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CN111868524A - 用于药物adme研究的高密度3d肝细胞球体平台 - Google Patents

用于药物adme研究的高密度3d肝细胞球体平台 Download PDF

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CN111868524A
CN111868524A CN201980019191.7A CN201980019191A CN111868524A CN 111868524 A CN111868524 A CN 111868524A CN 201980019191 A CN201980019191 A CN 201980019191A CN 111868524 A CN111868524 A CN 111868524A
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low clearance
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V·N·戈拉尔
李锋
G·R·马汀
A·J·坦纳
左荣军
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Corning Inc
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Abstract

本公开涉及用于评价候选化合物对体外培养中的3D肝细胞球体的相互作用的方法，包括评价候选化合物的代谢，以用于各种生物化学和分子生物学研究。所述方法在实验室器具中进行，其将3D球体培养与微图案化设计结合，使得允许在相同条件下处理多个至几百个球体，并且产生足够的材料(例如，母体药物，药物代谢产物，细胞的DNA、RNA和蛋白质)和更高的检测信号强度以用于ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)研究。所述方法除了其他用途外，尤其便于研究和生成准确的体外内在清除率数据，因此更准确地预测体内清除率，特别是对于低清除率化合物而言。

Description

用于药物ADME研究的高密度3D肝细胞球体平台
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§120要求2018年3月13日提交的系列号为62/642447的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并将其通过引用全文纳入本文。
技术领域
本公开一般涉及用于评价候选化合物与体外培养中的3D肝细胞球体的相互作用的方法，包括评价候选化合物的代谢，以用于各种生物化学和分子生物学研究。所述方法在实验室器具中进行，其将3D球体培养与微图案化设计结合，长久地维持肝脏细胞(例如肝细胞)的活力和功能，但是还允许在相同条件下处理多个至几百个球体，并且便于产生足够的材料(例如，母体药物，药物代谢产物以及细胞的DNA、RNA和蛋白质)和具有更高的检测信号强度用于ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)以及更准确检测的其他相关研究。所述方法除了其他用途外，尤其便于研究和生成化合物的准确的体外内在清除率数据，并因此更准确地预测体内清除率，特别是对于低清除率的化合物而言。
背景技术
化合物的ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)性质是预测化合物的临床成功的关键要素。在药物发现过程中，早期的ADME/Tox筛选用来选择避开具有问题状况的药物，降低代谢风险，并最终实现所需的给药方案。药物发现计划中低清除率化合物的增加给用于清除率研究的常规体外系统提出了挑战。利用体外数据预测化合物的体内肝脏清除率的能力在药物发现和开发中至关重要，因为人们知道化合物的内在清除率参数是决定药物半衰期、口服生物利用度、剂量和给药方案的最重要参数。此外，候选药物的意外的体内清除率可能导致暴露问题和安全性问题。然而，由于现有的体外肝脏模型的检测极限，这些模型无法可靠地预测低清除率候选药物的体内清除率或半衰期。
因此，不断需要替代性的体外模型和方法来实现化合物的ADME/Tox性质的研究，更具体地，不断需要能够可靠且准确地预测低清除率化合物的体内清除率或半衰期的体外模型和方法。
发明内容
根据本公开的各个实施方式，用于评价候选化合物与体外培养中的3D肝细胞球体的相互作用的方法和实验室器具，以用于各种生物化学和分子生物学研究，尤其是ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)研究。在各方面中，所述方法和实验室器具可用于评价在体外3D肝细胞球体培养中的候选化合物的代谢。所述方法除了其他用途外，尤其便于研究和生成化合物的准确的体外内在清除率数据，并因此更准确地预测体内清除率，特别是对于低清除率的候选化合物而言。
在各个实施方式中，公开了用于评价一种或多种低清除率候选化合物与肝细胞的相互作用的测定方法。所述测定方法包括：在细胞培养制品中培养肝细胞以形成球体，其中，所述细胞培养制品包括室。所述室例如是多孔板的孔或烧瓶。在实施方式中，每个孔的底部可以是微腔体阵列。每个微腔体经结构化以限制肝细胞以3D球体构象生长。所述测定方法还包括：使3D球体肝细胞与一种或多种低清除率候选化合物接触。所述测定方法还包括：测量所述一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率。在实施方式中，所述培养是长期培养。在一些实施方式中，所述长期培养是至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约96小时、至少约7天、至少约14天、至少约21天、或至少约28天。
在一些实施方式中，细胞培养制品的所述室的每个微腔体包括顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面。在实施方式中，至少一部分的底表面包括在所述底表面之中或之上的低粘性或无粘性材料。在一些实施方式中，包括底表面的液体不可渗透的底部是透气性的。在一些实施方式中，至少一部分的底部是透明的。
在一些实施方式中，所述底表面包括凹形底表面。在一些实施方式中，所述室的每个微腔体的至少一个凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。
在一些实施方式中，所述室还包括侧壁。在一些实施方式中，所述室的侧壁包括垂直圆柱体，从室的顶部到底表面直径减小的垂直圆锥体的一部分，锥形过渡到所述至少一个凹形底表面的垂直方筒(shaft)，或其组合。
在一些实施方式中，每个微腔体包括侧壁。在一些实施方式中，每个微腔体的侧壁包括垂直圆柱体，从室的顶部到底表面直径减小的垂直圆锥体的一部分，锥形过渡到所述至少一个凹形底表面的垂直方筒，或其组合。
在一些实施方式中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述室，其中每个室与任何其他室物理分离。在实施方式中，所述室是多孔板的孔。例如，细胞培养制品可以具有1、6、12、24、96、384或1536个室。在一些实施方式中，每个室包括约25至约1,000个所述微腔体。
在一些实施方式中，一种或多种低清除率的候选化合物的体外内在清除率通过所述一种或多种候选化合物的消失来测量。在一些实施方式中，一种或多种候选化合物的体外内在清除率通过从所述一种或多种候选化合物形成代谢产物来测量。
在一些实施方式中，使用所测得的一种或多种候选化合物的体外内在清除率来预测所述一种或多种候选化合物的体内半衰期。在一些实施方式中，使用所测得的一种或多种候选化合物的体外内在清除率来预测所述一种或多种候选化合物的体内清除率。
在一些实施方式中，所述测定方法还包括分析所述一种或多种低清除率候选化合物的代谢产物的步骤，其中，代谢产物在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间产生。在一些实施方式中，分析所述一种或多种候选化合物的代谢产物包括：鉴定在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的所述一种或多种候选化合物的代谢产物。在一些实施方式中，分析所述一种或多种候选化合物的代谢产物包括：对在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的所述一种或多种候选化合物的代谢产物进行定量。
在一些实施方式中，所述测定方法还包括分析所述一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应的步骤。在一些实施方式中，分析一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应包括：在3D球体肝细胞与所述一种或多种低清除率候选化合物的孵育期间，测量基因和/或蛋白质表达改变。在一些实施方式中，分析一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应包括：测量3D球体肝细胞在3D球体肝细胞与所述一种或多种低清除率候选化合物的孵育期间所产生的DNA、RNA和/或蛋白质(例如，其从细胞、细胞提取物和/或培养基中分离出)。
在一些实施方式中，肝细胞包括人原代肝细胞。在一些实施方式中，肝细胞包括肝细胞系。
在一些实施方式中，所述测定方法还包括：同时评价多个候选化合物。
在一些实施方式中，3D肝细胞球体在至少三周内功能稳定。在一些实施方式中，3D肝细胞球体的功能稳定性通过测量代谢活性、细胞功能、基因表达或其组合来确定。在一些实施方式中，3D肝细胞球体的功能稳定性通过CYP3A4活性来测量。
在以下的具体实施方式中提出了本公开主题的其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的本公开主题而被认识。
应理解，前面的一般性描述和以下的具体实施方式给出了本公开主题的实施方式，并且旨在用来提供理解要求保护的本公开主题的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本公开的主题的进一步理解，附图并入本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的主题的各个实施方式，并与说明书一起对本公开的主题的原理和操作进行阐述。此外，附图和说明书仅仅是示例性的，并不试图以任意方式限制权利要求的范围。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可对下文本公开的具体的实施方式的详细描述有最好的理解，附图中相同的结构用相同的附图标记表示，其中：
图1A、图1B和图1C显示了多孔微孔板的实施方式，在这种情况下是96孔球体微孔板，在每个孔的底表面上具有微腔体阵列，以在96孔中的每一孔中提供多个球体。图1A显示了多孔微孔板。图1B显示了多孔板的单个孔。图1C是图1B中的框C中所示的单孔的底表面的区域的分解图。
图2A是示例性微腔体阵列的图示。图2B是另外的示例性微腔体阵列的图示。
图3A是当在0小时时首先将
Figure BDA0002680708780000041
HepatoCells球体手动汇集在一起时，所述球体的照片。图3B是示出了当将
Figure BDA0002680708780000042
HepatoCells球体手动汇集在一起并孵育22小时时，所述球体的融合的照片。
图4是本文公开的方法的一个实施方式。
图5是示出了与以2D培养的肝细胞的CYP3A4活性相比，在96孔球体板中培养的两批3D肝细胞球体的CYP3A4活性的图表。
图6A-I是示出了使用本文公开的方法的一个实施方式的经典低清除率化合物的体外测量的图表。
图7A是示出了微腔体插入件的图示。图7B是在第1天时，在24孔微腔体插入件中培养的人原代肝细胞的照片。图7C是在第3天时，在24孔微腔体插入件中培养的人原代肝细胞的照片，其证明了3D球体的形成。
图8A-I是示出了使用悬浮细胞进行经典低清除率化合物的体外测量的图表。
具体实施方式
下面将对本公开的主题的各个实施方式进行更详细的描述，其中的一些实施方式例示于附图中。图中使用的相同附图标记表示相同的部分、步骤等。但应理解，在给定的附图中使用附图标记来表示某部件并不会对另一附图中用相同附图标记标出的部件构成限制。另外，使用不同附图标记来表示部件不旨在表示不同编号的部件不能与其他编号的部件相同或相似。
以下具体的实施方式的说明本质上仅仅是示例性的，并且决不旨在限制本发明的范围、其应用或用途，这些当然是可以变化的。本发明关于本文包括的非限制性定义和术语来描述。这些定义和术语并非旨在限制本发明的范围或实施，而是仅出于说明性和描述性目的给出。除非另外定义，本文中所使用的所有术语(包括技术和科学术语)的含意与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。还应理解，术语，诸如在常用词典中定义的术语，应被解释为具有与其在本公开和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过度正式的意义解释，除非本文明确定义。
定义
除非上下文另外清楚地说明，否则，本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。因此，例如，提到的“结构化底表面”包括具有两个或更多个这样的“结构化底表面”的实例，除非文中有另外的明确表示。
如本说明书和所附权利要求书所用，“或”字通常在其包括“和/或”的含义上使用，除非文中有明确的相反表示。术语“和/或”表示所列出的要素中的一个或全部或者所列出的要素中的任何两个或更多个要素的组合。
如在本文中所使用的，“具有”、“具备”、“有”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”、“包括在内”、“涵盖”等以其开放含义使用，并且一般意为“包括但不限于”、“包含但不限于”或“含有但不限于”。
“任选”或“任选地”表示随后描述的事件、情形或部分可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件、情形或部分发生的情况和不发生的情况。
术语“优选”和“优选地”是指能够在特定条件下产生某些益处的本公开的实施方式。然而，在相同条件或其它条件下，其它实施方式也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方式的描述并不意味着其他实施方式是不可用的，也无意于将其他实施方式排除在本发明技术的范围之外。
本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。
同样，在本文中，通过端点来描述的数字范围包括该范围内包含的所有数字(例如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。还应理解，本说明书全文中给出的每个数值范围应包括落入所述较宽数值范围中的每个较窄数值范围，如同本文中明确写明这些较窄数值范围。当数值的范围“大于”、“小于”等特定值时，该值包含在该范围内。
如本文所用的“经结构化以提供”或“被构造用于提供”意为制品具有提供所述结果的特征。
本文指代的任何方向，例如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上方”、“下方”及其他方向和取向在本文中是为了清楚起见而参考附图来描述，并且不是对实际的装置或系统或者装置或系统的使用的限制。本文所述的许多装置、制品或系统可以以多种方向和取向来使用。在本文中关于细胞培养设备所用的方向描述符常指当出于在设备中培养细胞的目的来对设备进行取向时的方向。
还应注意，本文中涉及将部件“被构造成”或“使其适于”的描述以特定的方式起作用。就这方面而言，该部件“被构造成”或“使其适于”是为了具体表现特定的性质，或者以特定的方式起作用，这样的描述是结构性的描述，而不是对预期使用的描述。更具体而言，本文所述的部件“被构造成”或“使其适于”的方式表示该部件现有的物理条件，因此可以将其看作该部件的结构特征的限定性描述。
如本文所用，术语“细胞培养”是指保持细胞在体外存活。本术语中包含了连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化细胞)以及体外维持的任何其他细胞群，包括卵母细胞和胚胎。
如本文所用，术语“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可包括但不限于试管和细胞培养物。术语“体内”是指天然环境(例如，动物或细胞)以及在天然环境中发生的过程或反应。
如本文中所用的“长期培养”意在指细胞(例如但不限于肝细胞)已经培养了至少约12小时，任选地，培养了至少约24小时，至少约48小时，或至少约72小时，至少约96小时，至少约7天，至少约14天，至少约21天或至少约28天。长期培养促进了功能性质的确立，例如培养物中的代谢途径。
如本文中所用的术语“细胞培养制品”意为用于培养细胞的任何容器，其包括板、孔、烧瓶、多孔板、多层烧瓶、TRANSWELL插入件、TRANSWELL微腔体插入件以及提供细胞培养环境的灌注系统。
本文所用的“室”意为细胞培养容器，其可以是烧瓶或碟或多孔板的孔。在一些实施方式中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述室，其中每个室与任何其他室物理分离。在实施方式中，所述室是多孔板的孔。例如，细胞培养制品可以是具有单个室的烧瓶，其在细胞培养表面或底表面上具有微腔体阵列。或者，细胞培养制品可以是具有1、6、12、24、96、384或1536个室或孔的多孔板。在一些实施方式中，每个室包括约25至约1,000个所述微腔体。
在实施方式中，“孔”是以多孔板形式提供的独立的细胞培养环境。在实施方式中，孔可以是4孔板、6孔板、12孔板、24孔板、96孔板、538孔板、1536孔板或任何其他多孔板构造的孔。
在实施方式中，单个室可以是多孔板的孔，其被结构化以约束关注的细胞在该单个室中作为单个3D细胞团或单个球体生长。例如，96孔板的孔(传统96孔板的孔)为约10.67mm深，具有约6.86mm的顶孔和约6.35mm的孔底部直径。
在实施方式中，“球体板”意为具有单个球体室或孔的阵列的多孔板。也就是说，在实施方式中，多孔板可以具有多个室或孔，其中，每个室或孔被构造用于容纳单个球体。
如本文所用的“微孔”或“微腔体”被“结构化以约束关注的细胞以3D构象生长”，该“微孔“或”微腔体”等意为具有尺寸或处理，或尺寸和处理的组合的微孔或微腔体，其促进培养中的细胞以3D或球体构象而不是二维细胞片生长。处理例如包括用低结合溶液处理，使表面疏水性降低的处理，或者灭菌处理。
在实施方式中，“微腔体”或“微孔”例如可以是限定了上孔和最低点，上孔的中心以及上孔的中心和最低点之间的中心轴的微孔。在实施方式中，微腔体或微孔的孔围绕轴旋转对称(即，侧壁是圆柱形的)。在一些实施方式中，上孔限定了跨越上孔的距离在约250μm至1mm之间，或者在这些测量值内的任何范围。在一些实施方式中，从上孔到最低点的距离(深度“d”)在200μm至900μm之间，或者在400至600μm之间。微腔体阵列可具有不同的几何结构，例如，抛物线形，双曲线形，V形和横截面几何结构，或其组合。
在实施方式中，孔可以具有“微腔体”阵列。在实施方式中，“微腔体”例如可以是限定了上孔和最低点，上孔的中心以及上孔的中心和最低点之间的中心轴的微孔。在实施方式中，孔围绕轴旋转对称(即，侧壁是圆柱形的)。在一些实施方式中，上孔限定了跨越上孔的距离在250μm至1mm之间，或者在这些测量值内的任何范围。在一些实施方式中，从上孔到最低点的距离(深度“d”)在200μm至900μm之间，或者在400至600μm之间。微腔体阵列可具有不同的几何结构，例如，抛物线形，双曲线形，V形和横截面几何结构，或其组合。
在实施方式中，“微腔体球体板”意为具有孔阵列，并且每个孔具有微腔体阵列的多孔板。
在实施方式中，孔或微腔体孔的“圆形底部”例如可以是半球，或者一部分的半球，例如，构成孔或微腔体的底部的半球的水平截面或切片。
在实施方式中，术语“3D球体”或“球体”可以是例如培养中的细胞球，其不是平坦的二维细胞片。术语“3D球体”和“球体”在本文中可互换使用。在实施方式中，球体包含单细胞类型或多细胞类型，其直径为例如约100至约500微米，更优选约150至约400微米，甚至更优选约150至约300微米，最优选约200至约250微米，包括中间值和范围，这取决于例如球体中的细胞类型。球体直径可以是，例如，约200至约400微米。球体的最大尺寸一般受扩散考虑因素的限制(关于球体和球体容器的综述，参见Achilli,T-M等人，ExpertOpin.Biol.Ther.(2012)12(10))。
本文所用的“肝细胞”意为源自肝脏的主要实质组织的任何细胞。肝细胞可以是从动物(包括人)获得或分离的原代肝细胞，或者肝细胞可以是肝细胞系或原代肝细胞来源的细胞。
本文所用的“插入件”意为适合球体板或微腔体球体板的孔的细胞培养孔。插入件具有侧壁和底表面，其限定了用于培养细胞的腔体。如本文所用的“TRANSWELL微腔体插入件”意为底表面具有微腔体阵列的插入件。
如本文所用的“插入板”意为含有插入件阵列的插入板，所述插入件被结构化以适于多孔板的孔阵列。如本文所用的“微腔体插入板”意为插入件阵列中的每个插入件具有具备微腔体阵列的底表面的插入板。
如本文所用的“候选化合物”等(例如，“化合物”、“关注的化合物”或“药物化合物”)意在指期望表征化合物的ADME/Tox性质的任何化合物(外源性给予或内源性生成)。示例性的候选化合物包括通常被称为“药物”的异生物素低分子量治疗剂和其他治疗剂，致癌物质和环境污染物以及内生物素，例如类固醇、胆汁酸、脂肪酸和前列腺素。候选化合物可以包括药物，其包括所有作用类别，单独或组合地包括但不限于：抗肿瘤剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗增殖剂、抗血栓剂、抗血小板剂、抗脂质剂、抗炎剂、抗生素、血管生成剂、抗血管生成剂、维生素、ACE抑制剂、血管活性物质、抗有丝分裂剂、金属蛋白酶抑制剂、NO供体、雌二醇、抗硬化剂、激素、自由基清除剂、毒素、烷基化剂。候选化合物还可以包括，例如但决不限于生物剂，其包括但不限于：肽、脂质、蛋白质药物、蛋白质结合药物、酶、寡核苷酸、核糖酶、遗传物质、朊病毒、病毒和细菌。
本文所用的“清除率”意在指每单位时间完全清除化合物(例如但不限于药物)的血液体积。清除率通常以ml/min(毫升/分钟)或ml/min/kg(毫升/分钟/千克)来测量。
<本文所用的“内在清除率”或“Clint(Cl内在)”意在指化合物(例如但不限于药物)没有流量限制并且不与血液中的细胞或蛋白质结合时，肝移除该化合物的能力。因此，内在清除率是肝脏酶代谢药物的内在能力。
本文所用的“低清除率化合物”意在指清除率＜5ml/min/kg的化合物。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任何方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面或与任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面置换。
虽然使用过渡语“包含”可以公开特定实施方式的各个特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代性实施方式。
如前所述，化合物的ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)性质是预测化合物的临床成功的关键要素，并且用于选择避开有问题状况的药物，减少代谢风险并最终能够实现一日一次给药。虽然传统的体外系统已经获得了一定的成功并且增加了药物发现计划中的低清除率化合物的百分比，但是仍存在挑战。使用体外数据来预测体内肝脏代谢和毒性的能力是关键。另外，即使对于显现出缓慢代谢的药物候选化合物，基于所预测的清除率来准确地区分药物候选化合物也是至关重要的。例如，预测化合物的体内肝脏清除率在药物发现和开发中至关重要，因为人们知道化合物的清除率参数是决定药物半衰期、口服生物利用度、剂量和给药方案的重要因数。产生准确的体外内在清除率数据的能力是预测人体内清除率的重要要素，因为药物候选物的意外的体内清除率可导致暴露问题和安全性问题。
然而，现有的体外肝脏模型无法可靠且准确地预测(例如，在实际值的2倍(2-fold)或3倍以内)低清除率化合物(例如但不限于低清除率候选药物)的体内清除率或半衰期。例如，由于肝细胞含有肝脏中存在的全部氧化/还原，水解和共轭药物代谢酶(以及完整的肝清除途径)，以及新鲜和冷冻保存的肝细胞的可获得性增加，因此体外肝细胞悬浮液是预测体内肝清除率的常用方法。然而，肝细胞悬浮液，以及人肝微粒体通常会低估体内清除率，特别是对于低清除率化合物而言。这主要是由于体外肝细胞悬浮液和人肝微粒体的酶活性随着时间快速丧失(肝细胞悬浮液的酶活性通常在4-6小时内，而人肝微粒体的酶活性限于约1-2小时)，因此，不能够准确评价缓慢代谢的低清除率化合物的代谢稳定性。更准确地说，使用人肝微粒体通常具有10ml/min/kg的内在清除率测量值下限，而使用人肝细胞悬浮液通常具有6.3ml/min/kg的内在清除率测量值下限。如前所述，低清除率候选化合物的清除率＜5ml/min/kg。
本公开尤其描述了用于评价候选化合物对3D肝细胞球体的相互作用的方法和实验室器具，以用于各种生物化学和分子生物学研究，尤其是ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)研究。在各方面中，所述方法和实验室器具可用于评价在体外3D肝细胞球体培养中的候选化合物的代谢。所述方法在实验室器具中进行，其将3D球体培养与微图案化设计结合，使得长久地维持了肝脏细胞(例如肝细胞)的活力和功能，但是还允许在相同条件和培养基下处理多个至几百个球体(例如，在长期培养期间)，以用于产生足够的材料(例如，母体药物，药物代谢产物以及细胞的DNA、RNA和蛋白质)和更高的检测信号强度用于ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)研究，与此同时，在各个3D球体之间提供物理屏障以防止在培养或测试期间发生任何球体融合。在本公开的方法的一些实施方式中，所述一种或多种候选化合物是低清除率化合物。如前所述，低清除率化合物是清除率＜5ml/min/kg的化合物。低清除率化合物包括但不限于华法林、美洛昔康、甲苯磺丁脲、地西泮、阿普唑仑、格列美脲、泼尼松龙、利鲁唑和伏立康唑。不同于无法可靠预测低清除率候选药物的体内清除率或半衰期的大多数现有的体外肝脏模型，本公开的方法除了其他用途外，尤其便于研究和生成准确的体外内在清除率数据，并因此更准确地预测体内清除率，尤其是对于这种低清除率化合物而言。例如，将3D球体培养与微图案化设计相结合的本公开方法生成了9种低清除率化合物的体外内在清除率数据，其对44％的体内清除率的预测准确度在实际值的2倍以内，对67％的体内清除率的预测准确度在实际值的3倍以内。相较之下，对于相同的9种低清除率化合物，利用2D单层的方法产生的体外内在清除率数据仅对33％的体内清除率的预测准确度在实际值的2倍以内，并且对44％的体内清除率的预测准确度在实际值的3倍以内。另外，相比于其他共培养系统，例如
Figure BDA0002680708780000111
本公开的方法在3D球体培养中不需要动物基质细胞并且可以显著降低的成本来完成。另外，相比于体外轮换方法，本公开的方法不需要反复地解冻肝细胞和转移上清液，因此，本公开的方法的劳动强度显著更低。
在各个实施方式中，公开了用于评价一种或多种低清除率候选化合物与肝细胞的相互作用的测定方法。在各方面中，公开了用于评价在体外3D肝细胞球体培养中的低清除率候选化合物的代谢的测定方法。测定方法包括在细胞培养制品中培养肝细胞以形成球体，其中细胞培养制品包括室，所述室包括微腔体阵列，每个微腔体阵列被结构化用于约束肝细胞以3D球体构象生长。所述测定方法还包括：使3D球体肝细胞与一种或多种低清除率候选化合物接触。所述测定方法还包括：测量所述一种或多种低清除率候选化合物与体外培养的3D肝细胞球体的相互作用，其中，所述相互作用包括但不限于清除率研究(摄取清除率；基底外侧外排清除率；小管外排清除率；代谢产物清除率)，代谢产物ID和代谢稳定性(母体寿命)，候选化合物的细胞内浓度，蛋白质和基因调控(诱导/抑制)以及培养的3D球体肝细胞的其他分子、生物化学和遗传分析，毒理学作用，化合物动力学，亚细胞蓄积以及游离或总(结合和游离的组合)细胞内浓度，总胆汁清除率，P450和转运药物相互作用以及药代动力学。在实施方式中，所测量的体外相互作用用于预测所述一种或多种低清除率候选化合物的体内处置。
在本公开的方法的一些实施方式中，所培养的细胞，包括但不限于形成3D球体的肝细胞(在各方面中，与一种或多种低清除率候选化合物一起形成)作为长期培养物来培养。在一些实施方式中，使所培养的细胞培养(在各方面中，与所述一种或多种低清除率候选化合物一起)至少约12小时，任选地，培养至少约24小时，至少约48小时，或至少约72小时，至少约96小时，至少约7天，至少约14天，至少约21天，或者至少约28天。长期培养促进了功能性质的确立，例如培养物中的代谢途径。例如，如图5所示，相比于以2D培养的肝细胞，使用本公开的用于形成3D肝细胞球体的实验室器具和方法，在96孔球体培养板中培养的来自两个供体(批号299(顶部)和批号397(底部))的人原代肝细胞维持长时间的较高的CYP3A4活性(通过添加睾酮来活化和测量)。在本公开方法的一些实施方式中，所培养的3D球体肝细胞的功能稳定持续至少约1周，至少约2周，至少约3周，或者至少约4周。功能稳定性可如本领域已知的那样来测量，包括但不限于测量代谢活性、细胞功能、基因表达或其组合。在一些实施方式中，功能稳定性通过CYP3A4活性来测量。
在一些实施方式中，所述室的每个微腔体包括顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面，其中，至少一部分的底表面在底表面之中或之上包括低粘性或无粘性材料。在一些实施方式中，包括底表面的液体不可渗透的底部是透气性的。在一些实施方式中，至少一部分的底部是透明的。在一些实施方式中，所述底表面包括凹形底表面。在一些实施方式中，所述室的每个微腔体的至少一个凹形底表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。在一些实施方式中，所述室还包括侧壁。在一些实施方式中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述室，其中每个室与任何其他室物理分离。在一些实施方式中，每个室包括约25至约1,000个所述微腔体。例如但绝非限制，6孔板可以在该6孔板的一个孔中包括约700个微腔体，因此在一个孔中允许有700个球体(共计约120万个细胞)。类似地，24孔板中的每个孔可以包括约100-200个微腔体，而96孔板中的每个孔可以包含约50个微腔体。
以三维形式培养的细胞(例如球体)可以比作为单层以二维形式培养的对应物表现出更加类似体内的功能性。在二维细胞培养系统中，细胞可附着到在其上培养它们的基材上。然而，当细胞以三维形式(例如球体)生长时，细胞彼此相互作用而不是附着于基材。就细胞通讯和细胞外基质的发展而言，以三维形式培养的细胞与体内组织更相似。例如，肝细胞的3D球体培养得到了持续的肝细胞药物代谢活性和细胞活力。因此，肝细胞3D球体因而为ADME/Tox研究提供了优异的模型，包括研究和生成准确的体外内在清除率数据，从而更准确地预测体内清除率，特别是对于这些低清除率化合物而言。
现在参考图1A、图1B和图1C，其示出了作为微腔体球体板的细胞培养制品的一个实施方式，在这种情况中是96孔微腔体球体板，在每个孔的底表面上具有微腔体阵列，并且每个微腔体经结构化以约束所培养的细胞以3D球体构象生长，从而在96孔中的每一孔中提供多个球体。图1A例示了具有孔阵列110的多孔板10。图1B示出了图1A的多孔板10的单个孔101。该单个孔101具有顶部孔118，液体不可渗透的底表面106和侧壁113。图1C是图1B中的框C中所示的孔101的底表面106的区域的分解图，其例示了图1B所示的单个孔的底表面中的微腔体阵列112。微腔体阵列112中的每个微腔体115具有侧壁121和液体不可渗透的底表面116。图1A、图1B和图1C所示的微腔体球体板在每个单独的孔101的底部中提供微腔体阵列112，该微腔体球体板可用于在多孔板的每个单独孔的每个微腔体中生长单独的3D球体。通过使用这种类型的容器，使用者可在多孔板的每个孔中生长大量球体，从而提供维持长久活力和功能性的的大量肝脏细胞球体，并且该大量肝脏细胞球体可在相同的培养和实验条件下处理以用于如本文所提供的测定。另外，这种类型的容器在各个3D球体之间提供了物理屏障以在培养或测试期间防止任何球体融合。如图3A和图3B所示，当由
Figure BDA0002680708780000131
HepatoCells制造的球体通过手动汇集在一起(在图3A中在时间0处示出)并且孵育22小时时，球体融合在一起(示于图3B)。球体的融合可导致暴露的细胞表面积对总体积的比值发生变化。因此，本公开的微孔设计提供了物理屏障，其允许在延长的孵育时间期间维持每个球体与测试化合物的完整性，以使得在整个孔上具有均匀的扩散和药物代谢活性。
现在参考图2A，其示出了微腔体阵列112的一种示例性图示。图2A例示了微腔体115，每个微腔体115具有顶孔118，底表面119，深度d，和由侧壁121限定的宽度w。如图2A和图2B所示，微腔体阵列具有液体不可渗透的凹弧形底表面116。在实施方式中，微腔体的底表面可以是圆形或圆锥形，有角度的，平底的，或适于形成3D球体的任何形状。优选圆底。当垂直侧壁过渡到圆底119时，圆底119可以具有过渡区114。其可以是平稳或有角度的过渡区。在实施方式中，“微腔体”可以是例如限定上孔118和最低点116，上孔的中心以及上孔的中心和最低点之间的中心轴105的微孔115。在实施方式中，孔围绕轴旋转对称(即，侧壁是圆柱形的)。在一些实施方式中，上孔限定了跨越上孔的距离(宽度w)，其在250μm至1mm之间，或者是这些测量值内的任何范围。在一些实施方式中，从上孔到最低点的距离(深度“d”)在200μm至900μm之间，或者在400至600μm之间。微腔体阵列可具有不同的几何结构，例如，抛物线形，双曲线形，V形和横截面几何结构，或其组合。在实施方式中，微腔体在其下方可以具有保护层130，以保护它们免于与诸如实验室工作台或桌子之类的表面直接接触。在一些实施方式中，可以在孔119的底部与保护层之间提供空气空间110。在实施方式中，空气空间110可以与外部环境连通，或者可以是封闭的。在一些单独的微腔体115的底部示出了3D肝细胞球体25。现在参考图2B，其示出了微腔体阵列112的另一种示例性图示。图2B例示了微腔体阵列112可以具有正弦或抛物线形状。这形状产生圆化的顶边缘或微腔体边缘，在实施方式中，这减少了空气被滞留在微腔体顶部处的尖锐角落或90度角处。如图2B所示，在各方面中，微腔体115具有顶部开口，其具有顶直径D顶；从微腔体的底部116到微腔体的顶部的高度H；在微腔体的顶部与微腔体的底部116之间的一半高度处的微腔体直径DH；以及侧壁113。在这样的实施方式中，孔的底部是圆化的(例如，半球圆形)，侧壁的直径从孔的底部到顶部增大，并且孔之间的边界是圆化的。由此，孔的顶部不以直角终止。在一些实施方式中，孔具有在底部与顶部之间的中间点处的直径D(也被称为DH)，在孔的顶部处的直径D顶以及从孔的底部到顶部的高度H。在这些实施方式中，D顶大于D。
在实施方式中，具有所述至少一个凹弧形底表面的微腔体或“杯子”的底表面例如可以是半球形表面，具有圆底的锥形表面，以及类似的表面几何结构，或者其组合。微腔体底部最终以对球体“友好的”圆化或弯曲表面(例如凹坑、凹陷等凹形截头圆锥形起伏(relief)表面或其组合)终止、结束或见底。在实施方式中，所述室的每个微腔体的至少一个凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。在一些实施方式中，所述至少一个凹弧形底表面可以是例如半球的一部分，例如半球的水平部分或切片，其直径为例如约250至约5000微米(即，0.010至0.200英寸)，包括中间值和范围，这取决于例如所选择的孔几何结构，每个孔内的凹弧形表面的数量，板中孔的数量及类似的考虑因素。其他凹弧形表面可以具有例如抛物线形，双曲线形，V形等截面几何结构或其组合。
在实施方式中，包括室，并且每个室包括微腔体的细胞培养制品(例如，多孔板、微腔体球体板、微腔体插入件、微腔体插入板等)还可包括低粘性、超低粘性或无粘性涂层。所述涂层例如可以在一部分的微腔体上，例如，在每个微腔体的至少一个底表面上或者在每个微腔体的至少一个凹形底表面上和/或在每个微腔体的一个或多个侧壁上。无粘性材料的实例包括全氟化聚合物、烯烃或类似聚合物或其混合物。其他实例包括琼脂糖，非离子型水凝胶(例如聚丙烯酰胺)，或聚醚(例如聚氧化乙烯)，或多元醇(例如聚乙烯基醇)，或类似材料，或其混合物。
在实施方式中，所述室和/或每个微腔体的侧壁表面(即，环绕件)可以是例如垂直圆柱或筒，从腔室顶部到腔室底部的直径减小的垂直圆锥的一部分，具有锥形过渡的垂直方筒或垂直椭圆筒，即，在所述孔的顶部是正方形或椭圆形，过渡到圆锥形，并且以具有至少一个凹弧形表面(即，圆化或弯曲)的底部结束，或其组合。其他说明性几何结构实例包括带孔圆柱、带孔圆锥圆柱，先圆柱后圆锥，以及其他类似几何结构或其组合。
例如低附着性基材、微腔体的主体和基底部分中的孔曲率以及重力中的一者或多者可诱导肿瘤细胞自组装成球体。例如，单独的细胞可落到微腔体的底部，彼此粘附(并且不粘附于微孔的低结合性涂覆表面)并生长成球体。相对于以2D单层生长的细胞，肝细胞保持分化细胞功能，其指示了更像体内的响应。在实施方式中，球体例如可以是基本球形的，其直径为例如约100至约500微米，更优选约150至约400微米，甚至更优选约150至约300微米，最优选约200至约250微米，包括中间值和范围，这取决于例如球体中的细胞类型。球体直径例如可以是约200至约400微米，并且上部直径受扩散考虑因素的限制。
在实施方式中，包括室和/或在室中的每个微腔体的细胞培养制品还可包括不透明侧壁和/或透气且不透液体的底部，其包括至少一个凹形表面。当采用荧光成像时，不透明侧壁防止了孔或微孔之间的串扰。在一些实施方式中，包括至少一个凹形表面的至少一部分底部是透明的。具有这些特征的细胞培养制品(例如微腔体球体板、微腔体插入件、微腔体插入板等)可以为本公开的方法提供若干优点，包括不需要将培养的细胞球体从一个多孔板(其中形成球体并且可以可视化)转移到另一个板以进行测定，因此节省了时间并避免了任何不必要的球体破坏。另外，透气性底部(例如，由在特定的给定厚度下具有透气性质的聚合物制成的孔底部)可使得3D肝细胞球体接收的氧合增加。示例性的透气性底部可以由一定厚度的全氟化聚合物或例如聚4-甲基戊烷之类的聚合物形成。
透气性聚合物的代表性厚度和范围可以是，例如，约0.001英寸至约0.025英寸，0.0015英寸至约0.03英寸，包括中间值和范围(其中1英寸＝25400微米；0.000039英寸＝1微米)。另外或替代地，具有高透气性的其他材料，例如聚二甲基硅氧烷聚合物，可以在例如厚达约1英寸的厚度下提供足够的气体扩散。
现在参考图4，其是用于评价候选化合物与体外培养中的3D球体肝细胞的相互作用的本公开的方法和实验室器具的一个实施方式的图示，其用于各种生物化学和分子生物学研究，尤其是ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)研究。在各方面中，本公开的方法和实验室器具用于评价在体外3D肝细胞球体培养中的一种或多种低清除率候选化合物的代谢。如图4所示，关注的细胞201，例如肝脏细胞(包括但不限于肝细胞和/或非实质细胞，其可以从肝脏分离出)在位于细胞培养制品(例如，微腔体球体板、微腔体插入件、微腔体插入板等)的腔室的微腔体中的培养基中进行203的生长(即，培养，可以是长期培养)，所述微腔体经结构化以约束肝脏细胞以3D构象生长。在该情况中并且如图所示，细胞培养制品是24孔微腔体球体板，并且关注的细胞，例如肝脏细胞(包括但不限于肝细胞和/或非实质细胞)在具有微腔体阵列112的多孔板10的孔101中进行203的生长，每个微腔体115经结构化以约束关注的细胞以3D球体构象25生长，这将使得发展成球体阵列，在多孔板的孔的底表面上的微腔体阵列中的每个微腔体中有一个球体。随着细胞在培养中生长和繁殖，它们被约束生长成球体。发展成了球体25。在各方面中，微腔体插入件或微腔体插入板可用于培养关注的细胞以3D球体构象生长。例如，如图7A所示，插入件具有顶孔418，侧壁421和底表面419，它们形成了微腔体阵列420。微腔体插入件或微腔体插入板的使用可使得球体的形成更快。例如，如图7B(肝细胞培养的第1天)和图7C(肝细胞培养的第3天)所示，使用24孔微腔体插入件可在3天的培养内形成肝细胞球体。应理解，插入件可以许多种构造来获得，包括但不限于6孔微腔体插入件，12孔微腔体插入件，24孔微腔体插入件，48孔微腔体插入件，96孔微腔体插入件，以及单个板包含多个插入件的插入板构造，并且多孔插入板被结构化成插入到多孔板中的互补孔阵列中。
再次参考图4，一旦肝脏细胞(包括但不限于肝细胞和/或非实质细胞)发展成球体25，则可针对一种或多种低清除率候选化合物205进行肝脏代谢研究，包括ADME/Tox(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)研究。例如，可将一种或多种低清除率候选化合物加入到多孔板的每个孔中，以一起孵育3D肝脏细胞球体和候选化合物。接着，在合适的时间后，评价所述一种或多种低清除率候选化合物与细胞的相互作用。可进行评价的所述一种或多种低清除率候选化合物与3D肝脏细胞球体(例如，3D肝细胞球体)的相互作用包括但不限于：清除率研究(摄取清除率，基底外侧外排清除率，小管外排清除率，代谢产物清除率)；代谢产物ID和代谢稳定性(母体寿命)；候选化合物的细胞内浓度；蛋白质和基因调控(诱导/抑制)以及培养的3D球体肝细胞的其他分子、生物化学和遗传分析；毒理学作用；化合物动力学；亚细胞蓄积以及游离或总(结合+游离)细胞内浓度；总胆汁清除率；P450和转运药物相互作用；以及药代动力学。这些相互作用和效应可以通过本领域已知的任何合适方式测量，包括但不限于活体染色技术、ELISA测定、免疫组织化学和各种常规分子、生物化学和遗传测定。如前所述，本公开的方法在实验室器具中进行，其将3D球体培养与微图案化设计结合，使得长久地维持了肝脏细胞(例如肝细胞)的活力和功能，但是还允许在相同条件下处理多个至几百个球体(例如，在长期培养期间)，并且产生足够的材料(例如，母体药物，药物代谢产物以及细胞的DNA、RNA和蛋白质)和更高的检测信号强度用于上文列出的各种研究。孵育时期将根据所述一种或多种低清除率候选化合物而变化。孵育时间的调整可以在初步实验中完成，并且完全在本领域技术人员的一般技能范围内。
在一些实施方式中，用于评价所述一种或多种低清除率候选化合物与肝细胞的相互作用的测定方法包括：在细胞培养制品中培养肝细胞以形成球体，其中细胞培养制品包括室，所述室包括微腔体阵列，每个微腔体阵列被结构化用于约束肝细胞以3D球体构象生长。所述测定方法还包括：使3D肝细胞球体与一种或多种低清除率候选化合物接触。在合适的时间后，所述测定方法还包括：测量所述一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率。该孵育时间将根据候选化合物而变化。孵育时间的调整可以在初步实验中完成，并且完全在本领域技术人员的一般技能范围内。
在一些实施方式中，一种或多种候选化合物的体外内在清除率通过由所述一种或多种候选化合物形成代谢产物来测量。然而，为了由药物代谢产物的形成(例如，存在和或不存在)来计算内在清除率，需要明确的清除途径(例如，负责候选化合物清除的具体酶)和可靠的代谢产物标准，这些并非总是已知或可获得的。因此，在实施方式中，所述一种或多种候选化合物的体外内在清除率通过所述一种或多种候选化合物的消失来测量。测量由所述一种或多种候选化合物形成代谢产物和/或所述一种或多种候选化合物的消失可通过本领域已知的任何手段来测量，包括但不限于质谱法、液相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法或高效液相色谱法。体外清除率可如本领域已知的来计算，例如Chan等人,(2013)DrugMetab Dispos 41:2024–2032中所述，该文献通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中，使用所测得的一种或多种候选化合物的体外内在清除率来预测所述一种或多种候选化合物的体内半衰期。在一些实施方式中，使用所测得的一种或多种候选化合物的体外内在清除率来预测所述一种或多种候选化合物的体内清除率。例如，可使用充分搅拌模型，由所计算的体外内在清除率来计算体内肝清除率，如实施例所示。
在一些实施方式中，所述测定方法包括分析所述一种或多种低清除率候选化合物的代谢产物的步骤，其中，代谢产物在孵育3D球体肝细胞与所述一种或多种低清除率候选化合物期间产生。在一些实施方式中，分析所述一种或多种候选化合物的代谢产物包括：鉴定在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的所述一种或多种候选化合物的代谢产物。在一些实施方式中，分析所述一种或多种候选化合物的代谢产物包括：对在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的所述一种或多种候选化合物的代谢产物进行定量。测量由所述一种或多种低清除率候选化合物形成代谢产物——无论是代谢产物的鉴定和/或定量——可通过本领域已知的任何手段来测量，包括但不限于质谱法、液相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法或高效液相色谱法。
在一些实施方式中，所述测定方法包括分析所述一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应。所述一种或多种低清除率候选化合物在孵育期间对3D球体肝细胞的效应可通过本领域已知的任何手段来测量，包括细胞、细胞提取物或培养基的遗传、代谢或蛋白质分析，例如已知的可视化技术、荧光测量、ELISA测定、免疫组织化学测定和各种其他已知的常规分子、生物化学和遗传测定。在一些实施方式中，分析一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应包括：在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间，测量基因和/或蛋白质表达改变。在一些实施方式中，分析一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应包括：测量3D球体肝细胞在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的DNA、RNA和/或蛋白质(例如，其从细胞、细胞提取物和/或培养基中分离出)。
在本公开的方法的一些实施方式中，候选化合物包括通常被称为“药物”的异生物素低分子量治疗剂和其他治疗剂，致癌物质和环境污染物以及内生物素，例如类固醇、胆汁酸、脂肪酸和前列腺素。候选化合物可以包括药物，其包括所有作用类别，其单独或组合地包括但不限于：抗肿瘤剂、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗增殖剂、抗血栓剂、抗血小板剂、抗脂质剂、抗炎剂、抗生素、血管生成剂、抗血管生成剂、维生素、ACE抑制剂、血管活性物质、抗有丝分裂剂、金属蛋白酶抑制剂、NO供体、雌二醇、抗硬化剂、激素、自由基清除剂、毒素、烷基化剂。候选化合物还可以包括，例如但决不限于生物剂，其包括但不限于：肽、脂质、蛋白质药物、蛋白质结合药物、酶、寡核苷酸、核糖酶、遗传物质、朊病毒、病毒和细菌。
在本公开的方法的一些实施方式中，所述方法包括：同时评价多个候选化合物。在本公开的方法的一些实施方式中，所述方法包括：使一种或多种候选化合物暴露于/接触3D球体肝细胞。
在本公开方法的一些实施方式中，肝细胞可以是源自肝脏的主要实质组织的任何细胞。肝细胞可以是从动物(包括人)获得或分离的原代肝细胞，或者肝细胞可以是肝细胞系或原代肝细胞来源的细胞。在一些实施方式中，细胞群可源自一个或多个种，包括但不限于人细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、猴细胞、猪细胞、狗细胞、豚鼠细胞、鱼细胞。另外，所述细胞可以是新鲜或冻存的。
在本公开方法的一些实施方式中，非实质细胞可以与所培养的肝细胞一起包括进来或与所培养的肝细胞一起共培养。非实质细胞可包括但不限于库普弗(Kupffer)细胞，肝脏细胞(包括但不限于ITO细胞、窦内皮细胞、胆管细胞)，基质细胞(包括但不限于成纤维细胞和周细胞)，免疫细胞(包括但不限于T细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞，肥大细胞)和干细胞(包括但不限于肝祖细胞、胚胎干细胞和造血干细胞)。这些细胞群可源自一个或多个种，包括但不限于人细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、猴细胞、猪细胞、狗细胞、豚鼠细胞、鱼细胞。另外，所述细胞可以是新鲜或冻存的。在本公开的方法的一些实施方式中，在3D球体培养中不需要动物基质细胞。
在一些实施方式中，在肝细胞的培养期间可以使用基质或支架。因此，在培养期间，肝细胞(以及可能的其他共培养的细胞，包括非实质细胞)可嵌有、混有或覆盖有基质或支架。代表性的基质或支架包括任何合适的天然或合成基质或支架，例如但不限于胶原、层粘连蛋白和
Figure BDA0002680708780000191
在一些实施方式中，所述方法包括培养基[例如，包括营养物质(例如蛋白质、肽、氨基酸)，能量(例如碳水化合物)，必需金属和矿物质(例如钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐)，缓冲剂(例如磷酸盐、乙酸盐)，pH变化指示剂(例如酚红、溴-甲酚紫)，选择剂(例如化学品、抗微生物剂)等]，这在本领域中是已知的。
方面
本文描述了方法、系统、组合物和试剂盒的多个方面。下文提供了这些方法、系统、组合物和试剂盒的一些选择的实例概述。
第1个方面中为用于评价一种或多种低清除率候选化合物与肝细胞的相互作用的测定方法，所述方法包括：
在细胞培养制品中培养肝细胞以形成球体，其中细胞培养制品包括室，所述室包括微腔体阵列，每个微腔体被结构化用于约束肝细胞以3D球体构象生长以形成肝细胞球体；其中，所述室的每个微腔体包括：
顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面，其中，至少一部分的底部在底表面之中或之上包括低粘性或无粘性材料；
使3D肝细胞球体与一种或多种低清除率候选化合物接触；以及
测量所述一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率。
第2个方面是如第1个方面所述的方法，其中，所述培养是长期培养。
第3个方面是如第1或第2个方面所述的方法，其中，所述长期培养是至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约96小时、至少约7天、至少约14天、至少约21天、或至少约28天。
第4个方面是如方面1-3中任一方面所述的方法，其中，包括底表面的所述液体不可渗透的底部是透气性的。
第5个方面是如方面1-4中任一方面所述的方法，其中，底表面包括凹形底表面。
第6个方面是如方面1-5中任一方面所述的方法，其中，至少一部分的底部是透明的。
第7个方面是如方面5所述的方法，其中，凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。
第8个方面是如方面1-7中任一方面所述的方法，其中，所述室的每个微腔体还包括侧壁。
第9个方面是如方面8所述的方法，其中，所述侧壁表面包括垂直圆柱体，从室的顶部到底表面直径减小的垂直圆锥体的一部分，锥形过渡到凹形底表面的垂直方筒，或其组合。
第10个方面是如方面1-9中任一方面所述的方法，其中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述室，其中，每个室与任何其他室物理分离。
第11个方面是如方面1-10中任一方面所述的方法，其中，所述一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率通过所述一种或多种低清除率候选化合物的消失来测量。
第12个方面是如方面1-11中任一方面所述的方法，其中，所述一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率通过由所述一种或多种低清除率候选化合物形成代谢产物来测量。
第13个方面是如方面1-12中任一方面所述的方法，其中，利用所述一种或多种低清除率候选化合物的测得的体外内在清除率来预测所述一种或多种低清除率候选化合物的体内半衰期。
第14个方面是如方面1-13中任一方面所述的方法，其中，利用所述一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率来预测所述一种或多种低清除率候选化合物的体内清除率。
第15个方面是如方面1-14中任一方面所述的方法，其还包括分析所述一种或多种低清除率候选化合物的代谢产物的步骤，其中，代谢产物在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间产生。
第16个方面是如方面15所述的方法，其中，分析所述一种或多种候选化合物的代谢产物包括：鉴定在孵育3D球体肝细胞与所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的所述一种或多种候选化合物的代谢产物。
第17个方面是如方面15所述的方法，其中，分析所述一种或多种候选化合物的代谢产物包括：对在孵育3D球体肝细胞与所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的所述一种或多种候选化合物的代谢产物进行定量。
第18个方面是如方面1-17中任一方面所述的方法，其还包括分析所述一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应的步骤。
第19个方面是如方面18所述的方法，其中，分析所述一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应包括：测量3D球体肝细胞在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的DNA、RNA和/或蛋白质。
第20个方面是如方面1-19中任一方面所述的方法，其中，肝细胞包括人原代肝细胞。
第21个方面是如方面1-20中任一方面所述的方法，其中，肝细胞包括肝细胞系。
第22个方面是如方面1-21中任一方面所述的方法，其还包括同时评价多个候选化合物。
第23个方面是如方面1-22中任一方面所述的方法，其中，3D球体肝细胞的功能稳定持续至少3周。
第24个方面是如方面23所述的方法，其中，3D球体肝细胞的功能稳定性通过测量代谢活性、细胞功能、基因表达或其组合来确定。
第25个方面是如方面24所述的方法，其中，功能稳定性通过CYP3A4活性来测量。
实施例
以下实施例旨在例示本公开的具体特征和方面，而不应解释为限制其范围。
实施例1
人原代肝细胞(PHH)高密度(HD)球体培养
预润湿球体插入件：使移液辅助器处于低分散速度。使用5mL移液器并且将尖端抵靠侧壁而定位在底部处，如果使用威廉E培养基+(WEM+)(无FBS)，则将2mL培养基加入到6孔球体插入件中，每个孔插入件具有约700个微孔。使用200ul移液器尖端吹走滞留在微孔中的任何空气泡。在显微镜下检查所述板以确保移除所有空气泡。
将PHH铺到6孔高密度球体插入件(～700个微孔/插入件)上。按标准程序解冻PHH并且重悬于WEM平板培养基中。对PHH细胞进行计数并用WEM平板培养基将细胞密度调整到0.35e6/ml。将移液辅助器设置在低分散速度以用于铺PHH。用5mL移液器从预润湿的插入件移除大多数培养基，然后立即进行铺板。通过轻轻地上下移液，制备均匀的细胞悬浮液。使用5mL移液器并且将尖端抵靠侧壁而定位在底部处，向6孔球体插入件中加入2mL的细胞悬浮液(700K个细胞，～1000个细胞/微孔)。将板在通风橱中放置15-20分钟。用4倍物镜在显微镜下检查板，以确保相似数目的细胞沉积到每个微孔中。
实施例2
3D PHH高密度球体药物清除率测定
用WME+培养基更换一半培养基：使移液辅助器处于低分散速度。使用5mL移液器，从每个插入件中缓慢吸取1mL旧培养基。使1000μL移液器的尖端抵靠插入件侧壁的顶部定位，并且缓慢加入1mL预热的WME+培养基并且使培养基沿侧壁向下流动。在每次更换一半培养基之间等待5-10分钟，再重复3次这种更换一半培养基。在显微镜下检查PHH的球体形成。
2X清除率测定溶液的制备，其中最终的DMSO浓度小于0.2％，如表1所示。
表1：2X清除率测定溶液
Figure BDA0002680708780000231
将待测试清除率的候选化合物和培养的球体一起孵育：将移液辅助器设置在低分散速度。使用5mL移液器，从每个插入件缓慢移除1mL旧培养基。使1000μL移液器的尖端抵靠插入件侧壁的顶部定位，并且缓慢加入1mL的用于测试清除率并且含候选化合物的2X底物溶液，并且使培养基沿侧壁向下流动。5-10分钟后，将培养物放回37℃孵育箱。此时开始对孵育计时。
取样：在测定板中等分40μL/孔的终止液拉贝洛尔(Labetalol)(0.2uM在0.05％FA/50％ACN中)并放置在冰上。在期望的测定孵育时间(0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周，或者其间的任何数值或范围)，从每个孵育孔吸取40uL样品，与终止液充分混合，并且在-80℃下储存。
LC/MS分析：如本领域已知的，使用液相色谱法/质谱法来测量候选化合物的量。
实施例3
数据分析和清除率计算
计算消除率常数(kel)：如本领域已知的，培养物中剩余的候选化合物的百分比通过某孵育时间的质谱峰面积除以零时的质谱峰面积的比值来计算。针对时间绘制剩余的候选化合物百分比的自然对数，并且kel作为斜率的绝对值来计算。
计算候选化合物的消耗半衰期。一旦确定了候选化合物的kel，则通过方程1确定候选化合物的消耗半衰期，这在本领域是已知的。
T1/2＝0.692/kel (1)
计算候选化合物的体外清除率(Clint)：如本领域已知的，使用方程2的比例因子，利用方程1的体外半衰期计算候选化合物的体外清除率：
Figure BDA0002680708780000241
计算预测的体内肝清除率(CLh)：如本领域已知的，使用充分搅拌模型方程3，根据由方程2确定的体外清除率计算体内肝清除率。
Figure BDA0002680708780000242
实施例4
结果
如图6A-6I所示，本公开的方法和实验室器具能够测量经典的低清除率化合物，例如华法林(图6A)、美洛昔康(图6B)、甲苯磺丁脲(图6C)、地西泮(图6D)、格列美脲(图6E)、阿普唑仑(图6F)、泼尼松龙(图6G)、利鲁唑(图6H)和伏立康唑(图6I)。另外，如表2所示，将3D球体培养与微图案化设计相结合的本公开方法生成了9种低清除率化合物的体外内在清除率数据，其对44％的体内肝清除率的预测准确度在实际值的2倍以内，并且对67％的体内肝清除率的预测准确度在实际值的3倍以内。相较之下，对于相同的9种低清除率化合物，利用2D单层的方法产生的体外内在清除率数据仅对33％的体内清除率的预测准确度在实际值的2倍以内，并且对44％的体内清除率的预测准确度在实际值的3倍以内。因此，不同于无法可靠预测低清除率候选药物的体内清除率或半衰期的大多数现有的体外肝脏模型，本公开数据证明了本公开的方法除了其他用途外，尤其便于研究和生成准确的低清除率化合物的体外内在清除率数据，并因此更准确地预测体内清除率，尤其是对于这种低清除率化合物而言。相比之下，以悬浮液形式生长的PHH不能够测量经典的低清除率化合物，例如，例如华法林(图8A)、美洛昔康(图8B)、甲苯磺丁脲(图8C)、地西泮(图8D)、格列美脲(图8E)、阿普唑仑(图8F)、泼尼松龙(图8G)、利鲁唑(图8H)和伏立康唑(图8I)。
表2：在2D肝细胞培养中和3D肝细胞球体培养中的低清除率化合物的预测的CLh对比
Figure BDA0002680708780000251
Figure BDA0002680708780000261
上述说明书中提及的所有出版物和专利都通过引用纳入本文。对本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明技术进行各种修改和变动而不偏离本公开的精神和范围。虽然已结合具体的优选实施方式对本公开作了描述，但应了解，如权利要求所述，本公开不应过分地受限于这些具体实施方式。因为本领域技术人员可以结合本发明技术的精神和实质，对所公开的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此应认为本发明技术包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (25)

1.用于评价一种或多种低清除率候选化合物与肝细胞的相互作用的测定方法，所述方法包括：
在细胞培养制品中培养肝细胞以形成球体，其中，细胞培养制品包括室，所述室包括微腔体阵列，每个微腔体被结构化用于约束肝细胞以3D球体构象生长以形成肝细胞球体；其中，所述室的每个微腔体包括：
顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面，其中，至少一部分的底部在底表面之中或之上包括低粘性或无粘性材料；
使3D肝细胞球体与一种或多种低清除率候选化合物接触；以及
测量所述一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率。
2.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述培养是长期培养。
3.如权利要求2所述的测定方法，其中，所述长期培养是至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约96小时、至少约7天、至少约14天、至少约21天、或至少约28天。
4.如权利要求1所述的测定方法，其中，包括底表面的液体不可渗透的底部是透气性的。
5.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述底表面包括凹形底表面。
6.如权利要求1所述的测定方法，其中，至少一部分的底部是透明的。
7.如权利要求5所述的测定方法，其中，凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。
8.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述室的每个微腔体还包括侧壁。
9.如权利要求8所述的测定方法，其中，所述侧壁表面包括垂直圆柱体，从室的顶部到底表面直径减小的垂直圆锥体的一部分，锥形过渡到凹形底表面的垂直方筒，或其组合。
10.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述室，其中，每个室与任何其他室物理分离。
11.如权利要求1所述的测定方法，其中，一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率通过一种或多种低清除率候选化合物的消失来测量。
12.如权利要求1所述的测定方法，其中，一种或多种低清除率候选化合物的体外内在清除率通过由一种或多种低清除率候选化合物形成代谢产物来测量。
13.如权利要求1所述的测定方法，其中，使用一种或多种低清除率候选化合物的测得的体外内在清除率来预测一种或多种低清除率候选化合物的体内半衰期。
14.如权利要求1所述的测定方法，其中，使用一种或多种低清除率候选化合物的测得的体外内在清除率来预测一种或多种低清除率候选化合物的体内清除率。
15.如权利要求1所述的测定方法，其还包括分析所述一种或多种低清除率候选化合物的代谢产物的步骤，其中，代谢产物在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间产生。
16.如权利要求15所述的测定方法，其中，分析所述一种或多种候选化合物的代谢产物包括：鉴定在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的一种或多种候选化合物的代谢产物。
17.如权利要求15所述的测定方法，其中，分析所述一种或多种候选化合物的代谢产物包括：对在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的一种或多种候选化合物的代谢产物进行定量。
18.如权利要求1所述的测定方法，其还包括分析所述一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应的步骤。
19.如权利要求18所述的测定方法，其中，分析所述一种或多种低清除率候选化合物对3D球体肝细胞的分子、生物化学或遗传效应包括：测量3D球体肝细胞在孵育3D球体肝细胞和所述一种或多种低清除率候选化合物期间所产生的DNA、RNA和/或蛋白质。
20.如权利要求1所述的测定方法，其中，肝细胞包括人原代肝细胞。
21.如权利要求1所述的测定方法，其中，肝细胞包括肝细胞系。
22.如权利要求1所述的测定方法，其还包括：同时评价多个候选化合物。
23.如权利要求1所述的测定方法，其中，3D球体肝细胞的功能稳定持续至少3周。
24.如权利要求23所述的测定方法，其中，3D球体肝细胞的功能稳定性通过测量代谢活性、细胞功能、基因表达或其组合来确定。
25.如权利要求24所述的测定方法，其中，功能稳定性通过CYP3A4活性来测量。
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MATTHEW G. BARON等: "Pharmaceutical Metabolism in Fish: Using a 3-D Hepatic In Vitro Model to Assess Clearance", PLOS ONE, vol. 12, no. 1, XP055587665, DOI: 10.1371/journal.pone.0168837 *
王先良;徐顺清;: "系统毒理学及其应用", 生态毒理学报, no. 04 *

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