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CN112262855A - 一种防治烟草青枯病的方法及NaHS在防治烟草青枯病菌中的应用 - Google Patents

一种防治烟草青枯病的方法及NaHS在防治烟草青枯病菌中的应用 Download PDF

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CN112262855A CN202011171734.8A CN202011171734A CN112262855A CN 112262855 A CN112262855 A CN 112262855A CN 202011171734 A CN202011171734 A CN 202011171734A CN 112262855 A CN112262855 A CN 112262855A
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赵婉
杨锦鹏
饶雄飞
陈守文
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Abstract

本发明属于植物病害防治技术领域，尤其涉及一种防治烟草青枯病的方法及NaHS在防治烟草青枯病菌中的应用。本发明通过平板和摇瓶实验对烟草青枯雷尔氏菌生长效果进行测定，发现NaHS对青枯病病原菌的生长具有抑制效果；检测不同浓度NaHS对烟草青枯病发病率的影响，结果也说明了NaHS对烟草抗青枯病具有良好作用。本发明还从青枯菌在烟草根部定殖情况、烟草抗青枯病相关基因表达以及土壤微生态的研究各个方面证实了NaHS对烟草青枯病菌的抑菌效果。本发明首次发现并证明了NaHS是抗青枯病原菌的有效抑菌物质，为烟草青枯病的防治提供了新方法，为H2S开发利用及推进烟草青枯病的防治提供理论和实践依据。

Description

一种防治烟草青枯病的方法及NaHS在防治烟草青枯病菌中的 应用
技术领域
本发明属于植物病害防治技术领域，尤其涉及一种防治烟草青枯病的方法及NaHS在防 治烟草青枯病菌中的应用。
背景技术
青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种重要的土传病原菌，具有广泛的寄主范 围，可侵染50多科450余种植物，给许多农作物及经济作物生产造成了严重损失。其引起 的烟草青枯病是限制我国烟草生产的主要病害之一，每年给烟草行业带来巨大的经济损失。 目前，烟草青枯病在我国长江流域及其以南的植烟区普遍发生流行，造成严重危害。2008年 我国16个省烟草病虫害调研发现：青枯病的为害面积达5万hm2，造成减产约763.93万kg， 经济损失高达11522.15万元。田间烟株一旦感染青枯病，伴随高温高湿的发病有利条件，病 株就会迅速发病萎蔫死亡。
为控制青枯病已经进行了大量的艰苦工作。以往的研究主要集中在运用种植制度和有机 肥料等手段防治烟草青枯病，但目前，世界范围内尚无特效方法可以对烟草青枯病进行治疗。
硫化氢(hydrogen sulfide H2S)作为一种无色易燃有臭鸡蛋气味的气体，长久以来都被认为 危害动植物生长和发育，但近来研究表明，其H2S才被证实是生物体内继NO和CO后另一 种新型内源性气体信号分子。在人和动物体内，H2S参与了血管舒张，降血压、介导炎症过 程、保护细胞以及对心血管的保护作用等生理和病理过程，尽管H2S在植物体内的生物学作 用已有一些报道，但相对于其在动物体内作用的认识程度而言，关于H2S调控植物生长发育 机理的认识还远不够清楚。已有的研究指出，作为气体信号分子，H2S参与了植物生长发育 的多个方面，及对外界逆境的抵御反应，包括H2S影响植物悬浮细胞活性、气孔开度、侧根 萌发以及植物抗逆等反应。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种防治烟草青枯病的方法及NaHS在防治烟 草青枯病菌中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部 分问题。
本发明是这样实现的，一种防治烟草青枯病的方法，包括向培养基质中添加NaHS。
本发明还提供了NaHS在防治烟草青枯病菌中的应用。
本发明还提供了NaHS在制备青枯病菌的抑菌试剂中的应用。
本发明还提供了NaHS在调控烟草抗青枯菌相关基因的转录量中的应用。
进一步地，所述抗青枯菌相关基因包括NtACC Oxidase、NtPR 1a/c、E3ligase和Thaumatin 中的至少一种。
本发明还提供了NaHS在调控土壤中细菌和/或真菌多样性中的应用。
进一步地，NaHS提高烟草根际土壤微生物中细菌门中的疣微菌门、拟杆菌门和厚壁菌 门和真菌门中的担子菌门、壶菌门的青枯拮抗菌丰富度。
进一步地，NaHS降低细菌门中的酸杆菌门和真菌门中的子囊菌门的烟草有害菌丰富度。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
应用气体信号分子H2S或其供体防治烟草青枯病的研究尚未见报道。因此，开展H2S增 强烟草抗病生产实践的研究将有助于进一步了解这种新型气体信号分子的作用范畴，以期为 H2S开发利用及推进烟草青枯病的防治提供理论和实践依据。本发明首次发现并证明了H2S 外源添加剂NaHS是抗青枯病原菌的有效抑菌物质，为烟草青枯病的防治提供了新方法。
附图说明
图1是不同浓度NaHS对烟草青枯病原菌的抑制作用((a:不同浓度的NaHS对烟草青枯 病原菌平板生长的抑制作用；1：200mg/L；2：400mg/L；3：0mg/L；4：600mg/L；5：800 mg/L；b:不同浓度的NaHS对烟草青枯病原菌生物量的影响)；
图2是不同浓度NaHS对青枯菌在烟草根部定殖的实验结果(a:烟草根部青枯雷尔氏菌 的鉴定，b:不同浓度NaHS对青枯菌在烟草根部定殖的影响)；
图3是不同浓度NaHS对烟草抗青枯病相关基因表达的影响；
图4是不同浓度NaHS对烟草土壤微生态的影响实验结果；
图5是不同浓度NaHS对烟草土壤微生态的影响Simpson指数图；
图6是不同浓度NaHS对土壤微生物门水平上相对丰度分析；
图7是不同浓度NaHS对土壤功能性属水平上优势微生物组成分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进 一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。 此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述 进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于 所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发 明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各 种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比 的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特 别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试 图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字 和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选 为5％以内。
本发明披露了一种防治烟草青枯病的方法及NaHS在防治烟草青枯病菌中的应用，具体 如下实施例所示。
实施例
1、本发明中涉及的烟苗的培育：供试烤烟品种为云烟87，由湖北省烟草公司提供种子。 播种：在育苗盘内，每个穴盘播2～3粒。培育条件：室温昼夜控制在28±2℃，相对湿度控 制在80％以上。
试验菌株：烟草青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)为本研究团队保藏。
NA培养基：牛肉膏3g，酵母粉1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，加蒸馏水定容至1000mL。
MS培养基：
Figure BDA0002747500150000031
Figure BDA0002747500150000041
2、抑制烟草青枯雷尔氏菌生长效果测定
试验共设置5个处理，即NaHS浓度分别为0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L和800mg/L。
平板对峙法：
将灭菌的NA固体培养基加热溶化完全，冷却至55℃左右，倒入培养皿内，每皿15mL， 凝固后备用。将浓度为1.0x108 CFU/mL的烟草青枯病菌菌悬液用涂布棒均匀涂在平板表面， 采用打孔法，在直径为90mm的NA培养基上打出4个直径为5mm的孔，在孔内分别加入 50μL不同浓度NaHS溶液。待风干后将平板放置于37℃培养箱中，12h后检查抑菌效果，并用十字交叉法测量抑菌圈直径，记录抑菌圈大小。
摇瓶培养法：
在规格为250mL容量的三角瓶内加入30mL NA培养基，灭菌后接种浓度为1.0x108CFU/mL的烟草青枯病菌菌悬液600μL，同时并加入1mL不同浓度的NaHS溶液，在37℃、 230r/m摇床震荡培养12h，发酵液离心稀释后测定菌体生物量OD600值。
实验结果：
为了探究NaHS是否对烟草青枯病原菌生长具有抑制效果，本实施例在5个处理组(CK、 N200、N400、N600和N800)中研究其对烟草青枯病原菌生长的影响。在烟草青枯病原菌平 板抑菌试验中，发现N200－N800产生的抑菌圈直径依次为11.20±0.72、14.61±0.93、19.43±0.41、21.21±1.22mm。该结果证明了NaHS对烟草青枯病原菌HF-1-1的生长具有抑制 效果，且NaHS对青枯病病原菌的抑制效果随着其浓度的增加而增加，当外源添加NaHS的浓度为800mg/L时，其对HF-1-1的抑菌作用最为显著(图1a、表1)。除此之外，在HF-1-1 进行液体培养时，通过添加不同浓度的NaHS(0、200、400、600、800mg/L)，发现青枯 病病原菌HF-1-1的生物量随着其浓度的增加而递减，从而进一步证实了NaHS对青枯病病原 菌的生长具有抑制效果(图1b)。同时，该结果也首次表明了NaHS是一种抗青枯病原菌的 有效抑菌物质。
表1.不同浓度NaHS对烟草青枯病原菌平板生长的抑制圈直径
Figure BDA0002747500150000051
3、青枯雷尔氏菌在烟草根部生长测定
采用MS培养基水培的方法，于组培瓶中加入50mL 1/2MS液体培养基，将三叶一心的 烟苗根部的基质洗净后，用海绵将烟苗固定，使根浸泡在培养基中，每天加入适量的培养基， 3d替换一次培养液，培养3d后，分别加入10mL 0.8mmol羟胺作为H2S抑制剂处理；浓度分 别为200mg/L、400mg/L、600mg/L和800mg/L的NaHS溶液作为H2S外源供体，10ml水 作为对照，试验共设置6个处理。将在MS培养基长至四叶一心的不同处理的烟草灌根接种 浓度为l.0x 108CFU/mL的青枯雷尔氏菌菌悬液10mL。分别于接菌12h、24h和36h时， 去除地上部分，用无菌水洗净并用吸水纸吸干根表水分，称重记录。烟根用75％乙醇浸泡15 min后用蒸馏水冲洗5-6次，吸干水分后放于灭菌的研钵中，加入5mL无菌水充分研磨，静 置5min后吸取上清液1mL,即为烟株根内菌悬浮液。对根内菌悬浮液进行10倍梯度稀释,取 适宜浓度的悬浮液100μL均匀涂布于固体TTC平板上，置于37℃条件下培养12h后进行 菌种鉴定及菌落计数，计算单位重量下烟草根部的青枯菌含量。试验设三次重复。
实验结果：
首先，对烟草植株进行不同浓度的NaHS(0、200、400、600、800mg/L)和H2S抑制 剂处理。然后，对6个处理组(CK、N-、N200、N400、N600和N800)的烟草植株接青枯 菌并培养。接着，对早期培养的烟草根部细菌进行鉴定，通过青枯雷尔氏菌16S RNA特征引 物进行PCR验证(方法见下文)，发现烟草根部细菌含有青枯雷尔氏菌(图2a)。最后，对 青枯雷尔氏菌在烟草根部定殖情况进行测定和统计。结果显示在接菌12h时，CK－N800处 理的根部含青枯雷尔氏菌量分别为1.36x104CFU/g、1.38x104CFU/g、1.36x104CFU/g、1.39 x104CFU/g、1.40x104CFU/g、1.37x104CFU/g，不同处理样之间无显著性差异。而接菌24h 和36h时，虽然烟草根部的青枯雷尔氏菌含量都增加，但与CK和N-处理组相比，N200－N800 处理的烟草根部青枯雷尔氏菌的含量相对较低，且随着NaHS浓度的提高，青枯雷尔氏菌在 烟草根部定殖的数量逐渐降低。其中，添加800mg/L的NaHS效果最为显著，相比于对照组， 其36h时使青枯雷尔氏菌在烟草根部定殖的数量下降98.32％(图2b)。综上，这些结果表 明，外源添加NaHS能有效地抑制青枯雷尔氏菌的生长，进而显著地抑制青枯雷尔氏菌在烟 草根部的定殖，从而大大地降低了青枯雷尔氏菌对烟草的致病率。
4、青枯雷尔氏菌的鉴定
特异性引物鉴定青枯菌：
采用青枯菌特异性引物759/760进行PCR扩增，引物由武汉擎科创新生物科技有限公司 合成，引物序列为：759：5'-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3'，SEQ ID NO.1，760： 5'-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3'，SEQ ID NO.2。PCR扩增采用25μL反应体系， 反应液包括10×PCR Buffer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTP 1μL，5U Taq酶0.2μL， 25μmol/L的引物759和760各1μL，模板DNA 50ng，ddH2O补足25μL，在美国Bio-Rad 公司的mycycler@PCR扩增仪上扩增。
PCR反应程序为：第一步，95℃预变性2min；第二步，94℃变性20s，68℃退火20 s，72℃延伸30s，共30个循环；第三步，72℃延伸10min。取5μLPCR产物于2％的琼 脂糖凝胶中电泳，电压5V/cm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果，根据PCR扩增结果中条 带有无来确定菌株是否为青枯菌。
青枯菌16S rRNA序列分析：
从所有分离菌株中随机选取5个菌株进行16S rRNA序列分析。采用细菌16S rRNA通用 引物27f和1492r进行PCR扩增，引物序列如下：27f：5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'，SEQ ID NO.3，1492r：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ ID NO.4。
PCR扩增采用50μL反应体系，反应液包括10×PCR Buffer 5μL，25mM MgCl2 4μL，2.5mM dNTP 2μL，5U Taq酶0.4μL，25μmol/L的引物27f和1492r各2μL，模板DNA 50ng，ddH2O补足50μL，在美国Bio-Rad公司的mycycler@PCR扩增仪上扩增。
PCR反应程序为：第一步，96℃预变性5min；第二步，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，共30个循环；第三步，72℃延伸10min。PCR扩增产物回收后交 由武汉擎科创新生物科技有限公司测序，将测序所得序列在NCBI中进行BLAST同源性搜索 与比较。
5、烟草青枯病发生情况统计分析：
在烟苗移栽7d后接种青枯病病原菌，65d后根据行业标准GB/T23222-2008烟草病虫害 分级及调查方法[国家烟草专卖局.GB/T23222--2008烟草病虫害分级调查方法[S].北京:中国 标准出版社,2008.]，以株为单位对各处理烟草青枯病发生情况进行了调查与分析。
烟草青枯病分级标准：
0级:全株无病；
1级:茎部偶有褪绿斑，或病侧二分之一以下叶片凋萎；
3级:茎部有黑色条斑，但不超过茎高二分之一，或病侧二分之一至三分之二叶片凋萎；
5级:茎部黑色条斑超过茎高二分之一，但未到达茎顶部，或病侧三分之二以上的叶片凋 萎；
7级:茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎；
9级:病株基本枯死。
统计分析：统计各处理的发病率、病情指数和相对防效，结果用SPSS 18.0软件统计分 析。病情指数及防治效果计算公式：
Figure BDA0002747500150000071
Figure BDA0002747500150000072
Figure BDA0002747500150000073
实验结果：
为了探究外源添加NaHS对烟草青枯病发病率的影响，本实施例选择外源添加5种不同 浓度的NaHS(0、200、400、600、800mg/L)对烟草种苗进行处理，并将5个处理组分别 命名为CK、N200、N400、N600和N800。然后，在烟苗移栽7d后接种青枯病病原菌。最 后，65d后对不同浓度的NaHS处理组的烟草青枯病发生情况进行了统计与分析(表2)。 发现不同浓度的NaHS处理的烟草植株发病率和病情指数均显著低于对照组，且随着NaHS 浓度的增加，发病率和病情指数逐渐降低。此外，依据病情指数，计算了各处理组的防效， 发现以N800处理的相对防效最高，为89.50％，其次为N600的处理(82.99％)。该结果说 明了NaHS对烟草抗青枯病具有良好作用，同时，也表明NaHS可明显提高烟草土传病害的 防控效果。
表2.不同浓度NaHS对烟草青枯病发病率和病情指数的影响
Figure BDA0002747500150000074
Figure BDA0002747500150000081
6、烟草抗青枯病基因的转录水平测定
基于RT-PCR技术，探究在不同浓度NaHS处理下烟草被青枯菌侵染后抗性基因的响应 程度。选用基于烟草抗青枯病转录组测序筛选出的4个特异性抗病基因：NtACCOxidase、 NtPR 1a/c、E3ligase和Thaumatin，对相关基因的表达量进行统计分析。
在接菌后1d取样，6个处理每次取3株，每株烟选择同一部位的根0.1g迅速转至1.5mL RNase-free离心管，液氮冷冻后置-80℃保存，采用Trizol法提取植物组织总RNA。每个样 品中1μL总RNA用于反转录，反转录反应按试剂盒(iScript TM cDNA SynthesisKit)说明 书操作，产物cDNA置于－80℃保存备用。试验所用引物(见表3)：
Figure BDA0002747500150000082
基于烟草抗青枯病转录组测序筛选出的特异性抗病基因，其中UBI3基因作为内参基因。 PCR扩增：反应体系为20μL，其中10μL SYBR，上下游引物各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。将样品在管内混匀后分装入96孔PCR板中，放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR 扩增，反应程序为：95℃预变性3min；循环条件为95℃10s，54℃20s，共40个循环。
实验结果：
不同浓度NaHS对烟草抗青枯病相关基因表达的影响
本实施例选用了基于烟草抗青枯病转录组测序筛选出的4个特异性抗病基因：NtACC Oxidase、NtPR 1a/c、E3ligase和Thaumatin作为研究对象。然后，对6个处理组(N-、CK、 N200、N400、N600和N800)处理的烟草组样品进行RT-qPCR，并对上述4个基因的转录量进行统计和分析。
结果发现，和CK组相比，N200－N800处理的烟草植株体内4个抗性相关基因的转录表 达量均有提高，其中乙烯途径相关基因NtACC Oxidase分别提高了1.59、3.83、15.83和22.99 倍。而水杨酸途径相关基因NtPRla/c相对表达水平分别上调了1.42、2.16、3.86和148.84倍。 同时，我们发现N800处理的E3泛素连接酶相关基因E3ligase的转录上调520.87倍，而对 其余三个基因的上调幅度也效果显著，说明800mg/L NaHS处理条件下烟草的抗性最强，此 时最适应烟苗的生长，可提高烟株的抗性(图3)。该结果与上述实验结果相一致，表明了 外源添加NaHS可上调烟草植株体内的与抗青枯菌相关基因的转录量，从而提高了烟草对青 枯菌的抗性，进而大大降低了青枯菌对烟草的致病率。
7、烟株根际土壤样品采集
2018年时，于烟株移栽后100d采集各处理烟株根际土壤样品。每个小区采集5株烟株 的根际土壤，混合为一个样品。共计15个土样。土样混匀后，剔除石粒和植物残茬等杂物， 将土壤样品置于干冰中带回实验室。回实验室后于-80℃冰箱保存，用于DNA提取。
8、土壤微生物群落多样性分析
8.1、DNA提取及PCR扩增
根据FastDNA Spin Kit试剂盒(MP Biomedicals,USA)提取土壤总DNA。分别用515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，SEQ ID NO.5)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，SEQ ID NO.6)引物对细菌16S rDNA V4可变区进 行PCR扩增；用ITS5-1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，SEQ ID NO.7)和 ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′，SEQ ID NO.8)引物对真菌ITS1区进行 PCR扩增。扩增体系为30μL，包括15μL PhusionMaster Mix Buffer(2×)，3μL引物(2μM)， 10μL DNA(1ng/μL)模板，2μL H2O。反应程序为：98℃1min；98℃10s，50℃30s， 72℃30s(30个循环)；72℃5min(Bio-rad T100梯度PCR仪)。PCR产物经2％浓度的 琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行文库构建，使用Illumina HiseqPE250测序平台进行上机测 序(诺禾致源生物信息科技有限公司)。
8.2、数据分析
对下机的数据进行拼接，得到原始Tags数据(Raw Tags)，经严格过滤和去除嵌合体序 列后得到Effective Tags，即用于后续分析的有效数据。利用Uparse软件(Uparsev7.0.1001) 对所有样品的Effective Tags进行聚类，以97％的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs (Operational Taxonomic Units)。对OTUs代表序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA (http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库进行细菌物种注释分析，获得各分类水平上的 群落组成；用Qiime软件(Version 1.9.1)中的blast方法与Unit数据库进行真菌物种注释分 析(设定阈值为E-value＝10-5)，获得各分类水平上的群落组成。
8.3、数据处理
利用mothur软件做rarefaction分析，利用perl语言工具绘制稀释曲线图。利用Mothur 软件计算Sobs和Chao1丰富度指数、Shannon多样性指数，测序深度用覆盖率(Coverage) 表示。根据样品在属水平的物种注释及丰度信息，对其丰度进行标准化处理，以得到的Z值 采用HemI软件绘制heatmap图。其中，Z值为样品在该分类上的相对丰度和所有样品在该分 类的平均相对丰度的差除以所有样品在该分类上的标准差所得到的值。基于门和属分类水平 各物种的相对丰度，采用SPSS22.0软件中的One-way Anova进行方差分析，以反映各处理 间的差异，当P<0.05时认为差异达到显著水平。
实验结果：
1)不同浓度NaHS对土壤中细菌与真菌多样性影响
本实施例探究了不同浓度NaHS对烟草土壤微生态的影响。首先，我们分析了不同浓度 NaHS对烟草土壤中细菌和真菌多样性影响，在5个处理组(CK、N200、N400、N600和N800) 处理的烟草土壤样本中，分别鉴定出4201个真菌OTUs(operational taxonomicunits,based on 99.5％identity)和8204个细菌OTUs(图4)。然后，对各处理组(CK、N200、N400、N600、 N800)土壤样本的细菌和真菌群落多样性和丰富度进行了单因素方差分析。结果发现，土壤 细菌群落Observed species、Shannon、Ace、Simpson和Chao 1指数在各处理组间均存在显著 差异，其中N400－N800的各处理组Observed species、Shannon、Ace和Chao 1四项指数均 显著低于对照，降低幅度以N600最明显，其次为N800；此外，Simpson指数则表现为只有 N600与对照CK存在显著差异，N200和N400与对照间不存在显著差异，N800与对照差异 不显著(图5中的第一排附图)。而土壤真菌群落Observed species、Shannon、Ace和Simpson 指数均以N400显著低于其它处理组，并与对照组存在显著性差异；较其它处理组分别低 22.08～74.69％、51.72～76.66％、11.86～96.17％和21.40～31.49％。而Chao 1指数则表现为N600 低于其他处理组，N400、N600与对照组CK存在显著性差异，但N400与N600之间变化量 为1.61％，无显著性差异。综上，该结果表明施用NaHS对烟株根际土壤细菌、真菌群落的 多样性和丰富度具有一定的影响，且其根据NaHS施加浓度的不同呈现出差异。其中，NaHS 施用浓度为400mg/L(N400)对土壤中的真菌群落的多样性指数影响最大，而施用浓度为600 mg/L(N400)对土壤中的细菌群落影响最为明显。(图5中的第二排附图)
2)土壤微生物门水平上相对丰度分析
基于以上结果，接下来我们在门水平上，对5个处理组(CK、N200、N400、N600、N800)的烟草根际土壤相对丰度排名前10位生物进行了统计和分析。结果发现，在细菌门中，各处理组之间变形菌门(Proteobacteria)丰度最高，占40.26～50.68％；而其它细菌门分别为疣微 菌门(Verrucomicrobia，3.34～16.23％)、拟杆菌门(Bacteroidetes，6.11～12.49％)、厚壁菌门 (Firmicutes，2.11～13.93％)、蓝细菌门(Cyanobacteria，1.08～5.90％)、芽单胞菌门 (Gemmatimonadetes，3.52～6.91％)、酸杆菌门(Acidobacteria，3.24～6.20％)、放线菌门 (Actinobacteria，2.10～5.23％)、螺旋体门(Saccharibacteria，1.22～2.35％)、绿弯菌门(Chloroflexi， 1.12～3.21％)，这10个细菌门的相对丰度共占94.38～97.17％。另外，在这10个细菌门中， 疣微菌门、拟杆菌门和厚壁菌门与对照相比，相对丰度在各处理间存在显著差异。其中，芽 单胞菌门在N200～N800处理组中的相对丰度均有所增加，增加幅度为6.57％～96.10％；在N600 处理中，疣微菌门和拟杆菌门的相对丰度均有所增加，增加幅度分别为223.77％和45.43％； 而在N400处理中，厚壁菌门相对丰度显著高于其他处理，增加幅度为220.69～558.21％，其 它组间，CK与N800无显著性差异，但与N200～N600存在显著差异(图6中的左侧附图)。 当在真菌门中，各处理组中子囊菌门(Ascomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌 门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和新丽鞭毛菌 门(Neocallimastigomycota)分别占33.56～73.48％、6.83～60.25％、0.09～10.66％、3.31～18.47％、 0.03～1.42％和0.00～0.10％。担子菌门与球囊菌门的相对丰度在各处理间存在差异，另外，担 子菌门在N200、N400和N600处理中的相对丰度与对照相比存在显著性差异，其变化分别 是51.22％、268.72％和53.05％。而在壶菌门中，N400与N600显著性高于对照组，增加幅度 为504.13％,和202.18％；然而，在子囊菌门中，N400处理明显低于对照组，降低幅度为54.43％； 而接合菌门中，各处理与对照不存在显著差异(图6中的右侧附图)。根据该结果，我们猜 测NaHS提高烟草抗青枯菌能力的原因之一，是其不仅提高了烟草根际土壤微生物中细菌门 中的疣微菌门、拟杆菌门和厚壁菌门和真菌门中的担子菌门、壶菌门的青枯拮抗菌丰富度， 而且降低了细菌门中的酸杆菌门和真菌门中的子囊菌门的烟草有害菌丰富度，进而改善了烟 草的生长环境，以使其青枯菌发病率大大降低。
3)功能性属水平上优势微生物组成分析
随后，我们就深入对烟草根际土壤中一些具有促进烟草植株生长和与拮抗青枯菌有关的 35种细菌功能性微生物和35种真菌功能性微生物的相对丰度进行了分析，绘制了Heatmap 图以分析不同处理中这些细菌微生物(图7中的左侧附图)和真菌微生物(图7中的右侧附 图)的丰度变化情况。结果发现，细菌功能性微生物中，N600和N800处理组中具有相似的 丰度组成，聚为一类，其中分别有13种和17种功能性微生物在N600和N800处理中具有较 高的相对丰度；而N200处理组自成一类，其中，Rhodobacter、Scytonema、Microcoleus、Streptomyces等7种微生物具有较高的相对丰度；且Massillia、Aeromonas、Azospirillum、Bacillus四种微生物丰度明显高于同组其他功能性微生物，对照组中有5种功能性微生物具有 较高的相对丰度(图7中的左侧附图)。而真菌微生物中，N400自成一类，只有Monographella 一种微生物相对丰度明显高于其他微生物。N200与N800丰度组成相似，Monoblepharis、 Orbilia等6种真菌微生物丰度较高，但各自又有其特有的丰度较高的微生物，Thielaviopsis、 Olpidiaster等4种微生物在N200处理组具有较高丰度，Tomentella、Pseudocamarosporium等 3种真菌微生物在N800处理组中丰度较高。N600组中Fusicolla、engyodontium等6种真菌 微生物物种丰度较高，但与其他组相似性较低(图7中的右侧附图)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省烟草研究院
湖北大学
<120> 一种防治烟草青枯病的方法及NaHS在防治烟草青枯病菌中的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgccgtca actcactttc c 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgccgtca gcaatgcgga atcg 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tacggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgccagcmg ccgcggtaa 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggactachvg ggtwtctaat 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctgcgttct tcatcgatgc 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacaaaggga cattacaaga agt 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagaaggatt atgccaccag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aacctttgac ctgggacgac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcacatccaa cacgaaccga 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttctcggagc ctcttatg 18
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccctcttccc accttgc 17
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcacccgtgg tattagg 17
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gttcctgtag gacaagca 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gccgactaca acatccagaa gg 22
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgcaacacag cgagcttaac c 21

Claims (8)

1.一种防治烟草青枯病的方法，其特征在于：包括向培养基质中添加NaHS。
2.NaHS在防治烟草青枯病菌中的应用。
3.NaHS在制备青枯病菌的抑菌试剂中的应用。
4.NaHS在调控烟草抗青枯菌相关基因的转录量中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗青枯菌相关基因包括NtACCOxidase、NtPR 1a/c、E3ligase和Thaumatin中的至少一种。
6.NaHS在调控土壤中细菌和/或真菌多样性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：NaHS提高烟草根际土壤微生物中细菌门中的疣微菌门、拟杆菌门和厚壁菌门和真菌门中的担子菌门、壶菌门的青枯拮抗菌丰富度。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：NaHS降低细菌门中的酸杆菌门和真菌门中的子囊菌门的烟草有害菌丰富度。
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