CN111474336A - 一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法，其利用NiNPs与组氨酸较强的螯合结合力，将一端修饰组氨酸的8‑OHdG适体联接在NiNPs上，形成NiNPs‑组氨酸‑8‑OHdG适体复合物，并将此复合物上适体DNA与磁性微球上捕获探针碱基互补配对从而形成NiNPs适体传感器，制备的传感器灵成品性能稳定、应用效果优异。本发明还公开了利用上述铁氰化镍纳米粒适体传感器化学发光8‑OhdG检测的方法，以8‑OHdG适体上所连接的纳米镍作为检测探针，利用纳米镍催化鲁米诺体系产生化学发光信号的原理，建立适体传感器上所连接的纳米镍的用量与化学发光强度的对应关系，从而得出8‑OHdG浓度与化学发光强度的量化关系，间接实现8‑OHdG的定量分析检测，而且大大提高了检测灵敏度和精密度。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，进一步涉及核酸适配体技术，具体涉及一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OHdG的方法。
背景技术
8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是鸟嘌呤氧化在活性氧物质攻击鸟嘌呤碱基的第八个碳原子的过程中的主要产物。8-OHdG是DNA中自由基诱导的氧化损伤的主要形式之一，是氧化应激的优良生物标志物，是多种疾病的危险因素，包括癌症，糖尿病和神经系统疾病。国际上已经广泛应用于环境污染和职业安全评价、疾病早期诊断、癌症发生机制研究等领域，因此研究8-OHdG检测新方法越来越受到重视，研究一种满足不同层次的快速灵敏性高并且简便的检测方法具有重要意义
8-OHdG通过血液运输并排泄到尿液中而不会进一步代谢。因此，可以通过检测尿液中8-OHdG的浓度判断DNA的氧化损伤浓度。目前，32p后标记法是应用最广泛，灵敏度最高的8-OHdG检测方法但32p在实验过程中会对实验人员本身形成放射性损害，且如果实验废液处理不当，还会造成环境污染。所以，该法不适宜推广。另外，常见的8-OHdG检测方法还有高效液相色谱-电化学检测法、高效毛细管电泳法、气相-质谱联用法、同位素稀释质谱法等，但这些方法存在成本高、处理复杂、只能实现微量制备等问题导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。酶联免疫吸附试验(ELISA)也是常见的检测手段，ELISA在大多数实验室中易于执行，成本低，灵敏度高，仪器简单。但是准备工作既繁琐又耗时。因此，开发用于检测痕量8-OHdG的高灵敏度，方便且成本有效的传感器是必要的。
适体是使用指数富集的配体系统进化(SELEX)选自随机序列核酸文库的DNA或RNA分子。适体可以高亲和力特异性结合多种靶分子，并且已广泛用作生物传感应用的识别元件，例如荧光，电化学和电化学发光生物传感器。在2009年使用SELEX方法选择了8-OHdG的特异性适体。所选择的适体具有富含G的序列，并且8-OHdG可以诱导其构象以形成G-四链体结构。基于此已经开发了一些用于检测8-OH-dG的适体传感器的方法，例如杂交链反应(HCR)扩增，滚环扩增(RCA)和等温指数扩增。这些方法使信号放大从而提高灵敏性，但是检测的成本高。因此我们在这基础上建立一种灵敏性高，性质稳定且能特异性识别的检测8-OHdG的适体传感器。由于核酸适配体是通过SELEX技术体外筛选出来的能够特异性结合目标配体的寡聚核苷酸片段。以其特有的高亲和力和特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合各种生物目标分子，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而，要获得可行的检测方法，建立高效的适配体传感器是关键所在，首先适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量成有规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适配体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。
铁氰化镍为过渡金属铁氰化物即普鲁士蓝的过渡金属类似物，具有独特的混合价态基团结构属性，是良好的氧化还原阶梯，可用于化学修饰电极中电催化和检测多种物质以及生物传感器中的电子介体。纳米粒铁氰根离子可以和化学发光反应产生信号，而镍离子会促进信号增强。所以基于镍纳米粒制成的适体传感器成为目前化学发光检测的生物传感器中准确度更高、灵敏度更好的识别元件。不过经研究发现以及无数次实验验证，常规镍纳米粒适体传感器的制备过程中镍纳米粒容易发生瓦解，使得制备效率低、成品性能不稳定、应用的灵敏与精确效果不佳。
发明内容
针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种用于检测8-OHdG的铁氰化镍纳米粒(NiNPs)化学发光适体传感器的制备方法及其应用，用于解决现有技术中8-OHdG适体传感器制备效率低、成品性能不稳定、应用效果不佳的技术缺陷。
本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)通过在戊二醛溶液中将8-OHdG适配体和铁氰化镍纳米粒先后交联组氨酸，形成NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物；
2)通过氨酸反应将氨基修饰的8-OHdG报告序列固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-8-OHdG报告序列复合物；
3)将步骤2)中所得过量的复合物与步骤1)中所得的复合物反应后即得到铁氰化镍纳米粒标记的8-OHdG适体传感器。
进一步地，步骤1)具体包括以下步骤：
①将浓度为10～100mM的组氨酸溶于4％～6％戊二醛溶液中，后加入终浓度为0.5～7nM的8-OHdG适体进行交联，在35～39℃条件下震荡孵育2h～4h；
②加入终浓度为50～200mM的铁氰化镍纳米粒再次交联，在35～39℃条件下震荡孵育50min～70min；
③将步骤②反应完的液体加入至超滤管中进行超滤，超滤后取管内未透过超滤膜的液体，加入200uL的BA缓冲溶液再次超滤，超滤后的产物为NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物。
上述NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物的存储方法是在其中加入200uL的BA缓冲溶液，3℃～5℃储存待用。
进一步地，步骤2)具体包括以下步骤：
(a)取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃条件下震荡孵育15～25min，而后加入报告序列，于35～39℃条件下震荡孵育50min～70min；
(b)在上述步骤(a)后用WB溶液洗涤三次，加入5％～15％BSA 200uL，35～39℃条件下震荡孵育50min～70min，封闭磁性微球上多余的结合位点。
进一步地，上述步骤3)包括以下操作：取步骤1)中的复合物2uL加入到上述步骤2)中固定有报告序列的磁性微球溶液中，35～39℃条件下震荡孵育50min～70min，得到铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器。
进一步地，步骤3)制得的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器悬浮于0.1M的MES(2-(N吗啉基)乙磺酸单水合物)溶液中储存待用。
本发明还提供了一种基于铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器检测8-OhdG的方法，该方法为：将铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与待测的8-OhdG样品混合，35～39℃条件下震荡孵育1h后取出，用WB洗涤三次后磁性分离；所述铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器用50uL水转移至测量皿，将鲁米诺储存液用1mol/L NaOH的水溶液稀释至10-4mol/L，取50uL稀释后的鲁米诺溶液加入至测量皿中，使得上述稀释后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与鲁米诺试剂混匀后检测发光信号CL值。
本发明化学发光检测8-OhdG方法原理为：
以8-羟基脱氧鸟苷适体的捕获探针作为固定相，固定于磁性微球表面，并以在戊二醛溶液中将适配体和纳米镍先后交联到组氨酸表面，以纳米镍作为标记物；基于碱基互补配对原理，交联好的适配体与固定有8-OHdG的捕获探针的磁性微球形成适体传感器；由于核酸适配体的高亲和性，利用8-OHdG与报告序列竞争结合8-OHdG适体的竞争关系，且8-OHdG结合适配体的能力强报告序列，从而得到了待测8-OHdG浓度与传感器上所接标记了纳米镍8-OHdG适体的负相关关系；以8-OHdG适体上所连接的纳米镍作为检测探针，利用纳米镍催化鲁米诺体系产生化学发光信号的原理，建立适体传感器上所连接的纳米镍的用量与化学发光强度的对应关系，从而得出8-OHdG浓度与化学发光强度的量化关系，间接实现8-OHdG的定量分析检测。
在以上技术方案中，所述检测发光信号CL值，是利用BPCL微弱化学发光仪实现的；所述咪唑缓冲液可依据本领域的一般技术常识选择常规的配方实施本发明。
在以上技术方案中，镍纳米粒可用其常规方法制备获得，利用K3Fe(CN)6还原NiCl2的方法制备铁氰化镍纳米粒。具体方法为：在搅拌下，将35mL的0.01M NiCl2水溶液滴加到含有0.05M KCL的0.05M K3Fe(CN)6的35mL溶液中，合成铁氰化镍镍纳米粒；加完后，将液体剧烈搅拌5min，然后立即进行过滤(0.4μm Milipore纤维素滤膜)；用水连续洗涤保留物，然后过滤收集并在室温下真空干燥过夜，得到粉末状物质。
所制备的铁氰化镍纳米粒可以通过紫外可见分光光度计和透射电子显微镜对其进行表征。首先，将铁氰化镍纳米粒溶胶稀释一倍，通过紫外可见分光光度计测定，所制的纳米镍在400～700nm波长范围内的紫外可见吸收光谱；然后，将纳米镍溶胶滴在碳支持膜铜网上，自然晾干后，通过透射电子显微镜观察纳米镍粒子的形貌特征、粒度分布及粒径大小。
在以上技术方案中，所述8-OHdG的报告序列的序列为：5’-CCG CCG ATC GCC CGCAAA AAA AAA A-NH2-3’；该物质可自试剂销售公司定制、购得。所述的8-OHdG适体的序列为：5’-GCG GGC GAT CGG CGG GGG GTG CGT GCG CTC TGT GCC AGG GGG TGG GAC AGA TCATAT GGG GGT GCT-NH2-3’，该物质同样可自试剂销售公司定制、购得。
所述过量的磁性微球-8OHdG复合物，是指构建铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器的反应中，前者量较多、使结合反应完成后仍存在未结合有NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物的磁性微球-8-OHdG复合物游离于体系中的情形；具体的磁性微球-8-OHdG复合物用量可根据对待测样品中8-OHdG的含量的估算来确定，当然亦可参照本发明实施例中磁性微球-8-OHdG复合物用量来实施本发明。
所述充分反应是指固定于磁性微球上的8-OHdG适体与8-OHdG的特异性结合完全。
所述过量的DNA-NiNPs复合物，是指固定在纳米镍上的报告序列与固定在磁性微球上的、未与8-OHdG结合的8-OHdG适体之间的杂交反应中，前者量较多、使杂交反应完成后未结合有8-OHdG的磁性微球-8-OHdG适体复合物均结合上报告序列的情形；具体的DNA-NiNPs复合物用量可通过估算体系中未结合有8-OHdG的磁性微球-8-OHdG适体复合物含量来确定，当然亦可参照本发明实施例中DNA-NiNPs复合物用量来实施本发明。
在利用本发明方法执行检测时，可以先利用该方法对一组不含8-OHdG的标准溶液进行检测，以绘制出时间与发光信号CL值之间的线性关系，而后再对待测样品执行检测，将检测结果带入上述线性关系以获得实际检测值。其中标注曲线的绘制是利用本发明方法绘制的，而其中注入浓度梯度的选择、图表模式的选择、误差的校正等可以依照本领域的一般技术常识确定。
与现有技术相比，本发明有益效果包括：
(1)本发明采用独特的结合方式制备铁氰化镍纳米粒适体传感器，利用组氨酸和铁氰化镍的较强螯合结合力，组氨酸先和适配体连接后再与铁氰化镍纳米粒连接，使得一端修饰组氨酸的8-OHdG适体联接在NiNPs上形成NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物，此复合物上适体DNA与磁性微球上捕获探针碱基互补配对从而形成NiNPs适体传感器，避免组氨酸直接和镍络合连接会造成铁氰根纳米粒瓦解，使得灵敏度与精密度提高了数个量级。
(2)本发明制备的铁氰化镍纳米粒适体传感器对8-OhdG进行化学发光检测过程中，以8-OHdG适体上所连接的纳米镍作为检测探针，利用纳米镍催化鲁米诺体系产生化学发光信号的原理，建立适体传感器上所连接的纳米镍的用量与化学发光强度的对应关系，从而得出8-OHdG浓度与化学发光强度的量化关系，间接实现8-OHdG的定量分析检测，而且大大提高了检测灵敏度与精密度。
附图说明
图1是本发明检测方法的原理示意图。
图2是本发明实施例1中的标准曲线图。
图3是本发明实施例1中对本发明检测方法的特异性考察实验结果。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作进一步地说明。
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
1实验原理
本发明通过在磁性微球表面构建纳米镍标记的适配体传感器，以羧基磁性微球作为固定载体，并利用磁性分离技术实现了适配体传感器与其它异相的分离。该技术方案中首先通过以8-OHdG适体的捕获探针作为固定相，通过氨酸反应固定于磁性微球表面，合成磁性微球复合物。并在戊二醛溶液中将适配体和纳米镍先后交联到组氨酸表面，以纳米镍作为标记物，合成NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体。利用8-OHdG适体的捕获探针与适配体的互补杂交，合成纳米镍标记的适配体传感器。此外，将纳米镍粒子被氧化后形成的NiC4-催化鲁米诺体系发生化学发光这一化学发光检测原理，以及在该传感模式下，8-OHdG浓度与磁性微球表面标记的纳米镍粒子数量的负相关性，从而得到了8-OHdG浓度与化学发光信号的量化关系，实现了8-OHdG的定量分析检测，实验原理如图1所示。首先，本发明利用氨羧结合反应，将氨基化的8-OHdG适体的捕获探针固定在羧基磁性微球表面；在戊二醛溶液中将适配体和纳米镍先后交联到组氨酸表面，以纳米镍作为标记物，合成NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体。利用8-OHdG适体的捕获探针与适配体的互补杂交，合成纳米镍标记的适配体传感器，然后分别向各组加入不同浓度8-OHdG，由于8-OHdG适体与8-OHdG特异性结合，8-OHdG适体的捕获探针不能与纳米镍粒子表面修饰的报告序列互补杂交，从而使得磁性微球表面标记的纳米镍粒子数量变少，相应的化学发光信号值减小。当没有8-OHdG存在时，磁性微球表面固定NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体没有与8-OHdG发生特异性结合，使得磁性微球表面标记的纳米镍粒子数量最多，相应的化学发光信号值最大。当8-OHdG浓度逐渐增大时，越来越多在磁性微球表面固定的NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体与8-OHdG发生特异性结合，标记在磁性微球表面的纳米镍数量逐渐减少，相应测得的化学发光信号值也逐渐较小。因此，8-OHdG浓度与化学发光信号值呈负相关关系。然而，随着8-OHdG浓度的增加，加入不同浓度8-OHdG的组别对比空白对照组(不加8-OHdG)所引起的化学发光信号值的变化量(ΔCL)逐渐增大。因此，8-OHdG浓度与ΔCL呈正相关关系，从而实现了8-OHdG的定量分析检测。
2实验方法
2.1 6-氰基铁酸镍基团纳米粒的制备及表征
本实验采用利用K3Fe(CN)6还原NiCl2的方法制备6-氰基铁酸镍基团纳米粒。在搅拌下，将35mL的0.01M NiCl2水溶液滴加到含有0.05M KCL的0.05M K3Fe(CN)6的35mL溶液中，合成NiNP纳米粒子。加完后，将液体剧烈搅拌5min，然后立即进行过滤(用0.4umMilipore纤维素滤膜)。用水连续洗涤保留物，然后过滤收集并在室温下真空干燥过夜，得到粉末状物质。
2.2 NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体的制备
在5％戊二醛先将50nM组氨酸溶解，加入5nM 8-OHdG适体，在37℃下恒温震荡孵育3h；然后加入刚刚配好的120nM NiNPs，37℃恒温震荡孵育1h，将反应完的液体加入至超滤管中进行超滤，超滤后取管内未透过超滤膜的液体，加入200uL的BA缓冲溶液再次超滤，超滤后的产物中加入200uL BA缓冲溶液，4℃储存待用。
2.3纳米镍标记的适配体传感器制备
取60μg羧基磁性微球于1.5mL离心管中，磁性分离，弃上清液。用200μL pH6.0的0.1M咪唑缓冲溶液洗涤磁性微球，重复三次；使磁性微球重新悬浮于200μL含EDC的咪唑缓冲溶液中，在37℃下震荡活化20min；加入50pmol探针，37℃下震荡反应1h，使探针序列通过氨羧反应固定于磁性微球表面；通过磁性分离去除上清液，磁性微球用200μLWB缓冲溶液重复洗涤三次，加入200μL 10％BSA溶液，于37℃下震荡反应1h，封闭磁性微球表面的空白位点；取2uL NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体，于37℃下震荡反应1h，得到铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器。将铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与待测样品混合，37℃恒温震荡孵育1h后取出，用200μL WB洗涤三次后磁性分离。待化学发光检测。
2.4化学发光检测
铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器用50uL水转移至测量皿。将鲁米诺储存液用1mol/L NaOH的水溶液稀释至1×10-4mol/L，取50uL稀释后的鲁米诺溶液加入至测量皿中，混匀并立即放入化学发光检测器中测定。化学发光信号由BPCL微弱化学发光仪检测，由仪器所连电脑终端显示并记录，化学发光强度以输出信号峰值定量。
2.5铁氰化镍纳米粒适体传感器化学发光检测8-OHdG性能评价
本发明通过对医院癌症患者尿液的样本进行加标回收试验，从而评价本方法的准确性及精密度。实验制备100uL用MES稀释的不同浓度的8-OHdG溶液，将适体传感器分散在8-OHdG溶液中并在恒温下反应1h。反应后，进行磁分离，并用WB缓冲液洗涤3次。然后将其转移到装有50μL水的量杯中，最后加入50μL的Luminol溶液(1×10-4M)。随后用本方法对待测液进行化学发光检测，计算加标样品回收率。
本发明选取了5种离子K+、Na+、Zn2+、Mg2+、Cu2+和与8-OHdG结构类似的物质抗坏血酸、尿酸、鸟苷、鸟嘌呤、胞苷对本方法的选择特异性进行考察。
3实验结果
3.1标准曲线的建立
在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，50pmol探针，2uL NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体)，利用该传感器对一系列不同浓度的8-OHdG进行化学发发光检测，建立化发光标准曲线。
结果如图2所示，8-OHdG浓度在35.3pM～35.3nM范围内，ΔCL信号值与8-OHdG浓度的对数值呈现非常好线性关系(Y＝30113X-17236 R2＝0.9934)，最低检测限为34.6pM。
本发明参照了近期文献中其他分析方法(如Flurescence、HPLC-UV、Electrochemical、Fluorescence等方法)对8-OhdG进行检测，并与本发明进行比较，见下表1
表1对8-OHdG检测的不同方法的比较表
结合图2与表1可以知道本发明方法的灵敏度相较于其他方法大大提高。
3.2铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器性能评价
在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，0.5nM 8-OHdG适体，2uL)，选用抗坏血酸、尿酸、鸟苷、鸟嘌呤、胞苷、K+wNa+、Zn2+、Mg2+、Cu2+这些分析物，对铁氰化镍纳米粒适体传感器进行特异性考察。实验选择分别在铁氰化镍纳米粒适体传感器中添加与10ng/mL 8-OHdG等量水平的以上分析物，再进行化学发光检测，实验结果如图3所示。
另一方面，据计算，健康人尿液中8-OHdG的浓度范围为1.57ng/mL至6.48ng/mL，而癌症患者尿液中8-OHdG的浓度范围为21.54ng/mL至50.49ng/mL。例如饮食，吸烟，性别，年龄，疾病类型，但可以判断出所准备的传感器可以测量8-OHdG。在尿液中，癌症患者的8-OHdG水平确实高于普通人。实验对尿液样品中8-OHdG进行检测。加标浓度分别为3.53×10- 7M，3.53×10-8M，3.53×10-9M。结果如表2所示，平均回收率在92.83％～97.71％之间。重复三次测定，相对标准偏差在2.66％～3.81％之间。由此可知，本发明所设计的铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器具有较好的精密度，可行性较强，可用于实际样品中8-OHdG的定量分析。
表2尿液样品中8-OHdG加标回收率
4实验结论
本发明通过利用核酸适配体技术及磁性分离技术，在磁性微球表面组建8-OHdG适体传感器。以纳米镍作为检测标记物，利用其对鲁米诺化学发光体系的催化活性，实现的8-OHdG的定量分析检测。在优化实验条件下(60μg羧基磁性微球，0.5nM 8-OHdG适体，1∶100的DNA-AuNPs)，8-OHdG浓度在35.3pM～35.3nM范围内，化学发光信号下降幅度(ΔCL信号值，Y)与所测8-OHdG浓度(X)之间存在良好的线性关系(Y＝30113X-17236 R2＝0.9934)，最低检测限为34.6pM。尿液样品中8-OHdG的平均回收率在92.83％～97.71％之间，重复三次测定，相对标准偏差在2.66％～3.81％之间。本方法具有高精密度及高特异性，可用于实际样品中8-OHdG的高灵敏度快速分析。本发明所设计的纳米镍适体传感器，为OTA的分析检测提供一种新的思路，也为分析检测领域开拓了一个新的平台。
实施例2
一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法，包括以下步骤：
1)NiNPs-组氨酸-8-OHDG适体复合物制备
①将浓度为100mM的组氨酸溶于6％戊二醛溶液中，加入终浓度为7nM的能特异性结合8-OHdG的适体进行交联，在37℃条件下震荡孵育4h；
②加入终浓度为200mM的铁氰化镍纳米粒再次交联，在37℃条件下震荡孵育70min；
③将步骤②反应完的液体加入至超滤管中进行超滤，超滤后取管内未透过超滤膜的液体，加入200uL的BA缓冲溶液再次超滤，超滤后的产物为NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物；
上述NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物的存储方法是在其中加入200uL的BA缓冲溶液，5℃储存待用。
2)磁性微球-8-OHdG报告序列复合物制备
(a)取磁性微球4uL，利用0.1M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于37℃条件下震荡孵育20min，而后加入报告序列70pmol，于37℃条件下震荡孵育70min；
(b)在上述步骤(a)后用WB溶液洗涤三次，加入15％BSA 200uL，37℃条件下震荡孵育70min，封闭磁性微球上多余的结合位点；。
3)铁氰化镍纳米粒标记的8-OHdG适体传感器制备
取步骤1)中的复合物2uL加入到上述步骤2)中固定有报告序列的磁性微球溶液中，37℃条件下震荡孵育70min，得到铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器。
制得的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器悬浮于0.1M的MES(2-(N吗啉基)乙磺酸单水合物)溶液中储存待用。
4)适体传感器与待测样品混合
将步骤3)制备的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与待测的8-OhdG样品混合，37℃条件下震荡孵育1h后取出，用WB洗涤三次后磁性分离。
5)化学发光检测
将步骤4)混合后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器用50uL水转移至测量皿，将鲁米诺储存液用1mol/L NaOH的水溶液稀释至1X10-4mol/L，取50uL稀释后的鲁米诺溶液加入至测量皿中，使得上述稀释后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与鲁米诺试剂混匀后检测发光信号CL值。
通过实施例建立的标准曲线，将发光信号CL值与8-OhdG浓度对应起来，进而计算出8-OhdG浓度浓度。
实施例3
一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法，包括以下步骤：
1)NiNPs-组氨酸-8-OHDG适体复合物制备
①将浓度为10mM的组氨酸溶于5％戊二醛溶液中，加入终浓度为1nM的8-OHdG适体进行交联，在35℃条件下震荡孵育2h；
②加入终浓度为50mM的铁氰化镍纳米粒再次交联，在35℃条件下震荡孵育50min；
③将步骤②反应完的液体加入至超滤管中进行超滤，超滤后取管内未透过超滤膜的液体，加入200uL的BA缓冲溶液再次超滤，超滤后的产物为NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物；
上述NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物的存储方法是在其中加入200uL的BA缓冲溶液，4℃储存待用。
2)磁性微球-8-OHdG报告序列复合物制备
(a)取磁性微球0.5uL，利用0.05M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35℃条件下震荡孵育15min，而后加入报告序列，于35℃条件下震荡孵育50min；
(b)在上述步骤(a)后用WB溶液洗涤三次，加入10％BSA 200uL，35℃条件下震荡孵育50min，封闭磁性微球上多余的结合位点；。
3)铁氰化镍纳米粒标记的8-OHdG适体传感器制备
取步骤1)中的复合物2uL加入到上述步骤2)中固定有报告序列的磁性微球溶液中，35℃条件下震荡孵育50min，得到铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器。
制得的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器悬浮于0.1M的MES(2-(N吗啉基)乙磺酸单水合物)溶液中储存待用。
4)适体传感器与待测样品混合
将步骤3)制备的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与待测的8-OhdG样品混合，35℃条件下震荡孵育1h后取出，用WB洗涤三次后磁性分离。
5)化学发光检测
将步骤4)混合后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器用50uL水转移至测量皿，将鲁米诺储存液用1mol/L NaOH的水溶液稀释至10-4mol/L，取50uL稀释后的鲁米诺溶液加入至测量皿中，使得上述稀释后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与鲁米诺试剂混匀后检测发光信号CL值。
通过实施例建立的标准曲线，将发光信号CL值与8-OhdG浓度对应起来，进而计算出8-OhdG浓度浓度。
实施例4
一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法，包括以下步骤：
1)NiNPs-组氨酸-8-OHDG适体复合物制备
①将浓度为50mM的组氨酸溶于4％戊二醛溶液中，加入终浓度为5nM的8-OHdG适体进行交联，在39℃条件下震荡孵育4h；
②加入终浓度为100mM的铁氰化镍纳米粒再次交联，在39℃条件下震荡孵育60min；
③将步骤②反应完的液体加入至超滤管中进行超滤，超滤后取管内未透过超滤膜的液体，加入200uL的BA缓冲溶液再次超滤，超滤后的产物为NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物；
上述NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物的存储方法是在其中加入200uL的BA缓冲溶液，3℃储存待用。
2)磁性微球-8-OHdG报告序列复合物制备
(a)取磁性微球4uL，利用0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于39℃条件下震荡孵育25min，而后加入报告序列70pmol，于39℃条件下震荡孵育70min；
(b)在上述步骤(a)后用WB溶液洗涤三次，加入15％BSA 200uL，39℃条件下震荡孵育70min，封闭磁性微球上多余的结合位点；。
3)铁氰化镍纳米粒标记的8-OHdG适体传感器制备
取步骤1)中的复合物2uL加入到上述步骤2)中固定有报告序列的磁性微球溶液中，39℃条件下震荡孵育70min，得到铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器。
制得的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器悬浮于0.1M的MES(2-(N吗啉基)乙磺酸单水合物)溶液中储存待用。
4)适体传感器与待测样品混合
将步骤3)制备的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与待测的8-OhdG样品混合，39℃条件下震荡孵育1h后取出，用WB洗涤三次后磁性分离。
5)化学发光检测
将步骤4)混合后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器用50uL水转移至测量皿，将鲁米诺储存液用1mol/L NaOH的水溶液稀释至10-4mol/L，取50uL稀释后的鲁米诺溶液加入至测量皿中，使得上述稀释后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与鲁米诺试剂混匀后检测发光信号CL值。
通过实施例建立的标准曲线，将发光信号CL值与8-OhdG浓度对应起来，进而计算出8-OhdG浓度浓度。
实施例5
一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法，包括以下步骤：
1)NiNPs-组氨酸-8-OHDG适体复合物制备
①将浓度为75mM的组氨酸溶于5％戊二醛溶液中，加入终浓度为5nM的8-OHdG适体进行交联，在37℃条件下震荡孵育3h；
②加入终浓度为150mM的铁氰化镍纳米粒再次交联，在37℃条件下震荡孵育60min；
③将步骤②反应完的液体加入至超滤管中进行超滤，超滤后取管内未透过超滤膜的液体，加入200uL的BA缓冲溶液再次超滤，超滤后的产物为NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物；
上述NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物的存储方法是在其中加入200uL的BA缓冲溶液，4℃储存待用。
2)磁性微球-8-OHdG报告序列复合物制备
(a)取磁性微球2uL，利用0.1M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于37℃条件下震荡孵育20min，而后加入报告序列60pmol，于37℃条件下震荡孵育50min～70min；
(b)在上述步骤(a)后用WB溶液洗涤三次，加入10％BSA 200uL，37℃条件下震荡孵育60min，封闭磁性微球上多余的结合位点；。
3)铁氰化镍纳米粒标记的8-OHdG适体传感器制备
取步骤1)中的复合物2uL加入到上述步骤2)中固定有报告序列的磁性微球溶液中，37℃条件下震荡孵育60min，得到铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器。
制得的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器悬浮于0.1M的MES(2-(N吗啉基)乙磺酸单水合物)溶液中储存待用。
4)适体传感器与待测样品混合
将步骤3)制备的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与待测的8-OhdG样品混合，37℃条件下震荡孵育1h后取出，用WB洗涤三次后磁性分离。
5)化学发光检测
将步骤4)混合后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器用50uL水转移至测量皿，将鲁米诺储存液用1mol/L NaOH的水溶液稀释至10-4mol/L，取50uL稀释后的鲁米诺溶液加入至测量皿中，使得上述稀释后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与鲁米诺试剂混匀后检测发光信号CL值。
通过实施例建立的标准曲线，将发光信号CL值与8-OhdG浓度对应起来，进而计算出8-OhdG浓度浓度。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法
<140> 2020102053704
<141> 2020-03-21
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgggcgatcggcggggggtgcgtgcgccctgtgccagggggtgggacagatcatatggg 60
ggtgct 66
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgccgatcgcccgcaaaaaaaaaa 25
Claims (6)
1.一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)通过在戊二醛溶液中将8-OHdG适配体和铁氰化镍纳米粒先后交联组氨酸，形成NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物；
2)通过氨酸反应将氨基修饰的8-OHdG报告序列固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-8-OHdG报告序列复合物；
3)将步骤2)中所得过量的复合物与步骤1)中所得的复合物反应后即得到铁氰化镍镍纳米粒标记的8-OHdG适体传感器。
2.根据权利要求1所述的一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：
①将浓度为10～100mM的组氨酸溶于4％～6％戊二醛溶液中，后加入终浓度为0.5～7nM的8-OHdG适体进行交联，在35～39℃条件下震荡孵育2h～4h；
②加入终浓度为50～200mM的铁氰化镍纳米粒再次交联，在35～39℃条件下震荡孵育50min～70min；
③将步骤②反应完的液体加入至超滤管中进行超滤，超滤后取管内未透过超滤膜的液体，加入200uL的BA缓冲溶液再次超滤，超滤后的产物为NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物；
所述NiNPs-组氨酸-8-OHdG适体复合物的存储方法是在其中加入200uL的BA缓冲溶液(BA缓冲溶液：称取0.2125g Tris，7.305g氯化钠，取适量超纯水溶解，用0.10mol/L的稀盐酸溶液调节pH 8.0，取超纯水定容至250mL。)置于3℃～5℃储存待用。
3.根据权利要求1所述的一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤2)具体包括以下步骤：
(a)取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃条件下震荡孵育15～25min，而后加入报告序列，于35～39℃条件下震荡孵育50min～70min；
(b)在上述步骤(a)后用WB溶液(WB溶液：称取1.21g Tris，4.975g氯化钠，取适量的超纯水溶解，用0.10mol/L的稀盐酸溶液调节pH8.0，再称取0.25g吐温后，取超纯水定容至500mL。)洗涤三次，加入5％～15％BSA 200uL，35～39℃条件下震荡孵育50min～70min，封闭磁性微球上多余的结合位点。
4.根据权利要求1所述的一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤3)包括以下操作：取步骤1)中的复合物2uL加入到上述步骤2)中固定有报告序列的磁性微球溶液中，35～39℃条件下震荡孵育50min～70min，得到铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器。
5.根据权利要求4所述的一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法，其特征在于：步骤3)制得的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器悬浮于0.1M的MES(2-(N吗啉基)乙磺酸单水合物)溶液中储存待用。
6.一种基于权利要求1所述的铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器检测8-OhdG的方法，其特征在于：将所述铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与待测的8-OhdG样品混合，35～39℃条件下震荡孵育1h后取出，用WB洗涤三次后磁性分离；所述铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器用50uL水转移至测量皿，将鲁米诺储存液用1mol/L NaOH的水溶液稀释至1×10- 4mol/L，取50uL稀释后的鲁米诺溶液加入至测量皿中，使得上述稀释后的铁氰化镍纳米粒标记的适体传感器与鲁米诺试剂混匀后检测发光信号CL值。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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