CN111088285A - 携带atp7b基因表达框及变异体的aav载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供含有ATP7B基因表达框或其变异体的重组AAV载体。该AAV载体经静脉注射至肝豆状核变性模型小鼠体内，在肝脏中高效表达产生ATP7B或其变异体蛋白，有效地降低模型小鼠肝脏和尿液中的铜离子含量，显著降低模型小鼠血液中的谷丙转氨酶水平，缓解模型小鼠铜离子积累带来的不良症状，显示出治疗肝豆状核变性的潜力。

Description

携带ATP7B基因表达框及变异体的AAV载体及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及含有的ATP7B基因表达框及变异体的AAV载体，并将其应用于肝豆状核变性的基因治疗药物的开发。

背景技术

肝豆状核变性又称Wilson病，是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体单基因隐性遗传疾病，病变主要累及肝脏、脑、肾脏和角膜等部位，引起进行性加重的肝硬化、基底节损害、肾脏损害及角膜色素环等（Kodama H，et al. Curr Drug Metab. 2012;13(3): 237-250.）。肝豆状核变性由ATP7B基因突变引起，该基因编码铜转运P型ATP酶（copper-transporting P-type ATPase，ATP7B）。ATP7B是一种表达在多器官的膜蛋白，主要功能是促进铜随血液及胆汁排泄。当ATP7B基因发生突变时，ATP7B在细胞内的定位发生改变，其转运铜能力下降，引起血清铜蓝蛋白合成减少、胆管排铜受阻。过量的铜蓄积在体内，引起细胞坏死和器官损害，后期严重影响患者的生活质量，最终可引起死亡。目前，肝豆状核变性的诊断主要依靠典型的临床表现、实验室检查及基因检测，治疗包括青霉胺、锌制剂和肝移植等。早期诊断和早期干预对于延缓疾病的进展和预防不可逆的后遗症至关重要。目前，肝豆状核变性的全球患病率大约为1/3万，在隔离人群（如撒丁岛）中，患病率可达1/1万（Dedoussis GV, et al. Ann Hum Genet. 2005; 69(3):268-274. Gialluisi A, et al.Eur J Hum Genet. 2013;21(11): 1308-1311.），中国香港汉族患病率高达1/5400（MakCM, et al. J Hum Genet. 2008; 53(1): 55-63.）。

虽然对于ATP7B基因突变导致肝豆状核变性的具体分子机制尚不完全清楚，但越来越多的证据表明ATP7B基因突变是导致肝豆状核变性的根本原因。

ATP7B基因位于第13号染色体长臂（13q14.3～q21.1），全长约85kb，包含21个外显子和20个内含子，编码一种由1465个氨基酸组成的ATP7B。ATP7B属于跨膜蛋白，含6个N端金属结合域（N-terminal metal-binding domain，MBD），每个金属结合域都含一段高度保守重复序列蛋氨酸-X-半胱氨酸-X-X-半胱氨酸，8个跨膜通道（transmembrane domain，TM-区），1个ATP结合区（nucleotide-binding domain，N-区），1个磷酸化区（phosphorylationdomain，P-区），1个磷酸酶区（phosphatasedomain，A-区）（Lutsenko S, et al. ArchBiochem Biophys. 2007; 463(2):134-148. Kumari N, et al.Hum Mutat. 2018; 39(12):1926-1941.）。MBD与铜有高亲和力，与抗氧化蛋白1（antioxidant-1，Atox-1）相互作用下接受来自细胞质的铜离子，并促进铜释放到跨膜孔道中（Lenartowicz M, et al.Front Mol Neurosci. 2016; 9:68.）。MBD1～4主要调控其自身间的相互作用，MBD5～6是铜结合位点，能影响ATP7B蛋白的活性及催化能力（Yu CH, et al. IUBMB Life. 2017; 69(4): 226-235.）。半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列位于第6跨膜通道，可选择性通过金属铜离子（Kumari N, et al. Hum Mutat. 2018; 39(12): 1926-1941.）。如果ATP7B基因突变的残基是与ATP或铜的结合的关键位点，可能会引起ATP7B功能的完全丧失；如果突变只是影响对底物的亲和力、减缓构象转变或影响蛋白质的定位，ATP7B可能保留部分转运功能（Huster D, et al. Gastroenterology. 2012; 142(4): 947-956.）。

ATP7B是一种高度表达在肝细胞反式高尔基体网络的跨膜蛋白。铜主要在十二指肠吸收，通过高亲和力铜转运蛋白1参与肝肠循环。到达肝细胞后，铜和金属分子伴侣Atox-1结合并形成复合物，然后与ATP7B以蛋白-蛋白的形式相互作用。铜在ATP7B作用下被转运至反式高尔基体网络，并与相关的酶结合，形成血清铜蓝蛋白，随血液代谢；当肝细胞内的铜离子水平升高至一定程度时，ATP7B从反式高尔基体网络转运至溶酶体，将过量的铜运输到囊泡，铜经胞吐作用随胆汁排泄（Polishchuk EV, et al. Dev Cell. 2014;29(6):686-700）。在这一过程中，ATP7B借助ATP水解释放的能量磷酸化，随后脱磷酸化释放铜跨膜所需的能量。因此，ATP7B依赖性胆汁铜排泄是维持铜代谢平衡的主要方式。

肝豆状核变性ATP7B基因突变类型多样，目前人类基因突变数据库已收录780种ATP7B基因突变，包括491种错义/无义突变、65种剪切位点突变、187种小缺失/插入突变、12种大片段缺失。突变可能发生在基因的任何位置，包括外显子、内含子，甚至是启动子区域。ATP7B基因突变在不同种族和地域中存在遗传异质性。欧洲人群最常见的突变类型是14号外显子上的H1069Q突变，在意大利、瑞典和罗马尼亚等地多见，等位基因频率为30%～70%（Zarina A, et al. Mol Genet Genomic Med. 2017; 5(4): 405-409. Ferenci P, etal. Hum Genet. 2006; 120(2): 151-159.），临床主要以锥体外系症状为主，如震颤、肌张力障碍、精神症状等。亚洲人群最常见的突变类型是8号外显子上的错义突变R778L，以中国、韩国和日本最多见，其等位基因频率为17.3%～60%（Dong Y, et al. Theranostics.2016; 6(5): 638-649.），临床以肝脏方面症状为主，如肝功能异常、肝硬化、肝脾大等；其余常见的还有P992L、Q1399R等。

不同区域发生突变的概率不同。①MBD区（与1～6号外显子相关）：目前已报道位于该区的错义突变有18种，如位于MBD1的G85V，该突变抑制ATP7B与Atox-1的相互作用，影响蛋白和铜的结合（Yu CH, et al. Sci Rep. 2018; 8(1):581.）；②半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸跨膜转运区（与7～10、12、13号外显子相关）：目前报道有103种突变，如R778L、G937S，该区突变主要通过改变蛋白的定位影响其功能（Yu CH, et al. Sci Rep. 2018; 8(1):581.）；③A-区（与11号外显子相关）：目前发现有22种突变，该区域突变可导致ATP7B超磷酸化，引起催化活性的丧失（Yu CH, et al. Sci Rep. 2018; 8(1):581.）；④P-区（与14～16号外显子相关）：有47种突变，如I1148T；⑤N-区（与17～18号外显子相关）：有超过55种突变，该区突变和P-区一起影响蛋白和ATP的结合，造成功能缺失（Yu CH, et al. Sci Rep.2018; 8(1):581. 徐彬,等. 第二军医大学学报. 2014;35(11):1209-1214.）。但即使突变替换的氨基酸发生在同一区域，其编码的蛋白功能改变也不完全相同。

目前，ATP7B基因突变功能研究以错义突变为主，突变主要通过影响蛋白的合成、折叠、定位及降解等过程引起ATP7B蛋白转运功能的减弱或缺失，最终引起铜的沉积。ATP7B基因突变可抑制法尼酯X受体/短异二聚体伴侣通路，引起胆汁酸生成增加，肝功能受损，导致胆汁淤积。铜代谢的主要途径是胆汁，发生胆汁淤积时，进一步影响铜的代谢，从而引起恶性循环（Wooton-Kee CR, et al. J Clin Invest. 2015;125(9):3449-3460.）。

前体mRNA的选择性剪接是真核生物增加蛋白质多样性的重要手段，对于基因表达非常重要，包括5'和3'端剪接等。剪接受顺式作用元件和反式作用因子的调控，如剪接增强子、沉默子等。ATP7B基因中大约有10%的致病突变发生在外显子和内含子连接处的保守剪接位点。研究发现，肝豆状核变性患儿携带ATP7B基因错义突变R919G，该突变位于外显子剪接调控元件区，引起外显子跳跃及氨基酸改变（Wang C, et al. Liver Int. 2018;38(8):1504-1513.）。体内外实验表明R919G出现外显子跳跃，引起剪接增强子破坏、沉默子出现，从而影响外显子12的剪接，引起蛋白功能的缺失（Wang C, et al. Liver Int. 2018;38(8):1504-1513.）。因此，ATP7B基因点突变可能引起严重的mRNA异常剪接，而不是对编码潜能的直接影响。c．1707+5G＞A突变位于5'剪接位点，影响前体mRNA的剪接。研究者利用剪接异常体外功能验证实验（minigene技术）对该突变进行分析，发现c．1707+5G＞A转录产物出现外显子4缺失，其扩增长度为293bp，较野生型的457bp明显缩短；其mRNA表达水平较野生型明显下降（Liu M, et al. J Mol Neurosci. 2018;64(1):20-28.）。外显子4跳跃引起终止密码子提前出现，导致ATP7B蛋白合成提前终止，铜离子通道失活。无义介导的mRNA降解途径是真核细胞中重要的RNA监控机制，可识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子的mRNA，消除异常的剪接形式，避免因截短的蛋白产物积累对细胞造成毒害。

ATP7B基因突变导致ATP7B蛋白结构改变。S653Y突变位点位于一段高度保守区域：G621-S668，在MBD6和TM1之间。该突变不会影响蛋白的定位及其折叠结构，能正常运输铜至反式高尔基体网络，不影响血清铜蓝蛋白的形成;但当细胞内的铜水平升高至一定阈值时，ATP7B仍位于高尔基体内，无法携铜转运至细胞膜。研究发现S653Y突变引起跨膜段TM1内的局部变形，导致跨膜区TM1和TM2的相互作用改变，从而影响ATP7B从反式高尔基体网络转运至溶酶体的过程（Braiterman LT, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111(14):E1364-E1373.）。突变位点在MBD4的G386V和G386D，与野生型相比，其蛋白结构的热稳定性降低、活动性增强。在10℃以下时，大部分MBD4突变体蛋白很稳定，即能正确折叠并且能结合铜，但G386V和G386D不能得到有效折叠。二级结构分析显示：G386V蛋白丧失部分α-螺旋，β-折叠含量增多；而G386D突变蛋白失去β-折叠结构。与野生型相比，这两种突变蛋白的结构对称性增强（Kumar R, et al. Biometals. 2017;30(1): 27-35.）。热稳定性研究表明，这两种突变蛋白去折叠的热温度中点在40～50℃，较野生型的75℃明显下降，提示其蛋白稳定性降低（Kumar R, et al. Biometals. 2017;30(1): 27-35.）。MBD结构的不稳定性直接或间接影响ATP7B各结构域的相互联系，进而影响ATP7B和Atox-1的作用，增加与COMMD-1的相互作用（Kumar R, et al. Biometals. 2017;30(1): 27-35.）。COMMD-1是一个负性调节蛋白稳定性的因子，可以诱导ATP7B的降解及降低铜转运活性。

ATP7B基因突变引起ATP7B蛋白定位异常及表达量减少。ATP7B是定位于反式高尔基体的膜蛋白，主要利用水解ATP释放的能量，将铜排出体外，维持体内铜离子的平衡；突变型ATP7B可滞留在内质网，无法携铜转运，引起铜在肝脏、脑等部位沉积。对25种突变型ATP7B蛋白的铜转运功能进行研究（Huster D, et al. Gastroenterology. 2012; 142(4):947-956.），发现其中大部分突变蛋白的铜转运速率降低、承载铜离子数量减少;其中有16种突变蛋白的铜转运能力仅有野生型的5%～10%，甚至更低，包括D1027A、H1069Q、P840L等；有8种突变保留部分转运能力，如位于A-区的A874V、I857T；而只有M645R突变表现出铜过载现象。研究者将野生型及突变型ATP7B基因质粒转染至HEK293T和Sf9细胞，利用免疫荧光技术检测ATP7B蛋白在细胞中的定位，结果显示R969Q（突变位点在MBD区）蛋白定位在反式高尔基体网络，与野生型一致；L1083F（突变位点在N-区）和A874V（突变位点在A-区）蛋白定位于内质网，定位改变；这三者突变型蛋白表达量较野生型均有明显减少。

对L168P和S1423N研究发现前者蛋白表达量为野生型的（34.3±8）%，后者为（66.0±8）%（GuttmannS, et al. Front Pediatr. 2018;6:106.）。转运实验表明，L168P呈现出铜依赖性，S1423N则对铜水平升高无任何反应。ATP7B突变蛋白的错误定位及表达量减少均可导致其转运铜能力下降。

ATP7B基因突变加快ATP7B蛋白的降解。由p38和c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）介导的促分裂原活化的蛋白激酶信号通路可影响蛋白的稳定性（如囊性纤维化跨膜转导调节因子（Hegde RN, et al. Elife. 2015; 4.pii: e10365.））及调节内质网相关蛋白降解途径。内质网相关蛋白降解途径可保证正确折叠的蛋白质输出，对错误折叠的蛋白质进行鉴别、分类和降解，以此清除细胞内无功能的蛋白。研究发现，在过表达H1069Q突变的细胞中，p38和JNK表达明显升高（Chesi G, et al. Hepatology. 2016;63(6): 1842-1859.）。被激活的促分裂原活化的蛋白激酶信号通路诱导错误折叠的H1069Q蛋白滞留在内质网，并且通过内质网相关蛋白降解途径加快了突变蛋白的降解速度；同时由于细胞内铜离子的蓄积，活性氧离子水平增加，进一步影响内质网的稳态环境，形成恶性循环。上述研究结果提示，p38和JNK抑制剂可以通过对转录因子的调节，纠正H1069Q、D765N、L776V和R778L突变型蛋白的错误定位，提高ATP7B蛋白在反式高尔基体网络的表达及其转运能力；减少蛋白的降解，促进铜的代谢，降低细胞内铜离子的水平；但对于A874V和L1083F突变没有明显纠正作用。

分子伴侣类药物可纠正突变型ATP7B蛋白的错误折叠。α晶状体蛋白B链（α-crystallinBchain，CRYAB）是胞质分子伴侣，属于小热激蛋白类，可以与跨膜蛋白结合，抑制多聚体复合物的形成，促进突变型蛋白正确折叠。研究显示，CRYAB可以与ATP7B-H1069Q在内质网处相互作用，抑制突变蛋白中大段寡聚合物的形成（D′Agostino M, et al. JCell Sci. 2013;126(Pt18): 4160-4172.）。免疫荧光结果提示，在与CRYAB共转染下，超过60%的H1069Q蛋白恢复其正常定位。当细胞内铜水平升高时，CRYAB可以促进H1069Q重新分布于高尔基体囊泡，但对于H1069Q蛋白携铜排出体外的能力无明显提高。姜黄素是一种内质网的钙离子ATP酶抑制剂，对膜定位有纠正作用。4-苯丁酸钠可以通过帮助突变蛋白正确折叠，利用泛素-蛋白酶体途径降解错误折叠蛋白，减少蛋白质在内质网的沉积，并且通过稳定蛋白构象促进突变蛋白的转运。研究报道显示，在30℃环境下或使用4-苯丁酸钠和姜黄素干预，G85V、R778L和H1069Q等突变型蛋白的错误折叠可被部分纠正，引起膜蛋白表达增加，并随药物浓度升高而升高，其异常定位可被纠正（van den Berghe PV, et al.Hepatology. 2009;50(6):1783-1795.）。

肝豆状核变性是一种常染色体隐性遗传疾病，临床表现多样，受基因、年龄、饮食、脂质代谢、种族等多种因素影响，给疾病的诊断和治疗增加难度。ATP7B基因突变引起编码蛋白错误折叠，导致ATP7B滞留在内质网、其催化及转运活性功能减弱或丧失，引起铜离子在肝脏、脑等部位沉积。关于铜介导的组织损伤机制目前仍不完全清晰。过量的铜蓄积在组织内可能会引起一系列氧化应激反应，破坏线粒体的结构和完整性，导致细胞损伤及凋亡。铜诱导的活性氧类水平增加和脂质过氧化均可造成线粒体的损失（Sauer SW, et al.Biochim Biophys Acta. 2011; 1812(12): 1607-1615.）。同时，铜离子的积聚会引起肝细胞内锌的重新分布而损伤肝细胞（Meacham KA, et al. Metallomics. 2018; 10(11):1595-1606.）。

目前，肝豆状核变性的治疗包括药物治疗、手术治疗、基因和细胞治疗、康复治疗等。在我国，由于D-青霉胺经济有效，是治疗肝豆状核变性的经典药物之一；但是对于有严重神经系统症状，特别是伴有肌肉僵硬的患者D-青霉胺不宜被使用（Cocos R, et al.PLoS One. 2014; 9(6): e98520. Zhang JW, et al. Biochem Biophys Res Commun.2015; 458(1): 82-85.）。研究显示，某些分子伴侣类药物（如4-苯丁酸）及p38和JNK抑制剂可以纠正突变蛋白的错误定位，恢复蛋白的转运功能；小分子物质DPM-1001能有效降低肝豆状核变性小鼠模型中肝脏及脑部的铜水平（Krishnan N, et al. Genes Dev. 2018; 32(13-14): 944-952.）。个体化的细胞和（或）基因治疗是目前的研究热点，其根本目的是恢复ATP7B介导的肝胆管排泄铜的功能（Gupta S. Ann NY Acad Sci. 2014; 1315: 70-80.），可能是未来最有前景的治疗方法。

本发明提出拟用重组AAV载体携带ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框，用于治疗肝豆状核变性的药物开发策略。AAV载体经静脉注射后，能够有效地转导肝细胞，将携带的ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框导入肝细胞，持续表达产生具有正常生理功能的ATP7B蛋白或截短的ATP7B蛋白，恢复肝豆状核变性模型动物体内的铜离子排泄功能，从而达到治疗肝豆状核变性的目的。ATP7B基因表达框选择人为设计的序列短小、表达强度高的肝脏特异性启动子调控ATP7B基因转录，ATP7B经人源密码子表达优化，显著提高ATP7B基因表达框在肝细胞中的ATP7B蛋白表达效率。考虑到AAV载体携带基因组的容量大小限制，选择人为设计的短小的polyA加尾信号，保证设计的ATP7B基因表达框能够被AAV载体携带。在此基础上，我们参考文献设计了截短的ATP7B基因表达框（Guo Y, et al. AmJ Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005; 289: G904-G916.）。截短的ATP7B基因编码序列长度明显短于ATP7B基因编码序列，因此在二者表达框采用相同的启动子情况下，截短的ATP7B基因表达框选择了效率更高的加尾信号，有助于提高基因的表达效率。选择高嗜肝性的AAV载体携带ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框，使重组AAV病毒经静脉注射后高效地转导肝细胞，表达产生ATP7B蛋白或截短的ATP7B蛋白，从而达到治疗肝豆状核变性的目的。

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.Hoggan MD, et al. Proc Natl Sci USA. 1966; 55: 1467-1474.）。AAV是微小病毒科（Parvovirus）成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA（Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.），其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒（Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.），或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态（Chiorini JA, et al. Curr Top Microbiol Immunol. 1996; 218:25-33.），而不产生子代病毒。

最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）（Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.）。AAV2基因组长约4.7kb,基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”（inverted terminal repeat, ITR），呈回文-发卡结构（Lusby E, et al. J Virol. 1980; 34: 402-409.）。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中（Samulski RJ, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.）。

ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用（Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948.）。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site, RBS）和末端解链位点trs（terminal resolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口（Linden RM, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.）。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用（Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.）。

AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区（Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.）。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolution site）和GAGY重复基序（repeat motif）特异性结合（Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.），启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织（Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.）。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导致大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能（Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.）。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性（Gruntman AM, et al. Hum Gene Ther Methods. 2015; 26(2): 71-76.），容易开发出稳定性较高的生物制品。

AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type 1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（Yuan Z, et al. Hum Gene Ther. 2011; 22(5):613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999; 44(5): 506-509. Conway JE, et al. Gene Ther. 1999; 6:986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（Wustner JT, et al. Mol Ther. 2002; 6(4):510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Inverted terminal repeat, ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（Booth MJ,et al. Gene Ther.2004; 11:829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（Thomas DL, et al. Gene Ther.2009; 20:861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（Chen H. Mol Ther. 2008; 16(5): 924-930. Galibert L,et al.J Invertebr Pathol.2011; 107 Suppl:S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（MietzschM, et al. Hum Gene Ther. 2014; 25: 212-222. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther.2015; 26(10): 688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。

由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2018年12月，世界上批准的基于AAV载体的基因治疗临床试验方案有238项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.）；2017年12月19日美国FDA批准先天性黑曚症（RPE65基因突变引起）基因治疗药物Luxturna上市，成为美国第一个罕见病的基因治疗药物（https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm589467.htm）；2019年5月24日美国FDA批准脊髓性肌萎缩（SMN1基因突变引起）基因治疗药物Zolgensma上市成为世界上第一个静脉注射系统给药的基因治疗药物（https://www.fda.gov/media/126130/download），标志着AAV载体基因治疗药物研制进入新的阶段。血友病B（Kay MA, et al. Nat Genet. 2000;24(3): 257-261.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。

本发明中，我们选择AAV载体来携带ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中病毒包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射对肝脏具有较高的转导效率（Sands MS. Methods Mol Biol. 2011; 807: 141-157. Wang L, et al.Mol Ther. 2015; 23(12): 1877-1887.），保证携带ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框能够高效地转导肝脏，在肝脏内表达产生ATP7B蛋白或截短的ATP7B蛋白。

根据以上设计思路，我们制备得到一系列重组AAV载体，用于治疗肝豆状核变性的药物开发策略。这些重组AAV载体分别携带ATP7B基因表达框或含有截短的ATP7B基因表达框。首先，将携带ATP7B基因表达框的重组AAV8载体，经尾静脉以高中低等3个不同的剂量注射肝豆状核变性模型小鼠atp7b^-/-小鼠。注射病毒后，检测模型小鼠血清中转氨酶水平、尿液中铜离子含量和肝脏组织中铜离子含量测定、肝脏中ATP7B mRNA表达水平，验证ATP7B基因表达框的有效性以及不同病毒注射剂量对肝豆状核变性模型小鼠atp7b^-/-小鼠作用效果的影响。接下来，将含有ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框的重组AAV8载体经尾静脉以高中低等3个不同的剂量注射肝豆状核变性模型小鼠atp7b^-/-小鼠，以验证截短的ATP7B基因表达框的功能。在此基础上，我们用不同血清型的AAV载体携带截短的ATP7B基因表达框，经尾静脉将AAV病毒注射肝豆状核变性模型小鼠atp7b^-/-小鼠，以比较不同血清型AAV载体作用效果的差异。结果表明，设计的ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框用AAV载体携带后，经静脉给药能够有效地转导肝脏，表达产生ATP7B蛋白或截短的ATP7B蛋白，显著缓解肝豆状核变性模型小鼠中的症状，显示出开发成为肝豆状核变性基因治疗药物的潜力。而且不同的血清型AAV载体携带截短的ATP7B基因表达框，经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠后，都能够有效地缓解模型小鼠的生理症状，表明除了AAV8外的其他血清型AAV也可以用于肝豆状核变性基因治疗药物的开发。总之，本发明提出了肝豆状核变性基因治疗药物的开发方法，为肝豆状核变性的治疗提供了新的选择。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一系列携带ATP7B基因表达框或含有截短的ATP7B基因表达框的重组AAV载体，用于治疗肝豆状核变性的药物开发策略。首先，我们设计ATP7B基因表达框和截短的ATP7B基因表达框，构建得到两种表达框的AAV载体质粒，将两种质粒包装得到不同血清型的AAV病毒。然后，将携带ATP7B基因表达框的重组AAV8载体AAV8-LP15-ATP7B，经尾静脉以高中低等3个不同的剂量注射肝豆状核变性模型小鼠atp7b^-/-小鼠，评价AAV8-LP15-ATP7B的有效性以及不同注射剂量对其有效性的影响。接下来，以AAV8-LP15-ATP7B为对照，将携带截短的ATP7B（ΔC4ATP7B）基因表达框的重组AAV8载体AAV8-LP15-ΔC4ATP7B，经尾静脉以高中低等3个不同的剂量注射肝豆状核变性模型小鼠atp7b^-/-小鼠，评价AAV8-LP15-ΔC4ATP7B的有效性以及不同注射剂量对其有效性的影响。在此基础上，用不同血清型的AAV载体携带ΔC4ATP7B基因表达框，得到AAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、AAV5-LP15-ΔC4ATP7B和AAV9-LP15-ΔC4ATP7B等3种重组病毒。以AAV8-LP15-ΔC4ATP7B为对照，经尾静脉将AAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、AAV5-LP15-ΔC4ATP7B和AAV9-LP15-ΔC4ATP7B等3种AAV病毒注射肝豆状核变性模型小鼠atp7b^-/-小鼠，评价不同AAV血清型对模型动物作用效果影响。这些实验结果表明，设计的ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框用AAV载体携带后，经静脉给药能够有效地转导肝脏，表达产生ATP7B蛋白或截短的ATP7B蛋白，显著缓解肝豆状核变性模型小鼠中的症状，显示出开发成为肝豆状核变性基因治疗药物的潜力。而且不同的血清型AAV载体携带截短的ATP7B基因表达框，经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠后，都能够有效地缓解模型小鼠的生理症状，表明除了AAV8外的其他血清型AAV也可以用于肝豆状核变性基因治疗药物的开发。总之，本发明提出的肝豆状核变性基因治疗药物候选显示出较大的开发价值，为肝豆状核变性的治疗提供了新的选择。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种ATP7B基因表达框设计，其特征在于，该表达框由人为设计的肝脏特异性启动子LP15启动子、人源表达密码子优化的ATP7B编码序列和短小的人为设计的polyA加尾信号组成，表达框大小为4.8kb。表达框加上两个ITR序列，大小为5.1kb，接近AAV病毒载体的包装极限。该表达框能够在肝细胞中特异性地高表达产生ATP7B蛋白。具体过程详见实施例1。

本发明提供了一种截短的ATP7B基因表达框设计，其特征在于，该表达框由人为设计的肝脏特异性启动子LP15启动子、截短的ATP7B编码序列和牛生长激素的polyA加尾信号（BGH polyA）序列组成。截短的ATP7B编码序列ΔC4ATP7B参考文献（Guo Y, et al. Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol. 2005; 289: G904-G916.）合成，删除了全长ATP7B蛋白中4个铜离子结合的结构域，缩短基因编码序列长度，但不影响其生物学功能。截短的ΔC4ATP7B编码序列比全长的ATP7B编码序列短1.1kb，使ΔC4ATP7B表达框“LP15-ΔC4ATP7B-BGH polyA”的序列大小比ATP7B表达框“LP15-ATP7B-SPA”的序列短0.9kb，表达框大小为3.9kb，小于4.7kb，能够有效地被包装成各种AAV病毒。该表达框能够在肝细胞中特异性地高表达产生ATP7B蛋白。具体实施过程见实施例1。

本发明提供的一种携带ATP7B基因表达框的重组AAV8病毒AAV8-LP15-ATP7B，其特征在于，该重组病毒以高中低3个剂量经尾静脉注射肝豆状模型小鼠atp7b^-/-小鼠后，能够有效地降低肝豆状模型小鼠血清中的转氨酶水平、降低血液中和尿液中的铜离子含量，显著改善肝豆状核变性症状，且作用效果呈现出明显的剂量依赖性。用定量PCR方法在注射病毒小鼠肝脏中检测到ATP7B mRNA的表达。结果说明AAV8-LP15-ATP7B具有开发成为肝豆状核变性基因治疗药物的潜力。具体实施过程见实施例3。

本发明提供的一种携带ΔC4ATP7B基因表达框的重组AAV8病毒AAV8-LP15-ΔC4ATP7B，其特征在于，该重组病毒以高中低3个剂量经尾静脉注射肝豆状模型小鼠atp7b^-/-小鼠后，也能够有效地降低肝豆状模型小鼠血清中的转氨酶水平、降低血液中和尿液中的铜离子含量，显著改善肝豆状核变性症状，且作用效果呈现出明显的剂量依赖性。AAV8-LP15-ΔC4ATP7B的作用效果与AAV8-LP15-ATP7B的作用效果之间未见明显差异。用定量PCR方法在注射病毒小鼠肝脏中检测到ΔC4ATP7B mRNA的表达。结果说明AAV8-LP15-ΔC4ATP7B也具有开发成为肝豆状核变性基因治疗药物的潜力。具体实施过程见实施例4。

本发明提供的携带ΔC4ATP7B基因表达框的重组AAV病毒，包括AAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、AAV5-LP15-ΔC4ATP7B和AAV9-LP15-ΔC4ATP7B，其特征在于，同AAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒一样，这些重组病毒经尾静脉注射肝豆状模型小鼠atp7b^-/-小鼠后，也能够有效地降低肝豆状模型小鼠血清中的转氨酶水平、降低血液中和尿液中的铜离子含量，显著改善肝豆状核变性症状。用定量PCR方法在注射病毒小鼠肝脏中也检测到ΔC4ATP7B mRNA的表达。结果说明除AAV8外，其他血清型AAV载体（如AAV3B、AAV5和AAV9等），也能够用于肝豆状核变性基因治疗药物的开发。具体实施过程见实施例5。

本发明提供的携带ATP7B基因表达框和/或ΔC4ATP7B基因表达框的重组AAV 病毒，其特征还在于，重组病毒经静脉注射至小鼠体内后，能够持续有效地表达产生ATP7BmRNA或ΔC4ATP7B mRNA，进一步翻译成ATP7B蛋白或截短的ATP7B蛋白，恢复模型小鼠的铜代谢功能，降低模型小鼠体内的转氨酶水平以及尿液和血液中的铜离子含量，为肝豆状核变性基因药物的开发提供了新的选择。具体实施例见实施例3、实施例4和实施例5。

本发明用到的重要原始实验材料如下所示：

pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。

pAAV-R2C3B质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV3B基因组（GenBank ID：AF028705）中外壳蛋白编码序列Cap3B（基因组中第2208至4418位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C3B质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C3B质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C3B质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C3B质粒。pAAV-R2C3B质粒包含完整的AAV3B的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV3B病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV3B外壳蛋白。

pAAV-R2C5质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV基因组（GenBank ID：NC_006152.1）中外壳蛋白编码序列Cap5（基因组中第2207至4381位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C5质粒序列。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C5质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C5质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C5质粒。pAAV-R2C5质粒包含完整的AAV5的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV5病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV5外壳蛋白。

pAAV-R2C8质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV8基因组（GenBank ID：AF513852）中外壳蛋白编码序列Cap8（基因组中第2121至4337位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV8病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV8外壳蛋白。

pAAV-R2C9质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV9外壳蛋白编码序列（GenBankID：AY530579）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C9质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C9质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII和PmeI酶切位点之间序列获得pAAV-R2C9质粒。pAAV-R2C9质粒包含完整的AAV9的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV9病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV9外壳蛋白。

肝豆状核变性模型制备种鼠：atp7b基因杂合的B6；129S1-Atp7b^tm1Tcg/LtsnkJ雄性和雌性小鼠购自美国Jacksonlaboratory，商品号为032624。利用同源重组方法用neo基因表达框替换小鼠atp7b基因的外显子2，缺失外显子2的atp7b基因不能表达产生ATP7B蛋白。肝豆状核变性模型atp7b^-/-小鼠由雌雄杂合种鼠交配制备而来。制备得到模型采用PCR方法进行鉴定，鉴定方法和过程参见Jackson Laboratory网站。

C57BL/6小鼠：购自北京华阜康生物科技股份有限公司，用作动物实验的野生型小鼠。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（Dong X, et al. PLoS ONE. 2010; 5(10):e13479.）。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图2 pAAV2-LP15载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。LP15 promoter，人为设计的肝脏特异性启动子，序列信息详见SEQID NO.1。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图3 pAAV2-LP15-EGFP载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。LP15 promoter，人为设计的肝脏特异性启动子，序列信息详见SEQ ID NO.1。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。EGFP，增强型绿色荧光蛋白编码区序列。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图4 pAAV2-LP15-ATP7B载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。LP15 promoter，人为设计的肝脏特异性启动子，序列信息详见SEQ ID NO.1。SPA，人为设计的多聚核苷酸加尾信号，序列信息详见SEQ ID NO.2。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。ATP7B，密码子优化的ATP7B编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.3。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图5 pAAV2-LP15-ΔC4ATP7B载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。LP15 promoter，人为设计的肝脏特异性启动子，序列信息详见SEQ ID NO.1。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号，序列信息详见SEQ IDNO.2。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。ΔC4ATP7B，截短且密码子优化的ATP7B编码序列，序列信息详见SEQ ID NO.4。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。

图6 注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒小鼠血清中的谷丙转氨酶水平检测结果。rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。未注射病毒的野生型小鼠为阳性对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）为阴性对照，注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），尾静脉采血，分离血清，用试剂盒测定血清中的谷丙转氨酶水平。野生型，未注射病毒的野生型小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。IU/L，谷丙转氨酶活性单位。

图7 注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒小鼠尿液中的铜离子水平检测结果。rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。未注射病毒的野生型小鼠为阳性对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）为阴性对照，注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），收集24h内小鼠排出尿液，测定收集尿液中铜离子总量。野生型，未注射病毒的野生型小鼠尿液中的铜离子总量。对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。ng/24h，24h内小鼠排出尿液的铜离子总量，含量用ng表示。

图8 注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒小鼠肝脏中的铜离子水平检测结果。rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。未注射病毒的野生型小鼠为阳性对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）为阴性对照，注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，测定干燥的肝脏组织中的铜离子总量。野生型，未注射病毒的野生型小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。μg/g干燥组织，每克干燥肝脏组织中的铜离子总量，含量用μg表示。

图9 注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒小鼠肝脏中的ATP7B mRNA表达水平检测结果。rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）为阴性对照，注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，提取总RNA，反转录定量PCR测定100ng总RNA中ATP7B mRNA含量，用于表示小鼠肝脏中转导ATP7B基因的表达水平。对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ATP7B mRNA的表达水平。1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ATP7B mRNA的表达水平。3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ATP7B mRNA的表达水平。9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ATP7B mRNA的表达水平。copies/100ng总RNA，100ng总RNA中ATP7B mRNA拷贝数。

图10 注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒小鼠血清中的谷丙转氨酶水平检测结果。rAAV8-LP15-ATP7B或rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），尾静脉采血，分离血清，用试剂盒测定血清中的谷丙转氨酶水平。ATP7B-1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。ΔATP7B-1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。ATP7B-3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。ΔATP7B-3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。ATP7B-9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。ΔATP7B-9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。

图11 注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒小鼠尿液中的铜离子水平检测结果。rAAV8-LP15-ATP7B或rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），收集24h内小鼠排出尿液，测定收集尿液中铜离子总量。ATP7B-1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。ΔATP7B-1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。ATP7B-3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。ΔATP7B-3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。ATP7B-9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。ΔATP7B-9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。ng/24h，24h内小鼠排出尿液的铜离子总量，含量用ng表示。

图12 注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒小鼠肝脏中的铜离子水平检测结果。rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，测定干燥的肝脏组织中的铜离子总量。ATP7B-1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。ΔATP7B-1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。ATP7B-3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。ΔATP7B-3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。ATP7B-9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。ΔATP7B-9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠干燥肝脏组织中的铜离子总量。μg/g干燥组织，每克干燥肝脏组织中的铜离子总量，含量用μg表示。

图13 注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒小鼠肝脏中的ΔC4ATP7B mRNA表达水平检测结果。rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，提取总RNA，反转录定量PCR测定100ng总RNA中ATP7B mRNA或ΔC4ATP7B mRNA含量，用于表示小鼠肝脏中转导ATP7B基因或ΔC4ATP7B基因的表达水平。ATP7B-1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ATP7BmRNA的表达水平。ΔATP7B-1E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（1E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ΔC4ATP7B mRNA的表达水平。ATP7B-3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ATP7B mRNA的表达水平。ΔATP7B-3E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ΔC4ATP7B mRNA的表达水平。ATP7B-9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ATP7BmRNA的表达水平。ΔATP7B-9E+10vg/只，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（9E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ΔC4ATP7B mRNA的表达水平。copies/100ng总RNA，100ng总RNA中ATP7BmRNA拷贝数。

图14 不同血清型AAV载体注射小鼠后血清中的谷丙转氨酶水平检测结果。rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），尾静脉采血，分离血清，用试剂盒测定血清中的谷丙转氨酶水平。AAV3B，注射rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。AAV5，注射rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。AAV8，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。AAV9，注射rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠血清中的谷丙转氨酶水平。

图15 不同血清型AAV载体注射小鼠后尿液中的铜离子水平检测结果。rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），收集24h内小鼠排出尿液，测定收集尿液中铜离子总量。AAV3B，注射rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。AAV5，注射rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。AAV8，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。AAV9，注射rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠尿液中的铜离子总量。ng/24h，24h内小鼠排出尿液的铜离子总量，含量用ng表示。

图16 不同血清型AAV载体注射小鼠后肝脏中的铜离子水平检测结果。rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，测定干燥的肝脏组织中的铜离子总量。AAV3B，注射rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠干燥肝组织中的铜离子总量。AAV5，注射rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠干燥肝组织中的铜离子总量。AAV8，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠干燥肝组织中的铜离子总量。AAV9，注射rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠干燥肝组织中的铜离子总量。μg/g干燥组织，每克干燥肝脏组织中的铜离子总量，含量用μg表示。

图17 不同血清型AAV载体注射小鼠后肝脏中的ΔC4ATP7B mRNA表达水平检测结果。rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，提取总RNA，反转录定量PCR测定100ng总RNA中ΔC4ATP7B mRNA含量，用于表示小鼠肝脏中转导ΔC4ATP7B基因的表达水平。AAV3B，注射rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ΔC4ATP7B mRNA的表达水平。AAV5，注射rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ΔC4ATP7BmRNA的表达水平。AAV8，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ΔC4ATP7B mRNA的表达水平。AAV9，注射rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）小鼠肝脏组织中的ΔC4ATP7B mRNA的表达水平。copies/100ng总RNA，100ng总RNA中ATP7B mRNA拷贝数。

具体实施方式

本发明公开了一系列携带ATP7B基因表达框或截短的ATP7B基因表达框的重组AAV病毒，包含基因表达框的设计、重组AAV病毒的小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 质粒载体构建

为了包装获得本专利发明过程需要用到的AAV病毒，需要构建一系列AAV质粒载体。这些AAV质粒载体可分为三类，第一类为对照病毒包装需要的质粒载体pAAV2-LP15-EGFP；第二类为ATP7B基因表达框的AAV质粒载体pAAV2-LP15-ATP7B；第三类为截短的ATP7B基因表达框的AAV质粒载体pAAV2-LP15-ΔC4ATP7B。所有的AAV质粒载体构建均以本公司构建保存的pAAV2neo载体为基础，pAAV2neo的结构如图1所示。

（1）对照病毒包装需要的质粒载体pAAV2-LP15-EGFP构建

首先在本公司设计保存的肝脏特异性启动子LP15（序列信息见SEQ ID NO.1）的5’端添加XhoI酶切位点“5’-CTCGAG-3’”以及3’端添加KpnI酶切位点“5’-GGTACC-3’”，得到LP15-XK序列，序列信息详见SEQ ID NO.5。将LP15-XK序列发送南京金斯瑞公司合成，克隆入pUC57-1.8K载体（南京金斯瑞公司），得到pUC57-1.8K-LP15-XK载体。XhoI和KpnI双酶切消化pUC57-LP15-XK载体，回收长度为0.35kb片段备用。XhoI和KpnI双酶切消化pAAV2neo载体，回收长度为6.2kb片段备用。将两个回收备用片段连接，转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到pAAV2-LP15载体（图2）。pAAV2-LP15载体即为将pAAV2neo质粒载体中的CMV启动子替换为LP15启动子的AAV质粒载体。

接下来，以pCMV-C-EGFP（碧云天生物技术有限公司，中国）为模板，设计引物EGFP-F/EGFP-R，PCR扩增EGFP基因编码区序列，EGFP-F和EGFP-R引物中分别含有KpnI和EcoRI酶切位点。扩增得到EGFP编码区序列片段，用EcoRI和KpnI双酶切消化后回收备用。用EcoRI和KpnI分别双酶切消化pAAV2-LP15载体，回收线性化的pAAV2-LP15载体片段（约6.5kb）。将两个回收片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有EGFP基因表达框的AAV质粒载体pAAV2-LP15-EGFP（见图3）。

EGFP-F: 5’-ataggtaccgccaccatggtgagcaag-3’ (SEQ ID NO.6)

EGFP-R: 5’-gcggaattcttacttgtacagctcgtc-3’ (SEQ ID No.7)

（2）ATP7B基因表达框的AAV质粒载体pAAV2-LP15-ATP7B构建

在NCBI Protein数据库中搜索得到人ATP7B序列（ID：NP_000044.2），命名为ATP7B-P，蛋白氨基酸序列详见SEQ ID NO.8。将ATP7B蛋白序列由南京金斯瑞公司按照人源表达优化，命名为ATP7B，序列信息详见SEQ ID NO.3。根据“GGTACC+GCCACC+ATP7B+TGATAA+AGATCT+ tcgagaggcctaataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtg+GGATCC”原则，分别在ATP7B序列的5’端和3’端添加序列，得到ATP7B-KB序列，克隆入pUC-1.8K载体，得到pUC-1.8K-ATP7B-KB，ATP7B-KB序列信息详见SEQ ID NO.9。添加序列中，其中“GGTACC”为KpnI酶切位点， “GCCACC”为Kozak序列，“TGATAA”为终止密码子序列，“AGATCT”为BglII酶切位点，“tcgagaggcctaataaagagctcagatgcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtg”为人为设计的多聚腺苷酸加尾信号，详细的序列信息见SEQ ID NO.2，“GGATCC”为BamHI酶切位点。KpnI和BamHI双酶切消化pUC-1.8K-ATP7B-KB载体，回收长度为4.5kb片段备用。KpnI和BamHI双酶切消化pAAV2-LP15载体，回收长度为6.3kb片段备用。将两个回收片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有ATP7B基因表达框的AAV质粒载体pAAV2-LP15-ATP7B（见图4）。

（3）ΔC4ATP7B基因表达框的AAV质粒载体pAAV2-LP15-ΔC4ATP7B构建

在NCBI Protein数据库中搜索得到人ATP7B序列（ID：NP_000044.2），命名为ATP7B-P，蛋白氨基酸序列详见SEQ ID NO.8。参考文献（Guo Y, et al. Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol. 2005; 289: G904-G916.），找出ATP7B-P序列第1到第4铜离子结合结构域对应的氨基酸序列，命名为ATP7B-C4，序列信息详见SED ID NO.10。删除ATP7B-P序列中的ATP7B-C4序列，得到ΔC4ATP7B-P序列，氨基酸序列信息详见SEQ IDNO.11。将ΔC4ATP7B-P蛋白序列由南京金斯瑞公司按照人源表达优化，命名为ΔC4ATP7B，序列信息详见SEQ ID NO.4。根据“GGTACC+GCCACC+ΔC4ATP7B+TGATAA+AGATCT”原则，分别在ΔC4ATP7B序列的5’端和3’端添加序列，得到ΔC4ATP7B-KB序列，克隆入pUC-1.8K载体，得到pUC-1.8K-ΔC4ATP7B-KB，ΔC4ATP7B-KB序列信息详见SEQ ID NO.12。添加序列中，其中“GGTACC”为KpnI酶切位点，“GCCACC”为Kozak序列，“TGATAA”为终止密码子序列，“AGATCT”为BglII酶切位点。KpnI和BglII双酶切消化pUC-1.8K-ΔC4ATP7B-KB载体，回收长度为3.3kb片段备用。KpnI和BglII双酶切消化pAAV2-LP15载体，回收线性化的长度为6.5kb片段备用。将两个回收片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有ΔC4ATP7B基因表达框的AAV质粒载体pAAV2-LP15-ΔC4ATP7B（见图5）。

实施例2 重组AAV病毒制备及检定

参照文献(Xiao X, et al. J Virol. 1998;72(3):2224-2232.)，应用三质粒包装系统包装AAV病毒和氯化铯密度梯度离心分离纯化包装得到重组AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（指本发明中名称含有“pAAV2”字样的质粒）（pAAV2-LP15-EGFP、pAAV2-LP15-ATP7B或pAAV2-LP15-ΔC4ATP7B）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（指本发明中名称含有“pAAV-R”字样的质粒）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到6种重组病毒。具体为rAAV8-LP15-EGFP、rAAV8-LP15-ATP7B、rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B和rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B。

采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。定量PCR检测过程应用TaqMan探针法。包装得到重组AAV病毒用AAV载体通用性定量PCR检测引物和探针测定基因组滴度。定量PCR检测引物探针序列见文献（Aurnhammer C, et al. Hum Gene TherMethods. 2012;23(1):18-28.）。具体的序列信息如下，

ITR-F: 5’-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’ (SEQ ID NO.13)

ITR-R: 5’-CGGCCTCAGTGAGCGA-3’ (SEQ ID NO.14)

ITR-P: 5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-3’ (SEQ ID NO.15)

其中ITR-F和ITR-R为引物，ITR-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以ITR-F和ITR-R为引物特异性地扩增包装病毒ITR中长度为62bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1μg/μl的pAAV2-LP15-EGFP质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用Premix Ex Taq (ProbeqPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Aurnhammer C, et al. Hum Gene Ther Methods. 2012;23(1):18-28.）。

实施例3不同剂量的rAAV8-LP15-ATP7B病毒注射模型动物实验结果

以rAAV8-LP15-EGFP病毒为对照，携带ATP7B表达框的重组AAV8病毒以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠，检测血清中转氨酶、尿液中铜离子含量和肝脏组织中铜离子含量测定、肝脏中ATP7B mRNA表达水平，以验证rAAV8-LP15-ATP7B的有效性以及不同剂量对有效性的影响。同时设置野生型C57BL/6小鼠为对照，以观察正常小鼠的转氨酶水平变化。

肝豆状核变性小鼠atp7b^-/-由肝豆状核变性模型制备种鼠交配制备而得。种鼠购自美国Jackson Laboratory，为杂合的B6；129S1-Atp7b^tm1Tcg/LtsnkJ雄性和雌性小鼠，商品号为032624。制备得到模型采用PCR方法进行鉴定，鉴定方法和过程参见JacksonLaboratory网站。

首先，rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）等3种剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。未注射病毒的野生型小鼠为阳性对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）为阴性对照，注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），尾静脉采血，分离血清，用试剂盒测定（Merck）血清中的谷丙转氨酶水平，检测过程参见试剂盒说明书。结果如图6所示。从图6的结果可知，相比注射rAAV8-LP15-EGFP病毒的模型小鼠组，在同一时间点注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒的模型小鼠的谷丙转氨酶活性均明显降低，且随着注射剂量的增加，谷丙转氨酶活性降低程度越高，逐渐接近或达到未注射病毒的野生型小鼠的谷丙转氨酶水平。而且随着时间的增加，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒模型小鼠的谷丙转氨酶水平逐渐升高，但注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒小鼠却随着时间延长未见明显变化。

接下来，rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）等3种剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。未注射病毒的野生型小鼠为阳性对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）为阴性对照，注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），收集24h内小鼠排出尿液，测定收集尿液中铜离子总量，测定方法及操作过程参见文献（Murillo O, et al. Journal ofHepatology. 2016; 64(2):419-426.）。结果如图7所示。从图7的结果可知，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒模型小鼠尿液中的铜离子含量随着时间延长，含量逐渐升高。同一时间点，而注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒模型小鼠的尿液中铜离子含量明显低于注射rAAV8-LP15-EGFP模型小鼠，且随着注射计量的增加，尿液中铜离子含量逐渐降低，直至接近或到达野生型小鼠尿液中的铜离子水平。而且，随着注射病毒后时间的延长，尿液铜离子含量未见明显变化。

然后，rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）等3种剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。未注射病毒的野生型小鼠为阳性对照，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）为阴性对照，注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，测定干燥的肝脏组织中的铜离子总量，测定方法及操作过程参见文献（Murillo O, et al. Journal of Hepatology. 2016; 64(2):419-426.）。检测结果如图8所示。从图8的结果可知，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒模型小鼠的肝脏中铜离子含量明显高注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒模型小鼠以及未注射病毒的野生型小鼠。而且注射rAAV8-LP15-ATP7B病毒模型小鼠的肝脏中的铜离子含量，随着注射病毒剂量的增加，铜离子含量逐渐降低，直至接近或达到野生型小鼠水平。

最后， rAAV8-LP15-ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）等3种剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠）。注射rAAV8-LP15-EGFP病毒（9E+10vg/只）为阴性对照，注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，用TRIzol试剂（Invitrogen，15596018）提取总RNA，反转录定量PCR测定100ng总RNA中ATP7B mRNA含量，用于表示小鼠肝脏中转导ATP7B基因的表达水平。人工合成定量PCR检测用RNA标准品，命名为ATP7B-SR，序列信息详见SEQ ID NO.16。RNA标准品由ThermoFisher Scientific公司合成，长度为100nt，用无RNase水稀释至1×10¹⁰copies/μL备用。定量PCR检测用引物为ATP7B-Q-F（SEQ ID NO.17）和ATP7B-Q-R（SEQ ID NO.18），探针为ATP7B-Q-P（SEQ ID NO.19）。引物探针由ThermoFisher Scientific合成，探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerryquencher。引物和探针的详细信息如下。

ATP7B-Q-F：5’GACACATGAAGCCACTGACC3’ (SEQ ID NO.17)

ATP7B-Q-R：5’CTGTCCCTCCACCTATCGTC3’ (SEQ ID NO.18)

ATP7B-Q-P：5’TGCCGATGTGCACGCTCACCTGA3’ (SEQ ID NO.19)

采用“一步法”检测总RNA中ATP7B mRNA拷贝数。以ATP7B-Q-F和ATP7B-Q-R为引物特异性地反转录扩增ATP7B mRNA（messenger RNA，信使RNA）序列中长度为70bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1×10⁸copies/μl的合成的ATP7B-SR RNA及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂（货号:RR064A）（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测总RNA中ATP7B mRNA含量，用于表示ATP7B表达。具体检测过程参见One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂说明书。结果如图9所示。

从图9的结果可知，注射rAAV8-LP15-EGFP病毒的模型小鼠中未检测到ATP7BmRNA，说明模型小鼠体内没有ATP7B基因表达，同预期一致。相反在注射rAAV8-LP15-ATP7B模型小鼠肝脏中检测到ATP7B mRNA表达，且随着病毒注射剂量增加，ATP7B mRNA的表达检测值逐渐升高，提示rAAV8-LP15-ATP7B病毒注射模型小鼠能够有效地在肝脏中表达产生ATP7B mRNA。

实施例4不同剂量的rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒注射模型动物实验结果

以rAAV8-LP15-ATP7B病毒为对照，携带截短的ATP7B表达框的重组AAV8病毒rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）等3种剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠，检测血清中转氨酶、尿液中铜离子含量和肝脏组织中铜离子含量测定、肝脏中ATP7B mRNA或ΔC4ATP7BmRNA表达水平，以验证rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B的有效性以及不同剂量对有效性的影响。

肝豆状核变性小鼠atp7b^-/-由肝豆状核变性模型制备种鼠交配制备而得。种鼠购自美国Jackson Laboratory，为杂合的B6；129S1-Atp7b^tm1Tcg/LtsnkJ雄性和雌性小鼠，商品号为032624。制备得到模型采用PCR方法进行鉴定，鉴定方法和过程参见JacksonLaboratory网站。

首先，rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）等3种剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。设置注射高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）剂量rAAV8-LP15-ATP7B病毒的模型小鼠为实验对照。注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），尾静脉采血，分离血清，用试剂盒测定（Merck）血清中的谷丙转氨酶水平，检测过程参见试剂盒说明书。结果如图10所示。从图10的结果可知，相比注射等剂量的rAAV8-LP15-ATP7B病毒的模型小鼠，在同一时间点注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠的谷丙转氨酶活性未见明显差异，都较低，且随着注射剂量的增加，谷丙转氨酶活性越低。而且随着时间的增加，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV8-LP15-ATP7B病毒小鼠的谷丙转氨酶活性未见明显变化。

接下来，rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）等3种剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。设置注射高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）剂量rAAV8-LP15-ATP7B病毒的模型小鼠为实验对照。注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），收集24h内小鼠排出尿液，测定收集尿液中铜离子总量，测定方法及操作过程参见文献（Murillo O, et al. Journal of Hepatology. 2016; 64(2):419-426.）。结果如图11所示。从图11的结果可知，同注射等剂量的rAAV8-LP15-ATP7B病毒的模型小鼠相比，同一时间点，注射rAAV8-LP15-ΔATP7B病毒模型小鼠的尿液中铜离子含量未见明显差异，都较低。而且，随着注射病毒后时间的延长，尿液铜离子含量未见明显变化。

然后，rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）等3种剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。设置注射高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）剂量rAAV8-LP15-ATP7B病毒的模型小鼠为实验对照。注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，测定干燥的肝脏组织中的铜离子总量，测定方法及操作过程参见文献（Murillo O, et al. Journal ofHepatology. 2016; 64(2):419-426.）。检测结果如图12所示。从图12的结果可知，同注射等剂量的rAAV8-LP15-ATP7B病毒的模型小鼠相比，注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒模型小鼠的肝脏中铜离子含量未见明显差异，也都较低。而且随着注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒剂量的增加，铜离子含量逐渐降低。

最后， rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B以高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。设置注射高、中和低（1E+10vg/只、3E+10vg/只和9E+10vg/只）剂量rAAV8-LP15-ATP7B病毒的模型小鼠为实验对照。注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，用TRIzol试剂（Invitrogen，15596018）提取总RNA，反转录定量PCR测定100ng总RNA中ATP7B mRNA或ΔC4ATP7B mRNA含量，用于表示小鼠肝脏中转导ATP7B基因或ΔC4ATP7B基因的表达水平。ATP7B mRNA或ΔC4ATP7B mRNA检测采用相同标准品、引物探针以及试剂和方法。人工合成定量PCR检测用RNA标准品，命名为ATP7B-SR，序列信息详见SEQ ID NO.16。RNA标准品由Thermo FisherScientific公司合成，长度为100nt，用无RNase水稀释至1×10¹⁰copies/μL备用。定量PCR检测用引物为ATP7B-Q-F（SEQ ID NO.17）和ATP7B-Q-R（SEQ ID NO.18），探针为ATP7B-Q-P（SEQ ID NO.19）。引物探针由ThermoFisherScientific合成，探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针的详细信息如下。

ATP7B-Q-F：5’GACACATGAAGCCACTGACC3’ (SEQ ID NO.17)

ATP7B-Q-R：5’CTGTCCCTCCACCTATCGTC3’ (SEQ ID NO.18)

ATP7B-Q-P：5’TGCCGATGTGCACGCTCACCTGA3’ (SEQ ID NO.19)

采用“一步法”检测总RNA中ATP7B mRNA或ΔC4ATP7B mRNA拷贝数。以ATP7B-Q-F和ATP7B-Q-R为引物特异性地反转录扩增ATP7B mRNA或ΔC4ATP7B mRNA（messenger RNA，信使RNA）序列中长度为70bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1×10⁸copies/μl的合成的ATP7B-SR RNA及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用One Step PrimeScript^TM RT-PCRKit（Perfect Real Time）试剂（货号: RR064A）（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测总RNA中ATP7B mRNA或ΔC4ATP7B mRNA含量，用于表示ATP7B或ΔC4ATP7B表达。具体检测过程参见One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit（PerfectReal Time）试剂说明书。结果如图13所示。

从图13的结果可知，同rAAV8-LP15-ATP7B病毒一样，在注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B模型小鼠肝脏中检测到ΔC4ATP7B mRNA表达，且随着病毒注射剂量增加，ΔC4ATP7B mRNA的表达检测值逐渐升高，提示rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒注射模型小鼠能够有效地在肝脏中表达产生ATP7B ΔC4mRNA。

实施例5不同血清型AAV携带ΔC4ATP7B基因表达框注射模型动物实验结果

以rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒为对照，携带ΔC4ATP7B表达框的重组AAV3B、AAV5或AAV9病毒以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠，检测血清中转氨酶、尿液中铜离子含量和肝脏组织中铜离子含量测定、肝脏中ΔC4ATP7B mRNA表达水平，以验证不同AAV血清型携带ΔC4ATP7B表达框的有效性。

肝豆状核变性小鼠atp7b^-/-由肝豆状核变性模型制备种鼠交配制备而得。种鼠购自美国Jackson Laboratory，为杂合的B6；129S1-Atp7b^tm1Tcg/LtsnkJ雄性和雌性小鼠，商品号为032624。制备得到模型采用PCR方法进行鉴定，鉴定方法和过程参见JacksonLaboratory网站。

首先，rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。同时设置注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）为实验对照。注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），尾静脉采血，分离血清，用试剂盒测定（Merck）血清中的谷丙转氨酶水平，检测过程参见试剂盒说明书。结果如图14所示。从图14的结果可知，相比注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠组，在同一时间点注射rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠的谷丙转氨酶活性均未见明显差异，而且随着时间的增加，注射病毒模型小鼠的谷丙转氨酶水平未见明显变化。

接下来，rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。同时设置注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）为实验对照。注射病毒后不同时间点（注射病毒后4周、8周、12周和24周），收集24h内小鼠排出尿液，测定收集尿液中铜离子总量，测定方法及操作过程参见文献（Murillo O, et al. Journal ofHepatology. 2016; 64(2):419-426.）。结果如图15所示。从图15的结果可知，相比注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠组，在同一时间点注射rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠的尿液中铜离子含量未见明显差异。而且，随着注射病毒后时间的延长，尿液铜离子含量未见明显变化。

然后，rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。同时设置注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）为实验对照。注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，测定干燥的肝脏组织中的铜离子总量，测定方法及操作过程参见文献（Murillo O, et al. Journal of Hepatology. 2016; 64(2):419-426.）。检测结果如图16所示。从图16的结果可知，相比注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠组，注射rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠的肝脏中铜离子含量未见明显差异。而且，随着注射病毒后时间的延长，肝脏中铜离子含量未见明显变化。

最后，rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B以3E+10vg/只的剂量经尾静脉注射肝豆状核变性模型小鼠（atp7b^-/-小鼠），每个剂量注射5只小鼠。同时设置注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒（3E+10vg/只）为实验对照。注射病毒24周后，处死小鼠，分离肝脏，用TRIzol试剂（Invitrogen，15596018）提取总RNA，反转录定量PCR测定100ng总RNA中ΔC4ATP7B mRNA含量，用于表示小鼠肝脏中转导ΔC4ATP7B基因的表达水平。人工合成定量PCR检测用RNA标准品，命名为ATP7B-SR，序列信息详见SEQ IDNO.16。RNA标准品由ThermoFisher Scientific公司合成，长度为100nt，用无RNase水稀释至1×10¹⁰copies/μL备用。定量PCR检测用引物为ATP7B-Q-F（SEQ ID NO.17）和ATP7B-Q-R（SEQ ID NO.18），探针为ATP7B-Q-P（SEQ ID NO.19）。引物探针由ThermoFisherScientific合成，探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针的详细信息如下。

ATP7B-Q-F：5’GACACATGAAGCCACTGACC3’ (SEQ ID NO.17)

ATP7B-Q-R：5’CTGTCCCTCCACCTATCGTC3’ (SEQ ID NO.18)

ATP7B-Q-P：5’TGCCGATGTGCACGCTCACCTGA3’ (SEQ ID NO.19)

采用“一步法”检测总RNA中ΔC4ATP7B mRNA拷贝数。以ATP7B-Q-F和ATP7B-Q-R为引物特异性地反转录扩增ΔC4ATP7B mRNA（messenger RNA，信使RNA）序列中长度为70bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1×10⁸copies/μl的合成的ATP7B-SR RNA及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂（货号: RR064A）（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测总RNA中ΔC4ATP7B mRNA含量，用于表示ATP7B表达。具体检测过程参见One StepPrimeScript^TM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）试剂说明书。结果如图17所示。

从图17的结果可知，同注射rAAV8-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠一样，注射rAAV3B-LP15-ΔC4ATP7B、rAAV5-LP15-ΔC4ATP7B或rAAV9-LP15-ΔC4ATP7B病毒的模型小鼠肝脏的总RNA中都检测到ΔC4ATP7B mRNA。提示不同血清型AAV携带ΔC4ATP7B基因表达框，制备得到AAV病毒，都能够有效地转导小鼠肝脏，表达产生ΔC4ATP7B mRNA。

序列表

<110> 北京锦篮基因科技有限公司

<120> 携带ATP7B基因表达框及变异体的AAV载体及应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 352

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

gttaattttt aaaaagcaag tggcccttgg cagcatctgt ttgctctggt taataatctc 60

aggagcacaa acattcccag gagaagaaat caacatcctg gacttatcct ctgggcctaa 120

gtatttagtt tggttagtaa ttactaaaca ctgagaacgc caatgaaata caaagatgag 180

tctagttaat aatctacaat tattggttaa agaagtatat tagtgctaat ttccctccgt 240

ttgtcctagc ttttctcttc tgtcaacccc acacgccttt ggcaggtaag ttggcgccgt 300

ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta ccttttttac ag 352

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

tcgagaggcc taataaagag ctcagatgca tcgatcagag tgtgttggtt ttttgtgtg 59

<210> 3

<211> 4395

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

atgcccgaac aggaaagaca gatcaccgca agggaaggag caagtcgcaa gattctgagc 60

aaactgagcc tgccaacccg agcctgggag cccgccatga agaagagctt cgcctttgac 120

aacgtgggat acgagggcgg cctggatggc ctgggaccta gctcccaggt ggccacctcc 180

accgtgagaa tcctgggcat gacatgccag agctgcgtga agtccatcga ggacagaatc 240

tctaatctga agggcatcat ctctatgaag gtgagcctgg agcagggctc cgccaccgtg 300

aagtatgtgc cttctgtggt gtgcctgcag caggtgtgcc accagatcgg cgatatgggc 360

ttcgaggcca gcatcgcaga gggcaaggca gcatcctggc cttctcggag cctgccagca 420

caggaggcag tggtgaagct gagagtggaa ggaatgacct gtcagagctg cgtgagcagc 480

atcgagggca aggtgaggaa gctgcagggc gtggtgcgcg tgaaggtgtc cctgtctaac 540

caggaggccg tgatcaccta ccagccctat ctgatccagc ctgaggacct gagggatcac 600

gtgaatgaca tgggcttcga ggccgccatc aagagcaagg tggcaccact gtccctggga 660

ccaatcgaca tcgagcggct gcagtccacc aacccaaagc ggcccctgtc ctctgccaac 720

cagaacttca acaattctga gacactggga caccagggca gccacgtggt gaccctgcag 780

ctgaggatcg acggcatgca ctgcaagagc tgcgtgctga acatcgagga gaatatcggc 840

cagctgctgg gcgtgcagtc catccaggtg tctctggaga acaagacagc ccaggtgaag 900

tacgatcctt cttgcaccag cccagtggcc ctgcagaggg caatcgaggc cctgccccct 960

ggcaatttca aggtgtccct gcctgacgga gcagagggct ctggcaccga tcaccggagc 1020

agcagcagcc actccccagg ctctccacca aggaaccagg tgcagggcac atgttctacc 1080

acactgatcg caatcgcagg aatgacctgc gcaagctgcg tgcactccat cgagggcatg 1140

atcagccagc tggagggcgt gcagcagatc agcgtgtccc tggcagaggg caccgcaaca 1200

gtgctgtaca atcccagcgt gatctcccct gaggagctga gggcagcaat cgaggatatg 1260

ggatttgagg ccagcgtggt gtctgagagc tgctccacaa accccctggg caatcactct 1320

gccggcaaca gcatggtgca gaccacagac ggcaccccta caagcgtgca ggaggtggca 1380

ccacacaccg gccggctgcc agcaaatcac gcaccagata tcctggccaa gtctccccag 1440

agcacaagag ccgtggcccc tcagaagtgt tttctgcaga tcaagggcat gacctgcgcc 1500

tcctgcgtga gcaacatcga gcggaatctg cagaaggagg caggcgtgct gtccgtgctg 1560

gtggccctga tggcaggcaa ggccgagatc aagtacgacc ctgaagtgat ccagccactg 1620

gagatcgccc agttcatcca ggatctgggc tttgaggccg ccgtgatgga ggactatgcc 1680

ggcagcgatg gcaacatcga gctgaccatc acaggcatga cctgcgcctc ttgcgtgcac 1740

aacatcgaga gcaagctgac cagaacaaat ggcatcacat acgcctctgt ggccctggcc 1800

accagcaagg ccctggtgaa gttcgacccc gagatcatcg gccctaggga tatcatcaag 1860

atcatcgagg agatcggctt tcacgcctcc ctggcccagc gcaacccaaa tgcccaccac 1920

ctggaccaca agatggagat caagcagtgg aagaagtcct tcctgtgctc tctggtgttt 1980

ggcatccccg tgatggccct gatgatctac atgctgatcc cttccaacga gccacaccag 2040

tctatggtgc tggatcacaa catcatccct ggcctgagca tcctgaatct gatcttcttt 2100

atcctgtgca cattcgtgca gctgctgggc ggctggtact tttatgtgca ggcttacaag 2160

tccctgcggc accggagcgc caatatggac gtgctgatcg tgctggccac cagcatcgcc 2220

tacgtgtatt ccctggtcat cctggtggtg gcagtggcag agaaggcaga gcggtccccc 2280

gtgaccttct ttgatacacc tccaatgctg ttcgtgttta tcgccctggg cagatggctg 2340

gagcacctgg ccaagagcaa gacctccgag gccctggcca agctgatgag cctgcaggcc 2400

acagaggcca ccgtggtgac actgggcgag gacaacctga tcatcaggga ggagcaggtg 2460

cctatggagc tggtgcagcg cggcgatatc gtgaaggtgg tgccaggcgg caagttccca 2520

gtggacggca aggtgctgga gggcaataca atggccgatg agagcctgat caccggcgag 2580

gccatgcctg tgaccaagaa gccaggctct acagtgatcg caggcagcat caacgcacac 2640

ggctccgtgc tgatcaaggc cacccacgtg ggcaatgaca ccacactggc ccagatcgtg 2700

aagctggtgg aggaggccca gatgtccaag gcccctatcc agcagctggc cgatcggttc 2760

tccggctact tcgtgccctt catcatcatc atgtctaccc tgacactggt ggtgtggatc 2820

gtgatcggct tcatcgactt tggcgtggtg cagaggtatt ttcccaaccc taataagcac 2880

atcagccaga ccgaagtgat catccgcttc gcctttcaga ccagcatcac agtgctgtgc 2940

atcgcatgcc catgttccct gggcctggca accccaacag ccgtgatggt gggcacagga 3000

gtggcagcac agaacggcat cctgatcaag ggcggcaagc ccctggagat ggcccacaag 3060

atcaagaccg tgatgtttga caagaccggc acaatcaccc acggcgtgcc cagagtgatg 3120

agagtgctgc tgctgggcga tgtggccaca ctgcctctga gaaaggtgct ggcagtggtg 3180

ggcaccgcag aggccagcag cgagcaccca ctgggcgtgg ccgtgacaaa gtactgcaag 3240

gaggagctgg gcacagagac actgggctat tgtaccgact tccaggccgt gcccggatgc 3300

ggaatcggct gtaaggtgag caacgtggag ggcatcctgg cacactccga gcggcccctg 3360

agcgcccctg catcccacct gaatgaggca ggctctctgc cagcagagaa ggacgccgtg 3420

cctcagacct tcagcgtgct gatcggcaac agagagtggc tgcggagaaa tggcctgacc 3480

atcagctccg acgtgtccga tgccatgaca gatcacgaga tgaagggcca gaccgcaatc 3540

ctggtggcaa tcgacggcgt gctgtgcggc atgatcgcca tcgccgatgc agtgaagcag 3600

gaggccgccc tggcagtgca caccctgcag agcatgggcg tggacgtggt gctgatcacc 3660

ggcgataaca ggaagacagc aagggcaatc gcaacccaag tgggcatcaa taaggtgttc 3720

gccgaggtgc tgccttccca caaggtggcc aaggtgcagg agctgcagaa caagggcaag 3780

aaggtggcca tggtgggcga cggcgtgaat gattctccag ccctggcaca ggcagacatg 3840

ggagtggcaa tcggcacagg caccgacgtg gcaatcgagg cagcagatgt ggtgctgatc 3900

aggaatgacc tgctggatgt ggtggcctct atccacctga gcaagcggac cgtgaggcgc 3960

atcagaatca acctggtgct ggccctgatc tacaatctgg tgggcatccc aatcgcagca 4020

ggcgtgttta tgccaatcgg catcgtgctg cagccatgga tgggctctgc cgcaatggca 4080

gcctctagcg tgagcgtggt gctgtcctct ctgcagctga agtgctacaa gaagccagac 4140

ctggagcggt acgaggcaca ggcacacgga cacatgaagc cactgaccgc ctctcaggtg 4200

agcgtgcaca tcggcatgga cgataggtgg agggacagcc caagggcaac accatgggat 4260

caggtgtcct acgtgagcca ggtgagcctg agcagcctga cctccgataa gccctcccgc 4320

cactctgccg ccgccgacga cgacggggac aagtggagcc tgctgctgaa cgggagagac 4380

gaggaacagt acatt 4395

<210> 4

<211> 3309

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

atgcccgaac aggaaagaca gatcaccgca agggaaggag caagtcgcaa gattctgagc 60

aaactgagcc tgccaacccg agcctgggag cccgccatga agaagagctt cgcctttgac 120

aacgtgggat acgagggcgg cctggatggc ctgggaccta gctcccaggt ggccacctcc 180

accgtgagag tggtgtctga gagctgctcc acaaaccccc tgggcaatca ctctgccggc 240

aacagcatgg tgcagaccac agacggcacc cctacaagcg tgcaggaggt ggcaccacac 300

accggccggc tgccagcaaa tcacgcacca gatatcctgg ccaagtctcc ccagagcaca 360

agagccgtgg cccctcagaa gtgttttctg cagatcaagg gcatgacctg cgcctcctgc 420

gtgagcaaca tcgagcggaa tctgcagaag gaggcaggcg tgctgtccgt gctggtggcc 480

ctgatggcag gcaaggccga gatcaagtac gaccctgaag tgatccagcc actggagatc 540

gcccagttca tccaggatct gggctttgag gccgccgtga tggaggacta tgccggcagc 600

gatggcaaca tcgagctgac catcacaggc atgacctgcg cctcttgcgt gcacaacatc 660

gagagcaagc tgaccagaac aaatggcatc acatacgcct ctgtggccct ggccaccagc 720

aaggccctgg tgaagttcga ccccgagatc atcggcccta gggatatcat caagatcatc 780

gaggagatcg gctttcacgc ctccctggcc cagcgcaacc caaatgccca ccacctggac 840

cacaagatgg agatcaagca gtggaagaag tccttcctgt gctctctggt gtttggcatc 900

cccgtgatgg ccctgatgat ctacatgctg atcccttcca acgagccaca ccagtctatg 960

gtgctggatc acaacatcat ccctggcctg agcatcctga atctgatctt ctttatcctg 1020

tgcacattcg tgcagctgct gggcggctgg tacttttatg tgcaggctta caagtccctg 1080

cggcaccgga gcgccaatat ggacgtgctg atcgtgctgg ccaccagcat cgcctacgtg 1140

tattccctgg tcatcctggt ggtggcagtg gcagagaagg cagagcggtc ccccgtgacc 1200

ttctttgata cacctccaat gctgttcgtg tttatcgccc tgggcagatg gctggagcac 1260

ctggccaaga gcaagacctc cgaggccctg gccaagctga tgagcctgca ggccacagag 1320

gccaccgtgg tgacactggg cgaggacaac ctgatcatca gggaggagca ggtgcctatg 1380

gagctggtgc agcgcggcga tatcgtgaag gtggtgccag gcggcaagtt cccagtggac 1440

ggcaaggtgc tggagggcaa tacaatggcc gatgagagcc tgatcaccgg cgaggccatg 1500

cctgtgacca agaagccagg ctctacagtg atcgcaggca gcatcaacgc acacggctcc 1560

gtgctgatca aggccaccca cgtgggcaat gacaccacac tggcccagat cgtgaagctg 1620

gtggaggagg cccagatgtc caaggcccct atccagcagc tggccgatcg gttctccggc 1680

tacttcgtgc ccttcatcat catcatgtct accctgacac tggtggtgtg gatcgtgatc 1740

ggcttcatcg actttggcgt ggtgcagagg tattttccca accctaataa gcacatcagc 1800

cagaccgaag tgatcatccg cttcgccttt cagaccagca tcacagtgct gtgcatcgca 1860

tgcccatgtt ccctgggcct ggcaacccca acagccgtga tggtgggcac aggagtggca 1920

gcacagaacg gcatcctgat caagggcggc aagcccctgg agatggccca caagatcaag 1980

accgtgatgt ttgacaagac cggcacaatc acccacggcg tgcccagagt gatgagagtg 2040

ctgctgctgg gcgatgtggc cacactgcct ctgagaaagg tgctggcagt ggtgggcacc 2100

gcagaggcca gcagcgagca cccactgggc gtggccgtga caaagtactg caaggaggag 2160

ctgggcacag agacactggg ctattgtacc gacttccagg ccgtgcccgg atgcggaatc 2220

ggctgtaagg tgagcaacgt ggagggcatc ctggcacact ccgagcggcc cctgagcgcc 2280

cctgcatccc acctgaatga ggcaggctct ctgccagcag agaaggacgc cgtgcctcag 2340

accttcagcg tgctgatcgg caacagagag tggctgcgga gaaatggcct gaccatcagc 2400

tccgacgtgt ccgatgccat gacagatcac gagatgaagg gccagaccgc aatcctggtg 2460

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gccctggcag tgcacaccct gcagagcatg ggcgtggacg tggtgctgat caccggcgat 2580

aacaggaaga cagcaagggc aatcgcaacc caagtgggca tcaataaggt gttcgccgag 2640

gtgctgcctt cccacaaggt ggccaaggtg caggagctgc agaacaaggg caagaaggtg 2700

gccatggtgg gcgacggcgt gaatgattct ccagccctgg cacaggcaga catgggagtg 2760

gcaatcggca caggcaccga cgtggcaatc gaggcagcag atgtggtgct gatcaggaat 2820

gacctgctgg atgtggtggc ctctatccac ctgagcaagc ggaccgtgag gcgcatcaga 2880

atcaacctgg tgctggccct gatctacaat ctggtgggca tcccaatcgc agcaggcgtg 2940

tttatgccaa tcggcatcgt gctgcagcca tggatgggct ctgccgcaat ggcagcctct 3000

agcgtgagcg tggtgctgtc ctctctgcag ctgaagtgct acaagaagcc agacctggag 3060

cggtacgagg cacaggcaca cggacacatg aagccactga ccgcctctca ggtgagcgtg 3120

cacatcggca tggacgatag gtggagggac agcccaaggg caacaccatg ggatcaggtg 3180

tcctacgtga gccaggtgag cctgagcagc ctgacctccg ataagccctc ccgccactct 3240

gccgccgccg acgacgacgg ggacaagtgg agcctgctgc tgaacgggag agacgaggaa 3300

cagtacatt 3309

<210> 5

<211> 364

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

ctcgaggtta atttttaaaa agcaagtggc ccttggcagc atctgtttgc tctggttaat 60

aatctcagga gcacaaacat tcccaggaga agaaatcaac atcctggact tatcctctgg 120

gcctaagtat ttagtttggt tagtaattac taaacactga gaacgccaat gaaatacaaa 180

gatgagtcta gttaataatc tacaattatt ggttaaagaa gtatattagt gctaatttcc 240

ctccgtttgt cctagctttt ctcttctgtc aaccccacac gcctttggca ggtaagttgg 300

cgccgtttaa gggatggttg gttggtgggg tattaatgtt taattacctt ttttacaggg 360

tacc 364

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

ataggtaccg ccaccatggt gagcaag 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

gcggaattct tacttgtaca gctcgtc 27

<210> 8

<211> 1465

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

Met Pro Glu Gln Glu Arg Gln Ile Thr Ala Arg Glu Gly Ala Ser Arg

1 5 10 15

Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Leu Pro Thr Arg Ala Trp Glu Pro Ala

20 25 30

Met Lys Lys Ser Phe Ala Phe Asp Asn Val Gly Tyr Glu Gly Gly Leu

35 40 45

Asp Gly Leu Gly Pro Ser Ser Gln Val Ala Thr Ser Thr Val Arg Ile

50 55 60

Leu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Lys Ser Ile Glu Asp Arg Ile

65 70 75 80

Ser Asn Leu Lys Gly Ile Ile Ser Met Lys Val Ser Leu Glu Gln Gly

85 90 95

Ser Ala Thr Val Lys Tyr Val Pro Ser Val Val Cys Leu Gln Gln Val

100 105 110

Cys His Gln Ile Gly Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Ile Ala Glu Gly

115 120 125

Lys Ala Ala Ser Trp Pro Ser Arg Ser Leu Pro Ala Gln Glu Ala Val

130 135 140

Val Lys Leu Arg Val Glu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Gly Lys Val Arg Lys Leu Gln Gly Val Val Arg Val Lys Val

165 170 175

Ser Leu Ser Asn Gln Glu Ala Val Ile Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu Ile

180 185 190

Gln Pro Glu Asp Leu Arg Asp His Val Asn Asp Met Gly Phe Glu Ala

195 200 205

Ala Ile Lys Ser Lys Val Ala Pro Leu Ser Leu Gly Pro Ile Asp Ile

210 215 220

Glu Arg Leu Gln Ser Thr Asn Pro Lys Arg Pro Leu Ser Ser Ala Asn

225 230 235 240

Gln Asn Phe Asn Asn Ser Glu Thr Leu Gly His Gln Gly Ser His Val

245 250 255

Val Thr Leu Gln Leu Arg Ile Asp Gly Met His Cys Lys Ser Cys Val

260 265 270

Leu Asn Ile Glu Glu Asn Ile Gly Gln Leu Leu Gly Val Gln Ser Ile

275 280 285

Gln Val Ser Leu Glu Asn Lys Thr Ala Gln Val Lys Tyr Asp Pro Ser

290 295 300

Cys Thr Ser Pro Val Ala Leu Gln Arg Ala Ile Glu Ala Leu Pro Pro

305 310 315 320

Gly Asn Phe Lys Val Ser Leu Pro Asp Gly Ala Glu Gly Ser Gly Thr

325 330 335

Asp His Arg Ser Ser Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Pro Pro Arg Asn

340 345 350

Gln Val Gln Gly Thr Cys Ser Thr Thr Leu Ile Ala Ile Ala Gly Met

355 360 365

Thr Cys Ala Ser Cys Val His Ser Ile Glu Gly Met Ile Ser Gln Leu

370 375 380

Glu Gly Val Gln Gln Ile Ser Val Ser Leu Ala Glu Gly Thr Ala Thr

385 390 395 400

Val Leu Tyr Asn Pro Ser Val Ile Ser Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ala

405 410 415

Ile Glu Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Val Val Ser Glu Ser Cys Ser

420 425 430

Thr Asn Pro Leu Gly Asn His Ser Ala Gly Asn Ser Met Val Gln Thr

435 440 445

Thr Asp Gly Thr Pro Thr Ser Val Gln Glu Val Ala Pro His Thr Gly

450 455 460

Arg Leu Pro Ala Asn His Ala Pro Asp Ile Leu Ala Lys Ser Pro Gln

465 470 475 480

Ser Thr Arg Ala Val Ala Pro Gln Lys Cys Phe Leu Gln Ile Lys Gly

485 490 495

Met Thr Cys Ala Ser Cys Val Ser Asn Ile Glu Arg Asn Leu Gln Lys

500 505 510

Glu Ala Gly Val Leu Ser Val Leu Val Ala Leu Met Ala Gly Lys Ala

515 520 525

Glu Ile Lys Tyr Asp Pro Glu Val Ile Gln Pro Leu Glu Ile Ala Gln

530 535 540

Phe Ile Gln Asp Leu Gly Phe Glu Ala Ala Val Met Glu Asp Tyr Ala

545 550 555 560

Gly Ser Asp Gly Asn Ile Glu Leu Thr Ile Thr Gly Met Thr Cys Ala

565 570 575

Ser Cys Val His Asn Ile Glu Ser Lys Leu Thr Arg Thr Asn Gly Ile

580 585 590

Thr Tyr Ala Ser Val Ala Leu Ala Thr Ser Lys Ala Leu Val Lys Phe

595 600 605

Asp Pro Glu Ile Ile Gly Pro Arg Asp Ile Ile Lys Ile Ile Glu Glu

610 615 620

Ile Gly Phe His Ala Ser Leu Ala Gln Arg Asn Pro Asn Ala His His

625 630 635 640

Leu Asp His Lys Met Glu Ile Lys Gln Trp Lys Lys Ser Phe Leu Cys

645 650 655

Ser Leu Val Phe Gly Ile Pro Val Met Ala Leu Met Ile Tyr Met Leu

660 665 670

Ile Pro Ser Asn Glu Pro His Gln Ser Met Val Leu Asp His Asn Ile

675 680 685

Ile Pro Gly Leu Ser Ile Leu Asn Leu Ile Phe Phe Ile Leu Cys Thr

690 695 700

Phe Val Gln Leu Leu Gly Gly Trp Tyr Phe Tyr Val Gln Ala Tyr Lys

705 710 715 720

Ser Leu Arg His Arg Ser Ala Asn Met Asp Val Leu Ile Val Leu Ala

725 730 735

Thr Ser Ile Ala Tyr Val Tyr Ser Leu Val Ile Leu Val Val Ala Val

740 745 750

Ala Glu Lys Ala Glu Arg Ser Pro Val Thr Phe Phe Asp Thr Pro Pro

755 760 765

Met Leu Phe Val Phe Ile Ala Leu Gly Arg Trp Leu Glu His Leu Ala

770 775 780

Lys Ser Lys Thr Ser Glu Ala Leu Ala Lys Leu Met Ser Leu Gln Ala

785 790 795 800

Thr Glu Ala Thr Val Val Thr Leu Gly Glu Asp Asn Leu Ile Ile Arg

805 810 815

Glu Glu Gln Val Pro Met Glu Leu Val Gln Arg Gly Asp Ile Val Lys

820 825 830

Val Val Pro Gly Gly Lys Phe Pro Val Asp Gly Lys Val Leu Glu Gly

835 840 845

Asn Thr Met Ala Asp Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Ala Met Pro Val

850 855 860

Thr Lys Lys Pro Gly Ser Thr Val Ile Ala Gly Ser Ile Asn Ala His

865 870 875 880

Gly Ser Val Leu Ile Lys Ala Thr His Val Gly Asn Asp Thr Thr Leu

885 890 895

Ala Gln Ile Val Lys Leu Val Glu Glu Ala Gln Met Ser Lys Ala Pro

900 905 910

Ile Gln Gln Leu Ala Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Phe Val Pro Phe Ile

915 920 925

Ile Ile Met Ser Thr Leu Thr Leu Val Val Trp Ile Val Ile Gly Phe

930 935 940

Ile Asp Phe Gly Val Val Gln Arg Tyr Phe Pro Asn Pro Asn Lys His

945 950 955 960

Ile Ser Gln Thr Glu Val Ile Ile Arg Phe Ala Phe Gln Thr Ser Ile

965 970 975

Thr Val Leu Cys Ile Ala Cys Pro Cys Ser Leu Gly Leu Ala Thr Pro

980 985 990

Thr Ala Val Met Val Gly Thr Gly Val Ala Ala Gln Asn Gly Ile Leu

995 1000 1005

Ile Lys Gly Gly Lys Pro Leu Glu Met Ala His Lys Ile Lys Thr Val

1010 1015 1020

Met Phe Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr His Gly Val Pro Arg Val Met

1025 1030 1035 1040

Arg Val Leu Leu Leu Gly Asp Val Ala Thr Leu Pro Leu Arg Lys Val

1045 1050 1055

Leu Ala Val Val Gly Thr Ala Glu Ala Ser Ser Glu His Pro Leu Gly

1060 1065 1070

Val Ala Val Thr Lys Tyr Cys Lys Glu Glu Leu Gly Thr Glu Thr Leu

1075 1080 1085

Gly Tyr Cys Thr Asp Phe Gln Ala Val Pro Gly Cys Gly Ile Gly Cys

1090 1095 1100

Lys Val Ser Asn Val Glu Gly Ile Leu Ala His Ser Glu Arg Pro Leu

1105 1110 1115 1120

Ser Ala Pro Ala Ser His Leu Asn Glu Ala Gly Ser Leu Pro Ala Glu

1125 1130 1135

Lys Asp Ala Val Pro Gln Thr Phe Ser Val Leu Ile Gly Asn Arg Glu

1140 1145 1150

Trp Leu Arg Arg Asn Gly Leu Thr Ile Ser Ser Asp Val Ser Asp Ala

1155 1160 1165

Met Thr Asp His Glu Met Lys Gly Gln Thr Ala Ile Leu Val Ala Ile

1170 1175 1180

Asp Gly Val Leu Cys Gly Met Ile Ala Ile Ala Asp Ala Val Lys Gln

1185 1190 1195 1200

Glu Ala Ala Leu Ala Val His Thr Leu Gln Ser Met Gly Val Asp Val

1205 1210 1215

Val Leu Ile Thr Gly Asp Asn Arg Lys Thr Ala Arg Ala Ile Ala Thr

1220 1225 1230

Gln Val Gly Ile Asn Lys Val Phe Ala Glu Val Leu Pro Ser His Lys

1235 1240 1245

Val Ala Lys Val Gln Glu Leu Gln Asn Lys Gly Lys Lys Val Ala Met

1250 1255 1260

Val Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu Ala Gln Ala Asp Met

1265 1270 1275 1280

Gly Val Ala Ile Gly Thr Gly Thr Asp Val Ala Ile Glu Ala Ala Asp

1285 1290 1295

Val Val Leu Ile Arg Asn Asp Leu Leu Asp Val Val Ala Ser Ile His

1300 1305 1310

Leu Ser Lys Arg Thr Val Arg Arg Ile Arg Ile Asn Leu Val Leu Ala

1315 1320 1325

Leu Ile Tyr Asn Leu Val Gly Ile Pro Ile Ala Ala Gly Val Phe Met

1330 1335 1340

Pro Ile Gly Ile Val Leu Gln Pro Trp Met Gly Ser Ala Ala Met Ala

1345 1350 1355 1360

Ala Ser Ser Val Ser Val Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Lys Cys Tyr

1365 1370 1375

Lys Lys Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Ala Gln Ala His Gly His Met

1380 1385 1390

Lys Pro Leu Thr Ala Ser Gln Val Ser Val His Ile Gly Met Asp Asp

1395 1400 1405

Arg Trp Arg Asp Ser Pro Arg Ala Thr Pro Trp Asp Gln Val Ser Tyr

1410 1415 1420

Val Ser Gln Val Ser Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Lys Pro Ser Arg

1425 1430 1435 1440

His Ser Ala Ala Ala Asp Asp Asp Gly Asp Lys Trp Ser Leu Leu Leu

1445 1450 1455

Asn Gly Arg Asp Glu Glu Gln Tyr Ile

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<210> 9

<211> 4484

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

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aagattctga gcaaactgag cctgccaacc cgagcctggg agcccgccat gaagaagagc 120

ttcgcctttg acaacgtggg atacgagggc ggcctggatg gcctgggacc tagctcccag 180

gtggccacct ccaccgtgag aatcctgggc atgacatgcc agagctgcgt gaagtccatc 240

gaggacagaa tctctaatct gaagggcatc atctctatga aggtgagcct ggagcagggc 300

tccgccaccg tgaagtatgt gccttctgtg gtgtgcctgc agcaggtgtg ccaccagatc 360

ggcgatatgg gcttcgaggc cagcatcgca gagggcaagg cagcatcctg gccttctcgg 420

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tccctgtcta accaggaggc cgtgatcacc taccagccct atctgatcca gcctgaggac 600

ctgagggatc acgtgaatga catgggcttc gaggccgcca tcaagagcaa ggtggcacca 660

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tcctctgcca accagaactt caacaattct gagacactgg gacaccaggg cagccacgtg 780

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gagaatatcg gccagctgct gggcgtgcag tccatccagg tgtctctgga gaacaagaca 900

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gccctgcccc ctggcaattt caaggtgtcc ctgcctgacg gagcagaggg ctctggcacc 1020

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caggcttaca agtccctgcg gcaccggagc gccaatatgg acgtgctgat cgtgctggcc 2220

accagcatcg cctacgtgta ttccctggtc atcctggtgg tggcagtggc agagaaggca 2280

gagcggtccc ccgtgacctt ctttgataca cctccaatgc tgttcgtgtt tatcgccctg 2340

ggcagatggc tggagcacct ggccaagagc aagacctccg aggccctggc caagctgatg 2400

agcctgcagg ccacagaggc caccgtggtg acactgggcg aggacaacct gatcatcagg 2460

gaggagcagg tgcctatgga gctggtgcag cgcggcgata tcgtgaaggt ggtgccaggc 2520

ggcaagttcc cagtggacgg caaggtgctg gagggcaata caatggccga tgagagcctg 2580

atcaccggcg aggccatgcc tgtgaccaag aagccaggct ctacagtgat cgcaggcagc 2640

atcaacgcac acggctccgt gctgatcaag gccacccacg tgggcaatga caccacactg 2700

gcccagatcg tgaagctggt ggaggaggcc cagatgtcca aggcccctat ccagcagctg 2760

gccgatcggt tctccggcta cttcgtgccc ttcatcatca tcatgtctac cctgacactg 2820

gtggtgtgga tcgtgatcgg cttcatcgac tttggcgtgg tgcagaggta ttttcccaac 2880

cctaataagc acatcagcca gaccgaagtg atcatccgct tcgcctttca gaccagcatc 2940

acagtgctgt gcatcgcatg cccatgttcc ctgggcctgg caaccccaac agccgtgatg 3000

gtgggcacag gagtggcagc acagaacggc atcctgatca agggcggcaa gcccctggag 3060

atggcccaca agatcaagac cgtgatgttt gacaagaccg gcacaatcac ccacggcgtg 3120

cccagagtga tgagagtgct gctgctgggc gatgtggcca cactgcctct gagaaaggtg 3180

ctggcagtgg tgggcaccgc agaggccagc agcgagcacc cactgggcgt ggccgtgaca 3240

aagtactgca aggaggagct gggcacagag acactgggct attgtaccga cttccaggcc 3300

gtgcccggat gcggaatcgg ctgtaaggtg agcaacgtgg agggcatcct ggcacactcc 3360

gagcggcccc tgagcgcccc tgcatcccac ctgaatgagg caggctctct gccagcagag 3420

aaggacgccg tgcctcagac cttcagcgtg ctgatcggca acagagagtg gctgcggaga 3480

aatggcctga ccatcagctc cgacgtgtcc gatgccatga cagatcacga gatgaagggc 3540

cagaccgcaa tcctggtggc aatcgacggc gtgctgtgcg gcatgatcgc catcgccgat 3600

gcagtgaagc aggaggccgc cctggcagtg cacaccctgc agagcatggg cgtggacgtg 3660

gtgctgatca ccggcgataa caggaagaca gcaagggcaa tcgcaaccca agtgggcatc 3720

aataaggtgt tcgccgaggt gctgccttcc cacaaggtgg ccaaggtgca ggagctgcag 3780

aacaagggca agaaggtggc catggtgggc gacggcgtga atgattctcc agccctggca 3840

caggcagaca tgggagtggc aatcggcaca ggcaccgacg tggcaatcga ggcagcagat 3900

gtggtgctga tcaggaatga cctgctggat gtggtggcct ctatccacct gagcaagcgg 3960

accgtgaggc gcatcagaat caacctggtg ctggccctga tctacaatct ggtgggcatc 4020

ccaatcgcag caggcgtgtt tatgccaatc ggcatcgtgc tgcagccatg gatgggctct 4080

gccgcaatgg cagcctctag cgtgagcgtg gtgctgtcct ctctgcagct gaagtgctac 4140

aagaagccag acctggagcg gtacgaggca caggcacacg gacacatgaa gccactgacc 4200

gcctctcagg tgagcgtgca catcggcatg gacgataggt ggagggacag cccaagggca 4260

acaccatggg atcaggtgtc ctacgtgagc caggtgagcc tgagcagcct gacctccgat 4320

aagccctccc gccactctgc cgccgccgac gacgacgggg acaagtggag cctgctgctg 4380

aacgggagag acgaggaaca gtacatttga taaagatctt cgagaggcct aataaagagc 4440

tcagatgcat cgatcagagt gtgttggttt tttgtgtggg atcc 4484

<210> 10

<211> 362

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

Ile Leu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Lys Ser Ile Glu Asp Arg

1 5 10 15

Ile Ser Asn Leu Lys Gly Ile Ile Ser Met Lys Val Ser Leu Glu Gln

20 25 30

Gly Ser Ala Thr Val Lys Tyr Val Pro Ser Val Val Cys Leu Gln Gln

35 40 45

Val Cys His Gln Ile Gly Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser Ile Ala Glu

50 55 60

Gly Lys Ala Ala Ser Trp Pro Ser Arg Ser Leu Pro Ala Gln Glu Ala

65 70 75 80

Val Val Lys Leu Arg Val Glu Gly Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Ser

85 90 95

Ser Ile Glu Gly Lys Val Arg Lys Leu Gln Gly Val Val Arg Val Lys

100 105 110

Val Ser Leu Ser Asn Gln Glu Ala Val Ile Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu

115 120 125

Ile Gln Pro Glu Asp Leu Arg Asp His Val Asn Asp Met Gly Phe Glu

130 135 140

Ala Ala Ile Lys Ser Lys Val Ala Pro Leu Ser Leu Gly Pro Ile Asp

145 150 155 160

Ile Glu Arg Leu Gln Ser Thr Asn Pro Lys Arg Pro Leu Ser Ser Ala

165 170 175

Asn Gln Asn Phe Asn Asn Ser Glu Thr Leu Gly His Gln Gly Ser His

180 185 190

Val Val Thr Leu Gln Leu Arg Ile Asp Gly Met His Cys Lys Ser Cys

195 200 205

Val Leu Asn Ile Glu Glu Asn Ile Gly Gln Leu Leu Gly Val Gln Ser

210 215 220

Ile Gln Val Ser Leu Glu Asn Lys Thr Ala Gln Val Lys Tyr Asp Pro

225 230 235 240

Ser Cys Thr Ser Pro Val Ala Leu Gln Arg Ala Ile Glu Ala Leu Pro

245 250 255

Pro Gly Asn Phe Lys Val Ser Leu Pro Asp Gly Ala Glu Gly Ser Gly

260 265 270

Thr Asp His Arg Ser Ser Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Pro Pro Arg

275 280 285

Asn Gln Val Gln Gly Thr Cys Ser Thr Thr Leu Ile Ala Ile Ala Gly

290 295 300

Met Thr Cys Ala Ser Cys Val His Ser Ile Glu Gly Met Ile Ser Gln

305 310 315 320

Leu Glu Gly Val Gln Gln Ile Ser Val Ser Leu Ala Glu Gly Thr Ala

325 330 335

Thr Val Leu Tyr Asn Pro Ser Val Ile Ser Pro Glu Glu Leu Arg Ala

340 345 350

Ala Ile Glu Asp Met Gly Phe Glu Ala Ser

355 360

<210> 11

<211> 1103

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

Met Pro Glu Gln Glu Arg Gln Ile Thr Ala Arg Glu Gly Ala Ser Arg

1 5 10 15

Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Leu Pro Thr Arg Ala Trp Glu Pro Ala

20 25 30

Met Lys Lys Ser Phe Ala Phe Asp Asn Val Gly Tyr Glu Gly Gly Leu

35 40 45

Asp Gly Leu Gly Pro Ser Ser Gln Val Ala Thr Ser Thr Val Arg Val

50 55 60

Val Ser Glu Ser Cys Ser Thr Asn Pro Leu Gly Asn His Ser Ala Gly

65 70 75 80

Asn Ser Met Val Gln Thr Thr Asp Gly Thr Pro Thr Ser Val Gln Glu

85 90 95

Val Ala Pro His Thr Gly Arg Leu Pro Ala Asn His Ala Pro Asp Ile

100 105 110

Leu Ala Lys Ser Pro Gln Ser Thr Arg Ala Val Ala Pro Gln Lys Cys

115 120 125

Phe Leu Gln Ile Lys Gly Met Thr Cys Ala Ser Cys Val Ser Asn Ile

130 135 140

Glu Arg Asn Leu Gln Lys Glu Ala Gly Val Leu Ser Val Leu Val Ala

145 150 155 160

Leu Met Ala Gly Lys Ala Glu Ile Lys Tyr Asp Pro Glu Val Ile Gln

165 170 175

Pro Leu Glu Ile Ala Gln Phe Ile Gln Asp Leu Gly Phe Glu Ala Ala

180 185 190

Val Met Glu Asp Tyr Ala Gly Ser Asp Gly Asn Ile Glu Leu Thr Ile

195 200 205

Thr Gly Met Thr Cys Ala Ser Cys Val His Asn Ile Glu Ser Lys Leu

210 215 220

Thr Arg Thr Asn Gly Ile Thr Tyr Ala Ser Val Ala Leu Ala Thr Ser

225 230 235 240

Lys Ala Leu Val Lys Phe Asp Pro Glu Ile Ile Gly Pro Arg Asp Ile

245 250 255

Ile Lys Ile Ile Glu Glu Ile Gly Phe His Ala Ser Leu Ala Gln Arg

260 265 270

Asn Pro Asn Ala His His Leu Asp His Lys Met Glu Ile Lys Gln Trp

275 280 285

Lys Lys Ser Phe Leu Cys Ser Leu Val Phe Gly Ile Pro Val Met Ala

290 295 300

Leu Met Ile Tyr Met Leu Ile Pro Ser Asn Glu Pro His Gln Ser Met

305 310 315 320

Val Leu Asp His Asn Ile Ile Pro Gly Leu Ser Ile Leu Asn Leu Ile

325 330 335

Phe Phe Ile Leu Cys Thr Phe Val Gln Leu Leu Gly Gly Trp Tyr Phe

340 345 350

Tyr Val Gln Ala Tyr Lys Ser Leu Arg His Arg Ser Ala Asn Met Asp

355 360 365

Val Leu Ile Val Leu Ala Thr Ser Ile Ala Tyr Val Tyr Ser Leu Val

370 375 380

Ile Leu Val Val Ala Val Ala Glu Lys Ala Glu Arg Ser Pro Val Thr

385 390 395 400

Phe Phe Asp Thr Pro Pro Met Leu Phe Val Phe Ile Ala Leu Gly Arg

405 410 415

Trp Leu Glu His Leu Ala Lys Ser Lys Thr Ser Glu Ala Leu Ala Lys

420 425 430

Leu Met Ser Leu Gln Ala Thr Glu Ala Thr Val Val Thr Leu Gly Glu

435 440 445

Asp Asn Leu Ile Ile Arg Glu Glu Gln Val Pro Met Glu Leu Val Gln

450 455 460

Arg Gly Asp Ile Val Lys Val Val Pro Gly Gly Lys Phe Pro Val Asp

465 470 475 480

Gly Lys Val Leu Glu Gly Asn Thr Met Ala Asp Glu Ser Leu Ile Thr

485 490 495

Gly Glu Ala Met Pro Val Thr Lys Lys Pro Gly Ser Thr Val Ile Ala

500 505 510

Gly Ser Ile Asn Ala His Gly Ser Val Leu Ile Lys Ala Thr His Val

515 520 525

Gly Asn Asp Thr Thr Leu Ala Gln Ile Val Lys Leu Val Glu Glu Ala

530 535 540

Gln Met Ser Lys Ala Pro Ile Gln Gln Leu Ala Asp Arg Phe Ser Gly

545 550 555 560

Tyr Phe Val Pro Phe Ile Ile Ile Met Ser Thr Leu Thr Leu Val Val

565 570 575

Trp Ile Val Ile Gly Phe Ile Asp Phe Gly Val Val Gln Arg Tyr Phe

580 585 590

Pro Asn Pro Asn Lys His Ile Ser Gln Thr Glu Val Ile Ile Arg Phe

595 600 605

Ala Phe Gln Thr Ser Ile Thr Val Leu Cys Ile Ala Cys Pro Cys Ser

610 615 620

Leu Gly Leu Ala Thr Pro Thr Ala Val Met Val Gly Thr Gly Val Ala

625 630 635 640

Ala Gln Asn Gly Ile Leu Ile Lys Gly Gly Lys Pro Leu Glu Met Ala

645 650 655

His Lys Ile Lys Thr Val Met Phe Asp Lys Thr Gly Thr Ile Thr His

660 665 670

Gly Val Pro Arg Val Met Arg Val Leu Leu Leu Gly Asp Val Ala Thr

675 680 685

Leu Pro Leu Arg Lys Val Leu Ala Val Val Gly Thr Ala Glu Ala Ser

690 695 700

Ser Glu His Pro Leu Gly Val Ala Val Thr Lys Tyr Cys Lys Glu Glu

705 710 715 720

Leu Gly Thr Glu Thr Leu Gly Tyr Cys Thr Asp Phe Gln Ala Val Pro

725 730 735

Gly Cys Gly Ile Gly Cys Lys Val Ser Asn Val Glu Gly Ile Leu Ala

740 745 750

His Ser Glu Arg Pro Leu Ser Ala Pro Ala Ser His Leu Asn Glu Ala

755 760 765

Gly Ser Leu Pro Ala Glu Lys Asp Ala Val Pro Gln Thr Phe Ser Val

770 775 780

Leu Ile Gly Asn Arg Glu Trp Leu Arg Arg Asn Gly Leu Thr Ile Ser

785 790 795 800

Ser Asp Val Ser Asp Ala Met Thr Asp His Glu Met Lys Gly Gln Thr

805 810 815

Ala Ile Leu Val Ala Ile Asp Gly Val Leu Cys Gly Met Ile Ala Ile

820 825 830

Ala Asp Ala Val Lys Gln Glu Ala Ala Leu Ala Val His Thr Leu Gln

835 840 845

Ser Met Gly Val Asp Val Val Leu Ile Thr Gly Asp Asn Arg Lys Thr

850 855 860

Ala Arg Ala Ile Ala Thr Gln Val Gly Ile Asn Lys Val Phe Ala Glu

865 870 875 880

Val Leu Pro Ser His Lys Val Ala Lys Val Gln Glu Leu Gln Asn Lys

885 890 895

Gly Lys Lys Val Ala Met Val Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala

900 905 910

Leu Ala Gln Ala Asp Met Gly Val Ala Ile Gly Thr Gly Thr Asp Val

915 920 925

Ala Ile Glu Ala Ala Asp Val Val Leu Ile Arg Asn Asp Leu Leu Asp

930 935 940

Val Val Ala Ser Ile His Leu Ser Lys Arg Thr Val Arg Arg Ile Arg

945 950 955 960

Ile Asn Leu Val Leu Ala Leu Ile Tyr Asn Leu Val Gly Ile Pro Ile

965 970 975

Ala Ala Gly Val Phe Met Pro Ile Gly Ile Val Leu Gln Pro Trp Met

980 985 990

Gly Ser Ala Ala Met Ala Ala Ser Ser Val Ser Val Val Leu Ser Ser

995 1000 1005

Leu Gln Leu Lys Cys Tyr Lys Lys Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Ala

1010 1015 1020

Gln Ala His Gly His Met Lys Pro Leu Thr Ala Ser Gln Val Ser Val

1025 1030 1035 1040

His Ile Gly Met Asp Asp Arg Trp Arg Asp Ser Pro Arg Ala Thr Pro

1045 1050 1055

Trp Asp Gln Val Ser Tyr Val Ser Gln Val Ser Leu Ser Ser Leu Thr

1060 1065 1070

Ser Asp Lys Pro Ser Arg His Ser Ala Ala Ala Asp Asp Asp Gly Asp

1075 1080 1085

Lys Trp Ser Leu Leu Leu Asn Gly Arg Asp Glu Glu Gln Tyr Ile

1090 1095 1100

<210> 12

<211> 3333

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

ggtaccgcca ccatgcccga acaggaaaga cagatcaccg caagggaagg agcaagtcgc 60

aagattctga gcaaactgag cctgccaacc cgagcctggg agcccgccat gaagaagagc 120

ttcgcctttg acaacgtggg atacgagggc ggcctggatg gcctgggacc tagctcccag 180

gtggccacct ccaccgtgag agtggtgtct gagagctgct ccacaaaccc cctgggcaat 240

cactctgccg gcaacagcat ggtgcagacc acagacggca cccctacaag cgtgcaggag 300

gtggcaccac acaccggccg gctgccagca aatcacgcac cagatatcct ggccaagtct 360

ccccagagca caagagccgt ggcccctcag aagtgttttc tgcagatcaa gggcatgacc 420

tgcgcctcct gcgtgagcaa catcgagcgg aatctgcaga aggaggcagg cgtgctgtcc 480

gtgctggtgg ccctgatggc aggcaaggcc gagatcaagt acgaccctga agtgatccag 540

ccactggaga tcgcccagtt catccaggat ctgggctttg aggccgccgt gatggaggac 600

tatgccggca gcgatggcaa catcgagctg accatcacag gcatgacctg cgcctcttgc 660

gtgcacaaca tcgagagcaa gctgaccaga acaaatggca tcacatacgc ctctgtggcc 720

ctggccacca gcaaggccct ggtgaagttc gaccccgaga tcatcggccc tagggatatc 780

atcaagatca tcgaggagat cggctttcac gcctccctgg cccagcgcaa cccaaatgcc 840

caccacctgg accacaagat ggagatcaag cagtggaaga agtccttcct gtgctctctg 900

gtgtttggca tccccgtgat ggccctgatg atctacatgc tgatcccttc caacgagcca 960

caccagtcta tggtgctgga tcacaacatc atccctggcc tgagcatcct gaatctgatc 1020

ttctttatcc tgtgcacatt cgtgcagctg ctgggcggct ggtactttta tgtgcaggct 1080

tacaagtccc tgcggcaccg gagcgccaat atggacgtgc tgatcgtgct ggccaccagc 1140

atcgcctacg tgtattccct ggtcatcctg gtggtggcag tggcagagaa ggcagagcgg 1200

tcccccgtga ccttctttga tacacctcca atgctgttcg tgtttatcgc cctgggcaga 1260

tggctggagc acctggccaa gagcaagacc tccgaggccc tggccaagct gatgagcctg 1320

caggccacag aggccaccgt ggtgacactg ggcgaggaca acctgatcat cagggaggag 1380

caggtgccta tggagctggt gcagcgcggc gatatcgtga aggtggtgcc aggcggcaag 1440

ttcccagtgg acggcaaggt gctggagggc aatacaatgg ccgatgagag cctgatcacc 1500

ggcgaggcca tgcctgtgac caagaagcca ggctctacag tgatcgcagg cagcatcaac 1560

gcacacggct ccgtgctgat caaggccacc cacgtgggca atgacaccac actggcccag 1620

atcgtgaagc tggtggagga ggcccagatg tccaaggccc ctatccagca gctggccgat 1680

cggttctccg gctacttcgt gcccttcatc atcatcatgt ctaccctgac actggtggtg 1740

tggatcgtga tcggcttcat cgactttggc gtggtgcaga ggtattttcc caaccctaat 1800

aagcacatca gccagaccga agtgatcatc cgcttcgcct ttcagaccag catcacagtg 1860

ctgtgcatcg catgcccatg ttccctgggc ctggcaaccc caacagccgt gatggtgggc 1920

acaggagtgg cagcacagaa cggcatcctg atcaagggcg gcaagcccct ggagatggcc 1980

cacaagatca agaccgtgat gtttgacaag accggcacaa tcacccacgg cgtgcccaga 2040

gtgatgagag tgctgctgct gggcgatgtg gccacactgc ctctgagaaa ggtgctggca 2100

gtggtgggca ccgcagaggc cagcagcgag cacccactgg gcgtggccgt gacaaagtac 2160

tgcaaggagg agctgggcac agagacactg ggctattgta ccgacttcca ggccgtgccc 2220

ggatgcggaa tcggctgtaa ggtgagcaac gtggagggca tcctggcaca ctccgagcgg 2280

cccctgagcg cccctgcatc ccacctgaat gaggcaggct ctctgccagc agagaaggac 2340

gccgtgcctc agaccttcag cgtgctgatc ggcaacagag agtggctgcg gagaaatggc 2400

ctgaccatca gctccgacgt gtccgatgcc atgacagatc acgagatgaa gggccagacc 2460

gcaatcctgg tggcaatcga cggcgtgctg tgcggcatga tcgccatcgc cgatgcagtg 2520

aagcaggagg ccgccctggc agtgcacacc ctgcagagca tgggcgtgga cgtggtgctg 2580

atcaccggcg ataacaggaa gacagcaagg gcaatcgcaa cccaagtggg catcaataag 2640

gtgttcgccg aggtgctgcc ttcccacaag gtggccaagg tgcaggagct gcagaacaag 2700

ggcaagaagg tggccatggt gggcgacggc gtgaatgatt ctccagccct ggcacaggca 2760

gacatgggag tggcaatcgg cacaggcacc gacgtggcaa tcgaggcagc agatgtggtg 2820

ctgatcagga atgacctgct ggatgtggtg gcctctatcc acctgagcaa gcggaccgtg 2880

aggcgcatca gaatcaacct ggtgctggcc ctgatctaca atctggtggg catcccaatc 2940

gcagcaggcg tgtttatgcc aatcggcatc gtgctgcagc catggatggg ctctgccgca 3000

atggcagcct ctagcgtgag cgtggtgctg tcctctctgc agctgaagtg ctacaagaag 3060

ccagacctgg agcggtacga ggcacaggca cacggacaca tgaagccact gaccgcctct 3120

caggtgagcg tgcacatcgg catggacgat aggtggaggg acagcccaag ggcaacacca 3180

tgggatcagg tgtcctacgt gagccaggtg agcctgagca gcctgacctc cgataagccc 3240

tcccgccact ctgccgccgc cgacgacgac ggggacaagt ggagcctgct gctgaacggg 3300

agagacgagg aacagtacat ttgataaaga tct 3333

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 13

ggaaccccta gtgatggagt t 21

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 14

cggcctcagt gagcga 16

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 15

cactccctct ctgcgcgctc g 21

<210> 16

<211> 100

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 16

uacgaggcac aggcacacgg acacaugaag ccacugaccg ccucucaggu gagcgugcac 60

aucggcaugg acgauaggug gagggacagc ccaagggcaa 100

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 17

gacacatgaa gccactgacc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 18

ctgtccctcc acctatcgtc 20

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 19

tgccgatgtg cacgctcacc tga 23

Claims (7)

1.人为设计的基因表达单元，其特征在于，包括：

（1）肝脏特异性启动子，其序列信息如SEQ ID NO.1所示；

（2）人源表达优化的人ATP7B编码序列或截短的人ATP7B编码序列，其序列信息如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示；和/或

（3）多聚腺苷酸加尾信号，其中一种选择序列信息如SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因序列。

3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括：

（1）体内转导可表达产生人ATP7B蛋白或截短的人 ATP7B蛋白；和/或

（2）重组腺相关病毒载体血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10，其中优选的血清型为AAV3B、AAV5、AAV8和AAV9。

4.一种基因治疗药物，其特征在于，包括如权利要求1所述的基因表达框和如权利要求2、3所述的重组腺相关病毒载体。

5.根据权利要求4所述的基因治疗药物，其特征在于，给药方式为静脉注射。

6.根据权利要求4所述的基因治疗药物，其特征在于，一次给药可长期在肝脏中表达产生人ATP7B蛋白或截短的ATP7B蛋白，从而达到治疗ATP7B基因突变引起的疾病。

7.根据权利要求6所述的ATP7B基因突变引起的疾病，优选为肝豆状核变性。

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