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CN112094820B - 霍氏肠杆菌噬菌体yzu.p.a-5及其应用 - Google Patents

霍氏肠杆菌噬菌体yzu.p.a-5及其应用 Download PDF

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CN112094820B CN202010981364.8A CN202010981364A CN112094820B CN 112094820 B CN112094820 B CN 112094820B CN 202010981364 A CN202010981364 A CN 202010981364A CN 112094820 B CN112094820 B CN 112094820B
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Abstract

本发明公开了霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)噬菌体YZU.P.A‑5及其用途，该噬菌体经鉴定具有独特的基因组结构特征，属于一种新型噬菌体，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年6月15日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020206。本发明获得高效裂解霍氏肠杆菌的噬菌体，能够有效抑制各种基质中的霍氏肠杆菌，可以应用于制备控制霍氏肠杆菌污染的抑菌剂。本发明制备的抑菌剂能够在培养基、食物基质中有效控制霍氏肠杆菌的生长，同时可以有效抑制设备、器皿、原料固体表面霍氏肠杆菌菌膜形成，并且制备简单，使用方便，可降低霍氏肠杆菌传播和引发食源性疾病的风险。

Description

霍氏肠杆菌噬菌体YZU.P.A-5及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种霍氏肠杆菌噬菌体YZU.P.A-5及其作为生物抗菌剂在食品生产、贮藏环境中的抑菌应用。
背景技术
霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)肠道菌群75(未知肠杆菌杂交群，本群包括23株菌，75为菌群代码)，是一种重要的人兽共患的条件致病菌，广泛分布于人和动物肠道和自然环境，在特定条件下会引起动物和人感染。研究显示，该菌引起动物呼吸系统疾病、新生儿感染引发的败血症病例已在多个国家和地区爆发，并且该菌逐渐呈现耐药性趋势。获得廉价、环境友好的新型生物抑菌剂，减除食品生产、加工与贮藏环境与设施以及食品原料中霍氏肠杆菌污染，对于控制该菌引起的疾病具有十分重要的意义。
目前用于控制食品生产环境中细菌生长的抑菌剂主要有化学杀菌剂，但是化学杀菌剂残留对人畜安全和环境具有重要影响，并且霍氏肠杆菌在适应自然环境生长过程中，在食品环境及加工器具的表面形成生物被膜，被膜内的细菌对常规杀菌剂的抵抗能力提高数百倍，很难被清除，从而导致持续性污染，给食品安全带来严重危害。近年来，出于对食品绿色杀菌的需求，人们利用从动植物、微生物中提取的天然抗菌成分作为生物抑(减)菌剂，主要包括大蒜素、茶多酚、溶菌酶、乳酸链球菌素等，这些抑菌剂对人畜安全无害、虽能满足绿色环保需求，但是存在制造成本高、导致食品风味和品质改变、杀菌效果不佳等缺陷，因此亟需开发新型生物抑菌剂。
噬菌体具有宿主专一性，对人畜机体无害，并且广泛存在于自然界中，资源丰富、制备成本低廉，安全环保。近年来，新型噬菌体抑菌剂研发已受到广泛关注，世界各国在噬菌体资源、生物学特性以及在各种基质中的控菌方面开展了大量研究，在美国和欧洲国家已经形成沙门氏菌、李斯特菌等病原菌的商品化生物抑菌剂，在控制食品及生产环境中的病原菌污染与传播中具有高效、廉价、安全等优势。尽管霍氏肠杆菌是动物养殖和食品生产中重要的有害生物因子，由于国内外对其生物学特性研究较少，迄今为止霍氏肠杆菌的噬菌体抑菌剂及其应用尚无报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种对霍氏肠杆菌具有强烈裂解作用的噬菌体，该噬菌体可以用于控制食品及生产环境中霍氏肠杆菌污染。
本发明还提供所述噬菌体在制备霍氏肠杆菌及其生物膜抑制剂中的应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一种霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)噬菌体YZU.P.A-5，经鉴定具有独特的基因组结构特征，属于一种新型噬菌体，本发明的噬菌体是从江苏省扬州市农贸市场污水样品中分离获得，具有高效裂解霍氏肠杆菌功能的霍氏肠杆菌噬菌体YZU.P.A-5(Enterobacter hormaechei phage YZU.P.A-5)，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCCNO：M 2020206；保藏日期：2020年6月15日。
本发明中霍氏肠杆菌噬菌体YZU.P.A-5具有以下生物学特征：
(1)形态学特征：通过透射电镜观察，YZU.P.A-5头部对称，直径约为77.5nm，尾部长72.2nm，具有伸缩性尾鞘，形态学特征归属肌尾噬菌体科。
(2)核酸类型：YZU.P.A-5为dsDNA噬菌体。
(3)基因组结构特征：YZU.P.A-5基因组全长为159094bp，其中编码基因总长度为146583bp，平均长度为698bp，占总长的92.14％，GC含量为50.08％，拥有210个开放阅读框(ORFs)，其中6个ORFs在数据库中未发现同源性基因，204个ORFs编码蛋白同源性序列中包括149个假设蛋白编码序列、13个保守假设性噬菌体蛋白序列、47个已知蛋白功能的序列。不含有任何已知的毒力基因，在GenBank数据库中未发现霍氏肠杆菌噬菌体全基因组序列及相关基因，显示YZU.P.A-5是一株新型噬菌体。
(4)具有强烈裂解霍氏肠杆菌功能。
(5)能够抑制霍氏肠杆菌生物被膜形成。
本发明所述的噬菌体YZU.P.A-5在抑制霍氏肠杆菌中的应用。
作为优选，所述的噬菌体YZU.P.A-5在抑制食品生产环境、保藏运输器具中霍氏肠杆菌污染中的应用。
本发明所述的噬菌体YZU.P.A-5在制备霍氏肠杆菌抑制剂中的应用。
其中，所述抑制剂是以噬菌体P.A-5分离物或培养物作为抑菌剂成分。
作为优选，所述抑制剂用于食品及生产设施环境或保藏运输器具的除菌，控制霍氏肠杆菌的污染和传播。其中，所述抑菌剂制备为：分别取YZU.P.A-5噬菌体与对数生长期的霍氏肠杆菌液混合，室温放置，然后加到LB液体培养基中，恒温振荡过夜培养；将培养物转至灭菌离心管，离心后收集上清液，过滤，收集噬菌体增殖液，加PEG 8000、NaCl，摇匀至溶解，过夜；离心去上清液；加SM缓冲液，室温反应；使用氯仿抽提；离心回收含有YZU.P.A-5的亲水相。将获得的YZU.P.A-5颗粒与SM缓冲液混合，制成噬菌体抑菌剂母液。
本发明的霍氏肠杆菌噬菌体抑菌剂用途是指：将如噬菌体抑菌剂母液用水稀释并制成喷洒液或淋洗液，单独或者配合其他杀菌剂使用，用于对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少食品加工环境中霍氏肠杆菌载量以及菌膜形成；或者将纯化的噬菌体作为食品原料洗涤液添加剂，用于防止食品原料携带的霍氏肠杆菌代谢和繁殖。
本发明的制备的制剂可以单独或复配作为抑菌剂的主要成分，有效抑制食品生产环境中霍氏肠杆菌生长与代谢，为食品清洁生产提供一种安全、高效、廉价的生物抗菌产品。
有益效果：与现有技术相比较，本发明分离获得能够高效裂解霍氏肠杆菌的噬菌体YZU.P.A-5，具有独特的形态和基因组特征，是一种全新的有效抑制霍氏肠杆菌的噬菌体，该噬菌体YZU.P.A-5可以应用于制备绿色、廉价的霍氏肠杆菌抑制剂中。
本发明的噬菌体对霍氏肠杆菌具有高效裂解活性，制备形成的抑菌剂能够有效控制各种基质中霍氏肠杆菌的生长及生物被膜形成，有效减除霍氏肠杆菌污染和传播风险。具体的：本发明噬菌体制备形成的生物抑菌剂能够在培养基、食物基质中有效控制霍氏肠杆菌生长，同时能够抑制食品及生产设施表面霍氏肠杆菌菌膜形成，并且制备简单，使用方便。通过传统方法很容易制备成喷洒液或淋洗液，对食品加工贮藏环境中的霍氏肠杆菌进行清除，减少该菌对食品的污染；本发明涉及的噬菌体属于天然生物材料，基因组中不含任何毒力基因，没有毒副作用，可以作为食品及其储放设备、器皿、环境、原料固体表面等抑菌剂，用于食品及生产设施环境或保藏运输器具的除菌，降低霍氏肠杆菌传播和引发食源性疾病的风险。
附图说明
图1噬菌体YZU.P.A-5噬菌斑形态。
图2噬菌体YZU.P.A-5透射电镜图片。
图3噬菌体YZU.P.A-5全基因组序列特征。
图4噬菌体YZU.P.A-5对固体表面霍氏肠杆菌生物膜的抑制作用。图4A为SYZU.2-5与ATCC 700323混合菌液处理结果；图4B为SYZU.2-5菌液处理结果；图4C为ATCC 700323菌液处理结果。图中黑色柱状图(Control)表示未经噬菌体YZU.P.A-5处理的对照组；白色柱状图(Blank)为未加霍氏肠杆菌菌液的空白对照组；柱A-E分别为105、106、107、108、109PFU/mL浓度噬菌体YZU.P.A-5处理的试验组。
图5噬菌体YZU.P.A-5在培养基中对霍氏肠杆菌的抑制作用。图5A为SYZU.2-5与ATCC 700323混合菌液处理结果；图5B为SYZU.2-5菌液处理结果；图5C为ATCC 700323菌液处理结果。图中空心数据点(对照组)表示未加噬菌体YZU.P.A-5的霍氏肠杆菌接种物37℃恒温培养过程中OD值变化；实心数据点(试验组)为添加108PFU/mL、107PFU/mL、106PFU/mL、105PFU/mL噬菌体P.A-5处理的霍氏肠杆菌接种物在37℃恒温培养过程中OD值变化。
图6噬菌体YZU.P.A-5在肉汁模型中对霍氏肠杆菌的生长抑制作用。图6A为SYZU.2-5与ATCC 700323混合菌液处理结果；图6B为SYZU.2-5菌液处理结果；图6C为ATCC700323菌液处理结果。图中空心数据点表示未经噬菌体处理的肉汁在37℃恒温培养过程中OD值变化；实心数据点为106PFU/mL噬菌体YZU.P.A-5处理肉汁接种物的OD值变化。
图7噬菌体YZU.P.A-5在猪肉表面对霍氏肠杆菌的生长抑制作用。图7A为SYZU.2-5与ATCC 700323混合菌液处理结果；图7B为SYZU.2-5菌液处理结果；图7C为ATCC 700323菌液处理结果。图中空心数据点(对照组)表示未经噬菌体抑菌剂浸泡处理的猪肉接种物的活菌载量(Lg CFU/g)变化；实心数据点(试验组)为经过107PFU/mL的P.A-5噬菌体抑菌剂浸泡处理的猪肉接种物活菌载量变化。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明中的原料和试剂如无特殊说明，均为商业化市售。
本发明试验用噬菌体宿主菌霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei，菌株号：SYZU.2-5)，采用常规方法分离自腐败肉制品，由扬州大学食品科学与工程学院食品质量与安全实验室保藏，为一株野生型霍氏肠杆菌；霍氏肠杆菌菌株ATCC 700323购自北京百欧博伟生物技术有限公司。
实施例1
噬菌体分离及纯化制备
噬菌体分离
污水样品采自江苏扬州农贸市场。取30mL污水样品放入50mL离心管，5000×g离心10min，取5mL上清液加入到5mL LB液体培养基中，加入100μL对数生长期的霍氏肠杆菌菌株SYZU.2-5，37℃，100rpm摇床培养过夜；将试管中培养物转至无菌离心管中，4℃，5000×g离心10min，取上清过0.22μm滤膜，得到的噬菌体原液。
用SM缓冲液(1L：NaCl 5.8g，MgSO4.7H2O 2.0g，1M Tris-HCl(pH7.4)50mL)对噬菌体原液按体积比进行10倍梯度稀释，取100μL稀释后的噬菌体悬液与100μL对数生长期的霍氏肠杆菌在室温下混合10min，再加入5mL LB半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的LB固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在25℃恒温培养箱中培养。
在上述出现噬菌斑的双层平板上挑取透明单个空斑至1mL SM缓冲液中，混匀，4℃放置24h；次日用无菌的SM缓冲液对噬菌体液进行10倍梯度稀释(10-1-10-7)，分别取各稀释度的噬菌体液100μL与100μL对数生长期的霍氏肠杆菌在室温下混合10min，再加入5mL LB半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的LB固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在37℃恒温培养箱中培养。重复双层平板法的操作3次，得到的噬菌斑大小一致后，即认为分离到的是纯的噬菌体，挑取50个噬菌体空斑至1mL SM缓冲液中，混匀，4℃放置24h；于次日取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得噬菌体分离液，4℃保存备用。采用双层平板检测纯化噬菌体裂解效果。在5mL融化好的LB半固体培养基中加入50μL霍氏肠杆菌培养物(对数生长期的霍氏肠杆菌SYZU.2-5菌液)，立即倾倒在底层LB固体培养基上，在室温下放置10min，待培养基凝固后，在划分好的区域中分别滴加10μL各上述噬菌体分离液，在无菌操作台中吹干后将平板倒置于37℃培养箱中培养，筛选在菌株SYZU.2-5或者ATCC 700323平板上的裂解圈均明亮清澈的噬菌体，命名为YZU.P.A-5。
噬菌体的纯化制备
取100μL霍氏肠杆菌噬菌体YZU.P.A-5分离液(制备方法同上)与100μL对数期生长期的霍氏肠杆SYZU.2-5菌液混合，室温放置10min，然后加入10mL LB液体培养基，37℃，150rpm恒温振荡培养过夜；将培养物转至灭菌离心管，5000×g离心10min后收集上清，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌；收集噬菌体增殖液，加0.93g PEG 8000，0.58g NaCl，摇匀至溶解，4℃放置过夜；4℃条件下10000×g离心20min，去上清，加0.5mL SM[1L：NaCl 5.8g，MgSO4.7H2O 2.0g，1M Tris-HCl(pH7.4)50mL]溶液，室温作用1h；加入等体积氯仿抽提30s；3000×g离心15min，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，即为噬菌体纯化液；用双层平板检测噬菌体纯化液滴度，具体程序为：用SM缓冲液对噬菌体纯化液进行10倍梯度稀释(10-1-10-7)，取各稀释度的噬菌体稀释液100μL与100μL对数生长期的霍氏肠杆菌在室温下混合10min，再加入5mL LB半固体培养基，混匀，倾倒在LB固体培养基上，凝固后倒置放在37℃恒温培养箱中培养8h，对形成的空斑进行人工计数，计算滴度。同时用霍氏肠杆菌ATCC 700323(对数期)、ATCC 700323与SYZU.2-5的混合菌液(等体积对数期菌液混合)进行空斑计数并计算滴度。结果显示YZU.P.A-5纯化液对菌株SYZU.2-5和ATCC 700323的滴度均达到1012PFU/mL以上，而YZU.P.A-5纯化液与霍氏肠杆菌SYZU.2-5和ATCC 700323混合菌株(等体积对数期菌液混合)作用的平板上形成的噬菌斑明亮清澈、大小均一(如图1所示)，说明对二者的混合也有明显的抑制作用。
实施例2
噬菌体YZU.P.A-5特征分析
噬菌体形态特征
用透射电镜观察噬菌体微观形态特征。采用磷钨酸负染色法，将铜网有膜的一面朝上，取10μL实施例1中获得的YZU.P.A-5纯化液(1012PFU/mL)滴于铜网上，吸附15min后吸干水分，取出铜网，自然干燥2-3min。然后在铜网上滴加2％的磷钨酸(PTA)水溶液进行染色，2min后取下，用吸水纸吸干水分，空气中干燥5min，用透射电镜观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照分析。噬菌体YZU.P.A-5微观形态如图2所示，噬菌体YZU.P.A-5呈现头部对称，直径约为77.53nm，尾部长约72.24nm，具有伸缩性尾鞘，形态学特征归属肌尾噬菌体科。
噬菌体基因组特征
将上述制备的噬菌体YZU.P.A-5纯化液(1012PFU/mL)加DNase I至终浓度5μg/mL，RNase A至1μg/mL，37℃温育1h；加入EDTA(pH 8.0)至终浓度20mmol/L；加蛋白酶K至终浓度50μg/mL，加SDS至终浓度0.5％(mg/mL)，混匀，56℃孵育1h；加入等体积平衡酚(pH 8.0)振荡抽提，5000×g离心10min，收集上层水相；用等体积氯仿抽提，5000×g离心10min，收集上层水相；加入1/10体积3mol/L NaAc(pH 5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜；4℃，12000×g离心10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，沉淀在空气中干燥10min；用适量TE(pH 8.0)混悬沉淀，应用GeneQuant核酸定量仪进行噬菌体DNA定量，-20℃保存；提取获得的噬菌体DNA送至上海凌恩生物基因测序有限公司进行Illumina Hiseq测序。
噬菌体DNA测序结果(如图3所示)显示YZU.P.A-5基因组全长为159094bp，其中编码基因总长度分别为146583bp，平均长度为698bp，占总长的92.14％，GC含量分别为50.08％，含有210个开放阅读框(ORFs)，其中6个ORFs在数据库中无同源性基因，204个ORFs编码的蛋白具有同源性序列，其中包括149个假设蛋白(hypothetical protein)和55个已知蛋白功能的序列，同源性在41.1％至100％之间。比对结果显示GenBank数据库中无霍氏肠杆菌噬菌体全基因组序列及相关基因，表明YZU.P.A-5是一株新型噬菌体；同时，基因组分析结果显示YZU.P.A-5不存在任何已知的毒力基因。结合噬菌体的生理生化特征，初步鉴定为霍氏肠杆菌噬菌体，命名为霍氏肠杆菌噬菌体YZU.P.A-5(Enterobacter hormaecheiphage YZU.P.A-5)。将该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2020206；保藏日期：2020年6月15日。
实施例3
噬菌体YZU.P.A-5对霍氏肠杆菌生物被膜的抑制作用
取对数生长期的霍氏肠杆菌培养物(霍氏肠杆菌SYZU.2-5和ATCC 700323混合菌株，菌液等体积)，用LB培养基稀释，调节最终浓度约为1×107CFU/mL。试验分成P.A-5处理组，阴性对照组，空白组。YZU.P.A-5处理组：在96孔板中每孔加入150μL浓度为107CFU/mL霍氏肠杆菌稀释菌液(菌株SYZU.2-5和ATCC 700323等体积混合)和150μL噬菌体YZU.P.A-5悬液(将1012PFU/mL的YZU.P.A-5纯化液10倍稀释获得)(A处理中至噬菌体YZU.P.A-5为105PFU/mL、B处理为106PFU/mL、C处理为107PFU/mL、D处理为108PFU/mL、E处理为109PFU/mL)；阴性对照组：在无菌96孔板中每孔加入菌液(107CF·U/mL)和SM缓冲液各150μL；空白组：每孔加300μL LB培养基；37℃培养24h，取出96孔板，吸出悬浮菌液，用无菌PBS洗涤3次，充分除去浮游菌体；每孔加入200μL浓度为0.2％的结晶紫染色液，染色30min；吸出染色液，用PBS(pH7.4)清洗96孔板至洗出液呈无色，室温吹干；每孔加入200μL的33％醋酸脱色剂，振荡溶解，利用酶标仪测定600nm处的OD值，每组平行测定5次，取平均值用于分析。
实施结果如图4A所示，加入105PFU/mL、106PFU/mL、107PFU/mL、108PFU/mL、109PFU/mL P.A-5悬液的试验组(A、B、C、D、E处理组)的OD600nm均显著低于阴性对照组(p<0.001)，表明噬菌体YZU.P.A-5显著抑制了固体多孔板表面霍氏肠杆菌生物膜形成。
此外，按上述方法单独采用上述浓度1×107CFU/mL的霍氏肠杆菌SYZU.2-5和ATCC700323分别加入上述噬菌体YZU.P.A-5纯化液，验证抑制作用其结果分别如图4B和4C所示，表明噬菌体YZU.P.A-5均可以显著抑制固体多孔板表面两种霍氏肠杆菌生物膜形成。
实施例4
噬菌体YZU.P.A-5在培养基中的抑菌作用
将霍氏肠杆菌(菌株SYZU.2-5和ATCC 700323等体积混合)按107CFU/mL浓度接种到30mL LB液体培养基，P.A-5处理组中加入噬菌体YZU.P.A-5悬液至108PFU/mL、107PFU/mL、106PFU/mL、105PFU/mL，阴性对照组中加入等体积SM缓冲液(0PFU/mL)，经处理的接种物分别放置在37℃培养箱中恒温培养，每隔2h取样1mL，用分光光度计测量波长在600nm处的吸光值，每组设置3个平行，取平均值用于分析。
实施结果如图5A所示，随着培养时间延长，阴性对照组OD600nm快速增长，8h时达到0.29，而添加YZU.P.A-5处理组(108PFU/mL、107PFU/mL、106PFU/mL三个处理组)OD600nm在培养8h内始终保持在较低的水平(OD600<0.1)，表明本发明中YZU.P.A-5噬菌体在培养基中对霍氏肠杆菌生长起到显著抑制作用(P<0.001)。
此外，按上述方法单独采用上述浓度1×107CFU/mL的霍氏肠杆菌SYZU.2-5和ATCC700323分别加入上述噬菌体YZU.P.A-5纯化液，验证在培养基中的抑菌作用其结果分别如图5B和5C所示，表明噬菌体YZU.P.A-5在培养基中对两种霍氏肠杆菌生长起到显著抑制作用。
实施例5
噬菌体YZU.P.A-5肉汁中的抑菌作用
将新鲜猪肉切丁称重，按比例为2：1(33.3g/100mL)加水煮沸5min，用纱布过滤，取肉块重新添加等体积水，继续煮沸5min，取肉汁滤纸过滤，用NaOH调整pH为7，每升肉汁中加入40mg L-半胱氨酸和40mg L-甲硫氨酸，分装至锥形瓶中，121℃灭菌15min。将霍氏肠杆菌液(菌株SYZU.2-5和ATCC 700323等体积混合)按106CFU/mL终浓度接种到30mL肉汁中，YZU.P.A-5处理组加入30μL噬菌体YZU.P.A-5悬液(至109PFU/mL)，阴性对照组中加入30μLSM缓冲液(0PFU/mL)，接种物放置在37℃培养箱中恒温保藏8h，每隔2h取样1mL，用分光光度计测定波长600nm处的吸光值，每组设置3个平行，取平均值用于分析。
实施结果如图6A所示，在肉汁恒温保藏8h内，阴性对照组的OD600nm在4h内迅速上升至0.2左右，而噬菌体YZU.P.A-5(106PFU/mL，MOI为1)在8h以内均能将OD600nm控制在0.05以下，保藏终点的抑菌率达到85％，抑菌效果显著，结果显示本发明中YZU.P.A-5噬菌体在猪肉基质中对霍氏肠杆菌起到显著抑制作用(P<0.01)。
此外，按上述方法单独采用上述浓度1×106CFU/mL的霍氏肠杆菌SYZU.2-5和ATCC700323分别加入肉汁中再加入上述噬菌体YZU.P.A-5纯化液，验证在肉汁中的抑菌作用其结果分别如图6B和6C所示，表明噬菌体YZU.P.A-5在猪肉基质中对两种霍氏肠杆菌均能起到显著抑制作用。
实施例6
噬菌体YZU.P.A-5在肉片贮藏过程中的抑菌作用
新鲜猪肉切成2cm×2cm×1cm肉片，用次氯酸钠浸泡15min，无菌水漂洗5遍，捞出沥干；用霍氏肠杆菌菌株悬液(107CFU/mL)浸泡10min，捞出沥干；阴性对照组用SM缓冲液(0PFU/mL)浸泡10min；YZU.P.A-5处理组用噬菌体YZU.P.A-5悬液(107PFU/mL)浸泡10min，捞出沥干，装入聚乙烯薄膜袋中，置于25℃下恒温贮藏。于0h、2h、4h、6h、8h采集样品，匀浆，应用稀释平板涂布法测定细菌总数(CFU/g)，每组测定3个平行，取平均数分析YZU.P.A-5在生猪肉表面的抑菌作用。
实施结果如图7A所示，贮藏初期阴性对照组和YZU.P.A-5处理组细菌总数分别为4.47Lg CFU/g和4.26Lg CFU/g，随着贮藏时间增加，YZU.P.A-5处理组肉片细菌总数在整个贮藏期始终显著低于对照组，第8h时比对照组减少4.05Lg CFU/g，表明本发明中YZU.P.A-5噬菌体处理对生猪肉表面霍氏肠杆菌生长具有显著的抑制作用。
此外，按上述方法单独采用上述浓度1×107CFU/mL的霍氏肠杆菌SYZU.2-5和ATCC700323分别浸泡猪肉再用上述噬菌体YZU.P.A-5纯化液浸泡，验证在在肉片贮藏过程中的抑菌作用其结果分别如图7B和7C所示表明本发明中YZU.P.A-5噬菌体处理对生猪肉表面各种霍氏肠杆菌生长具有显著的抑制作用。

Claims (6)

1.一种霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）噬菌体YZU.P.A-5，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年6月15日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020206。
2.权利要求1所述的噬菌体YZU.P.A-5在抑制食品生产环境与设施中霍氏肠杆菌中的应用。
3.权利要求1所述的噬菌体YZU.P.A-5在制备霍氏肠杆菌抑菌剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂以噬菌体YZU.P.A-5作为抑菌剂成分。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂用于清除食品及生产设施、环境、保藏运输器具中的霍氏肠杆菌及其生物膜污染。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂的制备方法为：将噬菌体YZU.P.A-5与对数生长期的霍氏肠杆菌混合，室温放置，然后加到LB液体培养基，恒温振荡过夜培养；将培养物转至灭菌离心管，离心收集上清液，过滤，收集噬菌体增殖液，加PEG8000和NaCl，摇匀至溶解，过夜；离心去上清液；加SM缓冲液，室温反应；使用氯仿抽提；离心回收含YZU.P.A-5颗粒的亲水相，将获得的YZU.P.A-5颗粒与SM缓冲液混合，制成噬菌体抑菌剂母液。
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