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CN112063597A - 玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2及其应用 - Google Patents

玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2及其应用 Download PDF

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CN112063597A CN201910496374.XA CN201910496374A CN112063597A CN 112063597 A CN112063597 A CN 112063597A CN 201910496374 A CN201910496374 A CN 201910496374A CN 112063597 A CN112063597 A CN 112063597A
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Abstract

本发明公开了一种玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559‑2，该基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559‑2或含该基因的植物表达载体在提高作物对干旱或高盐逆境胁迫耐受性育种中的应用。实验证实过表达ZmDEK559‑2基因的玉米其抗旱和耐盐等性状较未转化的野生型对照得到了明显的提高，在遭遇干旱和高盐等逆境胁迫时可保持相对好的长势，进而促进作物产量的提高，预示本发明在作物抗逆遗传育种改良中具有广阔的应用前景。

Description

玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2及其应用
技术领域
本发明属于植物生物工程育种和分子生物学技术领域，具体说，涉及一种玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2及其在提高作物对干旱或高盐逆境胁迫耐受性育种并在逆境下提高作物产量中的应用。
背景技术
玉米是重要的粮食、饲料和能源作物，在我国粮食和能源安全保障体系中占有极其重要的地位。人口的增长，气候的改变，社会经济的增长，畜牧业的发展和矿物质能源的日益枯竭，使得全球粮食、饲料和燃料短缺，尤其对玉米的需求更是呈刚性增长。目前，随着城市化进程的推进，我国耕地面积不断缩减，自然灾害频发，对粮食生产的约束日益突出。为此，发掘耐逆关键基因，利用农业生物技术培育玉米耐逆新品种，提高作物单产和对不良环境的适应能力，是保证粮食高产、稳产，解决我国粮食安全问题的有效途径。
粮食的生产经常遭受非生物胁迫的严重影响，包括干旱和土壤盐渍化等。据统计，干旱已成为限制我国粮食生产的第一要素，我国约48％的耕地处于干旱或半干旱地区，随着水资源短缺和全球气温升高，干旱对粮食产量的影响会越来越大。玉米的植株高大，耗水量多，生育期易受到干旱侵袭，我国每年约60％的玉米种植面积受到不同程度的干旱胁迫，玉米抽穗期的严重干旱常常造成玉米大幅度减产甚至绝产。土壤盐渍化是限制玉米生产的又一重要因素，我国16亿亩耕地中，盐碱地1亿多亩，中低产田约10亿亩，其中干旱和盐碱是导致其产量低的重要原因。传统的植物育种策略相对缓慢，并且在赋予玉米提高非生物胁迫耐受性方面通常是不成功的。通过常规育种提高玉米产量近年来达到了一个平台期。转基因被认为是现代农业中发展最快的生物技术，其核心之一是重要功能基因的发掘，世界各国越来越意识到基因资源对未来农业发展的重要性。孟山都和杜邦等五大跨国公司利用其基因专利和品种，占据了国际种业市场约70％的份额。因此，基因的知识产权之争将会成为今后育种产业发展的焦点问题。
农业生物技术已经在模式作物系统、温室及田间试验中得以广泛验证，通过遗传改良提高作物的非生物胁迫耐受性等，以提高粮食的高产和稳产性。植物不能移动以逃避胁迫环境。因此，植物进化出了一系列适应性策略，以应对不良环境。干旱和高盐等不良条件下，对植物的一大挑战是产生的大量代谢产物对其造成的氧化胁迫，这些代谢产物包括过氧化物、超氧阴离子(ROS)、超氧化物及其有机衍生物等。已有的研究表明，氧化还原水平的维持在细胞增殖与分化中发挥至关重要的作用，而ROS在维持细胞氧化还原水平中起主导作用，它在植物的生长发育、胁迫反应和基因表达调控方面发挥重要作用。低浓度的ROS是植物生长发育所必须的，然而高浓度的ROS却导致细胞严重受损，影响植物的正常发育和生长。ROS对核酸、蛋白和不饱和脂类物质等具有很强的破坏性，它从这些物质中提取氢，导致还原型氧和第2种有机ROS的形成，这种链式反应的持续会对细胞成分造成严重破坏，直至ROS被清除。为应对氧化胁迫，植物体能够产生一定量的ROS清除剂(包括还原性抗坏血酸、谷胱甘肽、硫氧还蛋白、花青素和生育酚等)和相关酶类，以维持ROS水平。然而，遭遇不良环境时，ROS的产生将大量增加，远超过植物对其清除的能力，细胞遭受严重的氧化胁迫，生长发育受阻，严重时甚至导致细胞死亡、生产力丧失。这是干旱和高盐等不良条件下造成作物减产的一个重要原因。
已有的研究表明，改变植物中与ROS清除系统相关的基因的表达可提高植物胁迫耐受性，进而促进逆境条件下产量的形成。经检索，有关玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2及其在逆境下提高作物产量中应用的文献还未见报道。
发明内容
针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2及其在逆境下提高作物产量中的应用。
本发明所述的玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2，其特征在于：该基因ZmDEK559-2的CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其蛋白编码序列如SEQ ID No.2所示，与基因的克隆方法无关。
鉴于本领域专业人员很容易通过定向优化或者点突变等方法对本发明专利中所述基因的核苷酸序列进行修饰或突变，那些经过人工修饰改造后具有与本发明所提供的基因CDS序列同源性≧85％且仍具有该基因功能的核苷酸序列均为本发明中所述基因的序列衍生物，等同于本发明所述序列，属于本专利的保护范畴。
本发明还提供了一种含上述基因ZmDEK559-2的重组表达载体。
其中：所述重组表达载体采用的受体载体为pCAMBIA3300-Bar，重组后的表达载体含有上述如SEQ ID No.1所示的完整开放读码框(ORF)序列。
进一步的，所述重组表达载体优选是含有玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2的重组质粒pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar。其构建方法是：设计上下游引物，通过PCR扩增向SEQ ID No.1核苷酸序列的两端分别引入SacI酶切位点，获得两端含有SacI酶切位点碱基序列。利用限制性内切酶SacI酶切pCAMBIA3300-Bar载体和带有SacI酶切位点碱基序列片段，分别回收酶切后的载体片段和带有SacI酶切位点的核苷酸序列片段，利用T-4DNA连接酶将片段连接到载体中。构建好的植物表达载体利用BamHI进行酶切鉴定和测序确认，鉴定出SEQ ID No.1核苷酸序列正向连入pCAMBIA3300-Bar的载体，即为构建好的重组质粒pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar(见图1)。
其中，所述上游引物为5'-GGAGCTCATGGTGTGGTCGGCTGGGAT-3'，下游引物为5'-GGAGCTCCTAGACGGAGAGGTAGGACGG-3'。
上述植物表达载体的特征在于其外源基因表达的多克隆位点处含有ZmDEK559-2基因的完整开放读码框(ORF)序列。
本发明所述的玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2在提高作物对干旱或高盐逆境胁迫耐受性育种中的应用。
其中：所述作物是玉米，水稻，小麦，棉花，高粱或烟草，优选作物是玉米；所述应用是通过在作物体内过表达基因ZmDEK559-2来实现，对干旱或高盐逆境胁迫耐受性表现在作物整株、器官和/或细胞水平上表现出的抗旱或耐盐特性或其组合。
本发明所述的重组质粒pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar在提高作物对干旱或高盐逆境胁迫耐受性育种中的应用。
其中：所述作物是玉米，水稻，小麦，棉花，高粱或烟草，优选作物是玉米。
检索证实，本发明提供的玉米ZmDEK559-2基因的功能未见相关报道，该基因隶属于Suf1superfamily，含有多个多铜氧化酶(cupredoxin)结构域。多铜氧化酶包括抗坏血酸氧化酶、漆酶、血浆铜蓝蛋白等多种类型，是植物体内非常重要的一类金属氧化酶，并在植物多种生理过程中发挥着举足轻重的作用。进化树重建分析显示该基因对应水稻中的L-抗坏血酸氧化酶同系物(L-ascorbate oxidase homolog)和拟南芥中的漆酶同系物，且水稻和拟南芥中同源基因的功能也均未见报道。因此，本发明提供的玉米ZmDEK559-2基因应是申请人自主克隆的一个新基因。基于ZmDEK559-2含有多个多铜氧化酶结构域，推测该基因可能与植物体中氧化还原状态的维持有关，通过申请人检测ZmDEK559-2功能缺失的玉米突变体，发现其突变体中ROS的含量较野生型对照大幅提高。在玉米中过表达ZmDEK559-2基因发现转基因植株在干旱和盐胁迫等逆境条件下较野生型能够更好地生长，在玉米抗逆育种中体现出了很好的应用前景。
本发明提供了一种玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2以及该基因在提高作物逆境胁迫耐受性及其产量的有效方法，是通过在作物体内过表达ZmDEK559-2基因提高植物抗逆性，进而促使作物遭遇不良环境时仍能稳产和高产。具体方法是在实验室克隆到ZmDEK559-2基因的基础上，利用玉米MaizeGDB数据库中该基因的cDNA序列设计引物，利用高保真Taq酶扩增出ZmDEK559-2的cDNA序列，获得其含有完整ORF序列的全长cDNA。构建包含ZmDEK559-2基因完整ORF序列的植物过表达载体，转化玉米，水稻，小麦，棉花，高粱或烟草等作物，实现提高玉米，水稻，小麦，棉花，高粱或烟草等作物对干旱和高盐等逆境胁迫耐受性，进而实现提高其逆境胁迫下的作物产量。本发明体现的主要价值和有益效果是：
1)利用分子生物学技术手段克隆了玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2，该基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示，为作物抗旱和耐盐等抗逆遗传改良提供了新的候选基因资源。
2)构建了含有上述玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2的植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar，将该载体转入玉米中，实验证明过表达ZmDEK559-2基因的玉米其抗旱和耐盐等性状较未转化的野生型对照得到了明显的提高，在一定逆境胁迫下植株能够更好地生长，最终可促进胁迫条件下作物产量的形成，在作物抗逆遗传育种改良中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar的结构示意图。
图2：两端引入SacI酶切位点的ZmDEK559-2ORF序列和pCAMBIA3300-Bar质粒的SacI酶切电泳示图。
其中M：分子量marker DL2000；泳道1：两端引入SacI酶切位点的ZmDEK559-2基因的ORF序列；泳道2：pCAMBIA3300-Bar质粒的SacI酶切片段。
图3：ZmDEK559-2ORF序列连入pCAMBIA3300-Bar质粒后的菌落PCR鉴定结果。
其中M：分子量marker DL2000；泳道1、2、4和5是ZmDEK559-2ORF序列已连入pCAMBIA3300-Bar质粒多克隆位点处的阳性大肠杆菌；泳道3是未转化的大肠杆菌(阴性对照)；泳道6是水(对照)。
图4：构建的pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar质粒的BamH1酶切鉴定图。
其中M：分子量marker DL2000。BamH1单酶切鉴定，除切出载体片段外，正向连入的应切出一条大小为300bp的片段，反向连入的应切出一条1.6kb大小的片段，其中泳道1表示目的片段反向连入；泳道2表示正向连入，为构建正确的植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar。
图5：质粒pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar转入农杆菌所得阳性菌落的PCR鉴定结果。
其中M：分子量marker DL2000；泳道1和2为pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar质粒导入农杆菌获得的阳性菌株的PCR鉴定结果。
图6：转pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar质粒玉米的除草剂筛选。
其中：左侧为转基因阳性植株，右侧为未转化的阴性对照，结果表明转基因植株具有明显的Bar抗性，表明pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar质粒已转入玉米植株中表达。
图7：转pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar质粒玉米的PCR检测。
其中M：分子量marker DL2000；泳道3,6,8,10和13为PCR阳性植株；P为质粒扩增条带(阳性对照)。
图8：转pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar质粒玉米的Bar试纸条检测。
其中1和2为未转化的阴性对照植株；3、4和5为转基因阳性植株。转基因植株除对照条带，下面还有一条带，为Bar基因编码蛋白的酶联免疫反应条带，表明pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar质粒已转入玉米植株中表达。
图9：转ZmDEK559-2基因玉米在干旱处理下的表型。开花前期干旱是影响玉米生产的一个关键时期，为评估转ZmDEK559-2基因对提高玉米干旱耐受性的影响，玉米植株长至10叶期开始控制土壤中的相对含水量约15％，干旱胁迫处理20天后进行玉米表型观察。
其中1为未转基因的野生型对照，2为过表达ZmDEK559-2基因的转基因玉米。
图10：转ZmDEK559-2基因玉米在高盐处理下的表型。选择长势一致的玉米材料进行盐胁迫处理实验，评估转ZmDEK559-2基因对提高玉米盐胁迫耐受性的影响，野生型(对照)植株和转基因植株分别在含有120mM NACl的MS营养液中处理8天，随后在MS营养液中恢复培养8天后观察玉米表型。
其中1为未转基因的野生型对照，2为过表达ZmDEK559-2基因转基因玉米。
具体实施方式
以下将通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但是如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中所述方法内容若无特殊说明，则均为常规性实验方法。涉及的试剂、载体、菌株若无特殊说明，则均为公知的销售渠道获得。
实施例1：玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2的克隆
1)根据ZmDEK559-2基因的序列号Zm00001d043090检索玉米MaizeGDB数据库(https://www.maizegdb.org/)获得该基因的cDNA序列，用于该基因克隆的引物设计与筛选。
2)依据上述序列，利用PRIMER5.0软件设计PCR扩增引物。
上游引物为5'TATAAGCCGTGGCCTCCC 3'；
下游引物为5'CTGACCATCGCCTCTTAATTT 3'。
3)取玉米齐319幼苗叶片，置于液氮中研磨，利用植物总RNA提取试剂盒RNAisoPlus(Takara DaLian)提取RNA，取500ng总RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser(Takara,Dalian)试剂盒进行反转录，以获得其cDNA模板用于ZmDEK559-2基因的克隆。
反应体系如下所示：
PCR反应体系：10mM Tris·Cl，1.5mM MgCl2，50mM KCl，200μM dNTP each，0.8μM引物，0.625U高保真DNA polymerase，1μL模板，无菌水补足25μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
4)电泳结束后，利用DNA片段回收试剂盒(AXYGEN)回收目的条带，凝胶回收具体步骤参见其说明书。回收的目的条带利用全式金公司的基因克隆试剂盒连入Peasy-B克隆载体，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞TransT-1，具体参照试剂盒说明书进行。向转化的大肠杆菌管中加入约1ml LB培养基37℃ 200rpm振荡培养1小时，4000rpm离心5min收菌，涂布在含有50μg/mL卡那霉素、20mg/mL X-gal、0.1M IPTG的LB固体平板上过夜培养，挑白色单克隆在含有50mg/L Kan的液体LB培养基中振荡培养6-8小时后提取质粒DNA，经PCR鉴定插入片段的大小，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认，以确保该基因cDNA序列的正确克隆。
实施例2：玉米Ubiquitin1启动子驱动ZmDEK559-2表达的重组载体的构建及大肠杆菌和农杆菌的转化
1)依据上述克隆的cDNA序列，利用primer5.0软件设计上下游引物，同时两端分别引入SacI酶切位点，获得两端含有SacI酶切位点的碱基序列，以便于后续的质粒重组。
2)引物序列如下所示：
上游引物：5'-GGAGCTCATGGTGTGGTCGGCTGGGAT-3'
下游引物：5'-GGAGCTCCTAGACGGAGAGGTAGGACGG-3'
3)以含ZmDEK559-2cDNA序列的质粒为模板，PCR扩增获得其两端带有SacI酶切位点的CDS核苷酸序列，其CDS序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收(具体步骤参考其说明书)。
PCR反应体系：5×PCR反应缓冲液(含Mg2+)5μL，引物Ⅰ(10μM)1μL，引物Ⅱ(10μM)1μL，dNTP(2.5mM)，2μL，高保真DNA polymerase(5U/μl)0.25μL，质粒1μL，ddH2O补足至25μL。
PCR程序:95℃预变性5min；95℃变性40s；56℃退火40s；72℃延伸1min；35个循环；最后72℃延伸5min。
4)将扩增获得的目的片段及其表达载体pCAMBIA3300-Bar用SacI限制性内切酶酶切(见图2)，具体酶切条件和程序参见其说明书。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收(参考说明书)。
5)将4)中获得的酶切后的目的DNA片段与载体片段进行连接。通常目的DNA片段与质粒载体连接时的摩尔比为3:1～5:1，连接体系如下：10×buffer 2μL，T4DNA Ligase 1μL，载体50-100ng，DNA片段与载体摩尔比对应的量，ddH2O补足至20μL。轻轻混匀，置于PCR仪中，25℃2-3h，随后连接产物直接用于转化大肠杆菌。
6)大肠杆菌的转化
-80℃冰箱中取出约50μL感受态大肠杆菌置于冰上，加入连接产物后轻轻混匀；冰浴30分钟，同时融化固体培养基，待冷却到50℃左右时加入Kan抗生素至50mg/L，混匀后倒平板；42℃热激90s，随后迅速冰浴2min；向管中加入800μL液体LB培养基(不含抗生素)混匀后放入摇床，37℃，200rpm，1h复苏；在上述倒好的平板表面将100μL IPTG(0.1M)和20μL X-gal(20mg/mL)涂抹均匀，用于后续的蓝白斑筛选；复苏结束后，5000rpm，离心3min，将上清吸至剩余约100μL左右，轻轻将菌悬浮；将其涂布于上述准备好的平板上，倒置平板，放入培养箱中37℃过夜培养；挑单克隆摇菌进行PCR检测(见图3)，保菌并提取质粒进行酶切鉴定(见图4)和测序确认，构建正确的质粒命名为重组质粒pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar(见图1)。
7)农杆菌LB4404的转化
向25mL含50mg/L利福平的YEP培养基中接入100μL农杆菌LB4404，28℃，200rpm，过夜培养；次日，取2mL加入到25mL含利福平50mg/L的YEP培养基中，培养至OD值0.8左右；将菌液分装到7mL管中，每个5mL菌液，置于冰上30min，在此过程中配20mM的CaCl2于7mL管中，放置在冰上备用；菌液5000rpm离心10min后收菌，每管加入2mL0.15mol/L的NaCl溶液(4℃预冷)，轻轻弹起；4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，每管加入200μL 20mmol/L的CaCl2，轻轻弹起，混匀后合并一处，以200μL每管分装于1.5mL离心管中；每管中加入8μL重组质粒，混匀，静置冰浴30min；液氮速冻90s，迅速置入37℃水浴锅3min；加入1mL未加抗生素的YEP培养基，28℃,180rpm复苏1h；融化YEP固体培养基，冷却至50℃左右，加入利福平和Kan(均为50mg/L)倒平板；5000rpm，离心3min收菌涂平板，28℃，倒置暗培养约2天；挑单克隆进行PCR鉴定(见图5)，鉴定正确后保菌备用。
实施例3：玉米的遗传转化及转基因植株的获得
1)以玉米自交系齐319为材料，进行农杆菌介导的遗传转化。种子灭菌后萌发，其茎尖离体培养产生丛生芽，最终以丛生芽作为受体进行转化。培养基如下：
种子萌发培养基：KI 0.83mg/l，KNO3 1900mg/l，CaCl2·2H2O 440mg/l，MnSO4·4H2O 22.3mg/l，KH2PO4·H2O 170mg/l，H3BO3 10mg/l，CuSO4·5H2O 0.025mg/l，FeSO4·7H2O27.8mg/l，MgSO4·7H2O 370mg/l，NH4NO3 1650mg/l，ZnSO4·7H2O 10mg/l，CoCl2·6H2O0.025mg/l，Na2MoO4·2H2O 0.5mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，肌醇100.0mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，酪蛋白水解物500mg/l,烟酸1.0mg/l，蔗糖30g/l,生物素0.05mg/l，琼脂粉7g/l，pH 5.8-6.0，用于种子萌发(液体培养基不加琼脂)。
A培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加2,4—D 1.0-3.0μmol/l和6-BA 4.5-9.0μmol/l。
B培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加和6-BA 4.5μmol/l和IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l。
C成苗培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加6-BA 2.25μmol/l和IBA 3.6μmol/l。
D生根培养基：在上述种子萌发培养基的基础上添加IBA 2.5-3.6μmol/l。
培养基经高温高压灭菌，抗生素及除草剂等活性成分应经高压过滤灭菌。
2)种子的灭菌与萌发：玉米种子用70％乙醇灭菌7分钟，0.1％氯化汞灭菌8分钟，无菌水洗涤5-6遍。将灭菌后的种子置于培养瓶中(培养瓶封口且瓶内放少量无菌水)，28℃暗处培养2-3天。当种子露白后，将其转移到基本培养基中继续培养(28℃，黑暗)。
3)茎尖的离体培养：当萌发种子的胚芽长到4-5厘米左右时，将胚芽鞘和幼叶进行剥离，最后将5毫米左右的上胚轴和茎尖切取并接种在A培养基中25℃暗培养(在此过程中要注意及时切除伸长的下胚轴和幼叶)。
4)丛生芽组织的诱导、继代与分化：离体茎尖在培养7-9天左右后开始发生不规则的膨大，在膨大的分生组织处有瘤状和指状的突起。20天后，在突起的表面开始有不定芽和胚状体的生成。一般情况下4周进行1次继代。在继代培养的过程中，如若发现在丛生芽组织块上丛生小芽过多，则将2,4-D浓度调整为3.0μmol/l；如若发现在丛生芽组织块上愈伤组织化较严重而不定芽很少，则将2，4-D浓度降至1.0μmol/l，进行继代培养直至产生大量的瘤状或指状突起(在A培养基上进行培养的组织块中，有少数材料可能会产生不定根，不定根的出现与幼叶一样会影响到组织块的膨大和胚状体或丛生芽的产生，所以要注意及时切除)。将丛生芽组织块再次转移到B培养基上培养2-3天后，其质地变得较为柔韧，色泽则慢慢变黄。利用扫描电镜观察可看到各个时期的胚状体和不定芽。胚状体和不定芽迅速发育，在其表面上产生丛生小芽。
5)以丛生芽组织块为受体进行农杆菌介导的遗传转化
将含有pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar质粒的农杆菌LB4404在含有50mg/L Kan的LB液体培养基中震荡培养(28℃，200rpm)至对数生长期。3500rpm,离心10min，弃上清。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(种子萌发培养基成分浓度减半，且不加琼脂粉)进行洗涤，离心收菌。用含100μM/L的乙酰丁香酮的1/2浓度的丛生芽诱导培养基进行悬浮(稀释5-20倍)后用于遗传转化。
以准备好的已培养12-18天的丛生芽组织块为受体进行转化，转化后在黑暗处进行恢复培养。将经农杆菌感染后的丛生芽或者组织块在含250mg/L头孢霉素(Cefotaxime)的培养基上进行抑菌培养(黑暗处)，然后将丛生芽或组织块转移到筛选培养基中进行筛选(一般3-4代)。筛选过程中大量丛生芽组织块死掉，将存活的组织块转移到不含筛选剂且不含2,4-D的A培养基上进行培养，直至产生抗性小芽。
将抗性小芽切下并转移到成苗培养基上培养(光强约2000-3000lx，光照14-16h/d)。当小苗至3-4叶期时再次转移到生根培养基中以诱导生根。将生根后的小苗移栽到蛭石中进行生长(移栽时洗去粘附的培养基)。植株的生长条件为：自然光下，日温22-28℃，夜温16-21℃，隔天浇灌含1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分的营养液。大约两周后移植苗产生大量根系，最后将其定植在田间生长。
6)转基因植株的鉴定
在移栽成活的玉米植株叶片上涂抹除草剂草丁膦(0.125％有效成分)，10天后筛选出除草剂抗性植株(图6)。同时，收取移栽成活植株的叶片提取DNA并进行PCR检测(上游引物：tgacgcacaatcccactatcc，下游引物：aacccacgtcatgccagttcc，扩增目的片段大小为689bp；见图7)。上述两者检测均为阳性的植株进一步利用bar检测试剂盒(Quickstix Kitfor PAT/bar,Envirologix,USA)检测bar蛋白的表达(见图8)，具体操作按照试剂盒说明书进行，阳性植株收获种子繁殖后代，用于后续研究。
采用CTAB法提取玉米基因组DNA，具体参见《分子克隆实验指南Ⅲ》，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下所示：
PCR反应体系：10mM Tris·Cl，1.5mM MgCl2，50mM KCl，200μM dNTP each，0.8μM引物，0.625U高保真DNA polymerase，1μL模板，无菌水补足25μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，循环36次；72℃延伸5min，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例4：过表达ZmDEK559-2基因对玉米干旱胁迫耐受性的影响
挑取籽粒饱满的转基因玉米和野生型对照种子，种植于装满土的花盆中，待植株长至10叶期时，每个转基因株系选取5株生长状态一致的植株，同时选取5株长势与转基因植株一致的野生型植株作为对照，进行干旱胁迫处理实验，控制每天的浇水量，使花盆中的土壤含水量保持在15％左右，持续胁迫处理20天。在干旱胁迫过程中观察转基因玉米植株和野生型对照植株的长势变化，发现随着胁迫时间的延长，转基因植株较野生型对照植株表现出明显的生长优势，到处理至20天时，转基因植株较野生型对照叶色更加浓绿，具有更高的生物量和更好的长势，说明过表达ZmDEK559-2基因可提高玉米植株的干旱胁迫耐受性(见图9)。
实施例5：过表达ZmDEK559-2基因对玉米高盐胁迫耐受性的影响
为探讨过表达ZmDEK559-2基因对提高玉米高盐胁迫耐受性的影响，申请人开展了转基因材料的盐胁迫处理实验。分别挑取籽粒饱满的转基因玉米和野生型对照种子，70％酒精灭菌8分钟，0.1％升汞灭菌7分钟，28℃暗处萌发3-4天，随后转入含有1/2MS营养液的培养瓶中培养，光照强度300μmol m-2s-1，光照时间16/8h(昼/夜)，相对湿度60-70％下长至四叶一心期。随后选择生长状态一致的转基因植株和野生型对照进行盐胁迫处理。盐处理采用NaCl浓度递增的方式：从60mM NaCl开始，每天递增30mM，直至NaCl浓度为120mM；植株在120mM NaCl盐浓度下处理8d，随后恢复生长8天后观察玉米表型。在高盐胁迫过程中观察转基因玉米植株和野生型对照植株的长势变化，发现随着胁迫时间的延长，转基因植株较野生型对照植株表现出明显的生长优势。盐胁迫处理8d后，将玉米幼苗进行恢复培养8d，恢复过程中发现过表达ZmDEK559-2的转基因玉米植株能够较野生型植株更快恢复生长(见图10)。结果表明，过表达ZmDEK559-2可在一定程度上缓解高盐胁迫给植株生长发育带来的损伤，提高了玉米植株对高盐胁迫的耐受性。
序列表
<110> 山东大学
<120> 玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2及其应用
<141> 2019-6-8
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1674
<212> DNA
<213> 玉米
<221> 玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2的 CDS序列
<400> 1
atggtgtggt cggctgggat ggcaatgcga ggcgcctccg ccgcgctgct cgtgctggcg 60
ctcgtcgcca ccgtggcgcg cgcggaggac ccctaccact tcttcgagtg gaaggtgacg 120
tacgggacga agaccatcat ggggacgccg cagaaggtga tcctcatcaa cgacatgttc 180
cccggcccta ccatcaactg cacatccaac aacaacatcg tcatcaatgt cttcaacatg 240
ctcgaccagc cgctcctctt cacctggcac gggatccagc agaggaagaa ctcatggcag 300
gacggcatgc tgggcaccat gtgcccaatc cagcccaaca ccaacttcac gtaccactgg 360
cagcccaagg accagatcgg cagcttcttc tattacccca gcaccggcat gcagcgggcg 420
gcgggcgcct acgggctcat cagcgtccac agccgtgacc tgatcccggt ccccttcgac 480
acgccggccg acgacttccc ggtcctcgtc ggcgactggt acaccaagga ccacaccgtc 540
ctggccaaga acctggacgc cggcaagggg atcgggcggc ccgcggggct cgtgatcaac 600
ggcaagaacg agaaggacgc gtcgaacccg cccatgtaca acgtggaggc cggcaagacg 660
taccgcttcc gcgtctgcaa cgtgggcatc aaggcgtcct tcaacatccg catccagaac 720
cacatcatga agctggtgga gatggagggc tcccacacca tgcagaacga ctacgactcg 780
ctggacctcc acatcggcca gtgcctgtcg ttcctcgtca ccgccgacca gaagcccggc 840
gactacctgc tggcggtgtc cacccggttc atcaaggagg tgaacagcat cacggccgtg 900
atccgctaca agggctccaa cgccccgccg ccggccaagg tgccggagag ccccagcgga 960
tgggcgtggt ccatcaacca gtgcaggtcc ttccgctgga acctgacggc gagcgcggcg 1020
cggcccaacc cgcaggggtc gtaccactac ggccagatca acatcacccg caccatcaag 1080
ctcgccatgg gccgcggcaa ggtggacggc aaggagcggt tcggcttcaa cggcgtgtcg 1140
cacgtcgacc ccgagacccc cgtcaagctc gccgagtact tcaacaccac cgacggggtg 1200
ttccagtacg acatcatcgg cgacgtgccg ccctccaagt ccgcgcccac caagatggcc 1260
cccaacgtca tccgcgccga gttccgcacc ttcatcgagg tggtcttcga gaaccccgag 1320
aagagcatcg acaccatcca catcgacggc tacgccttct tcgccgtcgg catgggcccg 1380
ggcaaatgga cgccagcgtc ccggagcacg tacaacctcc tggacacggt gagccggcac 1440
acgatccagg tgtaccctag gtcgtggacg gcggtgatga tgacgttcga caacgcgggc 1500
atgtggagca tccggtccaa catctgggag aggcagtacc tcggcgagca gctgtacgtg 1560
agcgtcatct cgccggagcg gtcgctcagg gacgagtaca acatgccgga gactagcctc 1620
cgctgcggca aggtcgtcgg actgccaatg ccgccgtcct acctctccgt ctag 1674
<210> 2
<211> 557
<212> PRT
<213> 玉米
<221> 玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2的氨基酸序列
<400> 2
MVWSAGMAMR GASAALLVLA LVATVARAED PYHFFEWKVT YGTKTIMGTP QKVILINDMF 60
PGPTINCTSN NNIVINVFNM LDQPLLFTWH GIQQRKNSWQ DGMLGTMCPI QPNTNFTYHW 120
QPKDQIGSFF YYPSTGMQRA AGAYGLISVH SRDLIPVPFD TPADDFPVLV GDWYTKDHTV 180
LAKNLDAGKG IGRPAGLVIN GKNEKDASNP PMYNVEAGKT YRFRVCNVGI KASFNIRIQN 240
HIMKLVEMEG SHTMQNDYDS LDLHIGQCLS FLVTADQKPG DYLLAVSTRF IKEVNSITAV 300
IRYKGSNAPP PAKVPESPSG WAWSINQCRS FRWNLTASAA RPNPQGSYHY GQINITRTIK 360
LAMGRGKVDG KERFGFNGVS HVDPETPVKL AEYFNTTDGV FQYDIIGDVP PSKSAPTKMA 420
PNVIRAEFRT FIEVVFENPE KSIDTIHIDG YAFFAVGMGP GKWTPASRST YNLLDTVSRH 480
TIQVYPRSWT AVMMTFDNAG MWSIRSNIWE RQYLGEQLYV SVISPERSLR DEYNMPETSL 540
RCGKVVGLPM PPSYLSV 557

Claims (9)

1.一种玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2，其特征是：所述基因ZmDEK559-2的CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种含权利要求1所述基因ZmDEK559-2的重组表达载体。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体采用的受体载体为pCAMBIA3300-Bar，重组后的表达载体含有权利要求1中如SEQ ID No.1所示的完整开放读码框(ORF)序列。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是含有玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2的重组质粒pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar。
5.权利要求1所述的玉米多铜氧化酶编码基因ZmDEK559-2在提高作物对干旱或高盐逆境胁迫耐受性育种中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述作物是玉米，水稻，小麦，棉花，高粱或烟草；所述应用是通过在作物体内过表达基因ZmDEK559-2来实现，对干旱或高盐逆境胁迫耐受性表现在作物整株、器官和/或细胞水平上表现出的抗旱或耐盐特性或其组合。
7.权利要求4所述重组质粒pCAMBIA3300-Ubi-ZmDEK559-2-35S-Bar在提高作物对干旱或高盐逆境胁迫耐受性育种中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述作物是玉米，水稻，小麦，棉花，高粱或烟草。
9.如权利要求5或7所述的应用，其特征在于：所述作物是玉米。
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