CN111398444A - 一种基于sdda-uhplc-ms/ms的拟靶向代谢组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于SDDA‑UHPLC‑MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，包括以下步骤：S1、制备质量控制QC样本，选出最优的质量轴分段方案；S2、对最佳质量轴分段方案下的分段数据依赖型采集‑超高效液相色谱‑高分辨率质谱色谱图进行二级质谱去卷积处理；S3、构建候选离子对；S4、汇总整理不同质量范围的候选离子对；S5、验证候选离子对；S6、基于SDDA‑UHPLC‑MS/MS的拟靶向分析方法的建立；S7、对上一步骤的分析方法进行验证；S8、使用基于SDDA‑UHPLC‑MS/MS的拟靶向分析方法检测待分析样品，并进行代谢组学数据挖掘。本发明所述分析方法保证了检测离子拥有充足的扫描时间，提高了对共洗脱离子的检测，能将分析物检测覆盖率扩大一倍，且灵敏度高、重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析领域，尤其涉及一种基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法。
背景技术
代谢组学是研究生物体内所有内源性代谢物及其变化与生理病理的相对关系的科学。代谢组学通常分为非靶向分析、靶向分析和拟靶向分析。非靶向分析借助高分辨率质谱可获得无偏倚的全扫描信息和准确分子量，然而存在线性范围窄、重复性差、数据处理复杂的问题。靶向分析通常采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式进行检测，具备动态线性范围宽、重复性好的优点，而且分析对象为已知物质，无需色谱峰对齐等复杂的数据处理；但是，靶向分析需要用标准品确定代谢物的离子对信息，导致其化合物覆盖范围窄、通量低。融合了非靶向分析和靶向分析的优势，拟靶向分析通过用高分辨率质谱检测实际样品以获得二级质谱，根据二级质谱建立代谢物离子对的MRM通道，再用三重四极杆质谱的MRM模式检测样品，故而兼具灵敏度高、精密度高、线性范围宽等优点。同时，拟靶向分析打破了传统定量分析需要用标准品确定离子对信息的限制，极大限度缓解了因缺乏标准品无法定量的困难。
数据依赖型采集(data dependent acquisition,DDA)是代谢组学分析中质谱仪常用的采集模式。DDA模式能够在一个扫描循环中获得多个化合物的二级质谱数据，展现出良好的离子归属能力，因此DDA模式非常适合需要建立离子对的拟靶向分析。然而，在遇到共洗脱现象时，由于洗脱物质过多，基于DDA的拟靶向分析或无法有效地建立所有分析物的离子对，造成大量离子漏检。质量轴分段策略可以有效地增加每个离子的扫描时间，提高对共洗脱离子的检测性能。传统检测方法的质量范围大约在100-1000m/z，而质谱仪的扫描速度有限，过宽的质量范围导致每个m/z的扫描时间很短暂，容易导致漏检。但是质量轴分段策略缩短了质量范围，保证每个离子拥有充足的扫描时间，使检测信号更加稳定、结果更加可靠。分段数据依赖型采集(segment data dependent acquisition,SDDA)模式可以延长每个离子的扫描时间，有望提高共洗脱物质的检测。故而，一种基于SDDA-UHPLC-MS/MS(segment data dependent acquisition-ultra high performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry,SDDA-UHPLC-MS/MS)的拟靶向代谢组学分析方法的建立，对拓宽拟靶向分析物质检测范围具有重要意义。
发明内容
为了扩宽拟靶向分析的化合物覆盖范围，本发明提供一种基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于SDDA-UHPLC-MS/MS(分段数据依赖型采集-超高效液相色谱-串联质谱联用技术，segment data dependent acquisition-ultra high performance liquidchromatography-tandemmass spectrometry,SDDA-UHPLC-MS/MS)的拟靶向代谢组学分析方法，包括以下步骤：
S1、制备质量控制QC样本，并以SDDA(segment data dependent acquisition)模式采集不同质量轴分段方案下QC样本的超高效液相色谱-高分辨率质谱数据，选出最优的质量轴分段方案；
SDDA模式简单有效地延长了每一个离子的扫描时间，增强了对共洗脱离子的检测。
S2、对最佳质量轴分段方案下的分段数据依赖型采集-超高效液相色谱-高分辨率质谱色谱图进行二级质谱去卷积处理；
S3、依据二级质谱筛选出前体离子对应的特征产物离子，构建候选离子对；
S4、汇总整理不同质量范围的候选离子对；
S5、验证候选离子对；
S6、基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法的建立；
S7、对基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法进行验证；
S8、使用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法检测待分析样品，并进行代谢组学数据挖掘。
进一步地，步骤S1具体如下：
1)、制备QC样本：所有参与代谢组学分析的样本均精确移取10-100μL等量样本于同一容器中，800rpm涡旋2min以充分混合，形成一个大样本即为QC样本；
2)、质量轴分段依据：以传统的数据依赖型采集(data dependent acquisition,DDA)模式获取代谢物在保留时间(retention time，RT)和质荷比(mass-to-charge ratio,m/z)二维空间上的大体分布情况，在代谢物分布聚集的质量值位置进行分段，一般为100-400Da范围使得每一质量范围的代谢物分布较为均匀；
3)、优化SDDA模式，选择最优质量轴分段方案：进行3-7种不同的分段方案，每种分段方案的分段数不同，获取分段数据依赖型采集-超高效液相色谱-高分辨率质谱扫描数据，以不同分段方案得到的前体离子数量之和为标准，选择前体离子数量之和最大者作为最优的质量轴分段方案。最佳质量轴分段方案的质量轴分段数在2-8段范围。
SDDA模式有效地延长了每一个离子的扫描时间，使得共洗脱离子得到更清晰的检测，从而提高了化合物的检测覆盖率。
进一步地，步骤S2具体为：将最佳质量轴分段方案下的分段数据依赖型采集-超高效液相色谱-高分辨率质谱扫描数据导入质谱去卷积软件进行去卷积、色谱峰识别和色谱分对齐。
优选的，去卷积软件为MS-DIAL，软件版本为3.52或更高，色谱峰的强度阈值为1000-3000amplitude，Mass slice width为0.05或0.1Da，Sigma window value为0.4-0.6，二级质谱背景噪音阈值为10-30amplitude，同位素离子范围为0.5Da。
进一步地，步骤S3具体如下：
1)、筛选产物离子：在去卷积后的文件中(软件优选为MS-DIAL)，每一个前体离子对应的产物离子通过保留时间和质量差匹配，前体离子和产物离子的保留时间相同，且产物离子的质量至少比前体离子的质量小14Da、信号至少高于100amplitude，不同时满足以上两个要求则该前体离子无与其对应的产物离子，同时多个产物离子满足以上两个要求则该前体离子对应多个产物离子；
2)、选择特征产物离子：对于含有多个产物离子的前体离子，以信号最高的产物离子作为其特征产物离子，前体离子和特征产物离子共同构建成候选离子对；对于无产物离子的前体离子则无法构成候选离子对。
进一步地，步骤S4具体如下：
1)、汇总候选离子对：将所有不同质量范围的候选离子对的信息进行汇总，信息包括但不限于保留时间、前体离子精确质量、产物离子精确质量、产物离子信号强度；然后，删除保留时间差小于0.2min且前体离子质量差小于0.05Da且产物离子质量差小于0.05Da的重复候选离子对；
2)、候选离子对编号：对保留下来的候选离子对进行唯一的编号，编号从1开始，编号与候选离子对一一对应不得改变。
进一步地，步骤S5具体如下：
1)、候选离子对分组：验证候选离子对前，将所有编号的候选离子对按保留时间排序，再交错分组，分组数根据候选离子对数量决定，每组候选离子对数量不超过200对；
2)、色谱-质谱检测：采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术的动态MRM模式分组验证候选离子对，每对候选离子对的分析时间为保留时间前后3min，三重四极杆质谱的扫描速度为大于等于15000u/sec，灵敏度为信噪比100000:1pg利血平；
3)、确定离子对：若以超高效液相色谱-三重四极杆质谱检测的候选离子对色谱峰信噪比大于20，则候选离子对通过验证，确定为离子对；
进一步地，步骤S6具体为：汇总所有通过验证的无重复的离子对形成基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法，离子对的编号不变，更新离子对在超高效液相色谱-三重四极杆质谱上的保留时间，每对离子对的扫描时间为保留时间前后1.5min。
进一步地，步骤S7具体如下：
1)、日内重复性：采用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法连续重复分析12份QC样品，对所有色谱峰进行峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)计算。RSD小于15％的色谱峰占总色谱峰数量的85％，且占总色谱峰面积的90％，则拟靶向分析方法日内稳定性优秀；
2)、日间重复性：采用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法每天重复分析8份QC样品，连续三天，对所有色谱峰进行峰面积RSD计算。RSD小于15％的色谱峰占总色谱峰数量的70％，且占总色谱峰面积的75％，则最终的离子对列表日间稳定性良好。
进一步地，步骤S8具体为：运用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法，对所有待测样品进行扫描检测，借助定量积分软件进行色谱峰积分，得到数值化结果方便后续挖掘代谢组学数据。
本发明相对现有技术具有以下优点：
1、本发明采用的质量轴分段策略能够有效地增加每个离子的扫描时间，提高对共洗脱物质的分析检测，拓宽拟靶向分析的化合物覆盖范围。
2、本发明采用的SDDA模式可以根据不同的样品便捷地分割质量轴，使该拟靶向代谢组学分析方法具有广泛的应用范围。
3、本发明利用实际样品建立离子对，从而进行定量检测，故而即使没有标准品也能实现精准的相对定量。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析的工作流程图。
图2为实施例所述基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析的质量轴分段策略的分段依据。
图3为实施例所述基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析的日内重复性考察。
图4为实施例所述基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析的日间重复性考察。
图5为实施例所述基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法与传统基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学方法检测到的前体离子的三维分布。
图6为实施例所述基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法与传统基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学方法建立的离子对数量比较。
图7为实施例所述基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法与传统基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学方法检测到的差异代谢物数量比较。
具体实施方式
实施例
一种基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法。
参阅图1，为所述基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析的工作流程图。首先针对样品特点优化出SDDA模式的最佳质量轴分段数，并用高分辨率质谱以SDDA模式检测样品；然后对最佳质量轴分段数获得的数据进行去卷积处理以构建候选离子对；接着用三重四极杆质谱验证候选离子对；随后汇总整理通过的验证的离子对形成基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法；最后采用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法进行实际应用。
本实施例对大鼠尿液进行分析，具体包括以下步骤：
(1)样品采集：以SD大鼠尿液为例，采集建模给药后正常组、抑郁症模型组、甘草苷给药组、氟西汀给药组四组大鼠24h尿液样品共32个，于4℃以12000rpm离心10min除去固体杂质，留取上层清液于-80℃冻存。
(2)制备QC样本：每个大鼠尿液各移取100μL于15mL离心管，以800rpm涡旋2min均匀混合成一个新的样本，即QC样本。
(3)样本前处理：尿液样本于4℃以12000rpm离心10min，取100μL上层清液直接进样分析。
(4)色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm)柱，柱温35℃。流动相为含0.1％甲酸的水(A)和含0.1％甲酸的乙腈(B)，流速0.30mL/min。洗脱梯度：前2min保持3％B，线性提高，17min时升至35％B，再次线性提高，19min时升至95％B，保持3min，0.01min内迅速降回3％B，平衡至25min。进样体积为1μL。
(5)高分辨率质谱条件：电喷雾电离(ESI)，源温度120℃，fastDDA模式，扫描时间0.1s，每个质谱扫描循环选择信号强度排名前20个离子进行MS/MS扫描。毛细管电压3.0kV，碰撞电压分别为10V、20V、30V。氮气为去溶剂气，温度300℃，流速800L/h。锥孔气流速30L/h。高纯度氩气为碰撞气。200ng/mL亮氨酸脑啡肽作为质量校正液，流速10μL/min。
(6)优化SDDA模式，选择最优质量轴分段数：参阅图2，为本实施例的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析中质量轴分段策略的分段依据，即传统DDA模式检测的代谢物在保留时间(retention time,RT)和m/z平面上的分布。代谢物密集分布在100-400m/z范围，则在采用将质量轴分为五段的SDDA模式检测时，将质量范围分为50-150m/z、150-190m/z、190-240m/z、240-300m/z、300-800m/z五段，分段检测。
质谱质量轴范围设为50-800Da，分析QC样本；得到的数据导入MS-DIAL软件，设置最低峰高为1000amplitude，MS/MS噪音阈值为10amplitude，进行色谱峰提取、色谱峰对齐，获得代谢物的保留时间和m/z，用之作出代谢物在保留时间-m/z平面上的大体分布情况。然后根据代谢物的分布情况，将质量轴按不同的分段水平分为三段、五段、八段，再次分别分析QC样本，分三段的MS和MS/MS质量范围分别为50-180、180-250、250-800Da和50-180、50-250、50-800Da；分五段的MS和MS/MS质量范围分别为50-150、150-190、190-240、240-300、300-800Da和50-150、50-190、50-240、50-300、50-800Da；分八段的MS和MS/MS质量范围分别为50-125、125-150、150-170、170-200、200-235、235-270、270-320、320-800Da和50-125、50-150、50-170、50-200、50-235、50-270、50-320、50-800Da。再将数据导入MS-DIAL软件用相同的条件进行色谱峰提取和对齐。最后，选择总色谱峰数量最多的五段作为最优质量轴分段数。
(7)构建候选离子对：首先QC样本分五段采集的数据借助MS-DIAL软件进行去卷积处理，导出去卷积的二级质谱数据。然后从二级质谱数据中筛选出每一个前体离子对应的产物离子，产物离子与前体离子保留时间相同、信号强度大于100amplitude、分子量至少比前体离子的小14Da且。最后从产物离子中挑选出信号最强者特征产物离子，前体离子与特征产物离子匹配成候选离子对。
(8)将五段不同质量轴得到的候选离子对的信息进行汇总，删除保留时间差小于0.2min且前体离子质量差小于0.05Da且产物离子质量差小于0.05Da的重复候选离子对。
(9)候选离子对编号：对汇总整理后的候选离子对进行唯一的编号，按照保留时间顺序排序，编号从1开始，直至3944，编号与候选离子对一一对应不得改变。
(10)候选离子对验证：首先将所有候选离子对按保留时间排序，进行保留时间交错分组，共分为20组。然后采用Shimadzu公司的超高效液相色谱-三重四极杆质谱的MRM模式分组验证候选离子对，每对候选离子对的分析时间为保留时间前后3min。色谱条件同上，三重四极杆质谱条件：雾化气流量3L/min，加热气流量10L/min，接口温度300℃，DL温度250℃，加热块温度400℃，干燥气流量10L/min。得到的数据用Labsolution软件进行峰面积积分，色谱峰信号的信噪比大于20的候选离子对验证通过并确定为离子对。随后汇总所有分组的离子对，整理形成合并的离子对列表，离子对的编号不变，更新离子对在超高效液相色谱-三重四极杆质谱上的保留时间。最后对比同一离子对在10、20、30V不同碰撞电压下的峰面积，保留使得峰面积最大的最佳碰撞电压，形成最终的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，并将分析时间改为保留时间前后1.5min。
(11)方法验证：采用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法连续重复分析12份QC样品，计算峰面积RSD作为日内重复性的指标。每天重复分析8份QC样品，连续三天，计算所以色谱峰的峰面积RSD作为日间重复性的指标。
图3为本实施例的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法的日内重复性考察。以基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法重复检测12份QC样品，计算各个色谱峰的峰面积RSD，分别统计满足RSD<5％或RSD<10％或RSD<15％或RSD<30％的色谱峰比例及其峰面积之和占总峰面积的比例。
图4为本实施例的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法的日间重复性考察。以基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法每日重复检测8份QC样品，连续3日，计算各个色谱峰三日检测的峰面积RSD，分别统计满足RSD<5％或RSD<10％或RSD<15％或RSD<30％的色谱峰比例及其峰面积之和占总峰面积的比例。
结果显示，超过93％的代谢物(占总峰面积的97％)峰面积RSD<15％，表明方法的日内重复性优秀；超过70％的代谢物(占总峰面积的83％)峰面积RSD<15％，表明方法的日间重复性良好。
(12)实际样本检测：采用所建立和验证的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法分析大鼠尿液实际样品，每6个样本中间插入1个QC样本以监测仪器的稳定性。得到的数据用LabSolution软件进行色谱峰面积积分，然后进行多元统计分析、差异性分析、代谢通路分析等代谢组学数据挖掘。
图5为本实施例所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法和采用传统基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法检测到的前体离子在RT、信号强度、m/z三维空间的分布。采用基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法检测到的离子基本都能用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法检测，而且后者还能检测到前者没有检测到的离子，后者检测的离子数量约是前者的两倍。
图6为本实施例所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法和采用传统基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析学方法建立的离子对数量。采用基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法建立的离子对几乎都能用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法建立，而且基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法建立的离子对数量(502)比基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法建立的离子对数量(254)多约一倍。
图7为本实施例所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法和采用传统基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法检测到的差异变量的数量。采用基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法检测到的差异变量全部都能用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法检测，而且基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法检测到的差异变量(比基于DDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向方法检测到的差异变量还多一倍。
综上，本实施例采用的质量轴分段策略能够有效地增加每个离子的扫描时间，提高对共洗脱物质的分析检测，拓宽拟靶向分析的化合物覆盖范围。本实施例采用的SDDA模式可以根据不同的样品便捷地分割质量轴，使该拟靶向代谢组学分析方法具有广泛的应用范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备质量控制QC样本，并以SDDA模式采集不同质量轴分段方案下QC样本的超高效液相色谱-高分辨率质谱数据，选出最优的质量轴分段方案；
S2、对最佳质量轴分段方案下的分段数据依赖型采集-超高效液相色谱-高分辨率质谱色谱图进行二级质谱去卷积处理；
S3、依据二级质谱筛选出前体离子对应的特征产物离子，构建候选离子对；
S4、汇总整理不同质量范围的候选离子对；
S5、验证候选离子对；
S6、基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法的建立；
S7、对基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法进行验证；
S8、使用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法检测待分析样品，并进行代谢组学数据挖掘。
2.根据权利要求1所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S1具体如下：
1)、制备QC样本：所有参与代谢组学分析的样本均精确移取10-100μL等量样本于同一容器中，800rpm涡旋2min以充分混合，形成一个大样本即为QC样本；
2)、质量轴分段依据：以传统的数据依赖型采集模式获取代谢物在保留时间和质荷比二维空间上的大体分布情况，在代谢物分布聚集的质量值位置进行分段，一般是在100-400Da范围内分段，段间距不需要等距，使得每一质量范围的代谢物分布较为均匀；
3)、优化SDDA模式，选择最优质量轴分段方案：进行3-7种不同的分段方案，每种分段方案的分段数不同，获取分段数据依赖型采集-超高效液相色谱-高分辨率质谱扫描数据，以不同分段方案得到的前体离子数量之和为标准，选择前体离子数量之和最大者作为最优的质量轴分段方案；最佳质量轴分段方案的质量轴分段数在2-8段范围。
3.根据权利要求1所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S2具体为：将最佳质量轴分段方案下的分段数据依赖型采集-超高效液相色谱-高分辨率质谱扫描数据导入质谱去卷积软件MS-DIAL进行去卷积、色谱峰识别和色谱分对齐，MS-DIAL版本为3.52或更高，色谱峰的强度阈值为1000-3000amplitude，Mass slicewidth为0.05或0.1Da，Sigma window value为0.4-0.6，二级质谱背景噪音阈值为10-30amplitude，同位素离子范围为0.5Da。
4.根据权利要求1所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S3具体如下：
1)、筛选产物离子：在去卷积后的文件中，每一个前体离子对应的产物离子通过保留时间和质量差匹配，前体离子和产物离子的保留时间相同，且产物离子的质量至少比前体离子的质量小14Da、信号至少高于100amplitude，不同时满足以上两个要求则该前体离子无与其对应的产物离子，同时多个产物离子满足以上两个要求则该前体离子对应多个产物离子；
2)、选择特征产物离子：对于含有多个产物离子的前体离子，以信号最高的产物离子作为其特征产物离子，前体离子和特征产物离子共同构建成候选离子对；对于无产物离子的前体离子则无法构成候选离子对。
5.根据权利要求1所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S4具体如下：
1)、汇总候选离子对：将所有不同质量范围的候选离子对的信息进行汇总，信息包括但不限于保留时间、前体离子精确质量、产物离子精确质量、产物离子信号强度；然后，删除保留时间差小于0.2min且前体离子质量差小于0.05Da且产物离子质量差小于0.05Da的重复候选离子对；
2)、候选离子对编号：对保留下来的候选离子对进行唯一的编号，编号从1开始，编号与候选离子对一一对应不得改变。
6.根据权利要求1所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S5具体如下：
1)、候选离子对分组：验证候选离子对前，将所有编号的候选离子对按保留时间排序，再交错分组，分组数根据候选离子对数量决定，每组候选离子对数量不超过200对；
2)、色谱-质谱检测：采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术的动态MRM模式分组验证候选离子对，每对候选离子对的分析时间为保留时间前后3min，三重四极杆质谱的扫描速度为大于等于15000u/sec，灵敏度为信噪比100000:1pg利血平；
3)、确定离子对：若以超高效液相色谱-三重四极杆质谱检测的候选离子对色谱峰信噪比大于20，则候选离子对通过验证，确定为离子对。
7.根据权利要求1所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S6具体为：汇总所有通过验证的无重复的离子对形成基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法，离子对的编号不变，更新离子对在超高效液相色谱-三重四极杆质谱上的保留时间，每对离子对的扫描时间为保留时间前后1.5min。
8.根据权利要求1所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S7具体如下：
1)、日内重复性：采用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法连续重复分析12份QC样品，对所有色谱峰进行峰面积相对标准偏差计算；RSD小于15％的色谱峰占总色谱峰数量的85％，且占总色谱峰面积的90％，则拟靶向分析方法日内稳定性优秀；
2)、日间重复性：采用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法每天重复分析8份QC样品，连续三天，对所有色谱峰进行峰面积RSD计算；RSD小于15％的色谱峰占总色谱峰数量的70％，且占总色谱峰面积的75％，则最终的离子对列表日间稳定性良好。
9.根据权利要求1所述的基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向代谢组学分析方法，其特征在于，步骤S8具体为：运用基于SDDA-UHPLC-MS/MS的拟靶向分析方法，对所有待测样品进行扫描检测，借助定量积分软件进行色谱峰积分，得到数值化结果方便后续挖掘代谢组学数据。
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