CN111593040B - 硫酸皮肤素裂解酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及硫酸皮肤素裂解酶及其应用。本发明中的硫酸皮肤素裂解酶DLase降解硫酸皮肤素的酶活力为800～1800U/mg，其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。本发明涉及的硫酸皮肤素裂解酶DLase具有更高的降解硫酸皮肤素活性，解决了现有技术中硫酸皮肤素专一性降解酶酶活低不利于大规模生产应用的问题，同时具有更好的温度稳定性，本发明的硫酸皮肤素裂解酶DLase为内切型酶，可用于CS/DS相关样品中DS组成结构的特异性分析、DS组分的选择性降解去除、DS寡糖的制备以及相关产品的质量控制分析等。

Description

硫酸皮肤素裂解酶及其应用

技术领域

本发明涉及硫酸皮肤素裂解酶及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin sulfates,CS)/硫酸皮肤素(Dermatan sulfates,DS)是一种主要类型的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)，它们通过连接序列(-GlcUA-Gal-Gal-Xyl-O-Ser)共价连接在核心蛋白上组成蛋白聚糖(Groteoglycans,PGs)(Lindahl,U.1965)，广泛分布在细胞表面以及细胞外基质中，参与细胞的各种生理病理过程，包括神经系统的发育(Faissner,A.1994,Clement,A.M.1998)、损伤修复(Trowbridge,J.M.2002)、细胞分裂生长、细胞间信号转导等过程(Nandi,S.2006,Taylor,K.R.2006)。这些多样化的功能归因于CS/DS结构的多样性。CS由D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid,GlcUA)和N-乙酰基-D-半乳糖胺(N-acetyl-D-galactosamine,GalNAc)组成的二糖单位重复连接而成。D-葡萄糖醛酸在C-5差向异构酶的作用下变为L-艾杜糖醛酸(L-iduronicacid,IdoUA)而变成了DS(Maccarana,M.2006)。因此CS与DS链经常以CS-DS共聚结构存在于哺乳动物组织中(Izumikawa,T.2004,Cheng,F.1994)。在生物合成过程中，CS/DS链通常会在GalNAc的C-4位和/或C-6位，和/或GlcUA/IdoUA的C-2位上被磺基转移酶进一步修饰，以形成独特的结构域。这些特定的结构域分布在特定的细胞组织中，与细胞因子、生长因子等各种蛋白相互作用参与机体的生理病理过程(Sugahara,K.2003)。因此研究CS/DS的特定结构对于其功能的研究十分重要。

CS与DS结构的异质性阻碍了其功能的研究，目前用于其结构分析的方法主要有核磁共振法(Nuclear magnetic resonance,NMR)与质谱法(Mass spectrometry,MS)(Linhardt,R.J.2006)。此外具有特定活性的CS/DS裂解酶也是用于CS/DS结构功能关系研究和制备生物活性寡糖的有效工具。这些裂解酶通过β-消除反应特异性切割GalNAc与GlcUA/IdoUA残基之间的1,4-糖苷键，从而在糖醛酸残基上产生一个在232nm具有特定紫外吸收的不饱和双键(Garron,M.L.2010)。在这些裂解酶中有些可以降解透明质酸(Hyaluronan,HA)，CS和DS，如来自Proteus vulgaris的商业化硫酸软骨素裂解酶ABC(CSase ABC)(Yamagata,T.1968)；有些可以特异性的切割CS/DS糖链中CS的GalNAcβ1-4GlcUA糖苷键，如来自Flavobaterium heparinum的CSase ACI和来自Arthrobacteraurescens的CSase ACII(Hiyama,K.1975)。

但目前仅有一个可以特异性的切割CS/DS糖链中DS的GalNAcβ1-4IdoUA糖苷键的酶CSase B被鉴定。该酶首先由Hoffman从F.heparinum中观察到，然后Michelacci和Dietrich对其进行了分离检测。2001年Pojasek克隆表达了F.heparinum中的CSase B(Pojasek K.2001)。除此之外，未见其它关于特异性降解DS的裂解酶相关报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，尤其是现有硫酸皮肤素专一性降解酶种类数量稀少且比酶活低不利于大规模生产应用的问题，本发明提供了硫酸皮肤素裂解酶及其应用。本发明利用生物信息学技术在NCBI数据库中发现了两个硫酸皮肤素裂解酶候选基因，并对其进行了异源克隆表达与应用。

本发明的技术方案如下：

硫酸皮肤素裂解酶DLase，其降解硫酸皮肤素的酶活力为800～1800U/mg。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase的反应pH为6～10，反应温度为10～50℃。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase降解硫酸皮肤素的酶活力为911～1630U/mg。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase的反应pH为9～10，反应温度为40℃。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase在0-40℃热处理24h后保持70％以上的酶活力。

进一步优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase在0-40℃热处理24h后保持80％以上的酶活力。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase在20～40mM的钙离子浓度条件下促进其酶活。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase在透明质酸、硫酸软骨素、肝素和/或硫酸乙酰肝素存在时抑制其酶活。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase为内切型酶。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase的编码基因核苷酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

上述硫酸皮肤素裂解酶DLase在制备生物活性多糖中的应用。

上述硫酸皮肤素裂解酶DLase在鉴定CS/DS结构中的应用。

本发明的技术特点和有益效果：

1、本发明利用生物信息学分析从NCBI数据库中发现了两个潜在的硫酸皮肤素裂解酶(DS Lyase,DLase)候选基因dlase 1和dlase 2，该候选基因与已知的硫酸皮肤素裂解酶CSase B的编码基因同源性较低，是除Pojasek克隆表达的F.heparinum中的CSase B外其它来源的硫酸皮肤素裂解酶，对该候选基因进行克隆表达，发现两个酶都具有更高的DS裂解酶活性，在CS/DS结构功能研究，活性寡糖制备及相关生物医药研究中具有重要的应用价值，丰富了硫酸皮肤素裂解酶的种类和数量。

2、本发明涉及的硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2都具有更高的降解硫酸皮肤素活性，酶活力分别可达911U/mg与1630U/mg，远高于已报道的CSase B酶活84.6U/mg，解决了现有技术中硫酸皮肤素专一性降解酶酶活低不利于大规模生产应用的问题，同时两个酶均比已报道的CSase B具有更好的pH和温度稳定性，本发明的硫酸皮肤素裂解酶DLase 1在0-40℃热处理24h后仍能够保持70％以上的酶活力，硫酸皮肤素裂解酶DLase 2在0-40℃热处理24h后仍能够保持80％以上的酶活力。

3、本发明所述的硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2为内切型酶，可以通过β-消除反应特异性切割GalNAc与IdoUA残基之间的β-1,4-糖苷键，因此可以选择性降解CS/DS样品中的DS结构，用于CS/DS相关样品中DS组成结构的特异性分析、DS组分的选择性降解去除、DS寡糖的制备以及相关产品的质量控制分析等，是研究CS/DS结构功能关系和制备生物活性寡糖的有效工具，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)的蛋白质三维结构模型；

图2为重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)的表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；

其中：泳道1、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD；泳道2、对照菌株破壁前的菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁后的菌液，上样量10μL，泳道4、重组菌破壁后的上清，上样量10μL，泳道5、经镍柱纯化的DLase 1，上样量10μL；箭头表示目标蛋白；

图3为pH对硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)活性的影响曲线；图中，纵坐标为相对活力；

图4为温度对硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)活性的影响曲线；图中，横坐标为温度，纵坐标为相对活力；

图5为温度对硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)稳定性的影响曲线；图中，横坐标为时间，纵坐标为相对活力；

图6为金属离子及化学试剂对硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)活性的影响曲线；图中，纵坐标为相对活力；

图7为不同浓度钙离子对硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)活性的影响曲线；图中，横坐标为CaCl₂浓度，纵坐标为相对活力；

图8为不同种类与浓度的糖胺聚糖对硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)活性的影响曲线；图中，纵坐标为相对活力；

图9为硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图A)与DLase 2(图B)不同时间降解硫酸皮肤素的降解产物的高效液相(HPLC)分析图；

其中：1,不饱和八糖；2,不饱和六糖；3,不饱和四糖；4,二硫酸化不饱和二糖；5,单硫酸化不饱和二糖。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度。实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1、硫酸皮肤素裂解酶候选基因的获得与序列分析。

硫酸皮肤素裂解酶候选基因用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的分析软件Basic Local AlignmentSearch Tool(BLAST,http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析获得。硫酸皮肤素裂解酶DLase 1来自于Pseudopedobacter saltans，基因编码区长1539bp(NCBI注册号：AAO78455)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，与已报道的硫酸皮肤素裂解酶CSase B的编码基因cslB(AAC83384.1)基因仅具有57％的同源性。硫酸皮肤素裂解酶DLase 2来自于uncultured Bacteroides，基因编码区长1461bp(NCBI注册号：SCH13530.1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，与已报道的硫酸皮肤素裂解酶CSase B的编码基因cslB(AAC83384.1)基因仅具有43％的同源性。

核苷酸序列SEQ ID NO.1编码的硫酸皮肤素裂解酶DLase 1的蛋白序列由512个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白质的理论分子量约为56.32kD。用SimpleModular Architecture Research Tool(SMART，http://smart.embl_heidelberg.de/)分析硫酸皮肤素裂解酶DLase 1的结构信息，结果显示N端第1至第21个氨基酸是信号肽序列，第26-414位氨基酸序列属于多糖裂解酶6超家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http:// swissmodel.expasy.org)对硫酸皮肤素裂解酶DLase 1的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的蛋白质三维结构模型如图1A所示。

核苷酸序列SEQ ID NO.2编码的硫酸皮肤素裂解酶DLase 2的蛋白序列由486个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，蛋白质的理论分子量约为53.46kD。用SimpleModular Architecture Research Tool(SMART，http://smart.embl_heidelberg.de/)分析硫酸皮肤素裂解酶DLase 2的结构信息，结果显示N端第1至第19个氨基酸是信号肽序列，第24-409位氨基酸序列属于多糖裂解酶6超家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http:// swissmodel.expasy.org)对硫酸皮肤素裂解酶DLase 2的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的蛋白质三维结构模型如图1B所示。

实施例2、DLase 1基因与DLase 2基因在大肠杆菌中的重组表达。

分别以SEQ ID No.1与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为PCR模板，该PCR模板由华大基因合成，进行PCR扩增，引物如下：

正向引物rDLase 1-F:GCATATGAAGCATATTCTGGTGGCGAGCG；

反向引物rDLase 1-R:GCTCGAGGTTGTTGCGATCACGTGCCAGC；

正向引物rDLase 2-F:GCATATGGAAAATATTACCGTGGGCACCACC；

反向引物rDLase 2-R:GCTCGAGCTGTGCAAAGATACCAGTCTCGGC。

在正向和反向引物中，标注有下划线的碱基序列分别为限制性内切酶NdeI和XhoI的酶切位点。Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃稳定15min。

DLase 1与DLase 2的基因片段经PCR扩增后，用限制性内切酶NdeI和XhoI对PCR产物和pET-30a表达载体分别进行双酶切处理，之后利用琼脂糖凝胶电泳回收双酶切后的目的基因片段。此过程所用的限制性内切酶NdeI、XhoI购自宝生物公司，pET-30a载体购自美国Novagen公司，酶与底物反应的体系、反应温度以及反应时间均遵循使用说明书。

经双酶切回收后的PCR产物与同样双酶切后的pET-30a表达载体进行连接，连接产物转化进大肠杆菌DH5α菌株后，涂布到含50μg/mL硫酸卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上；37℃培养12h，挑取单克隆到含有50μg/mL的硫酸卡那霉素液体Luria-Bertani培养基中，37℃、200rpm摇床培养12h，提取质粒；然后用正向引物和反向引物进行菌液PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确，取出20μL重组质粒送去生工生物公司测序，测序结果表明，DLase 1基因片段(SEQID NO.1)与DLase 2基因片段(SEQID NO.2)均成功分别插入到pET-30a表达载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，插入方向正确，且未发生碱基突变、缺失以及增加的情况，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将重组表达载体命名为pET30a-DLase 1与pET30a-DLase 2。T4 DNA ligase购自TaKaRa公司，连接反应体系、反应温度、反应时间均遵循使用说明书。

将重组质粒pET30a-DLase 1与pET30a-DLase 2分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2的诱导表达，目的蛋白利用Ni Sepharose 6Fast Flow(GE)凝胶进行纯化，之后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化的目的蛋白进行检测，检测结果如图2所示，纯化后的重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2在电泳胶上均呈现单一条带，且位置与预测的分子量相吻合，纯度均达到95％。

实施例3、重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2的酶学性质分析

1、pH对酶活性的影响

将3mg/mL的硫酸皮肤素、反应缓冲液、DLase 1或DLase 2以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合，反应缓冲液为150mM的NaAc-HAc(pH5.0-6.0)、150mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH6.0-8.0)、150mM的Tris-HCl(pH7.0-10.0)。在30℃下反应10分钟，反应结束后，按紫外分光光度法测定酶活力，检测结果如图3A所示，重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1在Tris-HCl(pH 10.0)时达到最大活力，在NaAc-HAc(pH 6.0)时活力次之，但考虑到过高的pH对后续金属离子稳定性的影响，最终选取NaAc-HAc(pH 6.0)作为后续实验反应pH；重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 2在Tris-HCl(pH 9.0)时达到最大活力(图3B)，因此最适反应pH为9.0。

紫外法测定酶活力的方法参考现有技术(Yamagata,T.1968)，以灭活酶为阴性对照，利用分光光度计测定反应产物232nm光吸收判断产物生产量从而判定酶活力的大小。

2、温度对酶活性的影响

将3mg/mL的硫酸皮肤素、150mM pH7.0的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液(用于DLase 1酶液反应)或150mM的Tris-HCl(pH 9.0)(用于DLase 2酶液反应)缓冲液、DLase 1酶液或DLase 2酶液以及去离子水按照10:10:3:7(体积比)的比例混合后，分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下反应10min，反应结束后，按紫外分光光度法测定酶活力，检测结果如图4所示，DLase 1与DLase 2在40℃时均达到最大活力，表明重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2的最适反应温度均为40℃。

3、温度对酶稳定性的影响

在0℃-70℃不同温度下将DLase 1酶液和DLase 2酶液进行1、2、4、8、12、24h热处理，然后与3mg/mL的硫酸皮肤素，分别在最适温度和最适pH下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力(relativie activity)，检测结果如图5A所示，重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1在0-40℃热处理24h后仍能够保持70％以上的酶活力。与已报道的CSase B相比，DLase 1具有更好的温度稳定性。重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 2在0-40℃热处理24h后仍能够保持80％以上的酶活力(图5B)，与已报道的CSase B相比，DLase 2也具有更好的温度稳定性。

4、金属离子对酶活性的影响

将3mg/mL的硫酸皮肤素、150mM pH7.0的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液(用于DLase 1酶液反应)或150mM的Tris-HCl(pH 9.0)(用于DLase 2酶液反应)、DLase 1或DLase 2酶液以及去离子水按照10:10:3:4(体积比)的比例混合，然后向反应体系中添加不同的金属离子，添加的金属离子终浓度为10mM，在40℃下反应10min，反应结束后，按紫外分光光度法检测残余酶活力，以未加金属离子的酶活力定义为100％。检测结果如图6A所示，Ag⁺,Hg²⁺,Fe^{2 +},Cu²⁺,Zn²⁺,Fe³⁺,Cr³⁺,EDTA和SDS对DLase 1酶活具有强烈的抑制作用，Ca²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺和Ba²⁺对DLase 1酶活具有较高的促进作用。如图6B所示，Ag⁺,Co²⁺,Pb²⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Fe³⁺,EDTA,和SDS对DLase 2酶活具有强烈的抑制作用，Ca²⁺,Hg²⁺,Mn²⁺,Cr³⁺和Ba²⁺对DLase 2酶活具有较高的促进作用。

5、钙离子浓度对酶活性的影响

将3mg/mL的硫酸皮肤素、150mM pH7.0的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液(用于DLase 1酶液反应)或150mM的Tris-HCl(pH 9.0)(用于DLase 2酶液反应)、DLase 1或DLase 2酶液以及去离子水按照10:10:3:4(体积比)的比例混合，然后向反应体系中添加终浓度为0,10,20,40,80,160,320mM不同浓度的钙离子，在40℃下反应10min，反应结束后，按紫外分光光度法检测残余酶活力，检测结果如图7A所示，20～40mM的钙离子浓度对DLase 1酶活具有较强的促进作用。如图7B所示，20-40mM的钙离子浓度对DLase 2酶活具有较强的促进作用，为减少钙离子浓度的使用，选择20mM的钙离子浓度为反应最佳浓度用于后续实验。

实施例4、重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2酶活的测定

1、重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2的酶活力测定

将3mg/mL的硫酸皮肤素，150mM pH7.0的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液(用于DLase 1酶液反应)或150mM的Tris-HCl(pH 9.0)(用于DLase 2酶液反应)、DLase 1或DLase 2酶液，去离子水以及200mM钙离子按照10:10:3:4:3(体积比)的比例混合，在40℃最适条件下反应0-10min，反应结束后，按前述的紫外分光光度法测定酶活力。同时用购于康为世纪公司的蛋白质定量试剂盒测定DLase 1与DLase 2酶液的蛋白含量，结果表明：重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1对硫酸皮肤素的比活为911U/mg，重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 2对硫酸皮肤素的比活为1630U/mg。

酶活单位定义：每分钟内产生1微摩尔的不饱和双键所需要的酶量。

2、不同种类与浓度糖胺聚糖对酶活性的影响

将3mg/mL的硫酸皮肤素、150mM pH7.0的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液(用于DLase 1酶液反应)或150mM的Tris-HCl(pH 9.0)(用于DLase 2酶液反应)、DLase 1或DLase 2酶液，去离子水以及200mM钙离子按照10:10:3:4:3(体积比)的比例混合，然后向反应体系中分别添加终浓度为0,0.5,1,2mg/mL的不同种类的糖胺聚糖，40℃下反应1min，反应结束后，按前述的紫外分光光度法测定酶活力。检测结果如图8所示，除硫酸皮肤素外其他种类的糖胺聚糖(HA、CS、Hep、HS)对DLase 1(图8A)与DLase 2(图8B)的酶活均有抑制作用，并且随着糖胺聚糖浓度的增加抑制作用逐渐增强。其中，肝素对于酶活的抑制作用最强烈。

实施例5、重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1与DLase 2降解产物的高效液相(HPLC)分析

将3mg/mL的硫酸皮肤素、150mM pH7.0的NaAc-HAc(pH 6.0)缓冲液(用于DLase 1酶液反应)或150mM的Tris-HCl(pH 9.0)(用于DLase 2酶液反应)、DLase 1或DLase 2酶液，去离子水以及200mM钙离子按照10:10:3:4:3(体积比)的比例混合，在40℃下反应不同时间(0、0.5、1、3、10、30、120、360min)，取降解产物进行HPLC分析，HPLC分析条件为凝胶柱：superdex peptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

检测结果如图9所示，重组硫酸皮肤素裂解酶DLase 1(图9A)与DLase 2(图9B)在降解多糖的过程中，均首先生成较大分子量的寡糖，然后再降解为小分子量的寡糖，最终转变成二糖。该结果表明DLase 1与DLase 2都属于内切型硫酸皮肤素裂解酶。

本发明中的硫酸皮肤素裂解酶DLase 1/DLase 2可以通过β-消除反应特异性切割GalNAc与IdoUA残基之间的β-1,4-糖苷键，因此可以选择性降解CS/DS样品中的DS结构，用于CS/DS相关样品中DS组成结构的特异性分析、DS组分的选择性降解去除、DS寡糖的制备以及相关产品的质量控制分析等。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 硫酸皮肤素裂解酶及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1539

<212> DNA

<213> Pseudopedobacter saltans

<400> 1

atgaataaaa ggacacttgt tttaggtttt gttttactat gctttgccct gccaacatgg 60

gcaaagcata ttcttgttgc ttctgtaaaa gaagtttata gtaaggttga tcagcttaaa 120

gccggcgata cattgctgct aaaagacggt atctataaag atatccaatt ggttgttaaa 180

cgctctggaa gtaaagaaaa accaattgtt attgctgcgc aaaacggagg aaaggttttc 240

tttaccggtg atgccaaggt agaattgaga ggtgaatatc ttgtccttaa ggatatctat 300

tttaaagacg gaaatcgcaa tgtcaatcaa tggaaatcgc atgggccggg tttggtggct 360

atttacggta gttataaccg cgtaaccgga tgtgttttta atgcttttga cgaagccaac 420

tctgcttata ttaccacttc tttaacagag gaaggaaaag taccaaaaca ttgccgtata 480

gaccattgtg tctttaccga taaaatcact ttcgatcagg taattaactt aaataacaga 540

cccagagccg ataaggaaag caaggttttg ggcgaggcta tgtatcatcg tatagaccat 600

tgctttttct ctaatccgcc aaagccagga aatgcaggtg gcggtattcg tgttggttat 660

taccgaaatg atatcggccg gtgcctgata gattctaacc tttttgtcag acaagattcg 720

gaagctgaaa tcgtgaccag caaatcgcag gagaatgttt attatggtaa taccatttta 780

aattgtcagg gaacattaaa cttcagacat ggcgataagc aagtagctct aaataacttt 840

tttatcagta cagataataa atatggctac ggcggaatgt ttgtttgggg aagtcagcat 900

atcatagcca ataactattt caatctgaaa aagactatca aggccagagg gaatgccgct 960

ttgtatctta atccaggacc ggaaggttct gaacatgctt tggctttcaa ctcgttaatc 1020

gtcaataatt tttttgatga taataatggt tacgatatca attttgaacc gttattagaa 1080

agaagaaagg agtttgctaa agaggtgaat gccgagttta aactacctta taacatcacg 1140

attgaaggaa atctttttgc aagcaagcag ggcgataaac atattccatt cttaggaaat 1200

ctggataaga ataaccttca gaacaattat agtttcggac aaatggctaa tgataaattg 1260

tttaccaatg taaagccaac gaccgacggt tcttataacc cgcaaagtta taaaggatat 1320

cagttagcta acgttaagga tattaagaat attgaaggga ttgatctgga tatccaaaat 1380

ctaatcaata aaggaataga aggaaaccca ctaacatgga atgatgtacg tccgtcatgg 1440

ttagtggaaa taccaggatc ttacgccaaa gaaggtacac tggatcagga aactaaaata 1500

cgttttcaaa gggttttggc aagagacaga aataactaa 1539

<210> 2

<211> 1461

<212> DNA

<213> uncultured Bacteroides

<400> 2

atgaaacgca tattatcaat tcttccatca ctggcctttg ccacctgtgt catggctgaa 60

aacattacag taggcacaac gcaagacctc gtaaatgctg cggcaacagt aaaacccggc 120

gatactattc tattgaccga cggaacatac agagacctac gtcttacggt aactgcagac 180

ggaacaggcg acaagatgat aaccataaaa gcccagaacc cgggcaaagc atatatctcc 240

ggcaattcag caatcgaact ccgcggagat tacatccacc tgtcgggatt gtatttcaag 300

gacggcagca gaaatcctag cgaatggaaa actcacggcc ctggtatagt aagcatttat 360

gccgaccatt gcgaagtgtc agactgcctg ttctacgatt tcgataacgc taactcatca 420

tatatatcta ccaatctaga cgaaacaggc catgtacctc aatattgcca tatacaccac 480

tgtgcatttg taggcaaaac aacccaggat caggttataa atcttaataa caccaaaaag 540

aaaaccctgg aaggagaacc tggaaaaccg atgtatcacc gcatcagcta ttgctatttc 600

tccaatcccc caaagaaagg caatgccgga ggcggtatca gagtaggcta ctggcgcaaa 660

gactacggaa gatgtctgat agaccacaac ctgtttgaaa gacaagactc tgaagccgag 720

attgtgacaa gcaaatctat ggagaatgta tatttcgcca acacattcat caactgtcgc 780

ggaacactta atttccgtca tggcgacaag caggttgccc tgaacaacat attcatagga 840

tcagacgaaa tgtacggtta tggcggcatg tacatctggg gtagtaacca cattataggc 900

aataacttct tttatcttcc taaaacgatg aaagacagag gatacgcagg tatatatttc 960

aactgcggac cgaaagcaag cgaacacgct ctggcatacg atatggtggt agtgagcaat 1020

acttttatag ctgtacaagg aacagcattc aaccttgcgc ctatgtatga cagacgtctg 1080

aaagcctttg gagatgcagc agaattgcct cacgacataa catttgtcaa caattatata 1140

tcttcccaca acaagacaaa gtctatctgg tacgaggaaa aaggcaactc agccaatcag 1200

aaatgggaag gcaatgtgtg ttcaggcata aatgttacgg gcataaaagg ctgggagaac 1260

ggtacagcac ccaaaggcat caccacagaa gagttaacaa aaattcttcc atacacatct 1320

atcgaaggaa tagacatgga tttcgtaaag gtactctcca ctcctcttca ggacaaacct 1380

ctgaacaaaa agattaccgg tccttcatgg tgtgacgaat acccgggcaa ttatgccgaa 1440

acgggcatct tcgcacagta a 1461

<210> 3

<211> 512

<212> PRT

<213> Pseudopedobacter saltans

<400> 3

Met Asn Lys Arg Thr Leu Val Leu Gly Phe Val Leu Leu Cys Phe Ala

1 5 10 15

Leu Pro Thr Trp Ala Lys His Ile Leu Val Ala Ser Val Lys Glu Val

20 25 30

Tyr Ser Lys Val Asp Gln Leu Lys Ala Gly Asp Thr Leu Leu Leu Lys

35 40 45

Asp Gly Ile Tyr Lys Asp Ile Gln Leu Val Val Lys Arg Ser Gly Ser

50 55 60

Lys Glu Lys Pro Ile Val Ile Ala Ala Gln Asn Gly Gly Lys Val Phe

65 70 75 80

Phe Thr Gly Asp Ala Lys Val Glu Leu Arg Gly Glu Tyr Leu Val Leu

85 90 95

Lys Asp Ile Tyr Phe Lys Asp Gly Asn Arg Asn Val Asn Gln Trp Lys

100 105 110

Ser His Gly Pro Gly Leu Val Ala Ile Tyr Gly Ser Tyr Asn Arg Val

115 120 125

Thr Gly Cys Val Phe Asn Ala Phe Asp Glu Ala Asn Ser Ala Tyr Ile

130 135 140

Thr Thr Ser Leu Thr Glu Glu Gly Lys Val Pro Lys His Cys Arg Ile

145 150 155 160

Asp His Cys Val Phe Thr Asp Lys Ile Thr Phe Asp Gln Val Ile Asn

165 170 175

Leu Asn Asn Arg Pro Arg Ala Asp Lys Glu Ser Lys Val Leu Gly Glu

180 185 190

Ala Met Tyr His Arg Ile Asp His Cys Phe Phe Ser Asn Pro Pro Lys

195 200 205

Pro Gly Asn Ala Gly Gly Gly Ile Arg Val Gly Tyr Tyr Arg Asn Asp

210 215 220

Ile Gly Arg Cys Leu Ile Asp Ser Asn Leu Phe Val Arg Gln Asp Ser

225 230 235 240

Glu Ala Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gln Glu Asn Val Tyr Tyr Gly

245 250 255

Asn Thr Ile Leu Asn Cys Gln Gly Thr Leu Asn Phe Arg His Gly Asp

260 265 270

Lys Gln Val Ala Leu Asn Asn Phe Phe Ile Ser Thr Asp Asn Lys Tyr

275 280 285

Gly Tyr Gly Gly Met Phe Val Trp Gly Ser Gln His Ile Ile Ala Asn

290 295 300

Asn Tyr Phe Asn Leu Lys Lys Thr Ile Lys Ala Arg Gly Asn Ala Ala

305 310 315 320

Leu Tyr Leu Asn Pro Gly Pro Glu Gly Ser Glu His Ala Leu Ala Phe

325 330 335

Asn Ser Leu Ile Val Asn Asn Phe Phe Asp Asp Asn Asn Gly Tyr Asp

340 345 350

Ile Asn Phe Glu Pro Leu Leu Glu Arg Arg Lys Glu Phe Ala Lys Glu

355 360 365

Val Asn Ala Glu Phe Lys Leu Pro Tyr Asn Ile Thr Ile Glu Gly Asn

370 375 380

Leu Phe Ala Ser Lys Gln Gly Asp Lys His Ile Pro Phe Leu Gly Asn

385 390 395 400

Leu Asp Lys Asn Asn Leu Gln Asn Asn Tyr Ser Phe Gly Gln Met Ala

405 410 415

Asn Asp Lys Leu Phe Thr Asn Val Lys Pro Thr Thr Asp Gly Ser Tyr

420 425 430

Asn Pro Gln Ser Tyr Lys Gly Tyr Gln Leu Ala Asn Val Lys Asp Ile

435 440 445

Lys Asn Ile Glu Gly Ile Asp Leu Asp Ile Gln Asn Leu Ile Asn Lys

450 455 460

Gly Ile Glu Gly Asn Pro Leu Thr Trp Asn Asp Val Arg Pro Ser Trp

465 470 475 480

Leu Val Glu Ile Pro Gly Ser Tyr Ala Lys Glu Gly Thr Leu Asp Gln

485 490 495

Glu Thr Lys Ile Arg Phe Gln Arg Val Leu Ala Arg Asp Arg Asn Asn

500 505 510

<210> 4

<211> 486

<212> PRT

<213> uncultured Bacteroides

<400> 4

Met Lys Arg Ile Leu Ser Ile Leu Pro Ser Leu Ala Phe Ala Thr Cys

1 5 10 15

Val Met Ala Glu Asn Ile Thr Val Gly Thr Thr Gln Asp Leu Val Asn

20 25 30

Ala Ala Ala Thr Val Lys Pro Gly Asp Thr Ile Leu Leu Thr Asp Gly

35 40 45

Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Leu Thr Val Thr Ala Asp Gly Thr Gly Asp

50 55 60

Lys Met Ile Thr Ile Lys Ala Gln Asn Pro Gly Lys Ala Tyr Ile Ser

65 70 75 80

Gly Asn Ser Ala Ile Glu Leu Arg Gly Asp Tyr Ile His Leu Ser Gly

85 90 95

Leu Tyr Phe Lys Asp Gly Ser Arg Asn Pro Ser Glu Trp Lys Thr His

100 105 110

Gly Pro Gly Ile Val Ser Ile Tyr Ala Asp His Cys Glu Val Ser Asp

115 120 125

Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Asp Asn Ala Asn Ser Ser Tyr Ile Ser Thr

130 135 140

Asn Leu Asp Glu Thr Gly His Val Pro Gln Tyr Cys His Ile His His

145 150 155 160

Cys Ala Phe Val Gly Lys Thr Thr Gln Asp Gln Val Ile Asn Leu Asn

165 170 175

Asn Thr Lys Lys Lys Thr Leu Glu Gly Glu Pro Gly Lys Pro Met Tyr

180 185 190

His Arg Ile Ser Tyr Cys Tyr Phe Ser Asn Pro Pro Lys Lys Gly Asn

195 200 205

Ala Gly Gly Gly Ile Arg Val Gly Tyr Trp Arg Lys Asp Tyr Gly Arg

210 215 220

Cys Leu Ile Asp His Asn Leu Phe Glu Arg Gln Asp Ser Glu Ala Glu

225 230 235 240

Ile Val Thr Ser Lys Ser Met Glu Asn Val Tyr Phe Ala Asn Thr Phe

245 250 255

Ile Asn Cys Arg Gly Thr Leu Asn Phe Arg His Gly Asp Lys Gln Val

260 265 270

Ala Leu Asn Asn Ile Phe Ile Gly Ser Asp Glu Met Tyr Gly Tyr Gly

275 280 285

Gly Met Tyr Ile Trp Gly Ser Asn His Ile Ile Gly Asn Asn Phe Phe

290 295 300

Tyr Leu Pro Lys Thr Met Lys Asp Arg Gly Tyr Ala Gly Ile Tyr Phe

305 310 315 320

Asn Cys Gly Pro Lys Ala Ser Glu His Ala Leu Ala Tyr Asp Met Val

325 330 335

Val Val Ser Asn Thr Phe Ile Ala Val Gln Gly Thr Ala Phe Asn Leu

340 345 350

Ala Pro Met Tyr Asp Arg Arg Leu Lys Ala Phe Gly Asp Ala Ala Glu

355 360 365

Leu Pro His Asp Ile Thr Phe Val Asn Asn Tyr Ile Ser Ser His Asn

370 375 380

Lys Thr Lys Ser Ile Trp Tyr Glu Glu Lys Gly Asn Ser Ala Asn Gln

385 390 395 400

Lys Trp Glu Gly Asn Val Cys Ser Gly Ile Asn Val Thr Gly Ile Lys

405 410 415

Gly Trp Glu Asn Gly Thr Ala Pro Lys Gly Ile Thr Thr Glu Glu Leu

420 425 430

Thr Lys Ile Leu Pro Tyr Thr Ser Ile Glu Gly Ile Asp Met Asp Phe

435 440 445

Val Lys Val Leu Ser Thr Pro Leu Gln Asp Lys Pro Leu Asn Lys Lys

450 455 460

Ile Thr Gly Pro Ser Trp Cys Asp Glu Tyr Pro Gly Asn Tyr Ala Glu

465 470 475 480

Thr Gly Ile Phe Ala Gln

485

Claims (5)

1.一种利用硫酸皮肤素裂解酶DLase制备生物活性多糖的方法，其特征在于，将3mg/mL的硫酸皮肤素、150mM pH6.0的NaAc-HAc缓冲液或150mM pH 9.0的Tris-HCl缓冲液、DLase酶液，去离子水以及200mM钙离子按照10:10:3:4:3的体积比混合，在40℃下反应0.5～360min，即得含生物活性多糖的裂解液；所述硫酸皮肤素裂解酶DLase的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述pH6.0的NaAc-HAc缓冲液用于SEQ ID NO.1所示硫酸皮肤素裂解酶的裂解反应，所述pH 9.0的Tris-HCl缓冲液用于SEQ ID NO.2所示硫酸皮肤素裂解酶的裂解反应。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase为内切型酶，通过β-消除反应特异性切割GalNAc与IdoUA残基之间的β-1,4-糖苷键。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物活性多糖包括不饱和八糖、不饱和六糖、不饱和四糖、二硫酸化不饱和二糖和单硫酸化不饱和二糖。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase在透明质酸、硫酸软骨素、肝素和/或硫酸乙酰肝素存在时抑制其酶活。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸皮肤素裂解酶DLase降解硫酸皮肤素的酶活力为800～1800U/mg。

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