CN110824024A - 一种基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法以及搅拌棒 - Google Patents
一种基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法以及搅拌棒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于石墨烯纳米技术的同步检测六种黄曲霉素的方法，其包括以下步骤：将样品溶液与石墨烯涂层接触，以使石墨烯涂层吸附样品溶液中的黄曲霉素；解析吸附结合到石墨烯涂层上的黄曲霉素，使黄曲霉素释放并检测。相对于现有技术，本发明所述的同步检测六种黄曲霉素的方法通过利用石墨烯纳米材料丰富的大π键与同样具有芳环大π键结构的黄曲霉素间形成的弱π‑π相互作用，结合石墨烯纳米材料超大比表面等特性，实现石墨烯涂层对样品液体中六种黄曲霉素的吸附结合；另外，由于石墨烯具有良好的化学惰性和热稳定性，相对于其他物质形成的涂层，其在解析的过程中不会释放出涂层本身的物质混入黄曲霉素中，从而提高了黄曲霉素检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法以及搅拌棒。
背景技术
黄曲霉素(aflatoxin)是一类具有强烈生物毒性的化合物，由黄曲霉菌及寄生曲霉等霉菌代谢生成。研究表明，黄曲霉素具有六种不同的结构，分别为B1、B2、G1、G2、M1和M2，该六种黄曲霉素均含有苯环和呋喃环，如图1所示。黄曲霉素对人体的危害极大，主要表现在以下三个方面：第一、损害各种组织器官，其中以损坏肝脏为主；第二、可诱发多种癌症，如胃癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌，以及诱发卵巢及小肠等部位生长肿瘤；第三、抑制免疫系统活性。
由于黄曲霉毒素具有耐热性，只有在100-120℃的高温条件下才会使其失活，常规的巴氏消毒法温度较低无法使黄曲霉素失活，造成产品中常常存在残留的、仍具有活性的黄曲霉素。因此，对于产品中黄曲霉素的鉴定及其含量的检测至关重要。
目前，对于黄曲霉素的检测方法主要为液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(HPLC/MS)、酶联免疫法(ELISA)、薄层层析法(TLC)等。液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(HPLC/MS)、和薄层层析法(TLC)均耗时较长；液相色谱-串联质谱法所用仪器较为昂贵，操作繁琐，不易推广；薄层层析法和液相色谱方法在提取液体物质之后需要对液体物质进行进一步的清除步骤和衍生化以去除干扰物质，操作繁琐且耗时较长；酶联免疫法检测虽然相对较快，但重现性差，且易受样品基质干扰假阳性率高，难于定量。且多数情况下一次实验只能针对一种黄曲霉素抗原进行检测，要全部完成所有有毒黄曲霉素的检测需要经过多次实验。
搅拌棒吸附萃取技术(SBSE)通过在搅拌棒上涂布一层能够结合目标物质的涂层，在搅拌样品的过程中直接吸附目标物质到搅拌棒上，然后通过溶剂解析或热解析过程将目标物质释放到气相色谱-质谱联用(GC-MS)或液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)中直接进行目标物质的鉴定以及目标物质含量的测定。该方法大大简化了样品检测的步骤，今年来得到广泛地应用，有望将其应用于黄曲霉素的检测。
搅拌棒上的涂层的好坏直接决定检测结果的准确性，现有的涂层如磺胺二甲嘧啶涂层、甲磺隆涂层、莱克多巴胺涂层、聚二甲基硅氧烷涂层等，容易在解析过程中与目标物质一起从搅拌棒上脱落下来，导致质谱结果出现杂峰，影响目标物质及其含量的检测；且机械强度不够，容易在搅拌过程中被磨损，导致吸附在涂层上的目标物质在搅拌过程中脱落，影响检测结果的准确性。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种操作简单、准确性高、杂峰少且能够同时检测六种黄曲霉素的检测方法以及搅拌棒。
本发明的一种基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法，其包括以下步骤：
将样品溶液与石墨烯涂层接触，以使石墨烯涂层吸附样品溶液中的黄曲霉素；解析吸附结合到石墨烯涂层上的黄曲霉素，使黄曲霉素释放并检测。
相对于现有技术，本发明所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法通过利用石墨烯纳米材料丰富的大π键与同样具有芳环大π键结构的黄曲霉素间形成弱的π-π相互作用萃取吸附液体中各种黄曲霉素；同时，石墨烯涂层相对于其他材料的涂层具有更高的比表面积(理论比表面2630m2/g)，能够吸附结合溶液中更多的黄曲霉素，避免了样品溶液中的黄曲霉素未被全部吸附，从另一个方面提高了黄曲霉素检测的准确性。另外，由于石墨烯具有良好的化学惰性和热稳定性，相对于其他物质，如磺胺二甲嘧啶、聚二甲基硅氧烷等形成的涂层，其在解析的过程中不会释放出涂层本身的物质混入黄曲霉素中，避免杂质色谱峰干扰，从而进一步提高了黄曲霉素检测的准确性；并且所述石墨烯纳米材料是迄今为止发现的机械强度(1.06TPa)最高的材料，断裂强度高达125GPa。超窄石墨烯带杨氏模量约为7TPa，是目前已知最牢固的材料，其优异的机械学、力学性能结合化学惰性使得上述基于石墨烯纳米涂层的黄曲霉素富集分离装置相对其他材料使用寿命大幅增加，装置使用成本也显著降低。
进一步地，所述石墨烯涂层上偶联有黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体。通过在石墨烯涂层上设置能够与相应的黄曲霉素特异性结合的黄曲霉素抗体，由于抗体与抗原的结合相比石墨烯大π键与黄曲霉素苯环大π键的结合以及简单物理吸附更灵敏特异，从而大幅提升了石墨烯涂层对黄曲霉素的吸附结合能力，进一步提升了样品溶液中黄曲霉素的被吸附结合率，从而进一步提升了样品溶液中黄曲霉素含量检测的准确度。
进一步地，所述石墨烯涂层为所述石墨烯涂层为氧化石墨烯涂层、氧化氮掺杂石墨烯涂层、氧化硼掺杂石墨烯涂层、氧化氟化石墨烯涂层中的任意一种。各种氧化石墨烯纳米材料相对于石墨烯材料来说具有更多的活性位点，能够偶联更多的黄曲霉素抗体，提升抗体抗原特异性结合的比例，从而进一步提升样品溶液中黄曲霉素的被吸附率。
进一步地，所述解析方式为热解析，并对所述释放的黄曲霉素进行气相色谱-质谱检测。热解析操作简单，只需将吸附结合有黄曲霉素的石墨烯涂层加热即可释放出黄曲霉素；另外，热解析可以和气相色谱-质谱仪联用，从而使得释放后的黄曲霉素直接进入气相色谱-质谱仪测定含量，进一步简化了操作。
本发明还保护一种基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒，其表面具有石墨烯涂层。
进一步地，所述石墨烯涂层上偶联有黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体。
进一步地，所述石墨烯涂层为氧化石墨烯涂层、氧化氮掺杂石墨烯涂层、氧化硼掺杂石墨烯涂层、氧化氟化石墨烯涂层中的任意一种。
进一步地，所述黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体占据所述石墨烯涂层60％～95％面积。抗体造价昂贵，不用黄曲霉素抗体全部覆盖石墨烯涂层表面可以节约搅拌棒制作费用。
进一步地，所述石墨烯涂层上的黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体的区域互不交叉。由于各种黄曲霉素抗体所分布的石墨烯涂层区域互不交叉，从而与不同黄曲霉素抗体结合的相应不同种类的黄曲霉素相对分离，各种黄曲霉素在经过热解过程进入质谱仪中被离子源离子化的过程中，不同的黄曲霉素相对分离，质谱所打出的杂峰更少。
进一步地，所述搅拌棒包括棒体及围设在棒体上并沿其径向延伸的承载面，所述石墨烯涂层涂覆在所述承载面上；所述承载面为沿该棒体轴向盘旋延伸的螺旋曲面；或所述承载面为若干个与该棒体垂直的平面。螺旋面与液体接触面积更大，能够有效增加石墨烯涂层和黄曲霉素抗体与黄曲霉素相遇及结合的概率。
相对于现有技术，本发明所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法通过利用石墨烯纳米材料丰富的大π键与同样具有芳环大π键结构的黄曲霉素间弱的π-π相互作用，结合石墨烯纳米材料超大比表面等特性，实现石墨烯涂层对样品液体中六种黄曲霉素的吸附结合；更进一步的，所述石墨烯纳米涂层按一定规律偶联有黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体。通过抗体-抗原特异性反应，实现样品溶液中六种黄曲霉素的高效富集分离。经后续热解析及气相色谱-质谱联用技术，能够一次性完成样本溶液中六种黄曲霉素的含量检测，减少了实验次数，并大大简化了检测过程；并且，石墨烯相对于其他材料具有更高的机械强度，可以与样品液体接触的过程中经历高强度的冲击和搅拌而不脱落，避免杂质色谱峰干扰，进一步提高了检测的准确性。另外，由于石墨烯具有良好的化学惰性和热稳定性，相对于其他物质形成的涂层，其在解析的过程中不会释放出涂层本身的物质混入黄曲霉素中，而石墨烯涂层的超强机械强度，使得其与样品液体接触的过程中经历高强度的冲击和搅拌而不脱落，有效避免了已经吸附结合在石墨烯涂层上的黄曲霉素随脱落的涂层回到样品溶液中导致黄曲霉素的测量不准确。与传统材料相比，石墨烯纳米材料的使用使得样品溶液中六种黄曲霉素富集分离效率大大提高，提高检测灵敏度。石墨烯纳米涂层超强机械强度和化学惰性等特性使得装置使用寿命长，装置成本大幅降低。
附图说明
图1为黄曲霉素M2的结构简式；
图2为本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法的流程示意图；
图3为本发明的基于石墨烯纳米材料的用于同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒的结构示意图。
图4为采用本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法检测防城港金花茶萃取液和凹脉金花茶萃取液中黄曲霉素的质谱结果。
图5为采用现有技术中全氟化树脂材料为涂层检测黄曲霉素的方法检测防城港金花茶萃取液中黄曲霉素的质谱结果。
具体实施方式
本发明的基于石墨烯纳米材料的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法的原理如下所示：黄曲霉素抗体能够与对应的黄曲霉素进行特异性结合；同时，六种黄曲霉素均含有苯环结构，苯环具有大π键，石墨烯也具有大π键，石墨烯可以与黄曲霉素中的苯环之间形成弱π-π相互作用，从而结合黄曲霉素。通过以上二种作用，使得表面偶联有六种黄曲霉素抗体的石墨烯涂层能够有效吸附结合样品溶液中的六种黄曲霉素。
加之石墨烯涂层具有大比表面积能够结合更多的黄曲霉素，有效提升了黄曲霉素的结合率，使得样品溶液中的黄曲霉素几乎全部吸附到石墨烯涂层上；并且石墨烯涂层具有很好的热稳定性，在热解释放黄曲霉素的过程中，不会受热与黄曲霉素一起脱落进入检测仪器干扰最终黄曲霉素检测的准确性；另外，石墨烯涂层的机械强度很高，可以与样品液体接触的过程中经历高强度的冲击和搅拌而不脱落，从而避免了已经吸附结合在石墨烯涂层上的黄曲霉素随脱落的涂层回到样品溶液中导致黄曲霉素的测量不准确。
请参阅图2，其为本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法的流程示意图。本发明的同步检测六种黄曲霉素的方法包括以下步骤：
S1吸附：样品溶液与表面涂布有石墨烯涂层的物体接触，样品溶液中的黄曲霉素吸附结合到石墨烯涂层上；
将样品溶液如金花茶等植物萃取液盛于样品瓶中，将表面涂布有石墨烯涂层的物体放入样品瓶中与样品溶液充分接触，使得样品溶液中的黄曲霉素与石墨烯涂层以及偶联于石墨烯涂层上的黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体六种抗体充分接触，使得样品溶液中的黄曲霉素吸附结合到表面涂布有石墨烯涂层的物体上，以用于后续检测样品溶液中含有哪几种黄曲霉素并测定每种黄曲霉素的含量。
所述石墨烯涂层的材料可以是石墨烯纳米材料、氧化石墨烯纳米材料、氟化石墨烯纳米材料、氧化氮掺杂石墨烯纳米材料、氧化氟化石墨烯纳米材料、氧化硼掺杂石墨烯纳米材料中的一种或多种；表面涂布有石墨烯涂层的物体可以是涂布有石墨烯材料涂层的筛网、涂布有石墨烯材料涂层的搅拌棒、涂布有石墨烯材料涂层的栅栏等。
S2解析：解析释放吸附结合到石墨烯涂层上的黄曲霉素；
将S1所得到的吸附结合有黄曲霉素的石墨烯涂层物体插入热解析管中后，放入热解器中加热到250℃～450℃，热能使得黄曲霉素从黄曲霉素抗体以及石墨烯涂层上脱落下来并气化，以气体形式进入检测仪器中。具体加热过程如下：自室温起以10℃/min升温到85℃，再以10℃/min升温到180℃，最后以5℃/min升温到250℃～450℃。所述热解器采用较低的温度，负压并使用触媒以加速裂解反应，并实现较低温度下气化高沸点黄曲霉素。
S3检测：检测步骤S2中释放得到的黄曲霉素的含量。
检测仪器为气相色谱—质谱联用系统(GC-MS)，热解器与气相色谱(GC)相连，因此，加热后脱落并气化后的六种黄曲霉素直接进入气相色谱仪(GC)，气相色谱将黄曲霉素的各种结构体分离开来，依次进入质谱仪检测样品溶液中含有哪几种黄曲霉素并测定每种黄曲霉素的含量。具体的测量参数为：气相色谱仪中的火焰电力检测器(FID)温度为250℃～320℃，分流比为20～30：1，柱流量为1mL/min，载气为高纯氦气；质谱仪中EI离子源的电压为70eV，离子源温度为250℃～320℃，传输线温度为250℃，扫描范围为40-500amu，采用高纯氦气，质谱标准库采用Nist谱图库。
本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测多种黄曲霉素的方法还具有多种变形实施例，例如解析方式可以不是热解析，可以为溶液解析，采用溶液解析时，与解析过程联用的仪器为液相色谱；石墨烯涂层上也可以不偶联有黄曲霉素抗体，只依靠石墨烯涂层吸附结合黄曲霉素。
另外，用于本发明的植物萃取液可以通过超临界CO2萃取、溶剂浸提萃取等萃取技术得到。所述溶剂浸提萃取技术所用溶剂为甲醇-水(55:45)、丙酮-水(85:15)、氯仿-丙酮(92:8)和乙腈-水(90:10)中的任意一种。
以下讲述本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒的结构。本发明的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒包括棒体10及围设在棒体10上并沿棒体10径向延伸的承载面20。所述承载面20以及所述棒体10的柱表面11上涂覆有石墨烯涂层，优选地，所述石墨烯涂层为氧化石墨烯纳米涂层。所述石墨烯涂层上偶联有黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体。所述黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体分别分布于石墨烯涂层的不同区域。优选地，所述棒体10柱表面，尤其是所述棒体10下端的柱表面11的石墨烯涂层上偶联黄曲霉素B1抗体，以最大限度地吸附样品溶液中致癌性最强的黄曲霉素B1。
本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素抗原的搅拌棒具有多种变形，例如，所述承载面可以为沿所述棒体轴向盘旋延伸的螺旋曲面，或若干个与所述棒体垂直的平面，或者与所述棒体成任何角度的曲面或平面；所述搅拌棒的材料可以是不锈钢、钢化玻璃、陶瓷等不与样品溶液反应的材料；所述石墨烯涂层可以是石墨烯纳米涂层、氧化石墨烯纳米涂层、氟化石墨烯纳米涂层、氟化石墨烯氧化物纳米涂层、氧化石墨烯涂层、氟化石墨烯涂层、氟化石墨烯氧化物涂层等；所述六种黄曲霉素抗体可以不是分开分布，可以交叉混杂在一起偶联在石墨烯涂层上；所述六种黄曲霉素抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体，只要能与对应的黄曲霉素抗原发生特异性结合就行；所述六种黄曲霉素抗体与石墨烯涂层的偶联方式为EDC/NHS偶联、戊二酸酐偶联、戊二醛偶联、重氮偶联中的任意一种；所述棒体10的下端柱表面可以不涂覆石墨烯涂层，涂覆石墨烯涂层的情况下，其上偶联的抗体也可以是黄曲霉素B1抗体之外的另外五种黄曲霉素的抗体。
本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测多种黄曲霉素的搅拌棒的制备方法，包括以下步骤：
S1涂层：超声粉碎石墨烯并制成浓度为0.1-0.6mg/ml的石墨烯溶液，然后将所得的石墨烯溶液喷涂在预先预热至120℃-130℃的搅拌棒基底材料上，得到涂覆有石墨烯涂层的搅拌棒；
S2偶联抗体：将黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体偶联到石墨烯涂层上，得到石墨烯涂层上偶联有黄曲霉素抗体的搅拌棒。
其中，所述搅拌棒基底材料为不锈钢、钢化玻璃和陶瓷中的任意一种；步骤S2中，所述石墨烯涂层与各种黄曲霉素抗体之间的偶联方法为EDC/NHS偶联法、戊二酸酐偶联法、戊二醛偶联法、重氮偶联法中的任意一种；步骤S3中的去离子水为去除离子更彻底的三次水。另外，步骤S1得到涂覆有石墨烯涂层的搅拌棒和步骤S2得到石墨烯涂层上偶联有黄曲霉素抗体的搅拌棒之后都需经过老化过程。所述老化过程如下：具有石墨烯涂层的搅拌棒或石墨烯涂层偶联有黄曲霉素抗体的搅拌棒在约150kPa氮气气流的保护下，分别经过50℃3h、60℃3h、和80℃30～60min的热老化，然后降至室温完成老化；其中，完成老化的涂覆有石墨烯涂层的搅拌棒进入步骤S2，完成老化的石墨烯涂层上偶联有黄曲霉素抗体的搅拌棒保存在去离子水中备用。
实施例一
以下结合具体实施例讲述本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒的结构。请参阅图3，其为本发明的基于石墨烯纳米材料的用于同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒的结构示意图。本发明的能够同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒为不锈钢材料，其包括棒体10及围设在棒体10上并沿棒体10径向延伸的承载面。优选地，所述承载面为沿所述棒体10轴向盘旋延伸的螺旋曲面20，螺旋曲面20更有利于搅拌棒与样品溶液充分接触。所述螺旋曲面20以及所述棒体10的柱表面11上涂覆有氧化石墨烯纳米涂层。所述氧化石墨烯纳米涂层上偶联有黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体。
具体，所述螺旋曲面20自下往上数分为六个区域，第一区域21的氧化石墨烯纳米涂层上偶联有偶联有黄曲霉素B2单克隆抗体，第二区域22的氧化石墨烯纳米涂层上偶联有偶联有黄曲霉素B1单克隆抗体，第三区域23的氧化石墨烯纳米涂层上偶联有偶联有黄曲霉素G2单克隆抗体，第四区域24的氧化石墨烯纳米涂层上偶联有偶联有黄曲霉素G1单克隆抗体，第五区域25的氧化石墨烯纳米涂层上偶联有偶联有黄曲霉素M2单克隆抗体，第六区域26的氧化石墨烯纳米涂层上偶联有偶联有黄曲霉素M1单克隆抗体；所述棒体10的下端柱表面11的氧化石墨烯纳米涂层上偶联有黄曲霉素B1单克隆抗体。
本实施例还可以有以下变形，所述六个区域的面积可以相同，也可以不同；所述螺旋曲面20自下往上数分为若干个区域，不只限于六个区域，优选地为六的倍数个区域，也可以不为六的倍数个区域；所述黄曲霉素抗体结合到到所述螺旋曲面20的各个区域的顺序可以是随意的，只要六种抗体都偶联在所述螺旋曲面的氧化石墨烯纳米涂层上即可。
实施例二
本实施例以金花茶为例具体说明本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法以及基于石墨烯纳米材料的用于同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒的应用。
预处理：金花茶花朵经摘选、清洗、真空干燥后在乙腈-水(90:10)溶剂中，于50℃搅拌萃取并浓缩得到金花茶花朵萃取液。
S1吸附：搅拌棒搅拌吸附金花茶花朵萃取液中的黄曲霉素；
首先将2ml金花茶花朵萃取液盛于50ml样品瓶中；然后于50℃条件下，将搅拌棒以～rpm转速搅拌金花茶花朵萃取液15分钟，使得金花茶花朵萃取液中的多种黄曲霉素与氧化石墨烯纳米涂层以及偶联于氧化石墨烯纳米涂层上的黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体结合，从而使得金花茶花朵萃取液中的多种黄曲霉素吸附到搅拌棒上。
S2解析：加热吸附有黄曲霉素的搅拌棒，释放吸附于搅拌棒上的黄曲霉素到检测仪器中；
将S1所得到的吸附结合有黄曲霉素的搅拌棒插入热解析管后，然后放入热解器中，加热器加热室温起以10℃/min升温到85℃，再以10℃/min升温到180℃，最后以5℃/min升温到400℃，使得黄曲霉素从搅拌棒上脱落下来并气化，以气体形式进入气相色谱仪。
S3检测：检测黄曲霉素的含量。
加热后脱落并气化后的六种黄曲霉素直接进入气相色谱仪(GC)，气相色谱仪中的火焰电力检测器(FID)温度为250℃，分流比为30：1，柱流量为1mL/min，载气为高纯氦气；气相色谱将经过热解过程混在一起的多种黄曲霉素分离开来，使其依次进入质谱仪中。质谱仪将每种黄曲霉素离子化后，按离子的质荷比分离并通过测量各种离子谱峰的强度测定每种黄曲霉素的含量，质谱仪中的EI离子源的电压为70eV，离子源温度为250℃，传输线温度为250℃，扫描范围为40-500amu，采用高纯氦气，质谱标准库采用Nist谱图库。
本实施例中的金花茶原料可以为防城港金花茶、显脉金花茶、陇瑞金花茶、东兴金花茶、小果金花茶及其变种、中东金花茶、毛瓣金花茶、凹脉金花茶、薄瓣金花茶、小瓣金花茶、四季金花茶、毛籽金花茶、直脉多脉金花茶、多瓣金花茶、柠檬金花茶、黄金花茶、薄叶金花茶、夏石金花茶、长柱金花茶、龙州金花茶、武鸣金花茶、平果金花茶、顶生金花茶、小花金花茶、弄岗金花茶、细叶金花茶、扶绥金花茶、天峨金花茶、多瓣淡黄金花茶、淡黄金花茶、簇蕊金花茶、直脉多瓣金花茶、博白金花茶、五室金花茶、大金花茶、四川金花茶、贵州金花茶、云南金花茶、离蕊金花茶、越南东京金花茶、越南抱茎金花茶、库克芳金花茶、厚叶金花茶、塔姆岛金花茶、胡龙金花茶、Camellia Luteopallida(T.Q.T.Nguyen&Luu)、Camelliabugiamapensis(Orel,Curry,Luu&Q.D.)和Camellia capitata(Orel,Curry&Luu,sp.nov.)中的任意一种。
效果检测：
取预处理得到的防城港金银花萃取液平分为两组，其中一组采用本发明的基于石墨烯纳米材料检测黄曲霉素的搅拌棒对防城港金银花萃取液中的黄曲霉素进行检测；另一组现有技术中全氟化树脂材料作为涂层的搅拌棒检测黄曲霉素的对防城港金银花萃取液中的黄曲霉素进行检测；其中，热解析过程和CC-MS检测过程的参数均相同。
请参阅图4，图4为采用本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法检测防城港金花茶萃取液和凹脉金花茶萃取液中黄曲霉素的质谱结果。其中，关于防城港金花茶萃取液中黄曲霉素的检测结果为曲线a，关于凹脉金花茶萃取液中黄曲霉素的检测结果为曲线b。由结果可知，两种金花茶萃取液中的六种黄曲霉素全部被检测出来，且不存在任何杂峰。
请参阅图5，图5为采用现有技术中全氟化树脂材料为涂层检测黄曲霉素的方法检测防城港金花茶萃取液中黄曲霉素的质谱结果。与图4中的防城港金花茶萃取液中黄曲霉素的检测结果(曲线a)相比，不仅漏检了黄曲霉素M2，还有很多杂峰，且各黄曲霉素丰度相对图4a对应结果均有一定程度降低。可见，采用石墨烯纳米材料的涂层比采用全氟化树脂材料的涂层的检测结果更加准确且无杂峰。
实施例三
本实施例以实施例二中所述的平果金花茶为例具体说明本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法以及基于石墨烯纳米材料的用于同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒的应用。
预处理：平果金花茶叶经摘选、清洗、真空干燥后在甲醇-水(55:45)溶剂中，于50℃搅拌萃取并浓缩得到平果金花茶叶萃取液。
S1吸附：搅拌棒搅拌吸附平果金花茶叶萃取液中的黄曲霉素；
首先将10ml平果金花茶叶萃取液盛于20ml样品瓶中；然后于35℃条件下，将搅拌棒以～rpm转速搅拌平果金花茶叶萃取液40分钟，使得平果金花茶叶萃取液中的多种黄曲霉素与氧化石墨烯纳米涂层以及偶联于氧化石墨烯纳米涂层上的黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体结合，从而使得平果金花茶叶萃取液中的多种黄曲霉素吸附到搅拌棒上。
S2解析：加热吸附有黄曲霉素的搅拌棒，释放吸附于搅拌棒上的黄曲霉素到检测仪器中；
将S1所得到的吸附结合有黄曲霉素的搅拌棒插入热解析管后，然后放入热解器中，加热器加热室温起以10℃/min升温到85℃，再以10℃/min升温到180℃，最后以5℃/min升温到380℃，使得黄曲霉素从搅拌棒上脱落下来并气化，以气体形式进入气相色谱仪。
S3检测：检测黄曲霉素的含量。
加热后脱落并气化后的六种黄曲霉素直接进入气相色谱仪(GC)，气相色谱仪中的火焰电力检测器(FID)温度为280℃，分流比为30：1，柱流量为1mL/min，载气为高纯氦气；气相色谱将经过热解过程混在一起的多种黄曲霉素分离开来，使其依次进入质谱仪中。质谱仪将每种黄曲霉素离子化后，按离子的质荷比分离并通过测量各种离子谱峰的强度测定每种黄曲霉素的含量，质谱仪中的EI离子源的电压为70eV，离子源温度为250℃，传输线温度为250℃，扫描范围为40-500amu，采用高纯氦气，质谱标准库采用Nist谱图库。
实施例四
本实施例以罗坑高山古树茶为例具体说明本发明的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法以及基于石墨烯纳米材料的用于同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒的应用。
预处理：罗坑高山古树茶经摘选、清洗、真空干燥后在丙酮-水(85:15)溶剂中，于50℃搅拌萃取并浓缩得到罗坑高山古树茶叶萃取液。
S1吸附：搅拌棒搅拌吸附罗坑高山古树茶叶萃取液中的黄曲霉素；
首先将5ml罗坑高山古树茶叶萃取液盛于10ml样品瓶中；然后于40℃条件下，将搅拌棒以～rpm转速搅拌罗坑高山古树茶叶萃取液30分钟，使得罗坑高山古树茶叶萃取液中的多种黄曲霉素与氧化石墨烯纳米涂层以及偶联于氧化石墨烯纳米涂层上的黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体结合，从而使得罗坑高山古树茶萃取液中的多种黄曲霉素吸附到搅拌棒上。
S2解析：加热吸附有黄曲霉素的搅拌棒，释放吸附于搅拌棒上的黄曲霉素到检测仪器中；
将S1所得到的吸附结合有黄曲霉素的搅拌棒插入热解析管后，然后放入热解器中，加热器加热室温起以10℃/min升温到85℃，再以10℃/min升温到180℃，最后以5℃/min升温到350℃，使得黄曲霉素从搅拌棒上脱落下来并气化，以气体形式进入气相色谱仪。
S3检测：检测黄曲霉素的含量。
加热后脱落并气化后的六种黄曲霉素直接进入气相色谱仪(GC)，气相色谱仪中的火焰电力检测器(FID)温度为300℃，分流比为20：1，柱流量为1mL/min，载气为高纯氦气；气相色谱将经过热解过程混在一起的多种黄曲霉素分离开来，使其依次进入质谱仪中。质谱仪将每种黄曲霉素离子化后，按离子的质荷比分离并通过测量各种离子谱峰的强度测定每种黄曲霉素的含量，质谱仪中的EI离子源的电压为70eV，离子源温度为250℃，传输线温度为250℃，扫描范围为40-500amu，采用高纯氦气，质谱标准库采用Nist谱图库。
除了本实施例中的罗坑高山古树茶，还可以是碧螺春、信阳毛尖、西湖龙井、君山银针、黄山毛峰、武夷岩茶、祁门红茶、都匀毛尖、铁观音、六安瓜片、凤凰单从、罗坑古树茶、庐山云雾茶、英德红茶、凌云白毫茶、安化黑茶、云南普洱茶、武夷山大红袍、福建银针、金骏眉红茶、苏州茉莉花、台湾东方美人、印度红茶、Vanilla bourbon(南非)、伊藤园绿茶(日本)等茶叶中的任意一种。
相对于现有技术，本发明所述的同步检测六种黄曲霉素的方法通过利用石墨烯的大π键能够结合黄曲霉素中苯环上的大π键，从而实现石墨烯涂层对样品液体中所有种类的黄曲霉素的吸附结合，从而能够一次性完成样本溶液中所有种类的黄曲霉素的含量检测，减少了实验次数，并大大简化了检测过程。另外，本发明所述的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒，由于石墨烯具有良好的稳定性，相对于其他物质形成的涂层，其在解析的过程中不会释放出涂层本身的物质混入黄曲霉素中，从而提高了黄曲霉素检测的准确性；同时，石墨烯涂层相对于其他材料的涂层具有更高的比表面积，能够吸附结合更多的黄曲霉素，避免了样品溶液中的黄曲霉素未被全部吸附，从另一个方面提高了换区霉素检测的准确性；并且，石墨烯相对于其他材料具有更高的机械强度，可以与样品液体接触的过程中经历高强度的冲击和搅拌而不脱落，从而避免了已经吸附结合在石墨烯涂层上的黄曲霉素随脱落的涂层回到样品溶液中导致黄曲霉素的测量不准确，进一步提高了检测的准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.本发明的一种基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将样品溶液与石墨烯涂层接触，以使石墨烯涂层吸附样品溶液中的黄曲霉素；解析吸附结合到石墨烯涂层上的黄曲霉素，使黄曲霉素释放并检测。
2.根据权利要求1所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法，其特征在于：所述石墨烯涂层上偶联有黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体。
3.根据权利要求1所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法，其特征在于：所述石墨烯涂层为氧化石墨烯涂层、氧化氮掺杂石墨烯涂层、氧化硼掺杂石墨烯涂层、氧化氟化石墨烯涂层中的任意一种。
4.根据权利要求1～3任意一种所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的方法，其特征在于：所述解析方式为热解析，并对所述释放的黄曲霉素进行气相色谱-质谱检测。
5.一种基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒，其特征在于：所述搅拌棒表面涂覆有石墨烯涂层。
6.根据权利要求5所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒，其特征在于：所述石墨烯涂层上偶联有黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体。
7.根据权利要求5或6任意一种所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒，其特征在于：所述石墨烯涂层为氧化石墨烯涂层、氧化氮掺杂石墨烯涂层、氧化硼掺杂石墨烯涂层、氧化氟化石墨烯涂层中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒，其特征在于：所述黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体占据所述石墨烯涂层60％～95％面积。
9.根据权利要求8所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒，其特征在于：所述石墨烯涂层上的黄曲霉素B1抗体、黄曲霉素B2抗体、黄曲霉素G1抗体、黄曲霉素G2抗体、黄曲霉素M1抗体和黄曲霉素M2抗体的区域互不交叉。
10.根据权利要求5或9任意一种所述的基于石墨烯纳米材料的同步检测六种黄曲霉素的搅拌棒，其特征在于：所述搅拌棒包括棒体及围设在棒体上并沿其径向延伸的承载面，所述石墨烯涂层涂覆在所述承载面上；所述承载面为沿所述棒体轴向盘旋延伸的螺旋曲面；或所述承载面为若干个与所述棒体垂直的平面。
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