQ ID NO.13所示)。
6.细胞培养与转染
(1)HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养基中(Cellgro,10-092-CVRC)，其中含有10％FBS,penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml).
(2)在转染前分至24孔板中，待70％～80％密度时进行转染。
(3)按照Lipofectamin3000Transfection Reagent(Invitrogen,L3000015)的操作手册，将250ng pGL3-U6-IKZF3sgRNA1质粒(如序列表SEQ ID NO.13所示)与250ngpST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(如序列表SEQ ID NO.14所示)混匀，共转染至每孔细胞中，第二天加入Puromycin(Invitrogen,A1113803)药筛，48小时后收细胞。
质粒pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP的制备方法参见文献Shen et al.2013,Generationof genemodified mice via Cas9RNA-mediated gene targeting.CellResearch 23,720-723.(doi:10.1038/cr.2013.46).
7.T7E1酶切验证
(1)将收集的细胞用DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN,69504)进行基因组DNA抽提。
(2)使用引物geno_For和geno_Rev(如序列表SEQ ID NO.15、16所示)进行PCR扩增，用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化获得回收产物，按照NEB T7E1酶使用方法取200ng统一稀释到19μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。
(3)在20μl体系中加入1μl T7E1，37℃酶切15分钟后，加入4μl 6X Gel loadingdye(NEB,B7025S)，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例3
利用CRISPR/Cas9特异性敲除人IKZF3基因(用于靶向IKZF3基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO.3所示)
1.线性化序列如序列表SEQ ID NO.11所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA
1μl CutSmart Buffer
1μl BsaI(NEB,R0535V)
补水至50ul,37℃孵育3-4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化回收至20-50μl灭菌水中。
2.将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.7、8所示)与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒。
连接体系如下：
3μl,50μM退火产物(双链sgRNA寡聚核苷酸，其Forward oligo如序列表SEQ IDNO.7所示，其Reverse oligo如序列表SEQ ID NO.8所示)
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA(25ng/μl)
1μl T4ligation buffer
0.5μl T4ligase(NEB,M0202S)
0.45μl灭菌水
16℃孵育1小时
3.将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞(Takara,9057)并涂Amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。
4. 37℃摇床摇菌过夜培养，并用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN,12123)抽提质粒。
5.用序列表SEQ ID NO.12所示的通用引物RVP3，用常规测序方法鉴定获得序列正确的pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒(如序列表SEQ ID NO.17所示)。
6.细胞培养与转染
(1)HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养基中(Cellgro,10-092-CVRC)，其中含有10％FBS,penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml).
(2)在转染前分至24孔板中，待70％～80％密度时进行转染。
(3)按照Lipofectamin3000Transfection Reagent(Invitrogen,L3000015)的操作手册，将250ng pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒(如序列表SEQ ID NO.17所示)与250ngpST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(如序列表SEQ ID NO.14所示)混匀，共转染至每孔细胞中，第二天加入Puromycin(Invitrogen,A1113803)药筛，48小时后收细胞。
质粒pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP的制备方法参见文献Shen et al.2013,Generation of genemodified mice via Cas9RNA-mediated gene targeting.CellResearch 23,720-723.(doi:10.1038/cr.2013.46).
7.T7E1酶切验证
(1)将收集的细胞用DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN,69504)进行基因组DNA抽提。
(2)使用引物geno_For和geno_Rev(如序列表SEQ ID NO.15、16所示)进行PCR扩增，用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化获得回收产物，按照NEB T7E1酶使用方法取200ng统一稀释到19μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。
(3)在20μl体系中加入1μl T7E1，37℃酶切15分钟后，加入4μl 6X Gel loadingdye(NEB,B7025S)，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例4
利用CRISPR/Cas9特异性敲除人IKZF3基因(用于靶向IKZF3基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO.4所示)
1.线性化序列如序列表SEQ ID NO.11所示的pGL3-U6-sgRNA质粒
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA
1μl CutSmart Buffer
1μl BsaI(NEB,R0535V)
补水至50ul,37℃孵育3-4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化回收至20-50μl灭菌水中。
2.将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.9、10所示)与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-IKZF3sgRNA3质粒
连接体系如下：
3μl,50μM退火产物(双链sgRNA寡聚核苷酸，其Forward oligo如序列表SEQ IDNO.9所示，其Reverse oligo如序列表SEQ ID NO.10所示)
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA(25ng/μl)
1μl T4ligation buffer
0.5μl T4ligase(NEB,M0202S)
0.45μl灭菌水
16℃孵育1小时
3.将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞(Takara,9057)并涂Amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。
4. 37℃摇床摇菌过夜培养，并用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN,12123)抽提质粒。
5.用序列表SEQ ID NO.12所示的通用引物RVP3，用常规测序方法鉴定获得序列正确的pGL3-U6-IKZF3sgRNA3质粒(如序列表SEQ ID NO.18所示)。
6.细胞培养与转染
(1)HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养基中(Cellgro,10-092-CVRC)，其中含有10％FBS,penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml).
(2)在转染前分至24孔板中，待70％～80％密度时进行转染。
(3)按照Lipofectamin3000Transfection Reagent(Invitrogen,L3000015)的操作手册，将250ng pGL3-U6-IKZF3sgRNA3质粒(如序列表SEQ ID NO.18所示)与250ngpST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(如序列表SEQ ID NO.14所示)混匀，共转染至每孔细胞中，第二天加入Puromycin(Invitrogen,A1113803)药筛，48小时后收细胞。
质粒pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP的制备方法参见文献Shen et al.2013,Generation of genemodified mice via Cas9RNA-mediated gene targeting.CellResearch 23,720-723.(doi:10.1038/cr.2013.46).
7.T7E1酶切验证
(1)将收集的细胞用DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN,69504)进行基因组DNA抽提。
(2)使用引物geno_For和geno_Rev(如序列表SEQ ID NO.15、16所示)进行PCR扩增，用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化获得回收产物，按照NEB T7E1酶使用方法取200ng统一稀释到19μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。
(3)在20μl体系中加入1μl T7E1，37℃酶切15分钟后，加入4μl 6X Gel loadingdye(NEB,B7025S)，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例5
利用CRISPR/Cas9特异性敲除人IKZF3基因。用于靶向IKZF3基因的gRNA为两个sgRNA共靶向，pGL3-U6-IKZF3sgRNA1和pGL3-U6-IKZF3sgRNA2其序列如序列表SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.17所示，这两个sgRNA在IKZF3基因上的靶向起始位点相距25bp，可显著提高敲除效率。如图5所示，#1+2表示pGL3-U6-IKZF3sgRNA1和pGL3-U6-IKZF3sgRNA2共靶向IKZF3基因，比pGL3-U6-IKZF3sgRNA1单靶向(图例为#1)或pGL3-U6-IKZF3sgRNA2单靶向(图例为#2)有更高IKZF3基因编辑效率。
1.线性化序列如SEQ ID NO.11所示的pGL3-U6-sgRNA质粒
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA
1μl CutSmart Buffer
1μl BsaI(NEB,R0535V)
补水至50ul,37℃孵育3-4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化回收至20-50μl灭菌水中。
2.将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸(其
Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.5、6和序列表SEQID NO.7、8所示)与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-IKZF3sgRNA1质粒和pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒
连接体系如下：
3μl,50μM退火产物
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA(25ng/μl)
1μl T4ligation buffer
0.5μl T4ligase(NEB,M0202S)
0.45μl灭菌水
16℃孵育1小时
3.将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞(Takara,9057)并涂Amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。
4. 37℃摇床摇菌过夜培养，并用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN,12123)抽提质粒。
5.用序列表SEQ ID NO.12所示的通用引物RVP3，用常规测序方法鉴定获得序列正确的pGL3-U6-IKZF3sgRNA1质粒和pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒(如序列表SEQ ID NO.13和序列表SEQ ID NO.17所示)。
6.细胞培养与转染
(1)HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养基中(Cellgro,10-092-CVRC)，其中含有10％FBS,penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml).
(2)在转染前分至24孔板中，待70％～80％密度时进行转染。
(3)按照Lipofectamin3000Transfection Reagent(Invitrogen,L3000015)的操作手册，将125ng pGL3-U6-IKZF3sgRNA1质粒(如序列表SEQ ID NO.13所示)、125ng pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒(如序列表SEQ ID NO.17所示)与250ng pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(如序列表SEQ ID NO.14所示)混匀，共转染至每孔细胞中，第二天加入Puromycin(Invitrogen,A1113803)药筛，48小时后收细胞。
质粒pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP的制备方法参见文献Shen et al.2013,Generation of genemodified mice via Cas9RNA-mediated gene targeting.CellResearch 23,720-723.(doi:10.1038/cr.2013.46).
7.T7E1酶切验证
(1)将收集的细胞用DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN,69504)进行基因组DNA抽提。
(2)使用引物geno_For和geno_Rev(如序列表SEQ ID NO.15、16所示)进行PCR扩增，用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化获得回收产物，按照NEB T7E1酶使用方法取200ng统一稀释到19μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。
(3)在20μl体系中加入1μl T7E1，37℃酶切15分钟后，加入4μl 6X Gel loadingdye(NEB,B7025S)，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例6
利用CRISPR/Cas9特异性敲除人IKZF3基因。用于靶向IKZF3基因的sgRNA为两个sgRNA共靶向，pGL3-U6-IKZF3sgRNA2和pGL3-U6-IKZF3sgRNA3其序列如序列表SEQ IDNO.17和序列表SEQ ID NO.18所示，这两个sgRNA在IKZF3基因上的靶向起始位点相距89bp，可显著提高敲除效率。如图5所示，#2+3表示pGL3-U6-IKZF3sgRNA2和pGL3-U6-IKZF3sgRNA3共靶向IKZF3基因，比pGL3-U6-IKZF3sgRNA2单靶向(图例为#2)或pGL3-U6-IKZF3sgRNA3单靶向(图例为#3)有更高IKZF3基因编辑效率。
1.线性化序列如序列表SEQ ID NO.11所示的pGL3-U6-sgRNA质粒
酶切体系和条件如下：
2μg pGL3-U6-sgRNA
1μl CutSmart Buffer
1μl BsaI(NEB,R0535V)
补水至50ul,37℃孵育3-4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化回收至20-50μl灭菌水中。
2.将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸(其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO.7、8和序列表SEQ ID NO.9、10所示)与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒和pGL3-U6-IKZF3sgRNA3质粒
连接体系如下：
3μl,50μM退火产物
1μl线性化的pGL3-U6-sgRNA(25ng/μl)
1μl T4ligation buffer
0.5μl T4ligase(NEB,M0202S)
0.45μl灭菌水
16℃孵育1小时
3.将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞(Takara,9057)并涂Amp+平板(50μg/ml)，并挑取克隆。
4. 37℃摇床摇菌过夜培养，并用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN,12123)抽提质粒。
5.用序列表SEQ ID NO.12所示的通用引物RVP3，用常规测序方法鉴定获得序列正确的pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒和pGL3-U6-IKZF3sgRNA3质粒(如序列表SEQ ID NO.17和序列表SEQ ID NO.18所示)。
6.细胞培养与转染
(1)HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养基中(Cellgro,10-092-CVRC)，其中含有10％FBS,penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml).
(2)在转染前分至24孔板中，待70％～80％密度时进行转染。
(3)按照Lipofectamin3000Transfection Reagent(Invitrogen,L3000015)的操作手册，将125ng pGL3-U6-IKZF3sgRNA2质粒(如序列表SEQ ID NO.17所示)、125ng pGL3-U6-IKZF3sgRNA3质粒(如序列表SEQ ID NO.18所示)与250ng pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(如序列表SEQ ID NO.14所示)混匀，共转染至每孔细胞中，第二天加入Puromycin(Invitrogen,A1113803)药筛，48小时后收细胞。
质粒pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP的制备方法参见文献Shen et al.2013,Generation of genemodified mice via Cas9RNA-mediated gene targeting.CellResearch 23,720-723.(doi:10.1038/cr.2013.46).
7.T7E1酶切验证
(1)将收集的细胞用DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN,69504)进行基因组DNA抽提。
(2)使用引物geno_For和geno_Rev(如序列表SEQ ID NO.15、16所示)进行PCR扩增，用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化获得回收产物，按照NEB T7E1酶使用方法取200ng统一稀释到19μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。
(3)在20μl体系中加入1μl T7E1，37℃酶切15分钟后，加入4μl 6X Gel loadingdye(NEB,B7025S)，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例7
本实施例提供制备CAR T细胞和靶细胞的详细方案。
1.将PBMC(ALLCELLS，PB005F)用T细胞培养基[含10％FBS(ThermoFisher,10091148)的RPMI 1640(ThermoFisher,11875093)培养基]稍加培养1至2个小时后进行电转，分别转染以下四组：
(1)将CD133-CAR piggyBac transposon(结构如图1，序列如序列表SEQ IDNO.20)、pGL3-U6-IKZF3sgRNA(2+3)(结构如图2所示)、pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(结构如图3，序列如序列表SEQ ID NO.14)、和Super piggyBac transposase(SystemBiosciences,PB200PA-1)四个质粒各5μg与人T细胞核转染试剂盒(Lonza,VPA-1002)中的电转缓冲液混合，获得包含该四种质粒的大约110μl电转混合液；
(2)以包含pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(结构如图3，序列如序列表SEQ IDNO.14)、CD133-CAR piggyBac transposon(结构如图1，序列如序列表SEQ ID NO.20)和Super piggyBac transposase(System Biosciences,PB200PA-1)三个质粒的电转混合液作为对照；
(3)将HER2-CAR piggyBac transposon(结构如图4，序列如序列表SEQ IDNO.21)、pGL3-U6-IKZF3sgRNA(2+3)(结构如图2所示)、pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(结构如图3，序列如序列表SEQ ID NO.14)、和Super piggyBac transposase(SystemBiosciences,PB200PA-1)四个质粒各5μg与人T细胞核转染试剂盒(Lonza,VPA-1002)中的电转缓冲液混合，获得包含该四种质粒的大约110μl电转混合液；
(4)以包含pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP(结构如图3，序列如序列表SEQ IDNO.14)、HER2-CAR piggyBac transposon(结构如图4，序列如序列表SEQ ID NO.21)和Super piggyBac transposase(System Biosciences,PB200PA-1)三个质粒的电转混合液作为对照；
以上两个步骤中使用的质粒pGL3-U6-IKZF3sgRNA(2+3)和pST1347-NLS-flag-Cas9-ZF-EGFP的制备方法参见文献Su et al.2016,CRISPR-Cas9mediated efficient PD-1disruption on human primary T cells from cancer patients.Scientific Reports.(doi:10.1038/srep20070).
质粒CD133-CAR piggyBac transposon的制备方法参见文献Zhu,X.,et al.2015,Patient-derived glioblastoma stem cells are killed by CD133-specific CAR Tcells but induce the T cell aging marker CD57.Oncotarget,6(1):p.171-84.(doi:10.18632/oncotarget.2767)。在质粒CD133-CAR piggyBac transposon的基础上，通过基因合成和常规分子克隆的方法，将CD133-CAR中的scFv序列替换为抗ERBB2的scFv序列，获得HER2-CAR piggyBac transposon质粒载体。具体地，抗ERBB2的scFv序列来自克隆4D5，根据克隆需要，在其后加入AAGSEQKLISE氨基酸序列，并由苏州金唯智生物科技有限公司将氨基酸序列人源化优化后，采用常规方法合成相应的DNA。进一步设计上游PCR引物5’-GCtctagaGCCACC-3’(SEQ ID NO.22)和下游引物5’-GAagatctTC-3’(SEQ ID NO.23)，包含限制性内切酶XbaI和BglII识别位点、部分载体序列和scFv序列，然后通过XbaI和BglII将scFv基因克隆至转座子载体中。本实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。质粒CD133-CAR piggyBac transposon和HER2-CAR piggyBac transposon的序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示。
2.参考人T细胞核转染试剂盒(Lonza，VPA-1002)的说明书，用所述电转混合液悬起1-2×107个PBMC细胞进行电转，电转结束后立刻将细胞转入预热的T细胞培养基；2个小时后再次更换一次培养基。
3. 16-18小时后加入含100IU/ml的IL-2的T细胞培养基，用偶联有CD3/CD28抗体的磁珠(ThermoFisher SCIENTIFIC,11141D)刺激激活CD3阳性T细胞。
4.每2至3天更换新的含100IU/ml的IL-2的T细胞培养基，同时观察细胞扩增状况。根据其增殖状况决定其刺激时长，但刺激时间不超过一周。
5.分离去除磁珠后，加入1μg/ml嘌呤霉素继续培养5至7天。收取少量细胞用于检测，其余细胞可继续使用快速扩增法进一步大量扩增，得到IKZF3基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞(即IKZF3敲除的CD133-CAR T细胞)。
6.本发明以过表达CD133的人胶质瘤细胞系U251(U251-CD133OE)作为CD133-CART和IKZF3基因编辑的CD133-CAR T的靶细胞，U251-CD133OE的构建方法参考文献Prasad,S.,et al.2015,Effective Eradication of Glioblastoma Stem Cells by LocalApplication of an AC133/CD133-Specific T-cell-Engaging Antibody and CD8TCells.Cancer Res,75(11):p.2166-76.(doi:10.1158/0008-5472)。U251购自中国科学院细胞库。进一步参考以上文献构建稳定表达荧光素酶的靶细胞U251-CD133OE-luc。
7.本发明以人乳腺癌细胞系MDA-MB-453作为HER2-CAR T和IKZF3基因编辑的HER2-CAR T的靶细胞。MDA-MB-453细胞购自中科院细胞库。进一步参考以上文献构建稳定表达荧光素酶的靶细胞453-luc。
实施例8
利用流式细胞术检测CAR表达。
扩增得到的CAR-T细胞中取105个重悬于100μl FACS缓冲液(含2mM EDTA和0.5％BSA的PBS)中，在细胞悬液中加入PE标记的Myc-Tag(9B11)Mouse mAb(1:50稀释，CellSignaling,3739S)室温孵育30-60分钟。CytoFLEX(Beckman Coulter)流式细胞仪用于获取染色细胞，FlowJo用于分析结果。如图6所示，流式细胞分析显示未进行IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(图例为CD133-CAR)、HER2-CAR T(图例为HER2-CAR)细胞和IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(图例为CD133-CAR-IKZF3ko)、HER2-CAR T(图例为HER2-CAR-IKZF3ko)细胞均高表达CAR分子。图例NT表示实施例7中相同刺激培养方法扩增的未表达CAR的T细胞。
实施例9
细胞基因组提取与IKZF3基因编辑效率分析。
将收集的细胞用DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN,69504)进行基因组DNA抽提。使用引物geno_For和geno_Rev(如序列表SEQ ID NO.15、16所示)进行PCR扩增，用illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits(GE,28903470)纯化获得回收产物。将PCR产物连接进pGEM-T载体(Promega,A1360)，连接方法详见说明书。将连接产物转化至DH5α感受态细胞(Takara,9057)并涂Amp+，X-gal平板，并随机挑取20个白色克隆。使用通用引物T7(如序列表SEQ ID NO.19所示)进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。结果见图7。如图7a所示，在IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞中，IKZF3基因存在缺失突变，基因编辑的效率可达89％以上。如图7b所示，在IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞中，IKZF3基因存在缺失和插入突变，基因编辑的效率可达94％以上。
实施例10
IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞细胞因子释放结果评估。
本发明以过表达CD133的人胶质瘤细胞系U251(U251-CD133OE)作为靶细胞(来自实施例7)分别与效应细胞CD133-CAR T(来自实施例7)以及IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(来自实施例7)细胞共培养。具体地，在200μl培养体系中，加入5000个靶细胞U251-CD133OE，按照效靶比2:1、4:1分别加入效应细胞CD133-CAR T(来自实施例7，图例为8a,U251-CD133OE+CD133-CAR)或IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(来自实施例7，图例为8a,U251-CD133OE+CD133-CAR-IKZF3ko)，于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中共培养。24小时后使用ALPHA-LISA试剂盒(Perkinelmer,AL221C,AL208C,AL216C)检测培养上清中IL-2、TNF-α和GM-CSF细胞因子水平。如图8a所示，IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞(图例为8a,U251-CD133OE+CD133-CAR-IKZF3ko)分泌IL-2、TNF-α和GM-CSF细胞因子的能力显著增强。
实施例11
IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞细胞因子释放结果评估。
本发明以人乳腺癌细胞系MDA-MB-453作为靶细胞(来自实施例7)分别与效应细胞HER2-CAR T(来自实施例7)以及IKZF3基因编辑的HER2-CAR T(来自实施例7)细胞共培养。具体地，在200μl培养体系中，加入20000个靶细胞MDA-MB-453，按照效靶比1:1、2:1分别加入效应细胞HER2-CAR T(来自实施例7，图例为8b,453+HER2-CAR)或IKZF3基因编辑的HER2-CAR T(来自实施例7，图例为8b,453+HER2-CAR-IKZF3ko)，于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中共培养。24小时后使用ALPHA-LISA试剂盒(Perkinelmer,AL221C,AL208C,AL216C)检测培养上清中IL-2和TNF-α细胞因子水平。如图8b所示，IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞(图例为8b,453+HER2-CAR-IKZF3ko)分泌IL-2和TNF-α细胞因子的能力显著增强。
实施例12
IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞裂解肿瘤细胞效果评估。
使用稳定表达荧光素酶的过表达CD133的人胶质瘤细胞系U251(U251-CD133OE-luc)(来自实施例7)作为靶细胞分别与效应细胞CD133-CAR T(来自实施例7)以及IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(来自实施例7)细胞共培养。具体地，在200μl培养体系中，加入5000个靶细胞U251-CD133OE-luc，按照效靶比1:1、2:1、4:1分别加入效应细胞CD133-CAR T(来自实施例7，图例为9a,U251-CD133OE-luc+CD133-CAR)或IKZF3敲除的CD133-CAR T(来自实施例7，图例为9a,U251-CD133OE-luc+CD133-CAR-IKZF3ko)，于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中共培养。分别于第3、5、7天加入终浓度为150ug/ml的萤火虫荧光素酶底物(PerkinElmer，货号122799)后使用enspire酶标仪检测生物发光信号，在连续检测6-10分钟之后使用稳定下来信号值按照公式((单独肿瘤细胞信号值-共培养测得信号值)/单独肿瘤细胞信号值)计算出肿瘤细胞的裂解率。如图9a所示，IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞(图例为9a,U251-CD133OE-luc+CD133-CAR-IKZF3ko)裂解肿瘤细胞能力显著增强。
实施例13
IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞裂解肿瘤细胞效果评估。
使用稳定表达荧光素酶的人乳腺癌细胞系MDA-MB-453(453-luc)(来自实施例7)作为靶细胞分别与效应细胞HER2-CAR T(来自实施例7)以及IKZF3基因编辑的HER2-CART(来自实施例7)细胞共培养。具体地，在200μl培养体系中，加入20000个靶细胞453-luc，按照效靶比1:4、1:2、1:1、2:1分别加入效应细胞HER2-CAR T(来自实施例7，图例为9b,453-luc+HER2-CAR)或IKZF3基因编辑的HER2-CAR T(来自实施例7，图例为9b,453-luc+HER2-CAR-IKZF3ko)，于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中共培养。分别于第1、2、3天加入终浓度为150ug/ml的萤火虫荧光素酶底物(PerkinElmer，货号122799)后使用enspire酶标仪检测生物发光信号，在连续检测6-10分钟之后使用稳定下来信号值按照公式((单独肿瘤细胞信号值-共培养测得信号值)/单独肿瘤细胞信号值)计算出肿瘤细胞的裂解率。如图9b所示，IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞(图例为9b,453-luc+HER2-CAR-IKZF3ko)裂解肿瘤细胞能力显著增强。
实施例14
IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞体外增殖能力评估。
使用CD133-CAR T(来自实施例7)以及IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(来自实施例7)细胞，按照eBioscienceTM CFSE(eBioscience，货号65-0850-84)使用说明书分别标记CD133-CAR T(来自实施例7)以及IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(来自实施例7)细胞，并按照效靶比2:1加入经过70Gy辐照计量辐照的靶细胞U251-CD133OE，于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中共培养，第4天流式检测CFSE信号。CytoFLEX(Beckman Coulter)流式细胞仪用于获取染色细胞，FlowJo用于分析结果。如图10所示，流式图左上角插入的两组数值，上方数值为增殖细胞数百分比，下方数值为细胞分裂次数的平均数，结果显示跟未进行IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞(图例为CD133-CAR)相比，IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞(图例为CD133-CAR-IKZF3ko)增殖细胞数和细胞分裂次数更多，说明IKZF3基因编辑后利于CD133-CAR T在肿瘤细胞存在的环境中增殖。
实施例15
IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞体外长时间抑瘤效果评估。
使用U251-CD133OE-luc(来自实施例7)作为靶细胞分别与效应细胞CD133-CAR T(来自实施例7，图例为CD133-CAR)以及IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(来自实施例7，图例为CD133-CAR-IKZF3ko)细胞共培养。具体地，在200μl培养体系中，加入5000个靶细胞U251-CD133OE-luc，按照效靶比1:1、2:1、4:1分别加入效应细胞CD133-CAR T(来自实施例7，图例为CD133-CAR)或IKZF3基因编辑的CD133-CAR T(来自实施例7，图例为CD133-CAR-IKZF3ko)，使用RTCA xCELLigence系统(ACEA Bioscience，货号00380601310)的16孔e-plate(ACEA Bioscience，货号05469813001)，于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中共培养。按照RTCA xCELLigence系统基本实验操作说明书，连续追踪7天观察靶细胞在xCELLigence系统上增殖情况。图11a横坐标为追踪时间，纵坐标为归一化的细胞指数，其中细胞指数越大，靶细胞U251-CD133OE-luc存活量越多，相应的效应细胞杀伤率越低。如图11a所示，IKZF3基因编辑的CD133-CAR T细胞(图例为CD133-CAR-IKZF3ko)更有效地杀伤和抑制靶细胞U251-CD133OE-luc。
实施例16
IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞体外长时间抑瘤效果评估。
使用453-luc(来自实施例7)作为靶细胞分别与效应细胞HER2-CAR T(来自实施例7，图例为HER2-CAR)以及IKZF3基因编辑的HER2-CAR T(来自实施例7，图例为HER2-CAR-IKZF3ko)细胞共培养。具体地，在200μl培养体系中，加入20000个靶细胞453-luc，按照效靶比1:2分别加入效应细胞HER2-CAR T(来自实施例7，图例为HER2-CAR)或IKZF3基因编辑的HER2-CAR T(来自实施例7，图例为HER2-CAR-IKZF3ko)，使用RTCA xCELLigence系统(ACEABioscience，货号00380601310)的16孔e-plate(ACEABioscience，货号05469813001)，于含有5％CO2的37℃恒温培养箱中共培养。按照RTCAxCELLigence系统基本实验操作说明书，连续追踪7天观察靶细胞在xCELLigence系统上增殖情况。图11b横坐标为追踪时间，纵坐标为归一化的细胞指数，其中细胞指数越大，靶细胞453-luc存活量越多，相应的效应细胞杀伤率越低。如图11b所示，IKZF3基因编辑的HER2-CAR T细胞(图例为HER2-CAR-IKZF3ko)反映出早期更好的杀伤和抑制靶细胞453-luc的功能。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海科技大学
<120> 一种IKZF3基因沉默的T细胞及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1530
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaagata tacaaacaaa tgcggaactg aaaagcactc aggagcagtc tgtgcccgca 60
gaaagtgcag cggttttgaa tgactacagt ttaaccaaat ctcatgaaat ggaaaatgtg 120
gacagtggag aaggcccagc caatgaagat gaagacatag gagatgattc aatgaaagtg 180
aaagatgaat acagtgaaag agatgagaat gttttaaagt cagaacccat gggaaatgca 240
gaagagcctg aaatccctta cagctattca agagaatata atgaatatga aaacattaag 300
ttggagagac atgttgtctc attcgatagt agcaggccaa ccagtggaaa gatgaactgc 360
gatgtgtgtg gattatcctg catcagcttc aatgtcttaa tggttcataa gcgaagccat 420
actggtgaac gcccattcca gtgtaatcag tgtggggcat cttttactca gaaaggtaac 480
ctcctccgcc acattaaact gcacacaggg gaaaaacctt ttaagtgtca cctctgcaac 540
tatgcatgcc aaagaagaga tgcgctcacg gggcatctta ggacacattc tgtggagaaa 600
ccctacaaat gtgagttttg tggaaggagt tacaagcaga gaagttccct tgaggagcac 660
aaggagcgct gccgtacatt tcttcagagc actgacccag gggacactgc aagtgcggag 720
gcaagacaca tcaaagcaga gatgggaagt gaaagagctc tcgtactgga cagattagca 780
agcaatgtgg caaaacgaaa aagctcaatg cctcagaaat tcattggtga gaagcgccac 840
tgctttgatg tcaactataa ttcaagttac atgtatgaga aagagagtga gctcatacag 900
acccgcatga tggaccaagc catcaataac gccatcagct atcttggcgc cgaagccctg 960
cgccccttgg tccagacacc gcctgctccc acctcggaga tggttccagt tatcagcagc 1020
atgtatccca tagccctcac ccgggctgag atgtcaaacg gtgcccctca agagctggaa 1080
aagaaaagca tccaccttcc agagaagagc gtgccttctg agagaggcct ctctcccaac 1140
aatagtggcc acgactccac ggacactgac agcaaccatg aagaacgcca gaatcacatc 1200
tatcagcaaa atcacatggt cctgtctcgg gcccgcaatg ggatgccact tctgaaggag 1260
gttccccgct cttacgaact cctcaagccc ccgcccatct gcccaagaga ctccgtcaaa 1320
gtgatcaaca aggaagggga ggtgatggat gtgtatcggt gtgaccactg ccgcgtcctc 1380
ttcctggact atgtgatgtt cacgattcac atgggctgcc acggcttccg tgaccctttc 1440
gagtgtaaca tgtgtggata tcgaagccat gatcggtatg agttctcgtc tcacatagcc 1500
agaggagaac acagagccct gctgaagtga 1530
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttttaaagt cagaacccat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaatagctgt aagggatttc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatagtagca ggccaaccag 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accgttttaa agtcagaacc cat 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacatgggt tctgacttta aaa 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accgaatagc tgtaagggat ttc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacgaaatc ccttacagct att 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accgatagta gcaggccaac cag 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaacctggtt ggcctgctac tat 23
<210> 11
<211> 4951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctagcaaaat aggctgtccc 20
<210> 13
<211> 4949
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atcgataggt accgattagt gaacggatct cgacggtatc gatcacgaga ctagcctcga 60
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<400> 14
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aacactaagt acgatgagaa cgataagctg atcagggaag tgaaagtgat aactctgaag 3780
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<212> DNA
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<212> DNA
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gtggaggaga atcccggccc ttccgggatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc 3720
acccgcgacg acgtccccag ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc 3780
gccacgcgcc acaccgtcga tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa 3840
ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc 3900
gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc 3960
ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc 4020
ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg 4080
cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc 4140
gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac 4200
gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg 4260
tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgaatc taggtcgaca atcaacctct ggattacaaa 4320
atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 4380
gctgctttaa tgcctttgta tcatgcgtta actaaacttg tttattgcag cttataatgg 4440
ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 4500
tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggaatt gactcaaatg 4560
atgtcaatta gtctatcaga agctcatctg gtctcccttc cgggggacaa gacatccctg 4620
tttaatattt aaacagcagt gttcccaaac tgggttctta tatcccttgc tctggtcaac 4680
caggttgcag ggtttcctgt cctcacagga acgaagtccc taaagaaaca gtggcagcca 4740
ggtttagccc cggaattgac tggattcctt ttttagggcc cattggtatg gctttttccc 4800
cgtatccccc caggtgtctg caggctcaaa gagcagcgag aagcgttcag aggaaagcga 4860
tcccgtgcca ccttccccgt gcccgggctg tccccgcacg ctgccggctc ggggatgcgg 4920
ggggagcgcc ggaccggagc ggagccccgg gcggctcgct gctgccccct agcgggggag 4980
ggacgtaatt acatccctgg gggctttggg ggggggctgt ccctgatatc tataacaaga 5040
aaatatatat ataataagtt atcacgtaag tagaacatga aataacaata taattatcgt 5100
atgagttaaa tcttaaaagt cacgtaaaag ataatcatgc gtcattttga ctcacgcggt 5160
cgttatagtt caaaatcagt gacacttacc gcattgacaa gcacgcctca cgggagctcc 5220
aagcggcgac tgagatgtcc taaatgcaca gcgacggatt cgcgctattt agaaagagag 5280
agcaatattt caagaatgca tgcgtcaatt ttacgcagac tatctttcta gggttaatct 5340
agctgcatca ggatcatatc gtcgggtctt ttttccggct cagtcatcgc ccaagctggc 5400
gctatctggg catcggggag gaagaagccc gtgccttttc ccgcgaggtt gaagcggcat 5460
ggaaagagtt tgccgaggat gactgctgct gcattgacgt tgagcgaaaa cgcacgttta 5520
ccatgatgat tcgggaaggt gtggccatgc acgcctttaa cggtgaactg ttcgttcagg 5580
ccacctggga taccagttcg tcgcggcttt tccggacaca gttccggatg gtcagcccga 5640
agcgcatcag caacccgaac aataccggcg acagccggaa ctgccgtgcc ggtgtgcaga 5700
ttaatgacag cggtgcggcg ctgggatatt acgtcagcga ggacgggtat cctggctgga 5760
tgccgcagaa atggacatgg ataccccgtg agttacccgg cgggcgcgct tggcgtaatc 5820
atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 5880
agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 5940
tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 6000
aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 6060
cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 6120
ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 6180
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 6240
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 6300
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 6360
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 6420
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6480
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6540
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6600
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6660
tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 6720
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 6780
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 6840
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 6900
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 6960
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 7020
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 7080
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 7140
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 7200
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 7260
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 7320
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 7380
atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 7440
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 7500
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 7560
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 7620
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 7680
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 7740
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 7800
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcat 7845
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctctagagc cacc 14
<210> 23
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaagatcttc 10

Claims (12)

1.一种IKZF3基因干扰的核酸分子，其特征在于，所述IKZF3基因中的靶序列如SEQ IDNO：1所示。
2.如权利要求1所述的IKZF3基因干扰的核酸分子，所述核酸分子为sgRNA，所述核酸分子的序列选自SEQ ID NO：2-4中的任一种或多种。
3.一种IKZF3基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求1-2任一所述的核酸分子中的基因片段，能表达所述核酸分子。
4.一种IKZF3基因干扰慢病毒，由权利要求3所述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
5.如权利要求1-2任一所述的IKZF3基因干扰的核酸分子，或权利要求3所述的IKZF3基因干扰核酸构建体，或权利要求4所述的IKZF3基因干扰慢病毒在制备T细胞活性促进剂中的用途。
6.一种T细胞活性促进剂，其有效物质含有权利要求1-2任一所述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或权利要求3所述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或权利要求4所述的IKZF3基因干扰慢病毒。
7.一种T细胞的制备方法或提高T细胞活性的方法，为将T细胞的IKZF3基因沉默。
8.如权利要求7所述的T细胞的制备方法，其特征在于，通过反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA、大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR系统靶向IKZF3基因中的靶序列使IKZF3基因沉默。
9.如权利要求8所述的T细胞的制备方法或提高T细胞活性的方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述IKZF3基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示；
2)为将权利要求1-2任一所述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或权利要求3所述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或权利要求4所述的IKZF3基因干扰慢病毒施用于T细胞，降低T细胞中IKZF3基因的表达；
3)为将SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4中的任一种或多种核酸分子施用于T细胞。
10.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞的IKZF3基因沉默。
11.如权利要求10所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞中含有权利要求1-2任一所述的IKZF3基因干扰的核酸分子，和/或权利要求3所述的IKZF3基因干扰核酸构建体，和/或权利要求4所述的IKZF3基因干扰慢病毒。
12.如权利要求1-2任一所述的IKZF3基因干扰的核酸分子，或权利要求3所述的IKZF3基因干扰核酸构建体，或权利要求4所述的IKZF3基因干扰慢病毒，或权利要求10所述的T细胞的用途，所述用途选自以下任一种或多种：(1)制备肿瘤治疗药物；(2)提高T细胞分泌细胞因子的能力；(3)提高T细胞的杀伤效率；(4)增加T细胞扩增倍数；(5)延长T细胞存续时间。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849920A (zh) * 2020-07-28 2020-10-30 上海科技大学 一种t淋巴细胞

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773888B (zh) * 2014-02-19 2016-08-31 天津医科大学 基因ikzf3在制备肺癌诊断试剂盒中的应用及试剂盒
WO2019178421A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773888B (zh) * 2014-02-19 2016-08-31 天津医科大学 基因ikzf3在制备肺癌诊断试剂盒中的应用及试剂盒
WO2019178421A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CINZIA FIONDA等: "he IMiDs targets IKZF-1/3 and IRF4 as novel negative regulators of NK cell-activating ligands expression in multiple myeloma", 《ONCOTARGET》 *
KAITLIN等: "Integrated STAT3 and Ikaros Zinc Finger transcription factor activities regulate Bcl-6 expression in CD4+ T helper cells", 《J IMMUNOL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111849920A (zh) * 2020-07-28 2020-10-30 上海科技大学 一种t淋巴细胞
CN111849920B (zh) * 2020-07-28 2023-02-17 上海科技大学 一种t淋巴细胞

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