CN111133114A - 用色原体检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属种 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；使所述样本与(7R)‑7‑[(z)‑2‑(2‑氨基噻唑‑4‑基)‑(Z)‑2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]‑3‑(2，4‑二硝基苯乙烯基)‑3‑头孢烯‑4甲酸)或其盐的溶液反应；以及当在试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属时，检测反应介质的颜色变化。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目(Enterobacteriales)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)的存在的方法，以及用于这类方法的试剂盒。
背景技术
碳青霉烯酶是一组对包括碳青霉烯类在内的各种抗生素均具有活性的β-内酰胺酶。碳青霉烯酶属于三类β-内酰胺酶，即Ambler类A、Ambler类B和Ambler类D。这三类碳青霉烯酶使临床上重要的细菌对碳青霉烯类具有耐药性或对碳青霉烯类的降低的敏感性。因此，产碳青霉烯酶的细菌在临床上引起关注，并且需要对其进行早期检测的方法，以防止其传播，并减少多药耐药性和泛药耐药性。
在临床上广泛使用两种试验来检测产碳青霉烯酶的细菌；
和其他MIC条产品以及“改良Hodge试验”。在
中，针对试验微生物的指示剂碳青霉烯和碳青霉烯加酶抑制剂抗菌剂在琼脂上以相反的预定义梯度提供，并用于测定抗菌剂的最小抑菌浓度(MIC)和抑菌浓度比。在“改良Hodge试验”中，当报告细菌朝着含有碳青霉烯的圆盘生长以在圆盘周围产生特征性的“三叶草”生长模式时，检测产碳青霉烯酶的细菌。这种现象可由试验分离株产生的碳青霉烯灭活酶介导。还使用了碳青霉烯酶基因的分子检测技术。然而，这三种试验都有其缺点。
和“改良Hodge试验”既不够灵敏，也没有足够的特异性，而分子检测技术复杂且昂贵。此外，所有这三种检测方法都非常耗时，确定样本是否含有产碳青霉烯酶的细菌的典型时间尺度是最多达24小时。这在控制医院获得性感染和耐药性传递时不能令人满意。
最近，开发了酸性比色(acido-colorimetric)技术用于检测产碳青霉烯酶的细菌，据报道，与
“改良Hodge试验”和分子检测技术相比，所述酸性比色技术显著降低了测定时间。WO2012/175637记载了这样一种方法，其中具体记录了测定时间小于2小时。然而，目前的快速表型试验表明，在样本中检测产碳青霉烯酶的假单胞菌属(Heinrichs等人，2015)和不动杆菌属的灵敏度和特异性较差。特别地，可能获得假阴性。
此外，快速检测产碳青霉烯酶的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是限制这些生物体传播的关键，虽然有表型和分子方法可用于检测这些生物体，但是没有单一的检测方法证明对于所有情况都是理想的(Lutgring et Limbago，2016)。根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)(EUCAST，2018)，最近的分类学研究缩窄了肠杆菌科的定义。因此，肠杆菌目是革兰氏阴性菌的一个目，其仅包括一个科；肠杆菌科。因此，本发明将参考肠杆菌目。
因此，需要提供一种检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其不仅具有高度的特异性和灵敏度，而且还可易于在临床上应用。
发明内容
本发明人发现，通过使用产色头孢菌素(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐进行表型试验，可以在非常短的时间内检测到产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在。
具体地，本发明人发现的检测方法不需要在测试碳青霉烯酶的存在之前，将分离株预先暴露于任何可能诱导或抑制表达的试剂，这因此需要额外的信息期。
在一个方面，本发明人已发现可以使用产色头孢菌素(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐检测来自怀疑感染了产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的患者的样本中这类细菌的存在。
因此，在第一方面，本发明提供一种用于检测来自患者的样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；使样本与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的溶液反应；以及检测反应介质的颜色变化，其中颜色从黄色变到红色表明试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属。
根据第二方面，本发明提供(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的用途。
根据第三方面，本发明还提供一种用于测定微生物是否产生水解碳青霉烯的β-内酰胺酶的试剂盒，其包括浸渍有(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐，和超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC抑制剂或其混合物的测定盘。
本发明还涉及一种微量滴定板，其包含一个孔或一系列孔，所述孔含有(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐，以及其在检测试验样本中碳青霉烯酶生产者的存在中的用途。
此外，本发明还涉及包含(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的小瓶或微量离心管，以及其在检测试验样本中碳青霉烯酶生产者的存在中的用途。
具体实施方式
需要可以快速检测产碳青霉烯酶的细菌的方法，以便采取必要的行动来防止抗生素耐药性的传播，并保持抗生素如青霉烯类和碳青霉烯类的功效。本发明的方法通过向用户提供以快速且可靠的方式测定样本是否含有产碳青霉烯酶的细菌的可解释结果来解决这一需要。
具体地，该方法可适合于提供快速且可靠的表型试验，用于检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属种的存在。因此，本发明有利地提供一种适合于提供快速且可靠的表型试验的方法，用于检测不可快速且可靠地使用其他已知方法和/或试验进行测试的产碳青霉烯酶的细菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的存在。
因此，在第一方面，本发明提供一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；使样本与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的溶液反应；以及当试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属时，检测反应介质的颜色变化。
本发明的方法对于检测肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属种中碳青霉烯酶产生可具有100％的灵敏度和100％的特异性。
本发明的方法基于以下概念：(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐可被β-内酰胺酶如碳青霉烯酶水解。([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸的水解导致可观察到的从黄色到红色的颜色变化。
优选地，本发明的方法在从怀疑感染了产碳青霉烯酶的细菌的受试者获得的样本上进行。所述样本可以是从受试者获得的任何生物样本，如液体、组织或细胞样本。优选地，所述样本可以来自分离的细胞培养物，或为尿液样本。所述样本可通过已知方法从受试者获得，所述受试者可为哺乳动物。优选地，从其获得样本的受试者是人。
本发明的方法可用于检测任何肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属产碳青霉烯酶的细菌。优选地，产碳青霉烯酶的细菌具有临床重要性，例如造成医院或社区获得性感染的细菌。
通常，本发明方法中使用的底物(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的浓度为0.1mg/ml至10mg/ml，更优选为1mg/ml至5mg/ml，甚至更优选为2mg/ml至3mg/ml。
根据一些实施方案，将产碳青霉烯酶的细菌在与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐反应之前裂解。细菌的裂解可以通过任何已知的技术进行。任选地，可在混合前将一定量的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属种重新悬浮在微量离心管或小瓶中的蛋白质提取缓冲液/试剂中。混合可通过涡旋适当的时间以确保彻底混合而进行。优选地，混合可通过将样本涡旋约2至约10秒的时间(例如5秒)而实现。然后，可将所述管在合适的温度下温育5至30分钟。任选地，可将所述管温育约10分钟。合适的温度可为约25℃至约45℃。优选地，所述管可在约35℃至约37℃下温育。
在一些实施方案中，样本裂解通过多粘菌素、糖肽和多肽抗生素的组合促进。
样本——其可为裂解样本——与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的反应可在足以观察颜色变化的时间内进行。优选地，颜色变化应在不到1小时内观察到。更优选地，颜色变化可在不到30分钟内观察到。最优选地，颜色变化可在约5至约20分钟内观察到。
样本与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的反应可在任何合适的温度下进行。优选地，该反应可在约5℃至约40℃下进行。例如，该反应可在约15℃至约30℃下进行，例如在室温下进行。优选地，该反应可在约20℃至约37℃下进行，最优选在35℃下进行。
产色头孢菌素(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐还易于被超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和AmpC水解。然而，ESBL和AmpC酶的作用可通过添加合适的抑制剂化合物而消除。因此，当这类抑制剂存在时，颜色的变化表明存在碳青霉烯酶。
因此，在一个实施方案中，该方法还包含超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC抑制剂或其混合物。可使用任何合适的抑制剂。一些合适的抑制剂包括克拉维酸、氯唑西林及其混合物。任选地，该抑制剂包含浓度为约30μg/ml至约50μg/ml的克拉维酸和浓度为约300μg/ml至约500μg/ml的氯唑西林中的至少一种。在抑制剂包含克拉维酸和氯唑西林的情况下，这些可以相等的份数混合在一起，以得到抑制剂混合物。或者，可使用不同量和/或额外的组分。此外，任何碳青霉烯或青霉烯可单独使用或与ESBL和AmpC抑制剂二者组合使用以进一步消除ESBL和AmpC的活性。
选择抑制超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和AmpC的抑制剂允许碳青霉烯酶表达的整个谱可视化。
在本发明的一个实施方案中，(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐可溶解在包含有机溶剂、有机酸和硫酸锌中的至少一种的溶液中。任选地，有机溶剂可为极性非质子溶剂。合适的溶剂可为DMSO。有机酸可为任何合适的有机酸。合适的有机酸可包括选自直链饱和二羧酸的那些，如草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸或癸二酸。
应理解，样本的反应可使用连续的顺序步骤进行，所述步骤例如，包括以下中的至少一些：混合抑制剂混合物，将(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶解于包含有机溶剂、有机酸和硫酸锌中的至少一种的溶液中，将一定量的产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属悬浮在一定量的蛋白质提取试剂中，用于测试和或加热悬浮的产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属以产生活样本，以及将经裂解的样本加入到含有一定量的抑制剂混合物的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸(或其盐)溶液中。
在其他实施方案中，反应过程可通过非连续的反应过程进行，其中将(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐、有机溶剂、有机酸、硫酸锌中的三种或更多种添加到产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的样本中，并与反应过程同时原位裂解。
例如，样本的反应可使用“一锅法”合成技术进行，其中未裂解的样本可与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐、有机溶剂和有机盐反应。任选地，有机溶剂可为DMSO，有机酸可为直链饱和二羧酸，如丁二酸。
在第二方面，本发明提供(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的存在的用途。
(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐可任选地为粉末形式。([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐可溶解在DMSO和丁二酸的混合物中，然后加入硫酸锌。例如，(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐可溶解在1份DMSO对3至20份丁二酸中，然后加入硫酸锌，使最终浓度为0.1mM至10mM。优选地，(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐可溶解在1份DMSO对5至9份丁二酸中。任选地，(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐可溶解在1份DMSO对7份丁二酸中，然后加入硫酸锌，使最终浓度为1mM。
可将一定量的裂解细胞样本或全细胞样本以大约相等的份数加入(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液中。可将裂解细胞样本或全细胞样本在室温下加入(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液中。任选地，可使用约20μl至约100μl经裂解的样本和(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液。
也可加入一定量的抑制剂。任何合适的抑制剂或其混合物可以20μl至约200μl的量使用。优选地，可使用约50μl至约150μl抑制剂。任选地，可加入约100μl的抑制剂，其以相等的份数包含配制至最终浓度为约4μg/ml和400μg/ml的克拉维酸和氯唑西林。
或者，可以等效的最终浓度加入不同的抑制剂或抑制剂混合物，或其比例。
可监测所得溶液的内容物最长达一个小时，优选最长达30分钟，以确定是否发生颜色变化。优选可仅需要对溶液监测5至30分钟。
从黄色到橙色/红色的颜色变化的发生可表明在试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属。
为了测试试验样本中是否存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属，可将一定量的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属种悬浮在蛋白质提取缓冲液/试剂中。然后，可将溶液混合并温育，以产生经裂解样本。可将经裂解的样本的一部分添加到一定量的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐和任选的一定量的抑制剂混合物中，其中通过观察颜色变化来验证阳性试验。
肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属种的使用量可为约0.1μl至约10μl。例如，可使用约0.2μl、0.5μl、1μl、2μl或5μl。蛋白质提取试剂的使用量可为50至250μl。例如，可使用约50μl、75μl、100μl、150μl。优选地，可使用约1μl肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属种和约100μl的蛋白质提取缓冲液/试剂。可使用任何合适的蛋白质提取缓冲液/试剂。
混合可使用任何合适的技术来实现，包括但不限于搅拌、摇动和涡旋混合。例如，可将溶液涡旋混合约1至60秒，例如约5秒。混合可在温育之前和/或过程中发生，以产生经裂解的样本。温育可在任何合适的温度下进行任何合适的时长。例如，温育可在约30至45℃、优选约35至37℃的温度下进行约1至约30分钟，优选约10分钟。
任选地，试验可在未裂解的样本上进行。
可将经裂解的(或未裂解的)样本的任何合适部分加入到任何合适量的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液中，所述溶液任选地含有一定量的抑制剂混合物。任选地，可将约10μl至约100μl，例如约50μl的经裂解的(或未裂解的)样本加入到约20μl至约100μl，例如约50μl的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液，任选地以及约20至200μl，例如约100μl的抑制剂混合物中。
优选地，所述样本、(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液和任选的抑制剂混合物可在室温下加入。
在第三方面，本发明提供一种用于测定微生物是否产生水解碳青霉烯的β-内酰胺酶的试剂盒，其可包含浸渍有([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐和超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC抑制剂或其混合物的测定盘。
在另一个方面，本发明提供一种用于检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的存在的微流控装置或电化学传感装置，其中所述装置包含底物，其为(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐。
微流控装置可为任何产生可表型读取的结果的装置。例如，微流控装置可为微毛细管膜。
电化学传感装置可为在(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐水解后产生信号的任何装置。例如，电化学传感装置可为电极、芯片、试剂盒或荷电膜。
当产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属存在于试验样本中时，经裂解的样本与试剂盒的反应在足以观察(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液中的颜色变化的时间内进行。通常，颜色变化在自样本与缓冲液/试剂混合后小于1小时且更优选小于30分钟观察到。通常，样本与试剂盒的反应在5℃至40℃、优选15℃至30℃的温度下进行，更优选在室温下进行。
所述试剂盒可用于根据本发明的方法，提供一种以高可靠性和准确性识别产碳青霉烯酶的肠杆菌科、假单胞菌属或不动杆菌属细菌的感染的非常快速的方式。
附图说明
图1示出了假单胞菌属种的表型结果。
图2示出了鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)的表型结果。
图3示出了使用本发明的方法和标准技术的假单胞菌属和不动杆菌属种的比较试验。
图4示出了检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目的表型结果。
将根据下文和实施例进一步说明本发明。
实施例1
制备了包含抑制剂混合物和([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸的试验溶液，并将其用于测定多个试验样本中产碳青霉烯酶的假单胞菌属或不动杆菌属的存在，如表1和表2所示。
试验溶液如下配制：
1)将克拉维酸和氯唑西林制成最终浓度为40μg/ml和400μg/ml，并以相等的份数混合在一起，得到抑制剂混合物。
2)将粉末形式的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶于1份DMSO对7份二羧酸中，然后加入硫酸锌至最终浓度为1mM。
3)在微量离心管中，将1μl接种环量的假单胞菌属或不动杆菌属种悬浮在100μl市售可得的蛋白质提取缓冲液/试剂或100μl包含50mM Tris HCl、100mM NaCl和1％Triton x100的提取缓冲液中。
4)将悬浮的假单胞菌属或不动杆菌属种通过涡旋混合5秒，然后在微量离心管中将样本加热至35℃-37℃，并温育10分钟以制备经裂解的样品。
5)在室温下，将50μl经裂解的样本加入到在96孔微量滴定板的孔中的50μl的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液和100μl抑制剂混合物中。
6)在加入细胞裂解物的过程中，通过移液将孔中的内容物混合。
7)目视监测样本最长达30分钟，在自将样本与([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液混合后5、10、20和30分钟，记录溶液颜色。
表1：假单胞菌属种组和用候选显色底物获得的结果
如表1所示，(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐成功地检测到所有9个产碳青霉烯酶的假单胞菌属种。本发明方法的灵敏度为100％，特异性也为100％。
假单胞菌属种的相应表型结果如图1所示。
这些试验表明，本发明的方法对假单胞菌属种的NDM-1、IMP和VIM的检测非常灵敏。此外，还显示在室温下，在加入经裂解的细菌样本后5分钟内，黄色的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液发生显著的变化，变成了红色。虽然较强的红色可能在更长的时间内形成，但是5分钟后的颜色变化足以显示出阳性反应。
表2：不动杆菌属种组和用候选显色底物获得的结果
如表2所示，(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐成功地检测到所有5种产碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌。本发明方法的灵敏度为100％，特异性也为100％。
鲍曼不动杆菌的相应表型结果如图2所示。
这些试验表明，本发明的方法对不动杆菌属种的OXA的检测非常灵敏。此外，还显示在室温下，在加入经裂解的细菌样本后5分钟内，黄色的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐溶液发生显著变化，变成了红色。虽然较强的红色可能在更长的时间内形成，但是5分钟后的颜色变化足以显示出阳性反应。
实施例2
根据实施例1的方法配制试验溶液，并将其用于测试5种假单胞菌属分离株；其中4种分离株对碳青霉烯类具有耐药性，1种为非碳青霉烯酶生产者。在4种产碳青霉烯酶的假单胞菌属分离株中，2种为NDM-1，而其余2种为VIM。还测试了6种不动杆菌属分离株；其中5种分离株对碳青霉烯类具有耐药性，1种为非碳青霉烯酶生产者。所有5种产碳青霉烯酶的不动杆菌属分离株均为OXA。
还使用本领域技术人员已知的用于检测对碳青霉烯类具有降低的敏感性的菌株的市售可得的比色试验，对每种假单胞菌属和不动杆菌属分离株的相应试验进行测试。按照标准说明，对比试验(以比色为基础的试验技术)在35℃-37℃下进行，而根据本发明的方法进行的试验在室温下进行。
这些试验的结果如表3所示，观察到的颜色变化如图3所示。
试验包括阴性对照假单胞菌属和不动杆菌属分离株，其由碳青霉烯酶阴性的铜绿假单胞菌和鲁氏不动杆菌(Acinetobacter iwoffi)分离株组成。所有其余的分离株都是碳青霉烯酶生产者。
表3：包含(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的试验溶液混合物与用于检测对碳青霉烯类具有降低的敏感性的菌株的市售可得的比色试验的比较
如表3所示，在比较(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐与市售可得的pH依赖性诊断方法的过程中所测试的11种生物体中，(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐成功地检测到所有9种产碳青霉烯酶的假单胞菌属和不动杆菌属分离株，而使用标准技术的试验在一种不动杆菌属分离株中没有检测到碳青霉烯酶产生(表中突出显示)。使用标准试验错误识别的假阴性是OXA-27。
因此，表明了标准技术的特异性为100％，但是灵敏度仅为89％，而所要求保护的本发明的方法具有100％的灵敏度和特异性。因此，本发明的方法提供了一种快速检测试验样本中产碳青霉烯酶的假单胞菌属或不动杆菌属的存在的方法，其与已知技术相比具有提高的灵敏度。
实施例3
根据实施例1的方法配制了两种试验溶液。其中一种溶液完全如实施例1中所述，另一种溶液使用产色头孢菌素HMRZ-86代替(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐。
然后将这两种试验溶液用于测试68种假单胞菌属分离株；其中8种分离株对碳青霉烯类具有耐药性，60种为非碳青霉烯酶生产者。在8种产碳青霉烯酶的假单胞菌属分离株中，4种为NDM-1，2种为VIM，而其余2种为IMP。
这两种使用HMRZ-86或(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸的试验溶液都是根据本发明的方法(在室温下进行)进行的。试验结果示于表4。
如表4所示，在(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸与HMRZ比较的过程中所测试的8种产碳青霉烯酶的假单胞菌属生物体中，(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸成功地检测到了所有8种产碳青霉烯酶的假单胞菌属分离株，而使用HMRZ-86代替(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸的试验没有检测到两种产NDM-1的分离株(表4中突出显示)。
因此，表明了本发明技术的灵敏度和特异性均为100％，而具有HMRZ-86的候选显色底物的灵敏度为75％。因此，使用(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸的本发明的方法对于快速检测试验样本中的产碳青霉烯酶的假单胞菌属或不动杆菌属具有较高的灵敏度。
实施例4
制备包含([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸、抑制剂混合物、硫酸锌和膨胀剂的二羧酸缓冲试验溶液，并将其用于测定147种试验分离株中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的存在，如表5所示。
试验溶液如下制备：
1)将粉末形式的(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸溶解在1份DMSO对7份二羧酸中，
2)然后，通过以1份试验溶液对4份二羧酸的比例额外补充二羧酸来缓冲上述步骤1的溶液。
3)将克拉维酸和氯唑西林配制成最终浓度为40μg/ml和400μg/ml，并以相等的份数混合在一起，得到抑制剂混合物。
4)将硫酸锌和PEG 8000加入抑制剂混合物中至最终浓度分别为1mM和0.5％。
5)将含有2mM多粘菌素、4mM糖肽和1.5mM多肽抗生素的混合物也溶解在含有抑制剂混合物的溶液中。
6)然后，将体积为2.8ml的上述步骤5所述的含有抑制剂混合物、硫酸锌、PEG 8000和抗生素混合物的溶液冷冻干燥成丸粒，持续72小时。
随后，测定碳青霉烯酶的存在如下所述进行：
(a)通过加入3.5ml的上述步骤2的试验溶液来复原丸粒。
(b)使丸粒在室温下完全溶解1分钟，并通过轻轻涡旋10秒混合内容物。
(c)复原的溶液应该是黄色的，如果溶液是任何其他颜色，则不要使用。
(d)将500μl复原的溶液分散到微量离心管中。每次试验一管。
(e)使用试验生物体的纯的、新鲜的培养物，向微量离心管中加入1μl接种环量的生物体，并通过涡旋10秒充分混合。
(f)在35-37℃下温育10分钟，并记录试验溶液的颜色。
表5：外部和内部评价数据，其表明用本发明检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属种分离株具有高灵敏度和特异性。
测试了110种肠杆菌目；其中72种分离株是碳青霉烯酶生产者，38种是非碳青霉烯酶生产者。所测试的分离株中的57种为克雷伯氏菌属种(Klebsiella spp)[12种ESBL、5种AmpC、10种OXA、13种KPC和17种MβL(6种NDM、6种IMP和5种VIM)]，24种为大肠杆菌(Escherichia coli)[8种ESBL、5种AmpC、5种OXA、1种KPC和5种MβL(2种VIM、2种NDM和1种IMP)]，23种为肠杆菌属种(Enterobacter spp)[6种ESBL、10种AmpC、2种OXA、4种MβL(2种VIM、2种NDM和1种KPC)]，测试了3种柠檬酸杆菌属种(Citrobacter spp)[全部为NDM]、1种克吕沃尔氏菌属种(Kluvyera spp)[NDM生产者]和2种沙门氏菌属种(Salmonella spp)分离株；其中两种均为AmpC生产者[非碳青霉烯酶]
-测试了23种假单胞菌属种分离株；其中8种分离株为MβL碳青霉烯酶生产者，包括2种NDM、2种IMP和4种VIM。15种假单胞菌属分离株为非碳青霉烯酶生产者[其中14种不具有任何酶介导的机制，而1种分离株为AmpC生产者]。
-测试了14种不动杆菌属种分离株；其中13种分离株为碳青霉烯酶生产者，1种为非碳青霉烯酶生产者。在碳青霉烯酶生产者中，有12种产苯唑西林酶的分离株[4种OXA-23、1种OXA-25、1种OXA-26、1种OXA-27、1种OXA-58和共同生产者如2种为OXA23+OXA-51、1种为OXA-23+OXA-27+OXA-51和1种为OXA-95+AmpC]。产碳青霉烯酶的不动杆菌属分离株中的一种为MβL生产者。
如表5所示，在总共147种所测试的分离株中，本发明检测到83种产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属分离株中的81种。这与对广泛的革兰氏阴性菌的97.59％的总灵敏度和100％的特异性有关。同时，已断定市售可得的试剂盒不适合与铜绿假单胞菌一起使用(Henrichs等人，2015)，而另一种主要的竞争试剂盒——据信使用显色HMRZ-86——对于产碳青霉烯酶的肠杆菌科的检测仅示出64.9％的灵敏度和90％的特异性(Mancini等人，2017)。因此，目前，本发明是唯一的快速比色碳青霉烯酶检测方法，其不仅适用于假单胞菌属和不动杆菌属种分离株，而且还扩展到肠杆菌目；具有非常高的灵敏度和特异性。
Claims (17)
1.一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：
提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；
使所述样本与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的溶液反应；以及
当在试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属时，检测反应介质的颜色变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本为生物样本。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物样本选自诸如尿液的生物样本或通常来自分离的细胞培养物。
4.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述方法还包括在与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐反应之前或同时将所述样本裂解的步骤。
5.根据权利要求1至3所述的方法，其中样本裂解在(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的存在下发生。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述样本裂解通过多粘菌素、糖肽和多肽抗生素的组合促进。
7.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述样本与([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的反应在足以观察颜色变化的时间内、优选在小于1小时内、更优选在小于30分钟内且最优选在约5至约20分钟内进行。
8.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述样本与([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的反应在约5℃至约40℃的温度下、更优选在约20℃至约37℃的温度下且最优选在35℃下进行。
9.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述方法还包括超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC抑制剂或其混合物。
10.根据上述任一权利要求所述的方法，其中([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐与碳青霉烯或青霉烯单独组合使用，或与超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC抑制剂或其混合物组合使用。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述超广谱抑制剂为克拉维酸，AmpC抑制剂为氯唑西林或其混合物。
12.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述抑制剂包含浓度为约30μg/ml至约50μg/ml的克拉维酸和浓度为约300μg/ml至约500μg/ml的氯唑西林中的至少一种。
13.根据上述任一权利要求所述的方法，其中([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐溶解在包含有机溶剂、有机酸和硫酸锌中的至少一种的溶液中。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述有机溶剂为极性的非质子溶剂，优选为DMSO，并且其中所述有机酸为直链饱和二羧酸。
15.([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的用途。
16.根据权利要求15所述的([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的用途，其中([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐连同碳青霉烯或青霉烯单独使用，或与超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC或其混合物组合使用。
17.一种用于确定微生物是否产生水解碳青霉烯的β-内酰胺酶的试剂盒，其包括含有([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的小瓶、具有涂有([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的孔的微量滴定板，或浸渍有HMRZ-98([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐和超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC抑制剂或其混合物的测定盘。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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