CN112029698A - 一种降解有机磷农药的工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种降解有机磷农药的工程菌及其构建方法，属于微生物技术领域，将mpd基因、opd基因、vgb基因和gfp基因插入P.putida KT2440宿主菌中，得到；插入顺序为mpd‑opd‑vgb‑gfp。本发明提供的工程菌株能够在培养条件下正常生长，并能稳定的表达外源基因。

Description

一种降解有机磷农药的工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种降解有机磷农药的工程菌及其构建方法。

背景技术

环境中残留的农药可通过多种方法进行处理，其中生物修复更为安全有效。然而当环境中同时存在多种农药时，需要用多种工程菌株进行降解，这些菌株会造成对资源的竞争，反而有可能会导致降解的不彻底以及中间产物毒素的积累。许多研究中外源基因的质粒型表达和有痕插入导致了宿主菌株对外源基因的低效和不稳定表达。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种降解有机磷农药的工程菌及其构建方法，本发明通过无痕插入构建工程菌，能够使外源基因稳定表达。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种降解有机磷农药的工程菌，将mpd基因、opd基因、vgb基因和gfp基因插入P.putida KT2440宿主菌中，得到；插入顺序为mpd-opd-vgb-gfp。

本发明还提供了上述技术方案所述的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将组成型启动子J23119和RBS，分别和mpd基因、opd基因、vgb基因和gfp基因进行第一融合，得到四种基因的第一融合产物；

所述RBS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)将所述步骤1)得到的mpd和opd基因的第一融合产物分别与λT0 terminator进行第二融合，得到两种基因的第二融合产物；

3)将所述步骤1)得到的vgb和gfp基因第一融合产物与上下游同源臂进行第二融合，步骤2)得到的两种基因的第二融合产物与上下游同源臂进行第三融合，得到四种基因的表达盒，将所述四种基因的表达盒分别连接到带有反向筛选标记upp的自杀质粒pKU，得到四种基因的打靶载体；

4)将所述步骤3)得到的四种基因的打靶载体化学转化到E.coli Mach1-T1感受态细胞中，提取质粒，得到四种基因的插入载体；

5)将所述步骤4)得到的四种基因的插入载体插入到P.putida KT2440宿主菌中，在含Kana的培养基中培养，得到单交换菌株；

6)将所述步骤5)得到的单交换菌株在培养基中培养，得到双交换菌株，所述双交换菌株为工程菌。

优选的，所述步骤1)mpd基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述opd基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述vgb基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述gfp基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

优选的，所述步骤2)mpd基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.10～12所示；

所述opd基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13～15；

优选的，所述步骤3)mpd基因进行第三融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.16～19所示；

所述opd基因进行第三融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20～23；

所述vgb基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24～27所示；

所述gfp基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.28～31所示。

优选的，所述步骤3)mpd基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。

优选的，所述步骤3)opd基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示。

优选的，所述步骤3)vgb基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示。

优选的，所述步骤3)gfp基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示。

优选的，所述步骤3)连接的条件包括：37℃金属浴中反应30min。

本发明提供了一种降解有机磷农药的工程菌，将mpd基因、opd基因、vgb基因和gfp基因插入P.putida KT2440宿主菌中，得到；插入顺序为mpd-opd-vgb-gfp。

本发明的有益效果：

1、本发明利用合成生物学方法设计并优化外源基因表达盒，将4个来源不同的外源基因mpd、opd、vgb、gfp置于组成型强启动子J23119的调控下，并成功构建插入载体。通过基因无痕编辑方法，将外源基因成功插入到P.putida KT2440的基因组上，实现了有机磷农药-甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷和二嗪磷降解菌株KTU-MOVG的构建。该工程菌株能够在培养条件下正常生长，并能稳定的表达外源基因。

2、本发明通过RT-PCR证明了mpd、opd、vgb和gfp在宿主菌株中成功转录。

3、本发明构建的多种有机磷农药降解工程菌株能够在摇瓶中有效降解100mg/L的甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷和二嗪磷，这表明了mpd和opd在P.putida KT2440中的成功表达。

4、Western-Blot实验和菌体颜色观察证明了vgb在P.putida KT2440中的成功表达，VHb蛋白在工程菌株中可以有效发挥作用，提高菌株的摄氧能力。

5、共聚焦显微镜观察结果证明gfp在P.putida KT2440中的成功表达，可以监测工程菌株的活动。

附图说明

图1打靶载体pKU-X的构建过程示意图；

图2为外源基因插入示意图；

图3为外源基因插入菌株PCR验证图，泳道M为MarkerⅢ；1-4分别为mpd、opd、vgb、gfp插入阅读框全长；PCR扩增所用引物为Y-UF/Y-DR(Y为目标外源基因)；

图4为KTU和KTU-MOVG在LB液体培养基中的生长曲线；

图5为外源基因稳定存在的PCR验证图，泳道M为MarkerⅢ；泳道1-4分别为mpd、opd、vg b、gfp插入阅读框全长；

图6为外源基因RT-PCR验证图，A-D分别为mpd，opd，vgb，gfp的转录情况；泳道M为Mar kerⅢ；泳道1-4分别为为以基因组DNA为模板、以反转录出的cDNA为模板、以mRNA为模板、以ddH₂O为模板进行扩增的验证结果；RT-PCR扩增所用引物为Y-F/Y-R(Y为目标外源基因)；

图7A.甲基对硫磷标准品的GC检测出峰时间图；B.甲基对硫磷标准曲线；

图8为工程菌株KTU-MOVG对甲基对硫磷的降解曲线和菌株的生长曲线；

图9A.毒死蜱标准品的GC检测出峰时间图；B.毒死蜱标准曲线；

图10为工程菌株KTU-MOVG对毒死蜱的降解曲线和菌株的生长曲线；

图11A.对硫磷标准品的GC检测出峰时间图；B.对硫磷标准曲线；

图12为工程菌株KTU-MOVG对对硫磷的降解曲线和菌株的生长曲线；

图13A.二嗪磷标准品的GC检测出峰时间图；B.二嗪磷标准曲线；

图14为工程菌株KTU-MOVG对二嗪磷的降解曲线和菌株的生长曲线；

图15为VHb在P.putida KT2440中的表达，A.考马斯亮蓝染色结果图；B.Western-Blot检测VHb，泳道M为蛋白Marker；泳道1为KTU的细胞裂解物；泳道2为KTU-MOVG的细胞裂解物；

图16为工程菌株KTU-MOVG中Vitreoscilla血红蛋白的表达；

图17为共聚焦显微镜下观察工程菌株P.putida KTU-MOVG的绿色荧光，A.细胞内绿色荧光；B.被FM4-64染色的细胞轮廓；C.A与B的融合。

图18为mpd、opd、vgb、gfp四个基因表达盒插入P.putida KT2440位点示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种降解有机磷农药的工程菌，将mpd基因、opd基因、vgb基因和gfp基因插入P.putida KT2440宿主菌中，得到；插入顺序为mpd-opd-vgb-gfp。

本发明还提供了上述技术方案所述的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将组成型启动子J23119和RBS，分别和mpd基因(登录号DQ677027)、opd基因(登录号AJ421424.1)、vgb基因(登录号AF292694)和gfp(登录号U57609)基因进行第一融合，得到四种基因的第一融合产物；

所述RBS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)将所述步骤1)得到的mpd和opd基因的第一融合产物分别与λT0 terminator进行第二融合，得到两种基因的第二融合产物；

3)将所述步骤1)得到的vgb和gfp基因第一融合产物与上下游同源臂进行第二融合，步骤2)得到的两种基因的第二融合产物与上下游同源臂进行第三融合，得到四种基因的表达盒，将所述四种基因的表达盒分别连接到带有反向筛选标记upp的自杀质粒pKU，得到四种基因的打靶载体；

4)将所述步骤3)得到的四种基因的打靶载体化学转化到E.coli Mach1-T1感受态细胞中，提取质粒，得到四种基因的插入载体；

5)将所述步骤4)得到的四种基因的插入载体插入到P.putida KT2440宿主菌中，在含Kana的培养基中培养，得到单交换菌株；

6)将所述步骤5)得到的单交换菌株在培养基中培养，得到双交换菌株，所述双交换菌株为工程菌。

本发明将组成型启动子J23119和RBS，分别和mpd基因、opd基因、vgb基因和gfp基因进行第一融合，得到四种基因的第一融合产物；所述RBS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明中，所述RBS适用于P.putida KT2440的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：5’-GTAAGAGAGG-3’。

在本发明中，所述mpd基因(甲基对硫磷水解酶基因)来源于Stenotrophomonassp.YC-1，能够降解甲基对硫磷、毒死蜱。在本发明中，所述opd基因(有机磷水解酶基因)来源于Flavobacteri um sp.MTCC 2495，能够降解对硫磷。在本发明中，所述工程菌能够同时降解甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷和二嗪磷这四种有机磷农药。

在本发明中，所述vgb基因(血红蛋白编码基因)来源于Vitreoscilla sp.，提高工程菌株摄取氧气的能力。在本发明中，所述gfp基因(绿色荧光蛋白编码基因)插入到工程菌的染色体上，监测工程菌在环境中的活性。

在本发明中，所述mpd基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.2：

5’-CTACGTGTTCGACCTTTGACAGCTAGCTCAGTCCT-3’；

SEQ ID No.3：

5’-CTATCAACAGGAGTCTCACTTGGGGTTGACGACCG-3’。

在本发明中，所述opd基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

SEQ ID No.4：

5’-CCAGTCCATCCGCACTTGACAGCTAGCTCAGTCCT-3’；

SEQ ID No.5：

5’-CTATCAACAGGAGTCTCATGACGCCCGCAAGGTCG-3’。

在本发明中，所述vgb基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

SEQ ID No.6：

5’-AGTCCTAGGTATAATGCTAGCCGCAGTAAGAGAGGAATGTACACATGTTAGACCAGCAAACCAT-3’；

SEQ ID No.7：

5’-GCAACACTGTGGCGACTGGTTATTCAACCGCTTGA-3’。

在本发明中，所述gfp基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

SEQ ID No.8：

5’-AGTCCTAGGTATAATGCTAGCCGCAGTAAGAGAGGAATGTACACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’；

SEQ ID No.9：

5’-TCATCAGCAATGCGCCTGGTTACTTGTACAGCTCG-3’。

本发明将得到的四种基因的第一融合产物分别与λT0terminator进行第二融合，得到四种基因的第二融合产物。

在本发明中，所述λT0 terminator为终止子。

在本发明中，所述mpd基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.10～12所示，

SEQ ID No.10：5’-GTCAACCCCAAGTGAGACTCCTGTTGATAGATCCA-3’；

SEQ ID No.11：5’-GATGTAGGTGGACAGCTGGATTCTCACCAATAAAA-3’；

SEQ ID No.12：5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCGCAGTAAGAGAGGAATGTACACATGGCCGCACCGCAGGTGCG-3’。

在本发明中，所述opd基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.13～15，

SEQ ID No.13：5’-TTGCGGGCGTCATGAGACTCCTGTTGATAGATCCA-3’；

SEQ ID No.14：5’-ACGGGTTGCGTGGCGCTGGATTCTCACCAATAAAA-3’；

SEQ ID No.15：5’-TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCGCAGTAAGAGAGGAATGTACACATGCAAACGAGAAGGGTTGT-3’。

在本发明中，所述mpd基因进行第三融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.16～19所示，

SEQ ID No.16：5’-CCGGGTACCGAGCTCGAATTCTCGGCACGCACCGTGCTGCG-3’；

SEQ ID No.17：5’-TGAGCTAGCTGTCAAAGGTCGAACACGTAGAACTT-3’；

SEQ ID No.18：5’-TTGGTGAGAATCCAGCTGTCCACCTACATCGATGC-3’；

SEQ ID No.19：5’-AAAACGACGGCCAGTGAATTCCGAACAGATGTGCCGAGCGG-3’。

在本发明中，所述opd基因进行第三融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.20～23，

SEQ ID No.20：5′-CCGGGTACCGAGCTCGAATTCACACCACGCGCCTGCCGGCC-3’；

SEQ ID No.21：5’-TGAGCTAGCTGTCAAGTGCGGATGGACTGGTTGTC-3’；

SEQ ID No.22：5’-TTGGTGAGAATCCAGCGCCACGCAACCCGTACCGC-3’；

SEQ ID No.23：5’-AAAACGACGGCCAGTGAATTCCGTTCTTCCTGCAGGAACTT-3’。

在本发明中，所述vgb基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.24～27所示，

SEQ ID No.24：5’-CCGGGTACCGAGCTCGAATTCTGCAGCACGGCGCGCTGATT-3’；

SEQ ID No.25：5’-TGAGCTAGCTGTCAAGCTTCCGTGGCCCGCATATC-3’；

SEQ ID No.26：5’-CGGTTGAATAACCAGTCGCCACAGTGTTGCTCGGC-3′；

SEQ ID No.27：5’-AAAACGACGGCCAGTGAATTCTCGACAGCCTGTTGCAACCG-3′。

在本发明中，所述gfp基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.28～31所示，

SEQ ID No.28：5’-CCGGGTACCGAGCTCGAATTCCTGCCGAAGCTGCCATAGCC-3’；

SEQ ID No.29：5’-TGAGCTAGCTGTCAAGGCAGATCTGCATGTCCACC-3’；

SEQ ID No.30：5’-TGTACAAGTAACCAGGCGCATTGCTGATGACATTG-3’；

SEQ ID No.31：5’-AAAACGACGGCCAGTGAATTCACTGGCGAGGTGGTGTCGCA-3’。

在本发明中，所述mpd基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示，具体如下，GTAAG AGAGG为RBS序列：

tcggcacgcaccgtgctgcgccaggccgtgcgccaaccgctgcacagcgccaagcatgtggctcactttggcctggagctgaagaacgtgttgctgggcaaatccagcctggccccggacagcgacgaccgtcgcttcaatgacccggcctggagcaacaacccgctgtaccgccgctacctgcaaacctacctggcctggcgcaaggagctgcaggactgggtgagcagcagcgacctgtccccccaggacatcagccgcggccagttcgtcatcaacctgatgaccgaggccatggcgccgaccaataccctgtccaacccggctgcggtcaaacgcttcttcgaaaccggcggcaagagcctgctcgatggcctgtccaacctggccaaggacatggtcaacaacggcggcatgcccagccaggtgaacatggatgccttcgaagtgggcaagaacctgggcaccagcgaaggcgcggtggtgtaccgcaacgatgtgctggaactgatccagtacagccccatcaccgagcaggtgcatgcccgtccgctgctggtggtgccaccgcagatcaacaagttctacgtgttcgacctttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagccgcagtaagagaggaatgtacacatggccgcaccgcaggtgcgcacctcggcccccggctactaccggatgctgctgggcgacttcgaaatcaccgcgctgtcggacggcacggtggcgctgccggtcgacaagcggctgaaccagccggccccgaagacgcagagcgcgctggccaagtccttccagaaagcgccgctcgaaacctcggtcaccggttacctcgtcaacaccggctccaagctggtgctggtggacaccggcgcggccggcctgttcggccccaccctgggccggctggcggccaacctcaaggccgcaggctatcagcccgagcaggtcgacgagatctacatcacccacatgcaccccgaccacgtgggcggcttgatggtgggtgagcaactggcgttcccgaacgcggtggtgcgtgcggaccagaaagaagccgatttctggctcagccagaccaacctcgacaaggccccggacgacgagagcaaaggcttcttcaaaggcgccatggcctcgctgaacccctatgtgaaggccggcaagttcaagcctttctcggggaacaccgacctggtgcccggcatcaaagcgctggccagccacggccacaccccgggccacaccacctacgtggtcgaaagccaggggcaaaagctcgccctgctcggcgacctgatactcgtcgccgcggtgcagttcgacgaccccagcgtcacgacccagctcgacagcgacagcaagtccgtcgcggtggagcgcaagaaggccttcgcggatgccgccaagggcggctacctgatcgcggcgtcccacctgtcgttccccggcatcggccacatccgcgccgaaggcaagggctaccgtttcgtgccggtgaactactcggtcgtcaaccccaagtgagactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccagctgtccacctacatcgatgcgctgaaagaagccgtcgacgcggtgctgtcgattaccggcagcaaggacctgaacatgctcggcgcctgctccggtggcatcacttgtaccgcactggtgggccactatgccgccattggcgagaacaaggtcaacgccctgaccctgctggtcagcgtgctggacaccaccatggacaaccaggttgctttgtttgtcgacgagcagaccttggaggccgccaagcgccactcctatcaggcgggcgtgctggaaggcagcgaaatggccaaggtgttcgcctggatgcgccccaacgacctgatctggaactactgggtaaacaactacctgctcggcaatgagccccccgtgttcgacatcctgttctggaacaacgacaccacgcgcctgccggccgccttccacggcgacctgatcgaaatgttcaagagcaacccgctgacccgccccgacgccctggaagtgtgcggcaccgcgatcgacctgaaacaggtcaaatgcgacatctacagcctcgccggcaccaacgaccacatcaccccctggccgtcatgctaccgctcggcacatctgttcg。

在本发明中，所述opd基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，具体如下，GTAAG AGAGG为RBS序列：

acaccacgcgcctgccggccgccttccacggcgacctgatcgaaatgttcaagagcaacccgctgacccgccccgacgccctggaagtgtgcggcaccgcgatcgacctgaaacaggtcaaatgcgacatctacagcctcgccggcaccaacgaccacatcaccccctggccgtcatgctaccgctcggcacatctgttcggcggcaagatcgaattcgtactgtccaacagcgggcatatccagagcatcctcaacccgccgggcaacccgaaggcacgtttcatgaccggtgccgatcgcccgggtgacccggtggcctggcaggaaaatgccatcaagcatgcagactcctggtggttgcactggcagagttggctgggcgagcgtgccggcgcgctgaaaaaggcaccgacccgcctgggcaaccgtacctatgccgccggcgaagcctccccaggcacctacgttcacgagcgttgagttacagcgccgtggcggcctgcacggcgccacggtgtttacttcacccaagagtcacgtgcatgccgcaaccctatattttcaggaccgtcgagctggacaaccagtccatccgcacttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagccgcagtaagagaggaatgtacacatgcaaacgagaagggttgtgctcaagtctgcggccgccgcaggaactctgctcggcggcctggctgggtgcgcgagcgtggctggatcgatcggcacaggcgatcggatcaataccgtgcgcggtcctatcacaatctctgaagcgggtttcacactgactcacgagcacatctgcggcagctcggcaggattcttgcgtgcttggccagagttcttcggtagccgcaaagctctagcggaaaaggctgtgagaggattgcgccgcgccagagcggctggcgtgcgaacgattgtcgatgtgtcgactttcgatatcggtcgcgacgtcagtttattggccgaggtttcgcgggctgccgacgttcatatcgtggcggcgaccggcttgtggttcgacccgccactttcgatgcgattgaggagtgtagaggaactcacacagttcttcctgcgtgagattcaatatggcatcgaagacaccggaattagggcgggcattatcaaggtcgcgaccacaggcaaggcgaccccctttcaggagttagtgttaaaggcggccgcccgggccagcttggccaccggtgttccggtaaccactcacacggcagcaagtcagcgcgatggtgagcagcaggccgccatttttgagtccgaaggcttgagcccctcacgggtttgtattggtcacagcgatgatactgacgatttgagctatctcaccgccctcgctgcgcgcggatacctcatcggtctagaccacatcccgcacagtgcgattggtctagaagataatgcgagtgcatcagccctcctgggcatccgttcgtggcaaacacgggctctcttgatcaaggcgctcatcgaccaaggctacatgaaacaaatcctcgtttcgaatgactggctgttcgggttttcgagctatgtcaccaacatcatggacgtgatggatcgcgtgaaccccgacgggatggccttcattccactgagagtgatcccattcctacgagagaagggcgtcccacaggaaacgctggcaggcatcactgtgactaacccggcgcggttcttgtcaccgaccttgcgggcgtcatgagactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccagcgccacgcaacccgtaccgcttccctgggctggccaagctgaccgcgcggatgctcgactacctcgactacggccaggtcaacgtcatcggcgtgtcctggggcggcgccctggcccagcagtttgctcacgattaccccgagcgctgcaagaagctggtgctggccgccaccgctgccggtgcggtaatggtgccaggcaagcccaaggtgctgtggatgatggccagcccccggcgttacgtgcagccatcgcatgtcatccgcattgcgccgatgatctatggcggcggcttccgacgtgaccccgacctggccatgcaccatgccgccaaggtgcgctccggcggcaagctgggctactactggcagctgttcgcagggctcggctggaccagcatccactggctgcacaagatccggcagcccaccctggtactggctggcgacgacgacccgttgatcccgctgatcaacatgcgcctgctggcctggcggattcccaatgcccagctacacattatcgacgacggccatctgttcctgatcacccgtgccgaagccgtcgccccgatcatcatgaagttcctgcaggaagaacg。

在本发明中，所述vgb基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示，具体如下，GTAAGAGAGG为RBS序列：

tgcagcacggcgcgctgattgatcgagcccttgtcggtgatttcaccggcgtcgatcgacggcggctcggccagcagcgacagccattcgatacggctggcgttgccttgggcatcgcggttcaagcgctccagccagtcagcgaaccaactgcgcacggtgtcgttggccagcacccgcgcatcgctggcatcctctgccagcccggccaggcgccgacactcgggcagacgcgggaacaccagcaggcccaggcattcacggtccggcgcggtgaccacgatgtcctgtacgtaaggcgagccctccagcactgcgcggttgcgcagcggcccgacactgacgaataccccggacgaaagtttgaagtcctcagcgatacggccatcgaacatcaggccaagctcgggctgcctggcatcggccagcttcaacgcgtcgcccgaacagtagaagccctcctcgtcgaacgcctcggcggtctgctgcggcgagcgccagtagcccggcatgatatgcgggccacggaagcttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagccgcagtaagagaggaatgtacacatgttagaccagcaaaccattaacatcatcaaagccactgttcctgtattgaaggagcatggcgttaccattaccacgactttttataaaaacttgtttgccaaacaccctgaagtacgtcctttgtttgatatgggtcgccaagaatctttggagcagcctaaggctttggcgatgacggtattggcggcagcgcaaaacattgaaaatttgccagctattttgcctgcggtcaaaaaaattgcagtcaaacattgtcaagcaggcgtggcagcagcgcattatccgattgtcggtcaagaattgttgggtgcgattaaagaagtattgggcgatgccgcaaccgatgacattttggacgcgtggggcaaggcttatggcgtgattgcagatgtgtttattcaagtggaagcagatttgtacgctcaagcggttgaataaccagtcgccacagtgttgctcggcaatgcggtccagccggtcccagacgctttgcgacaggcctgcggcggcaaagaagaacagcttgatgcgggcaaagaacacctcgcgtagcgcggggtcctgctccagtgccttgaccagttcctcccagcccttgggtacggtgaggtaggccgtgggggaaatctcgcgcagattgcgcaaggtctcggcgaagccttgcggggtcggcttgccggcgtccaggtagaaactgcccccgttgtaaagcacgatgccgaggttgtggctaccgccgaacgtgtggttccacggcagccagtccaccagcaccggcggctcctcggcgaacgtcggaaaagtctgcagaagcatctgctgattggcgcacagcatgcgctgggtggtgatcaccgccttgggcagcttggtcgagcccgaggtgaagaggaatttggcgatggtgtccggcccggtggcggcgaaagccgcatcggccgccgccaggtcacccggttgcaacaggctgtcga。

在本发明中，所述gfp基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示，具体如下，GTAAGAGAGG为RBS序列：

ctgccgaagctgccatagccgctggacttgaccccgccaaacggcatctgcgcttcatcgtgaacggtcgggccgttgatatggcagatacccgactccacccgttgggccaaggccagggcgcggctggtgtcgcggctgaaaatggccgatgacagaccgaactccgagtcgttggccagctgcagcaaggcttcgtcgccttcggcgcgcagtaccaccgccaccgggccgaaggactcctcgcggtacaggcgcatgctggcatcgacgttgtcgagcaaggtcggttgcaggatgctgccttccagctggccgccgctgaccaggcgcgcgcccttggccacggcatcgtcgatcagtgccttgatgcgctcgccggccgctgcgctgaccagcgagccgagcaccgaggtgctggcttgcggatcacctgcacgcagcccggcgatcttcaccgccagcttgtcgacgaaagcgtcggcaatacagctgtccaccacaaggcgctcggtggacatgcagatctgccttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagccgcagtaagagaggaatgtacacatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaccaggcgcattgctgatgacattgaccacgccgtcgccgatgcctgcatcgtgcagcacctggccgatcagccgatggaccgccgggctcagctccgaggccttgagcaccacggtgttgccgcaggccagcggcatggcaatggcacgcgtggccagtatcaccggggcgttccacggtgcgatgcccaacaccacgccgcagggcgcgcgcagggccattgcgaagctgccgggaacgtccgaggggatcacttcaccggtgatctgcgtggtcatggctgcagcctcgcgcagcatgttggcggccaacttcacgttgaagccataccagttggccatggccccggtttcaccggcggcggcgatgaactcggcggccctcgcctgcaacagatcagcgcctgccagcaagcggctgcgccgctcgcccggtgccagggcggcccaggccggaaacgccgcgctggcagcagccaccgcggcatcggcatcggccagtgtggcggcggcagcctgcgacaccacctcgccagt。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

2.1.1菌株、质粒和引物

用到的菌株、质粒和引物如表1-4所示。

表1 使用的菌株、质粒和引物

表2 使用的菌株、质粒和引物

表3 使用的菌株、质粒和引物

表4 使用的菌株、质粒和引物

2.1.2药品及试剂所用药品、试剂及试剂盒见表5。

表5 所用药品、试剂及试剂盒

2.1.3仪器设备

用到的主要仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、双人垂直超净台、紫外可见分光光度计、电热恒温培养箱等。

2.1.4培养基及溶液

2.1.4.1培养基

M9无机盐培养基、LB液体培养基、LB固体培养基常规配置即可。

2.1.4.2溶液

硫酸卡那霉素(Kana)母液(10g/L)：称取0.1g硫酸卡那霉素粉末充分溶解于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃避光保存。工作浓度为50μg/mL。

5-氟尿嘧啶(5-FU)母液：称取0.4g 5-FU粉末，充分溶解于20mL DMSO中，使其浓度为20mg/L，-20℃冰箱保存。工作浓度为20μg/mL。

1.0M Tris-HCl(pH 6.8)：称取121.1g Tris，去离子水充分溶解并定容到1L。使用浓盐酸调节pH值至6.8。121℃，20min高压蒸汽灭菌，室温保存。

50×TAE电泳缓冲液：称取Tris 242.0g和Na₂EDTA·2H₂O 37.2g于烧杯中，用适量去离子水溶解后加入57.1mL的冰醋酸，充分搅拌溶解，用去离子水定容至1.0L，室温保存。使用时将其稀释成1×TAE缓冲液。

5×Tris-Gly电泳缓冲液：称取Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，溶解，用蒸馏水定容至1L。

PB磷酸缓冲液(100mL)：Na₂HPO₄·12H₂O 7.819g，NaH₂PO₄·2H₂O 2.808g，即为0.1M，调节pH至7.0。

10％SDS：称取5g SDS，用去离子水定容至50mL。室温保存。

1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：称取181.7g Tris，用去离子水定容到1L。使用浓盐酸将pH值调至8.8。121℃，20min高压蒸汽灭菌。室温保存。

30％丙烯酰胺(Acr/Bis)：称取甲叉双丙烯酰胺10g和丙烯酰胺290g，用蒸馏水定容到1L。0.45μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。

考马斯亮蓝溶液：称取考马斯亮蓝G250 100mg，加入适量蒸馏水溶解。添加50mL95％乙醇和100mL 85％磷酸，最后使用蒸馏水定容至1L。

10％过硫酸铵(APS)：称取0.1g APS，溶于1mL去离子水中(注意现用现配)。

脱色缓冲液：称取50mL甲醇和7mL冰醋酸，使用蒸馏水定容至100mL。

5×SDS-PAGE上样缓冲液：SDS 0.5g，溴酚蓝(BPB)25mg，1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，甘油2.5mL，加入去离子水至5mL混匀，分装成500μL/份，室温保存。

转膜缓冲液：称取Tris 3.0g和甘氨酸14.4g，加入适量蒸馏水溶解。添加200mL甲醇，最后使用蒸馏水定容至1L。

PBS磷酸盐缓冲液：KCl 0.2g/L，NaCl 8.0g/L，KH₂PO₄ 0.272g/L，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g/L，调节pH至7.4。

PBST缓冲液：将1mL Tween 20加入到1L PBS缓冲液中。

4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)：称取0.7149g HEPES溶于1L蒸馏水中，配制3mmol/L溶液，调节pH至7.0，121℃，20min高压蒸汽灭菌，冷却后4℃备用。

5％脱脂奶粉：称取5g脱脂奶粉加入到100mL PBST缓冲液中，充分溶解。

甲基对硫磷母液：称取10mg甲基对硫磷标准品，充分溶解于1mL色谱级甲醇中，配制浓度为10g/L的母液，密封，4℃备用。

毒死蜱母液：称取10mg毒死蜱标准品，充分溶解于1mL色谱级甲醇中，配制浓度为10g/L的母液，密封，4℃备用。

对硫磷母液：称取10mg对硫磷标准品，充分溶解于1mL色谱级甲醇中，配制浓度为10g/L的母液，密封，4℃备用。

具体的步骤：

2.2.1细菌基因组提取

1.从划线的平板上挑取单菌落，接种于5mL含相应抗生素的LB液体培养基中，30℃培养过夜。

2.取细菌过夜培养物约4mL(106-108个细胞)，7500rm离心10min,弃上清。

3.向沉淀中加入180μL Buffer GTL，涡旋震荡使菌体充分重悬。

4.加入20μL Proteinase K，涡旋混匀，56℃孵育约30min直至菌体完全裂解，每隔一段时间将离心管颠倒或震荡使菌体分散。

5.涡旋震荡15s，加入200μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀；加入200μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。

6.将步骤5所得包括沉淀在内的所有溶液全部加入Spin Column DM中，4℃，8000r/m离心1min，弃废液，将Spin Column DM放回Collection Tube中。

7.向Spin Column DM中加入500μL Buffer GW1，4℃，8000r/m离心1min，弃废液，将Spin Column DM放回Collection Tube中。

8.向Spin Column DM中加入500μL Buffe GW2,4℃，14000r/m离心1min，弃废液，将Spin Column DM放回Collection Tube中。

9.4℃，14000r/m空离2min，将Spin Column DM转移至一个新的离心管中，室温放置8-10min，以彻底晾干吸附材料中残余的Buffer GW2。

10.向Spin Column DM膜中间部位悬空滴加200μL Buffe GE，室温放置1-5min，4℃，8000r/m离心1min，收集离心管中溶液，-20℃保存。

2.2.2 E.coli质粒DNA的提取

使用康为世纪生物有限公司所生产的细菌基因组DNA提取试剂盒对P.putidaKT2440基因组进行提取，具体操作步骤如下：

利用质粒提取试剂盒对E.coli质粒DNA进行提取。使用Axygen mini-prepare质粒提取试剂盒，具体操作步骤如下：

使用前，RNase A全部加入Buffer S1中，混合均匀，4℃储存。Buffer W2concentrate中加入指定体积的无水乙醇。

1.取约4mL在LB培养基中过夜培养的菌液，4℃，12000r/m离心1min，弃上清。

2.加入250μL Buffer S1均匀悬浮细菌沉淀。

3.加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次，使菌体充分混合均匀至形成透亮的溶液。

4.加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，4℃，12000r/m离心10min。

5.小心吸取上清液并将其全部转移到制备管中，4℃，12000r/m离心1min，弃滤液。

6.将制备管放回离心管，加入500μL Buffer W1，4℃，12000r/m离心1min，弃滤液。

7.将制备管放回离心管，加入700μL Buffer W2，4℃，12000r/m离心1min，弃滤液。

8.重复步骤7，弃滤液。

9.将制备管空管放回2mL离心管中，4℃，12000r/m离心2min。

10.将制备管转移至一个新的EP管中，室温静置8-10min，在制备管膜中央悬空滴加60-80μL Eluent，室温静置2min。4℃，12000r/m离心1min。

2.2.3 DNA片段回收

使用艾德莱(Aidlab)琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒对DNA片段进行回收，具体操作步骤如下：

1.提前将吸附柱EC置于收集管中，加入100μL平衡液，静置一段时间，4℃，12000r/m离心1min，弃滤液。

2.在长波紫外灯下切取含有目的条带DNA片段的琼脂糖凝胶，得到的凝胶体积越小越好。

3.将切下的含有DNA条带的凝胶置于干净的1.5mL离心管中，称重。

4.加入3倍体积的溶胶液DD。

5.将上述带有溶胶液的离心管于56℃水浴放置约10min(或直至胶完全溶解)，每2-3min旋涡震荡或摇晃，帮助加速溶解。

6.将步骤5中得到的溶解液全部加入到吸附柱EC中，室温放置约2min，4℃，12000r/m离心30s^-1min，倒掉收集管中的废液。

7.加入已添加无水乙醇的漂洗液WB 600μL，4℃，12000r/m离心30s^-1min，弃滤液。

8.重复步骤7一次。

9.将吸附柱EC重新放回收集管中，4℃，12000r/m离心2min，将吸附柱EC置于一个新的EP管中，室温放置8-10min，以晾干残余的无水乙醇。

10.向吸附柱EC的膜中间悬空滴加50μL提前预热的EB洗脱缓冲液，室温放置约2min，4℃，12000r/m离心1min。将得到的DNA片段-20℃保存。

2.2.4 DNA片段扩增

使用高保真聚合酶Phanta系列进行DNA片段的扩增。常用PCR反应体系如下：

表6 常用PCR反应体系

2×Phanta DNA聚合酶	25.0μL
		Template	5.0μL
XPrimer-F	2.0μL
		XPrimer-R	2.0μL
ddH<sub>2</sub>O	Up to 50.0μL

PCR程序设置如下:

表7 常用PCR程序设置

使用常规Taq DNA聚合酶系列进行DNA片段的检测。常用PCR反应体系如下：

表8 常用PCR反应体系

PCR程序设置如下:

表9 PCR程序设置

2.2.5基因插入载体pKU-X的构建

外源基因插入载体构建过程如图1所示。

外源基因为mpd，opd，vgb，gfp。带有插入位点上下游同源臂、启动子、RBS和终止子的外源基因X表达盒通过融合PCR得到。

以KTU基因组DNA为模板，使用高保真的Phanta系列酶对插入位点的上下游同源臂进行PCR扩增，引物分别为X-UF、X-UR、X-DF、X-DR，因后期利用同源重组方法构建基因插入载体，因此在设计引物时，分别在上游同源臂的上游引物(X-UF)和下游同源臂的下游引物(X-DR)的5’端飘出与载体待连接位点同源的15bp序列。本章中使用组成型启动子J23119和适用于P.putida KT2440的核糖体结合位点(5’-GTAAGAGAGG-3’)，因片段长度较短，故将启动子和RBS片段设计到引物中进行融合PCR，引物为P+X-F。同样使用高保真的Phanta系列酶扩增外源基因和终止子，外源基因的引物分别为X-F，X-R。在外源基因末端插入终止子以终止转录，本试验选用适配于P.putida KT2440的λT0 terminator，引物分别为X-T0-F，X-T0-R。

将PCR扩增产物用Aidlab琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收，具体操作步骤见2.2.3。回收后的样品进行浓度检测，再以它们为模板，对片段进行融合PCR。

先将启动子、RBS和外源基因进行融合，得到X-1，融合体系为：

表10 融合体系

2×Phanta DNA聚合酶	25.0μL
		外源基因	2.0μL
P+X-F	2.0μL
		X-R	2.0μL
ddH<sub>2</sub>O	Up to 50.0μL

将融合产物回收，定量，再将其与纯化后的λT0 terminator进行融合，得到X-2，融合体系为：

表11 融合体系

将融合产物回收，定量，再将其与纯化后的上下游同源臂进行融合，得到X表达盒，融合体系为：

表12 融合体系

2×Phanta DNA聚合酶	25.0μL
		上游同源臂片段	2.0μL
X-2	2.0μL
		下游同源臂片段	2.0μL
X-UF	2.0μL
		X-DR	2.0μL
ddH<sub>2</sub>O	Up to 50.0μL

将测序验证正确的X表达盒通过同源重组方法连接到带有反向筛选标记upp的自杀质粒pKU上(自杀质粒pKU提前进行酶切操作)，构建出可以插入外源基因的打靶载体pKU-X。

酶切体系如下：

表13 酶切体系

将上述酶切体系放置在37℃金属浴中孵育45min，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行检测，检测无误后对目标片段进行切胶回收。使用微量核酸蛋白分析仪对回收所得的融合DNA片段与线性化的pKU载体进行定量，之后进行重组连接反应。将上述重组体系放置于37℃金属浴中反应30min，之后放置于冰上5min结束反应，所得到的连接反应体系可立即进行下一步的转化及后续检测。

连接体系通过化学转化方法转化于E.coli Mach1-T1感受态细胞中构建插入载体，具体操作步骤如下：

1.取-80℃保存的E.coli Mach1-T1感受态细胞，置于冰上解冻。

2.将上述连接产物在无菌条件下加入到50μL感受态细胞中，轻柔地吹打混匀，冰上静置30min。

3.快速转移至42℃热激45-90s，冰上静置2min。

4.无菌条件下向EP管中加入1mL LB液体培养基，轻柔混合均匀后，置于37℃摇床，180r/min复苏培养1.5h。

5.取出EP管，4℃，6000r/m离心5min，无菌弃上清。

6.用100μL LB液体培养基重悬管底菌体，并将其涂布于含有50μg/mL Kana的LB平板上，37℃过夜培养。

7.挑取转化子，并通过PCR及酶切进行验证。选取阳性转化子，使用质粒提取试剂盒提取质粒(具体操作方法见2.2.2)，送公司进行测序验证。质粒保存于-20℃中，测序正确后进行后续插入实验。

2.2.6 P.putida KT2440菌株感受态制备及转化

1.将-80℃甘油保存的P.putida KT2440划线于添加有5-FU的LB平板，30℃过夜培养。

2.挑取单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，180r/min，30℃培养12h，为避免杂菌污染，可在试管中加入5-FU抗生素。

3.培养后的液体按照1％的接种量转接于装有100mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，180r/min，30℃培养2-4h至OD600＝0.6，将三角瓶转移至冰上，冰浴20min使其停止生长，并将灭菌的50mL离心管和3mM/L HEPES提前置于冰上预冷。

4.无菌条件下转移培养液至预冷的50mL离心管中，4℃，5000r/m离心10min，弃上清。

5.将菌体用适量的预冷的HEPES重悬并清洗，4℃，5000r/m离心10min，弃上清。

6.重复步骤5。

7.将离心后的菌体用1mL预冷的HEPES重悬，并将其每管50μL分装，可立即用于电转实验。

8.取出在75％酒精中浸泡的1mm电转杯，利用蒸馏水进行清洗，将其倒扣至超净工作台紫外灯下吹风晾干并杀菌后，置于冰上预冷。

9.取5μL插入载体与50μL制备好的感受态细胞充分轻柔混合后，加入到上述电转杯中，1200V，5ms电击。

10.电击后立刻加入1mL常温的LB液体培养基，于180r/min，30℃摇床中复苏2h。

11.取出EP管，6000r/m离心5min，无菌弃上清，在EP管中保留约100μL上清液用于重悬菌体，后涂布于含有Kana的LB筛选平板中。

2.2.7 P.putida KT2440工程菌株的构建

pK18mobsacB作为自杀质粒，进入宿主细胞P.putida KT2440后不能自我复制。在含有upp的菌株中，upp编码的尿嘧啶磷酸转移酶利用5-FU产生5-氟尿嘧啶单磷酸，进而代谢成5-氟脱氧尿嘧啶单磷酸，该物质强烈抑制胸苷酸合成酶的活性，从而抑制细胞生长；在不含有upp基因的菌株中，5-FU对其没有抑制作用，菌株可存活。结合以上两特性，可在upp缺失的P.putida KT2440菌株中进行无痕插入操作，外源基因插入原理如图2。菌株构建具体步骤如下：

1.将构建好的插入载体电转入P.putida KT2440中，将重组子涂布在含有50ng/μLKana的LB平板上，30℃倒置培养过夜。

2.挑取平板上的单菌落到含有Kana的LB液体培养基中，180r/min，30℃摇床中培养12h，通过PCR检测单交换菌株。

3.以1％接种量，将发生单交换的菌株转接于新鲜不含抗生素的LB试管中，于180r/min，30℃摇床中培养24h，使其发生双交换。

4.对上述培养物进行适当倍数(一般为10³)稀释，然后涂布于含有5-FU的LB平板上，于30℃培养箱中倒置培养。

5.将长出的单菌落挑取到含有20ng/μL 5-FU的LB试管中，于180r/min，30℃摇床中过夜培养，PCR检测其是否为双交换菌株。

6.将发生双交换的阳性菌株的PCR产物送公司测序做进一步验证。

插入外源基因后的染色体基因序列：其中PP_3356、PP_3357、PP_5003和PP_5004为基因的插入位点。

pK18mobsacB作为自杀质粒，进入宿主细胞P.putida KT2440后不能自我复制。在含有upp的菌株中，upp编码的尿嘧啶磷酸转移酶利用5-FU产生5-氟尿嘧啶单磷酸，进而代谢成5-氟脱氧尿嘧啶单磷酸，该物质强烈抑制胸苷酸合成酶的活性，从而抑制细胞生长；在不含有upp基因的菌株中，5-FU对其没有抑制作用，菌株可存活。结合以上两特性，可在upp缺失的P.putida KT2440菌株中进行无痕插入操作，外源基因插入原理如图2。菌株构建具体步骤如下：

Homology arm、Promoter、RBS、Terminator、CDS(vgb)、CDS(gfp)、CDS(mpd)、CDS(opd)

PP_3356(SEQ ID No.36)：

tcaaggccgcaccttggcgtgcaatgcgtcggggtcttcgccacggtacagcgcctcgacctgagcggcgcgccgctgcagcacggcgcgctgattgatcgagcccttgtcggtgatttcaccggcgtcgatcgacggcggctc ggccagcagcgacagccattcgatacggctggcgttgccttgggcatcgcggttcaagcgctccagccagtcagcg aaccaactgcgcacggtgtcgttggccagcacccgcgcatcgctggcatcctctgccagcccggccaggcgccgac actcgggcagacgcgggaacaccagcaggcccaggcattcacggtccggcgcggtgaccacgatgtcctgtacgta aggcgagccctccagcactgcgcggttgcgcagcggcccgacactgacgaataccccggacgaaagtttgaagtcc tcagcgatacggccatcgaacatcaggccaagctcgggctgcctggcatcggccagcttcaacgcgtcgcccgaac agtagaagccctcctcgtcgaacgcctcggcggtctgctgcggcgagcgccagtagcccggcatgatatgcgggcc acggaagcttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagccgcagtaagagaggaatgtacacatgttagaccagcaaaccattaacatcatcaaagccactgttcctgtattgaaggagcatggcgttaccattaccacgactttttataaaaacttgtttgccaaacaccctgaagtacgtcctttgtttgatatgggtcgccaagaatctttggagcagcctaaggctttggcgatgacggtattggcggcagcgcaaaacattgaaaatttgccagctattttgcctgcggtcaaaaaaattgcagtcaaacattgtcaagcaggcgtggcagcagcgcattatccgattgtcggtcaagaattgttgggtgcgattaaagaagtattgggcgatgccgcaaccgatgacattttggacgcgtggggcaaggcttatggcgtgattgcagatgtgtttattcaagtggaagcagatttgtacgctcaagcggttgaataaccagtcgccacagtgttgctcggca atgcggtccagccggtcccagacgctttgcgacaggcctgcggcggcaaagaagaacagcttgatgcgggcaaaga acacctcgcgtagcgcggggtcctgctccagtgccttgaccagttcctcccagcccttgggtacggtgaggtaggc cgtgggggaaatctcgcgcagattgcgcaaggtctcggcgaagccttgcggggtcggcttgccggcgtccaggtag aaactgcccccgttgtaaagcacgatgccgaggttgtggctaccgccgaacgtgtggttccacggcagccagtcca ccagcaccggcggctcctcggcgaacgtcggaaaagtctgcagaagcatctgctgattggcgcacagcatgcgctg ggtggtgatcaccgccttgggcagcttggtcgagcccgaggtgaagaggaatttggcgatggtgtccggcccggtg gcggcgaaagccgcatcggccgccgccaggtcacccggttgcaacaggctgtcgaagcttatatgggggcgacctgcgacctggccacgcacgctgatcacgccgaccgaatcgtccagcaccgcctcgaaggcgcgctggaacggctggctgtcgctgacgaagaccactccgggggtgagcacctcgcagacatggcgcaacttggcgaagtcttgcgacaacagcgcgtaggccggcgacaccgggcaataggcaataccggcatacatggcgccgagggcgatttgcaggtgttcgatgtcgttgccggaaagcagcgccagcgggcgctcggcactgaggcccagtcctagcaagttggcggcgatggtgcgcacatcggcgagcatctgcacgtagctgatcgaacgccaggcaccgtctgcctggcgtgccgcgatgaaagtggtgtccgggcgcacctgggcccaatgcaccaggcgctcgagcaggcgcgccggcagcggcgccagtggctcgacaggttgcatgcgcagcacgtcgtcgacgtgactgacctgcacctggggatgcccgatggccacctggcggtagcgcggacgttggccagggtcggtcgaccctgagcgggcttcgttattcacgcaggttgctccttgttcttgttgtacatcctgccgccgcccgatatgacggggcggcggtcatcttgccggaggtctgggcctgccgcggctagatgggatagtgacgcgggccgtgctggagggtgacccagcgcaactgggtgaactgatcgatggccgtgcggctgccgaagctgccatagccgc tggacttgaccccgccaaacggcatctgcgcttcatcgtgaacggtcgggccgttgatatggcagatacccgactc cacccgttgggccaaggccagggcgcggctggtgtcgcggctgaaaatggccgatgacagaccgaactccgagtcg ttggccagctgcagcaaggcttcgtcgccttcggcgcgcagtaccaccgccaccgggccgaaggactcctcgcggt acaggcgcatgctggcatcgacgttgtcgagcaaggtcggttgcaggatgctgccttccagctggccgccgctgac caggcgcgcgcccttggccacggcatcgtcgatcagtgccttgatgcgctcgccggccgctgcgctgaccagcgag ccgagcaccgaggtgctggcttgcggatcacctgcacgcagcccggcgatcttcaccgccagcttgtcgacgaaag cgtcggcaatacagctgtccaccacaaggcgctcggtggacatgcagatctgccttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagccgcagtaagagaggaatgtacacatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaccaggcgcattgctgatgacattgaccacgccgtcgccgatgcctgcatcgtgcagcacctggccgatcagccgatggac cgccgggctcagctccgaggccttgagcaccacggtgttgccgcaggccagcggcatggcaatggcacgcgtggcc agtatcaccggggcgttccacggtgcgatgcccaacaccacgccgcagggcgcgcgcagggccattgcgaagctgc cgggaacgtccgaggggatcacttcaccggtgatctgcgtggtcatggctgcagcctcgcgcagcatgttggcggccaacttcacgttgaagccataccagttggccatggccccggtttcaccggcggcggcgatgaactcggcggccctc gcctgcaacagatcagcgcctgccagcaagcggctgcgccgctcgcccggtgccagggcggcccaggccggaaacg ccgcgctggcagcagccaccgcggcatcggcatcggccagtgtggcggcggcagcctgcgacaccacctcgccagtcaccgggttacagcgctcgaaggttcgtccatcgctggcggggcgcgactgcccgccaatcagcaaaggcacctgcaacat

PP_5003(SEQ ID No.37):

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四个表达盒的插入顺序：

mpd、opd、vgb、gfp。

2.2.8工程菌株生长曲线的测定

1.将插入多个外源基因的工程改造菌株和野生菌株分别在含有5-FU的LB固体平板上划线，过夜培养，挑取单菌落接种于含有相应抗性的LB液体培养试管中，180r/min，30℃，培养12h。

2.取适量菌液接种到100mLLB液体培养基中，使初始接种量为OD600＝0.05，并设置三个平行，180r/min，30℃，培养48h。

3.每隔一定时间取样，用紫外分光光度计测定600nm下的吸光值，测定工程改造菌株和野生菌株的生长状况。

2.2.9工程菌株遗传稳定性实验

本实验对野生菌株进行了引入质粒及染色体改造操作，为了验证改造菌株的遗传稳定性，进行了如下操作：

1.将工程菌株进行划线，挑取单菌落，接种至含有特定抗生素的LB液体培养基中，180r/min，30℃，培养12h。

2.取适量培养物进行PCR检测，并用接种环将上述培养物在相应抗性的LB平板上划线，30℃倒置培养12h。同样挑取单菌落，接种至抗性LB液体培养基中，180r/min，30℃，培养12h。

3.将步骤2重复50次，并对每次的划线菌进行PCR扩增验证。

2.2.10工程菌株的RNA提取、反转录和RT-PCR

使用康为世纪公司的细菌RNA提取试剂盒对P.putida KT2440工程改造菌株的RNA进行提取，具体操作步骤如下：

1.收集过夜培养的工程改造菌液约1mL，4℃，12000r/m离心2min，弃上清。

2.取适量Lysozyme提前加入到缓冲液TE中，使其浓度为400μg/mL，混匀。取100μL混合后的缓冲液TE将菌体重悬，室温下孵育5-10min。

3.向RL Buffer中提前加入β-巯基乙醇，混匀，取350μL RL Buffer加入到上一步的重悬菌液中，充分震荡混匀。将所得液体全部加入到FL过滤柱中，12000r/m离心2min，收集滤液。

4.加入250μL无水乙醇充分混合均匀。将所得液体全部加入到FL吸附柱中，12000r/m离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

5.加入700μL RW1 Buffer到吸附柱中，12000r/m离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

6.加入500μL RW2 Buffer(提前加入无水乙醇)到吸附柱中,12000r/m离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。重复操作一次。

7.将带有吸附柱的收集管12000r/m空离2min，弃废液，并将吸附柱置于一个新的无RNase的EP管中，室温放置8-10min，以彻底晾干。

8.将30-50μL RNase-Free Water悬空滴加到吸附柱中央，室温静置2min，12000r/m离心1min，-80℃保存所得产物。

以提取的mRNA为模板，使用Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNAdigester plus)(上海翊圣生物科技有限公司)对工程菌株的mRNA进行反转录，该试剂盒中包含的gDNA digester，可将提取RNA过程中残留的基因组DNA去除。

2.2.11 Western-Blot分析

vgb来自Vitreoscilla sp.，编码血红蛋白，为了进一步证实该基因在异源宿主P.putida KT2440中的表达，选择了短肽(KHPEVRPLFDMGRQC)来合成抗原和抗体，通过观察工程菌株和野生菌株VHb蛋白的有无来判断vgb是否在工程菌株中表达。具体操作步骤如下：

1.取对数生长末期的培养物，4℃，12000r/m离心3min，弃上清，收集菌体。

2.用提前预冷的PBS缓冲液清洗菌体，然后重悬成等浓度的液体。此步骤重复三遍。

3.取约50mL的细胞悬浮液进行超声细胞破碎处理(间歇时间3s，超声时间3s，功率500W，总时间约10min)。

4.超声处理结束后，4℃离心取上清，加入适量的5×SDS-PAGE上样缓冲液以进行后续的SDS-PAGE实验。

SDS-PAGE具体操作步骤如下：

1.将胶板用蒸馏水彻底清洗干净，安装固定在底座上，添加蒸馏水检测装置是否漏液。

2.确认密封良好后，倒掉胶板内的蒸馏水，使用干净滤纸吸干水分。

3.制备12％分离胶，均匀快速地加到距胶板顶端约3cm处，然后匀速加入适量异丙醇压实分离胶，保证操作过程中没有出现气泡。

4.约1h分离胶凝固后，倒掉上层异丙醇，用干净滤纸吸干。

5.制备5％浓缩胶，填满胶板剩余部分，插入梳子。

6.待浓缩胶凝固后，将胶槽从固定底座上取出放置到电泳槽中，添加缓冲液，并轻柔地拔出梳子，确保胶孔没有被污染。

7.取样品约10-20μL，准确加到胶孔中心。

8.连接电泳仪，先低压60V，20min，然后调高电压至120V，约3h，直至蛋白条带完全分开。

9.轻柔地卸下胶板，获得两块SDS-PAGE胶。一块用考马斯亮蓝溶液染色4-5h，反复脱色4-5次，使用凝胶成像仪检测SDS-PAGE跑胶结果。另一块用于后续的转膜实验。

Western blot具体操作步骤如下：

1.将结合有目标蛋白的PVDF膜置于5％的脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h。

2.用5％脱脂奶粉对兔源VHb多肽抗体进行1000倍稀释，以该溶液作为一抗，将封闭后的PVDF膜置于其中，室温摇床处理2h，也可4℃过夜。

3.将结合一抗的PVDF膜用PBST缓冲液室温摇床洗脱3次，每次约10min。

4.用5％脱脂奶粉对羊抗兔IgG-HRP进行2000倍稀释，以该溶液为二抗，将PVDF膜置于其中，室温摇床处理2h，也可4℃过夜。

5.结合过二抗的PVDF膜用PBST缓冲液室温摇床洗脱3次，每次约10min。

6.分别取250μL ECL试剂盒中的A，B显影液充分混匀，黑暗中静置2min，然后均匀地涂布在PVDF膜表面，进行特异性蛋白条带的显影。

7.室温显影2min后，使用凝胶成像仪对目标蛋白条带进行观察。

2.2.12绿色荧光蛋白的检测

1.将KTU-MOVG和KTU分别在LB平板上划线，挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，30℃过夜培养。

2.共取2mL上述菌液于1.5mL离心管中，4℃，5000r/m离心5min，弃上清，用LB液体培养基洗涤菌体3次，然后重悬于400μL LB液体培养基中。

3.加入FM4-64荧光染料至工作浓度为10μM/L，30℃避光孵育15min。

4.避光条件下吸取上述混合物5μL于载玻片上，滴加终浓度为2％的甘油，压紧盖玻片，滤纸吸去周围液体。

5.使用莱卡共聚焦显微镜，并在100×10的油镜下对样品进行观察，使用绿色激发光(波长488nm)激发细胞内的绿色荧光蛋白，蓝色激发光(波长515nm)激发用FM4-64荧光染料染色的红色细胞轮廓。

2.2.13有机磷农药降解实验

1.KTU-MOVG划线培养，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，30℃过夜培养。4℃，5000r/m离心4min，收集菌体。用预冷的M9培养基充分洗涤后悬浮菌体。

2.取适量细胞悬浮液接种于含有100mL M9液体培养基的500mL三角瓶中，使初始浓度为OD600＝0.05。添加适量甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷和二嗪磷的母液。适当添加0.5％的葡萄糖来保证细胞的正常生长。

3.设置三组平行实验，30℃培养。相同条件下培养的KTU作为阴性对照。

4.不同时间点取样，每次吸取2mL的培养液，其中1mL使用紫外分光光度计检测菌株的生长状况；另外1mL萃取后采用气相色谱法(GC)进行污染物降解分析。

2.2.14样品中有机磷农药的提取

样品中有机磷农药的提取步骤如下：

1.取1mL样品到试管中，快速加入等体积的乙酸乙酯。

2.盖上塞子旋涡震荡2min，静置5min。

3.将液体转移到离心管中，4℃，12000r/m离心3min。

4.加入适量的无水硫酸钠，进一步析出有机相中的水分。

5.小心吸取上层有机相，0.45μm滤膜过滤到棕色样品瓶中，随后进行GC检测。

2.2.15GC的检测条件

样品中的有机磷农药的浓度通过GC进行检测。色谱柱型号为DB-FFAP(30m×0.25mm×0.25μm)，进样量为1μL。

甲基对硫磷的检测条件：初始温度50℃，保持1min；然后以30℃/min升至180℃，保持1min；再以15℃/min升至280℃，保持1min；进样口温度为220℃，检测器温度为250℃；不分流模式。

毒死蜱的检测条件：初始温度60℃，保持1min；然后以20℃/min升至170℃，保持0.5min；以5℃/min升至250℃，保持0.5min；再以10℃/min升至300℃，保持2min；进样口温度为250℃，检测器温度为320℃；不分流模式。

对硫磷的检测条件：初始温度50℃，保持0.5min；以20℃/min升至120℃；再以5℃/min升至250℃，保持5min；进样口温度250℃，检测器温度260℃；不分流模式。

二嗪磷的检测条件：初始温度95℃，保持1.5min；以25℃/min升至200℃，再以5℃/min升至240℃，再以20℃/min升至280℃，保持10min；进样口温度250℃，检测器温度250℃；不分流模式。

用以上农药的标准品母液分别配制不同浓度的标准溶液(0，20，50，80，100mg/L)进行GC测定，根据测出的峰面积绘制各农药的浓度标准曲线。利用该标准曲线计算出样品中农药的浓度。

实验结果及数据：

2.3.1降解多种有机磷农药的工程菌株的构建

有机磷农药在农业生产中极为常见，其中甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷和二嗪磷的使用也较为广泛，以上有机磷农药均可被物理修复、化学修复以及生物修复。研究表明甲基对硫磷和毒死蜱可被mpd基因编码MPH(甲基对硫磷水解酶)有效降解，对硫磷可被opd基因编码的OPH(有机磷水解酶)有效降解，二嗪磷被证明可被假单胞菌属菌株有效降解。

本发明将mpd和opd插入到P.putida KT2440的染色体上，构建出中间菌株KTU-MO；为了提高外源基因的表达量，在两个插入基因前均加入J23119强启动子；本发明还插入vgb以提高菌株摄取氧气的能力，构建出中间菌株KTU-MOV；插入gfp来示踪菌株的活动，构建出工程菌株KTU-MOVG。以上外源基因选取的插入位点均为菌株的非必需基因和副产物基因。外源基因的信息及插入位点见表14。

表14 外源基因的信息及插入位点

工程菌株的构建方法如上节所述，即将构建好的插入载体电转化到制备好的KT2440感受态细胞中，利用不同抗生素抗性进行单双交换筛选，并利用插入基因表达盒的上下游引物进行PCR扩增后通过条带大小进行检测，得到工程菌株。

如图3，泳道1为mpd基因插入阅读框PCR结果，条带大小为2251bp；泳道2为opd基因插入阅读框PCR结果，条带大小为2456bp；泳道3为vgb基因插入阅读框PCR结果，条带大小为1567bp；泳道4为gfp基因插入阅读框PCR结果，条带大小为1846bp。选取条带验证正确的菌株送公司测序，将测序结果与原始序列比对后显示为一致，则成功构建工程菌株。本发明依次构建了插入mpd、opd、vgb、gfp的菌株KTU-M、KTU-MO、KTU-MOV、KTU-MOVG。

2.3.2野生菌株和工程菌株的生长状况

外源基因插入P.putida KT2440染色体上选取的插入位点为非必需基因或副产物基因，不会影响菌株的正常状态。为了检验外源基因的插入是否会影响细胞生长，本试验观察了野生型菌株P.putida KTU和工程菌株KTU-MOVG的生长状况并进行了比较(图4)，具体操作方法见2.2.8。

2.3.3工程菌株KTU-MOVG外源基因的稳定性

为了进一步确定外源基因在P.putida KT2440中可以稳定遗传，本试验将工程菌株KTU-MOVG在LB液体培养基中连续培养传代50次，具体操作步骤见2.2.9。第50代工程菌株的PCR验证结果如图5所示。插入的4个外源基因在基因组上稳定存在，说明工程菌株是可以在自然状态下稳定遗传的。

2.3.4外源基因在工程菌株中的转录

本发明在构建外源基因表达盒时将4个外源基因mpd，opd，vgb，gfp置于启动子J23119的调控之下，组成型强启动子J23119在P.putida中可有效用于外源基因的表达。工程菌株P.putida KTU-MOVG中四个外源基因的转录通过以反转录得到的cDNA为模板进行RT-PCR来分析，具体操作步骤见2.2.10，PCR扩增结果验证如图6。

由图2.6可知，以工程菌株基因组DNA和反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增时，均得到了目的条带，而以mRNA和ddH₂O为模板时，未得到目的条带。这表明了插入到KTU-MOVG基因组上的外源基因成功地进行了转录。

2.3.5外源基因在工程菌株中的表达

本发明在P.putida KT2440中插入了四个外源基因mpd，opd，vgb，gfp，通过进行工程菌株P.putida KTU-MOVG对有机磷农药的降解实验来验证mpd和opd的表达；通过检测VHb在工程菌株中的存在及表达来验证vgb的表达；通过荧光检测P.putida KTU-MOVG的活力来验证gfp的表达。

2.3.5.1工程菌株对有机磷农药的降解

为了验证工程菌株P.putida KTU-MOVG对不同种有机磷农药的降解能力，本发明选取了甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷和二嗪磷进行降解。在M9液体培养基中分别添加100mg/L的甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷、二嗪磷，并设置对照实验和平行实验。在不同时间节点取样监测，对样品进行萃取处理后使用GC进行检测，具体操作方法见GC的检测条件。检测样品中农药浓度前先确定该农药的出峰时间，并绘制对应标准曲线。

甲基对硫磷：

根据甲基对硫磷标准品的GC结果显示，甲基对硫磷的出峰时间为8.1min左右。其出峰时间图和浓度标准曲线如图7。

以100mg/L甲基对硫磷为底物，每隔6h取样2mL，其中1mL使用紫外分光光度计对菌体的生长情况进行检测，另外1mL用乙酸乙酯萃取后进行GC检测。依据标准曲线，测算甲基对硫磷的浓度，并绘制甲基对硫磷降解曲线。菌体生长情况和甲基对硫磷降解曲线如图8。

图8中A为工程菌株对甲基对硫磷的降解曲线，在前12h甲基对硫磷被迅速降解，降解量约为最初添加量的80％；12h后降解速率减小可能是由于代谢产物的积累导致了对菌体的毒性，抑制了菌体的活性；在第30h甲基对硫磷被完全降解。在野生型菌株KTU培养体系中并未检测到甲基对硫磷的减少。B为工程菌株KTU-MOVG在添加了甲基对硫磷的培养基中的生长曲线，前6h菌株基本没有生长，可能是由于甲基对硫磷的添加对菌株造成了一定影响；6h后甲基对硫磷浓度降低，菌株生长较快；18h后，甲基对硫磷作为底物被大量消耗，菌株生长到达平台期。在野生型菌株KTU培养体系中未见菌体密度增长。

毒死蜱：

根据毒死蜱标准品的GC结果显示，毒死蜱的出峰时间为31.0min左右。其出峰时间图和浓度标准曲线如图9。

以100mg/L毒死蜱为底物，每隔6h取样2mL，其中1mL使用紫外分光光度计对菌体的生长情况进行检测，另外1mL用乙酸乙酯萃取后进行GC检测。依据所绘制出的标准曲线，通过样品的峰面积计算出毒死蜱的浓度，并绘制毒死蜱降解曲线。菌体生长情况和毒死蜱降解曲线如图10。

图10中A为工程菌株对毒死蜱的降解曲线，可以看出毒死蜱在前12h降解迅速，降解量大约占到最初添加量的70％；12h后降解速率略有减小；在第24h毒死蜱被基本降解。在野生型菌株KTU培养体系中并未检测到毒死蜱的减少。B为工程菌株KTU-MOVG在添加了毒死蜱的培养基中的生长曲线，菌株在前12h生长较迅速，工程菌株对毒死蜱的利用能力较好；12h后，毒死蜱作为底物被大量消耗，菌株生长到达平台期，菌体密度增长缓慢。在野生型菌株KTU培养体系中未见菌体密度增长。

对硫磷：

根据对硫磷标准品的GC结果显示，对硫磷的出峰时间为32.0min左右。其出峰时间图和浓度标准曲线如图11。

以100mg/L对硫磷为底物，每隔6h取样2mL，其中1mL使用紫外分光光度计对菌体的生长情况进行检测，另外1mL用乙酸乙酯萃取后进行GC检测。依据所绘制出的标准曲线，通过样品的峰面积计算出对硫磷的浓度，并绘制对硫磷降解曲线。菌体生长情况和对硫磷降解曲线如图12。

图12中A为工程菌株对对硫磷的降解曲线，可以看出对硫磷在前18h被迅速降解，降解量大约占到最初添加量的85％；18h后降解缓慢；在第36h对硫磷被完全降解。在野生型菌株KTU培养体系中并未检测到对硫磷的减少。B为工程菌株KTU-MOVG在添加了对硫磷的培养基中的生长曲线，菌株在前18h生长速率较高；18h后对硫磷浓度降低，菌株生长缓慢。在野生型菌株KTU培养体系中未见菌体密度增长。

二嗪磷：

根据二嗪磷标准品的GC结果显示，二嗪磷的出峰时间为30.7min左右。其出峰时间图和浓度标准曲线如图13。

以100mg/L二嗪磷为底物，每隔6h取样2mL，其中1mL使用紫外分光光度计对菌体的生长情况进行检测，另外1mL用乙酸乙酯萃取后进行GC检测。依据所绘制出的标准曲线，通过样品的峰面积计算出二嗪磷的浓度，并绘制二嗪磷降解曲线。菌体生长情况和二嗪磷降解曲线如图14。

图14中A为工程菌株对二嗪磷的降解曲线，可以看出二嗪磷在前12h降解速率很快，降解量大约占到最初添加量的70％；12h后降解缓慢，在第18-24h二嗪磷基本没有再被降解。在野生型菌株KTU培养体系中并未检测到二嗪磷的减少。B为工程菌株KTU-MOVG在添加了二嗪磷的培养基中的生长曲线，菌株在前12h生长速率较高；12h后菌体密度基本不变，菌株生长到达平台期。在野生型菌株KTU培养体系中未见菌体密度增长。

2.3.5.2 VHb在P.putida KT2440中表达

为了验证vgb在P.putida KT2440中正常表达，本发明验证了VHb在KT2440中的存在。使用SDS-PAGE胶进行考马斯亮蓝染色处理；并使用细胞裂解物和抗VHb血清为特异性一抗(兔抗)，使用羊抗兔的二抗进行Western-Blot，具体操作步骤见2.2.11。考马斯亮蓝染色结果图和Western-Blot检测结果见图15。

根据VHb的氨基酸序列计算出的蛋白分子量约为15.78kDa，图15中A为SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色图，在此染色图中无法明显区别野生菌和工程菌株中VHb的表达情况，可能是由于vgb是插入到KT2440的基因组中而非质粒表达，用考马斯亮蓝染色效果不明显。B为Western-Blot检测VHb的结果图，在15kDa处工程菌株KTU-MOVG出现了特异性条带，与VHb的蛋白分子量一致，而在野生型菌株KTU中检测不到特异性条带。这表明VHb能够在重组的P.putida KT2440中成功表达。

VHb的表达可以提高细胞的生长和代谢能力，KTU-MOVG在氧气限制条件下培养，离心后菌体会较野生型菌株KTU呈现较深的红色，如图16。

2.3.5.3 GFP在P.putida KT2440中的表达

为了对工程菌株进行追踪，本发明将gfp插入到P.putida KT2440的染色体上，通过绿色荧光蛋白监测重组菌株KTU-MOVG的活力。具体操作步骤见2.2.12。GFP在工程菌株中的表达结果见图17。

图17中A为共聚焦显微镜下观察绿色荧光，当用绿色激发光激发时，染色体上插入gfp的工程菌株会呈现绿色，说明gfp成功表达并且功能正常；B为同一视野下共聚焦观察红色荧光结果，用FM4-64对菌株进行染色，使用蓝色激发光激发，可看到红色的细胞轮廓；C为A与B的融合，菌体细胞膜为红色，细胞内为绿色，证明确实为工程菌株KTU-MOVG中的GFP行使功能所产生的绿色。本试验同时以野生型菌株KTU为阴性对照，未观察到绿色荧光信号。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一种降解有机磷农药的工程菌及其构建方法

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtaagagagg 10

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

ctacgtgttc gacctttgac agctagctca gtcct 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

ctatcaacag gagtctcact tggggttgac gaccg 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

ccagtccatc cgcacttgac agctagctca gtcct 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

ctatcaacag gagtctcatg acgcccgcaa ggtcg 35

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

agtcctaggt ataatgctag ccgcagtaag agaggaatgt acacatgtta gaccagcaaa 60

ccat 64

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

gcaacactgt ggcgactggt tattcaaccg cttga 35

<210> 8

<211> 64

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

agtcctaggt ataatgctag ccgcagtaag agaggaatgt acacatggtg agcaagggcg 60

agga 64

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

tcatcagcaa tgcgcctggt tacttgtaca gctcg 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

gtcaacccca agtgagactc ctgttgatag atcca 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

gatgtaggtg gacagctgga ttctcaccaa taaaa 35

<210> 12

<211> 78

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagccgcag taagagagga atgtacacat 60

ggccgcaccg caggtgcg 78

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 13

ttgcgggcgt catgagactc ctgttgatag atcca 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 14

acgggttgcg tggcgctgga ttctcaccaa taaaa 35

<210> 15

<211> 78

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 15

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagccgcag taagagagga atgtacacat 60

gcaaacgaga agggttgt 78

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 16

ccgggtaccg agctcgaatt ctcggcacgc accgtgctgc g 41

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 17

tgagctagct gtcaaaggtc gaacacgtag aactt 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 18

ttggtgagaa tccagctgtc cacctacatc gatgc 35

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 19

aaaacgacgg ccagtgaatt ccgaacagat gtgccgagcg g 41

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 20

ccgggtaccg agctcgaatt cacaccacgc gcctgccggc c 41

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 21

tgagctagct gtcaagtgcg gatggactgg ttgtc 35

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 22

ttggtgagaa tccagcgcca cgcaacccgt accgc 35

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 23

aaaacgacgg ccagtgaatt ccgttcttcc tgcaggaact t 41

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 24

ccgggtaccg agctcgaatt ctgcagcacg gcgcgctgat t 41

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 25

tgagctagct gtcaagcttc cgtggcccgc atatc 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 26

cggttgaata accagtcgcc acagtgttgc tcggc 35

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 27

aaaacgacgg ccagtgaatt ctcgacagcc tgttgcaacc g 41

<210> 28

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 28

ccgggtaccg agctcgaatt cctgccgaag ctgccatagc c 41

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 29

tgagctagct gtcaaggcag atctgcatgt ccacc 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 30

tgtacaagta accaggcgca ttgctgatga cattg 35

<210> 31

<211> 41

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 31

aaaacgacgg ccagtgaatt cactggcgag gtggtgtcgc a 41

<210> 32

<211> 2251

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 32

tcggcacgca ccgtgctgcg ccaggccgtg cgccaaccgc tgcacagcgc caagcatgtg 60

gctcactttg gcctggagct gaagaacgtg ttgctgggca aatccagcct ggccccggac 120

agcgacgacc gtcgcttcaa tgacccggcc tggagcaaca acccgctgta ccgccgctac 180

ctgcaaacct acctggcctg gcgcaaggag ctgcaggact gggtgagcag cagcgacctg 240

tccccccagg acatcagccg cggccagttc gtcatcaacc tgatgaccga ggccatggcg 300

ccgaccaata ccctgtccaa cccggctgcg gtcaaacgct tcttcgaaac cggcggcaag 360

agcctgctcg atggcctgtc caacctggcc aaggacatgg tcaacaacgg cggcatgccc 420

agccaggtga acatggatgc cttcgaagtg ggcaagaacc tgggcaccag cgaaggcgcg 480

gtggtgtacc gcaacgatgt gctggaactg atccagtaca gccccatcac cgagcaggtg 540

catgcccgtc cgctgctggt ggtgccaccg cagatcaaca agttctacgt gttcgacctt 600

tgacagctag ctcagtccta ggtataatgc tagccgcagt aagagaggaa tgtacacatg 660

gccgcaccgc aggtgcgcac ctcggccccc ggctactacc ggatgctgct gggcgacttc 720

gaaatcaccg cgctgtcgga cggcacggtg gcgctgccgg tcgacaagcg gctgaaccag 780

ccggccccga agacgcagag cgcgctggcc aagtccttcc agaaagcgcc gctcgaaacc 840

tcggtcaccg gttacctcgt caacaccggc tccaagctgg tgctggtgga caccggcgcg 900

gccggcctgt tcggccccac cctgggccgg ctggcggcca acctcaaggc cgcaggctat 960

cagcccgagc aggtcgacga gatctacatc acccacatgc accccgacca cgtgggcggc 1020

ttgatggtgg gtgagcaact ggcgttcccg aacgcggtgg tgcgtgcgga ccagaaagaa 1080

gccgatttct ggctcagcca gaccaacctc gacaaggccc cggacgacga gagcaaaggc 1140

ttcttcaaag gcgccatggc ctcgctgaac ccctatgtga aggccggcaa gttcaagcct 1200

ttctcgggga acaccgacct ggtgcccggc atcaaagcgc tggccagcca cggccacacc 1260

ccgggccaca ccacctacgt ggtcgaaagc caggggcaaa agctcgccct gctcggcgac 1320

ctgatactcg tcgccgcggt gcagttcgac gaccccagcg tcacgaccca gctcgacagc 1380

gacagcaagt ccgtcgcggt ggagcgcaag aaggccttcg cggatgccgc caagggcggc 1440

tacctgatcg cggcgtccca cctgtcgttc cccggcatcg gccacatccg cgccgaaggc 1500

aagggctacc gtttcgtgcc ggtgaactac tcggtcgtca accccaagtg agactcctgt 1560

tgatagatcc agtaatgacc tcagaactcc atctggattt gttcagaacg ctcggttgcc 1620

gccgggcgtt ttttattggt gagaatccag ctgtccacct acatcgatgc gctgaaagaa 1680

gccgtcgacg cggtgctgtc gattaccggc agcaaggacc tgaacatgct cggcgcctgc 1740

tccggtggca tcacttgtac cgcactggtg ggccactatg ccgccattgg cgagaacaag 1800

gtcaacgccc tgaccctgct ggtcagcgtg ctggacacca ccatggacaa ccaggttgct 1860

ttgtttgtcg acgagcagac cttggaggcc gccaagcgcc actcctatca ggcgggcgtg 1920

ctggaaggca gcgaaatggc caaggtgttc gcctggatgc gccccaacga cctgatctgg 1980

aactactggg taaacaacta cctgctcggc aatgagcccc ccgtgttcga catcctgttc 2040

tggaacaacg acaccacgcg cctgccggcc gccttccacg gcgacctgat cgaaatgttc 2100

aagagcaacc cgctgacccg ccccgacgcc ctggaagtgt gcggcaccgc gatcgacctg 2160

aaacaggtca aatgcgacat ctacagcctc gccggcacca acgaccacat caccccctgg 2220

ccgtcatgct accgctcggc acatctgttc g 2251

<210> 33

<211> 2456

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 33

acaccacgcg cctgccggcc gccttccacg gcgacctgat cgaaatgttc aagagcaacc 60

cgctgacccg ccccgacgcc ctggaagtgt gcggcaccgc gatcgacctg aaacaggtca 120

aatgcgacat ctacagcctc gccggcacca acgaccacat caccccctgg ccgtcatgct 180

accgctcggc acatctgttc ggcggcaaga tcgaattcgt actgtccaac agcgggcata 240

tccagagcat cctcaacccg ccgggcaacc cgaaggcacg tttcatgacc ggtgccgatc 300

gcccgggtga cccggtggcc tggcaggaaa atgccatcaa gcatgcagac tcctggtggt 360

tgcactggca gagttggctg ggcgagcgtg ccggcgcgct gaaaaaggca ccgacccgcc 420

tgggcaaccg tacctatgcc gccggcgaag cctccccagg cacctacgtt cacgagcgtt 480

gagttacagc gccgtggcgg cctgcacggc gccacggtgt ttacttcacc caagagtcac 540

gtgcatgccg caaccctata ttttcaggac cgtcgagctg gacaaccagt ccatccgcac 600

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagccgcag taagagagga atgtacacat 660

gcaaacgaga agggttgtgc tcaagtctgc ggccgccgca ggaactctgc tcggcggcct 720

ggctgggtgc gcgagcgtgg ctggatcgat cggcacaggc gatcggatca ataccgtgcg 780

cggtcctatc acaatctctg aagcgggttt cacactgact cacgagcaca tctgcggcag 840

ctcggcagga ttcttgcgtg cttggccaga gttcttcggt agccgcaaag ctctagcgga 900

aaaggctgtg agaggattgc gccgcgccag agcggctggc gtgcgaacga ttgtcgatgt 960

gtcgactttc gatatcggtc gcgacgtcag tttattggcc gaggtttcgc gggctgccga 1020

cgttcatatc gtggcggcga ccggcttgtg gttcgacccg ccactttcga tgcgattgag 1080

gagtgtagag gaactcacac agttcttcct gcgtgagatt caatatggca tcgaagacac 1140

cggaattagg gcgggcatta tcaaggtcgc gaccacaggc aaggcgaccc cctttcagga 1200

gttagtgtta aaggcggccg cccgggccag cttggccacc ggtgttccgg taaccactca 1260

cacggcagca agtcagcgcg atggtgagca gcaggccgcc atttttgagt ccgaaggctt 1320

gagcccctca cgggtttgta ttggtcacag cgatgatact gacgatttga gctatctcac 1380

cgccctcgct gcgcgcggat acctcatcgg tctagaccac atcccgcaca gtgcgattgg 1440

tctagaagat aatgcgagtg catcagccct cctgggcatc cgttcgtggc aaacacgggc 1500

tctcttgatc aaggcgctca tcgaccaagg ctacatgaaa caaatcctcg tttcgaatga 1560

ctggctgttc gggttttcga gctatgtcac caacatcatg gacgtgatgg atcgcgtgaa 1620

ccccgacggg atggccttca ttccactgag agtgatccca ttcctacgag agaagggcgt 1680

cccacaggaa acgctggcag gcatcactgt gactaacccg gcgcggttct tgtcaccgac 1740

cttgcgggcg tcatgagact cctgttgata gatccagtaa tgacctcaga actccatctg 1800

gatttgttca gaacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta ttggtgagaa tccagcgcca 1860

cgcaacccgt accgcttccc tgggctggcc aagctgaccg cgcggatgct cgactacctc 1920

gactacggcc aggtcaacgt catcggcgtg tcctggggcg gcgccctggc ccagcagttt 1980

gctcacgatt accccgagcg ctgcaagaag ctggtgctgg ccgccaccgc tgccggtgcg 2040

gtaatggtgc caggcaagcc caaggtgctg tggatgatgg ccagcccccg gcgttacgtg 2100

cagccatcgc atgtcatccg cattgcgccg atgatctatg gcggcggctt ccgacgtgac 2160

cccgacctgg ccatgcacca tgccgccaag gtgcgctccg gcggcaagct gggctactac 2220

tggcagctgt tcgcagggct cggctggacc agcatccact ggctgcacaa gatccggcag 2280

cccaccctgg tactggctgg cgacgacgac ccgttgatcc cgctgatcaa catgcgcctg 2340

ctggcctggc ggattcccaa tgcccagcta cacattatcg acgacggcca tctgttcctg 2400

atcacccgtg ccgaagccgt cgccccgatc atcatgaagt tcctgcagga agaacg 2456

<210> 34

<211> 1567

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 34

tgcagcacgg cgcgctgatt gatcgagccc ttgtcggtga tttcaccggc gtcgatcgac 60

ggcggctcgg ccagcagcga cagccattcg atacggctgg cgttgccttg ggcatcgcgg 120

ttcaagcgct ccagccagtc agcgaaccaa ctgcgcacgg tgtcgttggc cagcacccgc 180

gcatcgctgg catcctctgc cagcccggcc aggcgccgac actcgggcag acgcgggaac 240

accagcaggc ccaggcattc acggtccggc gcggtgacca cgatgtcctg tacgtaaggc 300

gagccctcca gcactgcgcg gttgcgcagc ggcccgacac tgacgaatac cccggacgaa 360

agtttgaagt cctcagcgat acggccatcg aacatcaggc caagctcggg ctgcctggca 420

tcggccagct tcaacgcgtc gcccgaacag tagaagccct cctcgtcgaa cgcctcggcg 480

gtctgctgcg gcgagcgcca gtagcccggc atgatatgcg ggccacggaa gcttgacagc 540

tagctcagtc ctaggtataa tgctagccgc agtaagagag gaatgtacac atgttagacc 600

agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat ggcgttacca 660

ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt cctttgtttg 720

atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg gtattggcgg 780

cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa attgcagtca 840

aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa gaattgttgg 900

gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac gcgtggggca 960

aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg tacgctcaag 1020

cggttgaata accagtcgcc acagtgttgc tcggcaatgc ggtccagccg gtcccagacg 1080

ctttgcgaca ggcctgcggc ggcaaagaag aacagcttga tgcgggcaaa gaacacctcg 1140

cgtagcgcgg ggtcctgctc cagtgccttg accagttcct cccagccctt gggtacggtg 1200

aggtaggccg tgggggaaat ctcgcgcaga ttgcgcaagg tctcggcgaa gccttgcggg 1260

gtcggcttgc cggcgtccag gtagaaactg cccccgttgt aaagcacgat gccgaggttg 1320

tggctaccgc cgaacgtgtg gttccacggc agccagtcca ccagcaccgg cggctcctcg 1380

gcgaacgtcg gaaaagtctg cagaagcatc tgctgattgg cgcacagcat gcgctgggtg 1440

gtgatcaccg ccttgggcag cttggtcgag cccgaggtga agaggaattt ggcgatggtg 1500

tccggcccgg tggcggcgaa agccgcatcg gccgccgcca ggtcacccgg ttgcaacagg 1560

ctgtcga 1567

<210> 35

<211> 1846

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 35

ctgccgaagc tgccatagcc gctggacttg accccgccaa acggcatctg cgcttcatcg 60

tgaacggtcg ggccgttgat atggcagata cccgactcca cccgttgggc caaggccagg 120

gcgcggctgg tgtcgcggct gaaaatggcc gatgacagac cgaactccga gtcgttggcc 180

agctgcagca aggcttcgtc gccttcggcg cgcagtacca ccgccaccgg gccgaaggac 240

tcctcgcggt acaggcgcat gctggcatcg acgttgtcga gcaaggtcgg ttgcaggatg 300

ctgccttcca gctggccgcc gctgaccagg cgcgcgccct tggccacggc atcgtcgatc 360

agtgccttga tgcgctcgcc ggccgctgcg ctgaccagcg agccgagcac cgaggtgctg 420

gcttgcggat cacctgcacg cagcccggcg atcttcaccg ccagcttgtc gacgaaagcg 480

tcggcaatac agctgtccac cacaaggcgc tcggtggaca tgcagatctg ccttgacagc 540

tagctcagtc ctaggtataa tgctagccgc agtaagagag gaatgtacac atggtgagca 600

agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa 660

acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga 720

ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca 780

ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact 840

tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg 900

acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca 960

tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt 1020

acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg 1080

tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc 1140

agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca 1200

cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt 1260

tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa ccaggcgcat 1320

tgctgatgac attgaccacg ccgtcgccga tgcctgcatc gtgcagcacc tggccgatca 1380

gccgatggac cgccgggctc agctccgagg ccttgagcac cacggtgttg ccgcaggcca 1440

gcggcatggc aatggcacgc gtggccagta tcaccggggc gttccacggt gcgatgccca 1500

acaccacgcc gcagggcgcg cgcagggcca ttgcgaagct gccgggaacg tccgagggga 1560

tcacttcacc ggtgatctgc gtggtcatgg ctgcagcctc gcgcagcatg ttggcggcca 1620

acttcacgtt gaagccatac cagttggcca tggccccggt ttcaccggcg gcggcgatga 1680

actcggcggc cctcgcctgc aacagatcag cgcctgccag caagcggctg cgccgctcgc 1740

ccggtgccag ggcggcccag gccggaaacg ccgcgctggc agcagccacc gcggcatcgg 1800

catcggccag tgtggcggcg gcagcctgcg acaccacctc gccagt 1846

<210> 36

<211> 4329

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 36

tcaaggccgc accttggcgt gcaatgcgtc ggggtcttcg ccacggtaca gcgcctcgac 60

ctgagcggcg cgccgctgca gcacggcgcg ctgattgatc gagcccttgt cggtgatttc 120

accggcgtcg atcgacggcg gctcggccag cagcgacagc cattcgatac ggctggcgtt 180

gccttgggca tcgcggttca agcgctccag ccagtcagcg aaccaactgc gcacggtgtc 240

gttggccagc acccgcgcat cgctggcatc ctctgccagc ccggccaggc gccgacactc 300

gggcagacgc gggaacacca gcaggcccag gcattcacgg tccggcgcgg tgaccacgat 360

gtcctgtacg taaggcgagc cctccagcac tgcgcggttg cgcagcggcc cgacactgac 420

gaataccccg gacgaaagtt tgaagtcctc agcgatacgg ccatcgaaca tcaggccaag 480

ctcgggctgc ctggcatcgg ccagcttcaa cgcgtcgccc gaacagtaga agccctcctc 540

gtcgaacgcc tcggcggtct gctgcggcga gcgccagtag cccggcatga tatgcgggcc 600

acggaagctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agccgcagta agagaggaat 660

gtacacatgt tagaccagca aaccattaac atcatcaaag ccactgttcc tgtattgaag 720

gagcatggcg ttaccattac cacgactttt tataaaaact tgtttgccaa acaccctgaa 780

gtacgtcctt tgtttgatat gggtcgccaa gaatctttgg agcagcctaa ggctttggcg 840

atgacggtat tggcggcagc gcaaaacatt gaaaatttgc cagctatttt gcctgcggtc 900

aaaaaaattg cagtcaaaca ttgtcaagca ggcgtggcag cagcgcatta tccgattgtc 960

ggtcaagaat tgttgggtgc gattaaagaa gtattgggcg atgccgcaac cgatgacatt 1020

ttggacgcgt ggggcaaggc ttatggcgtg attgcagatg tgtttattca agtggaagca 1080

gatttgtacg ctcaagcggt tgaataacca gtcgccacag tgttgctcgg caatgcggtc 1140

cagccggtcc cagacgcttt gcgacaggcc tgcggcggca aagaagaaca gcttgatgcg 1200

ggcaaagaac acctcgcgta gcgcggggtc ctgctccagt gccttgacca gttcctccca 1260

gcccttgggt acggtgaggt aggccgtggg ggaaatctcg cgcagattgc gcaaggtctc 1320

ggcgaagcct tgcggggtcg gcttgccggc gtccaggtag aaactgcccc cgttgtaaag 1380

cacgatgccg aggttgtggc taccgccgaa cgtgtggttc cacggcagcc agtccaccag 1440

caccggcggc tcctcggcga acgtcggaaa agtctgcaga agcatctgct gattggcgca 1500

cagcatgcgc tgggtggtga tcaccgcctt gggcagcttg gtcgagcccg aggtgaagag 1560

gaatttggcg atggtgtccg gcccggtggc ggcgaaagcc gcatcggccg ccgccaggtc 1620

acccggttgc aacaggctgt cgaagcttat atgggggcga cctgcgacct ggccacgcac 1680

gctgatcacg ccgaccgaat cgtccagcac cgcctcgaag gcgcgctgga acggctggct 1740

gtcgctgacg aagaccactc cgggggtgag cacctcgcag acatggcgca acttggcgaa 1800

gtcttgcgac aacagcgcgt aggccggcga caccgggcaa taggcaatac cggcatacat 1860

ggcgccgagg gcgatttgca ggtgttcgat gtcgttgccg gaaagcagcg ccagcgggcg 1920

ctcggcactg aggcccagtc ctagcaagtt ggcggcgatg gtgcgcacat cggcgagcat 1980

ctgcacgtag ctgatcgaac gccaggcacc gtctgcctgg cgtgccgcga tgaaagtggt 2040

gtccgggcgc acctgggccc aatgcaccag gcgctcgagc aggcgcgccg gcagcggcgc 2100

cagtggctcg acaggttgca tgcgcagcac gtcgtcgacg tgactgacct gcacctgggg 2160

atgcccgatg gccacctggc ggtagcgcgg acgttggcca gggtcggtcg accctgagcg 2220

ggcttcgtta ttcacgcagg ttgctccttg ttcttgttgt acatcctgcc gccgcccgat 2280

atgacggggc ggcggtcatc ttgccggagg tctgggcctg ccgcggctag atgggatagt 2340

gacgcgggcc gtgctggagg gtgacccagc gcaactgggt gaactgatcg atggccgtgc 2400

ggctgccgaa gctgccatag ccgctggact tgaccccgcc aaacggcatc tgcgcttcat 2460

cgtgaacggt cgggccgttg atatggcaga tacccgactc cacccgttgg gccaaggcca 2520

gggcgcggct ggtgtcgcgg ctgaaaatgg ccgatgacag accgaactcc gagtcgttgg 2580

ccagctgcag caaggcttcg tcgccttcgg cgcgcagtac caccgccacc gggccgaagg 2640

actcctcgcg gtacaggcgc atgctggcat cgacgttgtc gagcaaggtc ggttgcagga 2700

tgctgccttc cagctggccg ccgctgacca ggcgcgcgcc cttggccacg gcatcgtcga 2760

tcagtgcctt gatgcgctcg ccggccgctg cgctgaccag cgagccgagc accgaggtgc 2820

tggcttgcgg atcacctgca cgcagcccgg cgatcttcac cgccagcttg tcgacgaaag 2880

cgtcggcaat acagctgtcc accacaaggc gctcggtgga catgcagatc tgccttgaca 2940

gctagctcag tcctaggtat aatgctagcc gcagtaagag aggaatgtac acatggtgag 3000

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 3060

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 3120

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 3180

caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 3240

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 3300

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 3360

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 3420

gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 3480

ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 3540

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 3600

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 3660

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaccaggcgc 3720

attgctgatg acattgacca cgccgtcgcc gatgcctgca tcgtgcagca cctggccgat 3780

cagccgatgg accgccgggc tcagctccga ggccttgagc accacggtgt tgccgcaggc 3840

cagcggcatg gcaatggcac gcgtggccag tatcaccggg gcgttccacg gtgcgatgcc 3900

caacaccacg ccgcagggcg cgcgcagggc cattgcgaag ctgccgggaa cgtccgaggg 3960

gatcacttca ccggtgatct gcgtggtcat ggctgcagcc tcgcgcagca tgttggcggc 4020

caacttcacg ttgaagccat accagttggc catggccccg gtttcaccgg cggcggcgat 4080

gaactcggcg gccctcgcct gcaacagatc agcgcctgcc agcaagcggc tgcgccgctc 4140

gcccggtgcc agggcggccc aggccggaaa cgccgcgctg gcagcagcca ccgcggcatc 4200

ggcatcggcc agtgtggcgg cggcagcctg cgacaccacc tcgccagtca ccgggttaca 4260

gcgctcgaag gttcgtccat cgctggcggg gcgcgactgc ccgccaatca gcaaaggcac 4320

ctgcaacat 4329

<210> 37

<211> 4648

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 37

atgagtaaca agaacaacga tgagctacag cggcaggcct cggaaaacac cctggggctg 60

aacccggtca tcggcatccg ccgcaaggac ctgttgagct cggcacgcac cgtgctgcgc 120

caggccgtgc gccaaccgct gcacagcgcc aagcatgtgg ctcactttgg cctggagctg 180

aagaacgtgt tgctgggcaa atccagcctg gccccggaca gcgacgaccg tcgcttcaat 240

gacccggcct ggagcaacaa cccgctgtac cgccgctacc tgcaaaccta cctggcctgg 300

cgcaaggagc tgcaggactg ggtgagcagc agcgacctgt ccccccagga catcagccgc 360

ggccagttcg tcatcaacct gatgaccgag gccatggcgc cgaccaatac cctgtccaac 420

ccggctgcgg tcaaacgctt cttcgaaacc ggcggcaaga gcctgctcga tggcctgtcc 480

aacctggcca aggacatggt caacaacggc ggcatgccca gccaggtgaa catggatgcc 540

ttcgaagtgg gcaagaacct gggcaccagc gaaggcgcgg tggtgtaccg caacgatgtg 600

ctggaactga tccagtacag ccccatcacc gagcaggtgc atgcccgtcc gctgctggtg 660

gtgccaccgc agatcaacaa gttctacgtg ttcgaccttt gacagctagc tcagtcctag 720

gtataatgct agccgcagta agagaggaat gtacacatgg ccgcaccgca ggtgcgcacc 780

tcggcccccg gctactaccg gatgctgctg ggcgacttcg aaatcaccgc gctgtcggac 840

ggcacggtgg cgctgccggt cgacaagcgg ctgaaccagc cggccccgaa gacgcagagc 900

gcgctggcca agtccttcca gaaagcgccg ctcgaaacct cggtcaccgg ttacctcgtc 960

aacaccggct ccaagctggt gctggtggac accggcgcgg ccggcctgtt cggccccacc 1020

ctgggccggc tggcggccaa cctcaaggcc gcaggctatc agcccgagca ggtcgacgag 1080

atctacatca cccacatgca ccccgaccac gtgggcggct tgatggtggg tgagcaactg 1140

gcgttcccga acgcggtggt gcgtgcggac cagaaagaag ccgatttctg gctcagccag 1200

accaacctcg acaaggcccc ggacgacgag agcaaaggct tcttcaaagg cgccatggcc 1260

tcgctgaacc cctatgtgaa ggccggcaag ttcaagcctt tctcggggaa caccgacctg 1320

gtgcccggca tcaaagcgct ggccagccac ggccacaccc cgggccacac cacctacgtg 1380

gtcgaaagcc aggggcaaaa gctcgccctg ctcggcgacc tgatactcgt cgccgcggtg 1440

cagttcgacg accccagcgt cacgacccag ctcgacagcg acagcaagtc cgtcgcggtg 1500

gagcgcaaga aggccttcgc ggatgccgcc aagggcggct acctgatcgc ggcgtcccac 1560

ctgtcgttcc ccggcatcgg ccacatccgc gccgaaggca agggctaccg tttcgtgccg 1620

gtgaactact cggtcgtcaa ccccaagtga gactcctgtt gatagatcca gtaatgacct 1680

cagaactcca tctggatttg ttcagaacgc tcggttgccg ccgggcgttt tttattggtg 1740

agaatccagc tgtccaccta catcgatgcg ctgaaagaag ccgtcgacgc ggtgctgtcg 1800

attaccggca gcaaggacct gaacatgctc ggcgcctgct ccggtggcat cacttgtacc 1860

gcactggtgg gccactatgc cgccattggc gagaacaagg tcaacgccct gaccctgctg 1920

gtcagcgtgc tggacaccac catggacaac caggttgctt tgtttgtcga cgagcagacc 1980

ttggaggccg ccaagcgcca ctcctatcag gcgggcgtgc tggaaggcag cgaaatggcc 2040

aaggtgttcg cctggatgcg ccccaacgac ctgatctgga actactgggt aaacaactac 2100

ctgctcggca atgagccccc cgtgttcgac atcctgttct ggaacaacga caccacgcgc 2160

ctgccggccg ccttccacgg cgacctgatc gaaatgttca agagcaaccc gctgacccgc 2220

cccgacgccc tggaagtgtg cggcaccgcg atcgacctga aacaggtcaa atgcgacatc 2280

tacagcctcg ccggcaccaa cgaccacatc accccctggc cgtcatgcta ccgctcggca 2340

catctgttcg gcggcaagat cgaattcgta ctgtccaaca gcgggcatat ccagagcatc 2400

ctcaacccgc cgggcaaccc gaaggcacgt ttcatgaccg gtgccgatcg cccgggtgac 2460

ccggtggcct ggcaggaaaa tgccatcaag catgcagact cctggtggtt gcactggcag 2520

agttggctgg gcgagcgtgc cggcgcgctg aaaaaggcac cgacccgcct gggcaaccgt 2580

acctatgccg ccggcgaagc ctccccaggc acctacgttc acgagcgttg agttacagcg 2640

ccgtggcggc ctgcacggcg ccacggtgtt tacttcaccc aagagtcacg tgcatgccgc 2700

aaccctatat tttcaggacc gtcgagctgg acaaccagtc catccgcact tgacagctag 2760

ctcagtccta ggtataatgc tagccgcagt aagagaggaa tgtacacatg caaacgagaa 2820

gggttgtgct caagtctgcg gccgccgcag gaactctgct cggcggcctg gctgggtgcg 2880

cgagcgtggc tggatcgatc ggcacaggcg atcggatcaa taccgtgcgc ggtcctatca 2940

caatctctga agcgggtttc acactgactc acgagcacat ctgcggcagc tcggcaggat 3000

tcttgcgtgc ttggccagag ttcttcggta gccgcaaagc tctagcggaa aaggctgtga 3060

gaggattgcg ccgcgccaga gcggctggcg tgcgaacgat tgtcgatgtg tcgactttcg 3120

atatcggtcg cgacgtcagt ttattggccg aggtttcgcg ggctgccgac gttcatatcg 3180

tggcggcgac cggcttgtgg ttcgacccgc cactttcgat gcgattgagg agtgtagagg 3240

aactcacaca gttcttcctg cgtgagattc aatatggcat cgaagacacc ggaattaggg 3300

cgggcattat caaggtcgcg accacaggca aggcgacccc ctttcaggag ttagtgttaa 3360

aggcggccgc ccgggccagc ttggccaccg gtgttccggt aaccactcac acggcagcaa 3420

gtcagcgcga tggtgagcag caggccgcca tttttgagtc cgaaggcttg agcccctcac 3480

gggtttgtat tggtcacagc gatgatactg acgatttgag ctatctcacc gccctcgctg 3540

cgcgcggata cctcatcggt ctagaccaca tcccgcacag tgcgattggt ctagaagata 3600

atgcgagtgc atcagccctc ctgggcatcc gttcgtggca aacacgggct ctcttgatca 3660

aggcgctcat cgaccaaggc tacatgaaac aaatcctcgt ttcgaatgac tggctgttcg 3720

ggttttcgag ctatgtcacc aacatcatgg acgtgatgga tcgcgtgaac cccgacggga 3780

tggccttcat tccactgaga gtgatcccat tcctacgaga gaagggcgtc ccacaggaaa 3840

cgctggcagg catcactgtg actaacccgg cgcggttctt gtcaccgacc ttgcgggcgt 3900

catgagactc ctgttgatag atccagtaat gacctcagaa ctccatctgg atttgttcag 3960

aacgctcggt tgccgccggg cgttttttat tggtgagaat ccagcgccac gcaacccgta 4020

ccgcttccct gggctggcca agctgaccgc gcggatgctc gactacctcg actacggcca 4080

ggtcaacgtc atcggcgtgt cctggggcgg cgccctggcc cagcagtttg ctcacgatta 4140

ccccgagcgc tgcaagaagc tggtgctggc cgccaccgct gccggtgcgg taatggtgcc 4200

aggcaagccc aaggtgctgt ggatgatggc cagcccccgg cgttacgtgc agccatcgca 4260

tgtcatccgc attgcgccga tgatctatgg cggcggcttc cgacgtgacc ccgacctggc 4320

catgcaccat gccgccaagg tgcgctccgg cggcaagctg ggctactact ggcagctgtt 4380

cgcagggctc ggctggacca gcatccactg gctgcacaag atccggcagc ccaccctggt 4440

actggctggc gacgacgacc cgttgatccc gctgatcaac atgcgcctgc tggcctggcg 4500

gattcccaat gcccagctac acattatcga cgacggccat ctgttcctga tcacccgtgc 4560

cgaagccgtc gccccgatca tcatgaagtt cctgcaggaa gaacgtcagc gtgcggtcat 4620

gcatccccgt ccggcctcgg gggggtga 4648

Claims (10)

1.一种降解有机磷农药的工程菌，将mpd基因、opd基因、vgb基因和gfp基因插入P.putida KT2440宿主菌中，得到；插入顺序为mpd-opd-vg b-gfp。

2.权利要求1所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将组成型启动子J23119和RBS，分别和mpd基因、opd基因、vgb基因和gfp基因进行第一融合，得到四种基因的第一融合产物；

所述RBS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)将所述步骤1)得到的mpd和opd基因的第一融合产物分别与λT0 t erminator进行第二融合，得到这两种基因的第二融合产物；

3)将所述步骤1)得到的vgb和gfp基因第一融合产物与上下游同源臂进行第二融合，步骤2)得到的两种基因的第二融合产物与上下游同源臂进行第三融合，得到四种基因的表达盒，将所述四种基因的表达盒分别连接到带有反向筛选标记upp的自杀质粒pKU，得到四种基因的打靶载体；

4)将所述步骤3)得到的四种基因的打靶载体化学转化到E.coliMach 1-T1感受态细胞中，提取质粒，得到四种基因的插入载体；

5)将所述步骤4)得到的四种基因的插入载体插入到P.putida KT2440宿主菌中，在含Kana的培养基中培养，得到单交换菌株；

6)将所述步骤5)得到的单交换菌株在培养基中培养，得到双交换菌株，所述双交换菌株为工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)mpd基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述opd基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N o.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述vgb基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N o.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

所述gfp基因进行第一融合使用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)mpd基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10～12所示；

所述opd基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13～15。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)mpd基因进行第三融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16～19所示；

所述opd基因进行第三融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20～23；

所述vgb基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24～27所示；

所述gfp基因进行第二融合使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.28～31所示。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)mpd基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)opd基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)vgb基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示。

9.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)gfp基因的表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示。

10.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)连接的条件包括：37℃金属浴中反应30min。

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