CN112362765B - 一种多塞平及其代谢产物n-去甲多塞平固相萃取、检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多塞平及其代谢产物N‑去甲多塞平固相萃取、检测方法及试剂盒，包括以下步骤：取待测样本，经过酸性稀释剂稀释后，转移至活化后的固相萃取柱上，再依次经过碱性淋洗液、甲醇水淋洗液I和甲醇水淋洗液II淋洗、压干后，加入洗脱液洗脱，收集洗脱后的液相部分。该方法操作简单，大大提高萃取效率，无需使用复杂溶剂，不会造成二次污染；通过本发明方案的萃取方法，实现了多塞平及N‑去甲多塞平的高效回收，在单次实验中可实现多塞平、N‑去甲多塞平的定量下限分别为4pg·mL^‑1、2pg·mL^‑1，可满足低于10pg·mL^‑1的血药浓度含量测定，定量灵敏度显著优于目前的ng·mL^‑1级别定量下限。

Description

一种多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取、检测方法 及试剂盒

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取、检测方法及试剂盒。

背景技术

多塞平(Doxepin)是一种三环类抗抑郁症药物，用于治疗严重抑郁、焦虑症、失眠、强迫症等精神疾病。盐酸多塞平片治疗以睡眠维持困难为特征的失眠，于2010年3月在美国上市，商品名“Silenor”。它显示出有效的中枢抗胆碱能活性，并抑制去甲肾上腺素和5-羟色胺对的再摄取。临床应用表明，低剂量的多塞平即对H1受体有高选择性，同时，多塞平从胃肠道迅速吸收，通过细胞色素P450酶2C19的去甲基化作用，成为活性代谢物N-去甲基多塞平(Desmethyldoxepin)，二者的药理和毒理特性相当。其他无活性代谢产物包括2-羟基多塞平，2-羟基脱氧多塞平，多塞平-N-氧化物。

多塞平和去甲多塞平广泛分布在体内，血浆蛋白结合率约80％。多塞平的血浆生命周期从8到24h，去甲多塞平的半衰期则超过30h。由于活性代谢产物的药代动力学个体差异较大，因此，对多塞平开展血药浓度定量监测是必须的。

当前主要以单一检测多塞平为主，检测技术涉及高效液相色谱(HPLC)或液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)。这是由于目前的方法同时检测2种物质的检测灵敏度远远不够，尤其是定量下限的灵敏度，通常在0.25～100ng·mL^-1，如Ursula Geister^[1]同步检测多塞平和去甲多塞平，各自的定量范围10～20ng·mL^-1，3-10ng·mL^-1。此外，这些分析方法在检测多塞平的同时，还检测另外的抗抑郁和抗精神病药物，若分子量接近或有旋光异构体的话，可能存在相互干扰的不足。同时检测2种物质，如何保证方法的特异性，比如LC-MS/MS中的母子离子对选择，以及标准品配制时是分别配制多塞平、去甲多塞平，还是同步配制等。目前尚未有统一的临床评价方法指南，因此，亟待进一步研究。

现有技术中，在样品前处理阶段，结合多塞平和去甲多塞平的亲脂性，多采用液液萃取的方式为主，通常需要利用戊烷、异丙醇、正丁醇、己烷、乙醚-乙酸乙酯等多种形式的混合物作为萃取液。如NiravP.Patel^[2]等采用液液萃取方式，获得的2种物质的回收率约62％～78％，基本低于80％的回收率，表明在处理多塞平及其代谢物时的液相萃取前处理明显影响提取效率。该萃取方式不仅所需样本量大，难以适用于脑脊液、全血及药代动力学检测样本等，而且其使用的有机溶剂量较大，容易对环境造成污染；此外，检测结果显示萃取过程中易将具有类似结构的化学物质一同萃取出来，导致背景干扰高，同时蛋白沉淀法还存在待测物经数倍稀释剂稀释后，低于质谱检测灵敏度等缺陷。龚飞君等^[3]公开了一种利用固相萃取(SPE)-液相色谱-串联质谱法测定全血中多塞平的方法，具体公开了利用含有混合型阳离子交换反相吸附剂的萃取柱对碱性化合物具有较高选择性和灵敏度，实现全血中多塞平的检测，其实际获得的提取回收率约为78～82％，但其同样仅能单一的实现多塞平的检测且定量范围仅达5～1000ng·mL^-1，而人体药动学参数表明：口服多塞平3mg，多塞平的C_max约500±200pg·mL^-1，N-去甲多塞平的C_max约300±100pg·mL^-1，药代动力学通常要求检测方法可以检出5个半衰期后的血药浓度，因此，其在5个半衰期后的血药浓度下降到约10pg·mL^-1，显然现有的SPE-HPLC-MS/MS方法根本不能满足临床研究中的药代动力学定量要求。

参考文献信息如下：

[1]U Geister,M Gaupp,P Arnold,et al.Bioavailability investigation oftwo different oral formulations of doxepin[J].Clinical Trial，2001,51(3):189-196

[2]Nirav P Patel,Mallika Sanyal,Naveen Sharma,et al.Highly sensitiveLC-MS/MS method to estimate doxepin and its metabolite nordoxepin in humanplasma for a bioequivalence study[J].J Pharm anal,2018,8(6):378-385.

[3]龚飞君，严松茂，吴忠平，等.固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定全血中多塞平[J].法医学杂志，2011,27(5):350-352.

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，能够有效提高检测效率和灵敏度。

本发明还提出一种检测效率和灵敏度高的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平检测方法。

本发明还提出一种检测效率和灵敏度高的检测试剂盒。

根据本发明的第一方面实施方式的萃取方法，包括以下步骤：

取待测样本，经过酸性稀释剂稀释后，转移至活化后的固相萃取柱上，再依次经过碱性淋洗液、甲醇水淋洗液I和甲醇水淋洗液II淋洗、压干后，加入洗脱液洗脱，收集洗脱后的液相部分；其中，所述甲醇水淋洗液I中甲醇的体积百分数低于20％；所述甲醇水淋洗液II中甲醇的体积百分数高于50％。

根据本发明的一些实施方式，所述碱性淋洗液的pH为8.5～11.0；优选地，所述碱性淋洗液为碳酸氢铵溶液或氨水溶液；更优选地，所述碳酸氢铵溶液的质量百分数为1％～5％，最优选的碳酸氢铵溶液的质量百分数为5％，pH为10.4。

根据本发明的一些实施方式，所述甲醇水淋洗液I中甲醇的体积百分数为1％～10％，最优选的，所述甲醇水淋洗液I的甲醇体积百分数为5％。

根据本发明的一些实施方式，所述甲醇水淋洗液II中甲醇的体积百分数为60％～90％最优选的，所述甲醇水淋洗液II的甲醇体积百分数为80％。

根据本发明的一些实施方式，所述洗脱液为异丙醇-乙腈混合液；优选地，所述异丙醇-乙腈混合液中异丙醇的体积百分数为30％～60％，最优选的，所述异丙醇-乙腈混合液中异丙醇的体积百分数为50％，且含2％甲酸。本申请通过以极性适宜的异丙醇-乙腈作为洗脱液，避免使用传统的烷类萃取剂，既可更高效的洗脱萃取填料上吸附的目标待测物，又避免了二次污染。

根据本发明的一些实施方式，所述固相萃取柱中地填料为聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)；优选为Cleanert PEP。

根据本发明的一些实施方式，所述酸性稀释剂为磷酸水溶液；优选的，所述磷酸水溶液中磷酸的质量百分数为1％～10％，最优选的，所述磷酸水溶液中磷酸的质量百分数为4％。

根据本发明的一些实施方式，所述酸性稀释剂的添加量为待测样本体积的1～3倍；优选为2倍。

根据本发明的一些实施方式，所述压干操作为正压压干。通过正压压干，压力均匀；避免了采用离心等传统方法的瞬时处理方式，对应目标物质与萃取填料的结合不充分，目标物质流失明显，无法实现痕量物质检测(pg·mL^-1级)。

根据本发明的一些实施方式，所述待测样本选自血浆、脑脊液或关节腔内液。

根据本发明实施例的萃取方法，至少具有如下有益效果：本发明方案的萃取方法操作简单，可实现批量处理；且萃取过程中无需使用戊烷、正丁醇、己烷、乙醚-乙酸乙酯等复杂溶剂，不会造成二次污染；本发明方案采用酸性稀释剂进行稀释，使得多塞平、N-去甲多塞平与蛋白、脂肪更好分离，有利于呈游离状态；整个淋洗过程采用碱性、甲醇-水体系，无需使用正己烷萃取条件，避免了萃取剂与目标物质过度结合而不分离的缺陷；通过本发明方案的萃取方法，实现了多塞平及N-去甲多塞平的高效回收，可满足低于10pg/ml的血药浓度含量的测定；本发明方案的定量下降显著低于现有技术中的定量下限，检测灵敏度得到显著提升。

根据本发明的第二方面实施方式的检测方法，包括以下步骤：

S1、采用上述固相萃取方法对样本中的多塞平及其代谢物N-去甲多塞平进行萃取；

S2、通过LC-MS/MS进行含量分析。

根据本发明的一些实施方式，本发明方案通过LC-MS/MS同步检测多塞平、N-去甲多塞平，并分别以多塞平-d3、N-去甲多塞平-d3为内标，定量离子特征分别为多塞平(279.96→107.17)、N-去甲多塞平(265.93→107.18)、多塞平-d3(282.97→87.16)、N-去甲多塞平-d3(268.94→107.19)。多塞平的定量范围为4～1000pg·mL^-1，N-去甲多塞平终浓度分别为2～500pg·mL^-1。

根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括对经步骤S1萃取后的样本，干燥、复溶后制备LC-MS/MS分析所需的供试品。

根据本发明的一些实施方式，所述复溶操作采用的是乙腈水溶液作为复溶液；优选地，所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分数为5～20％。

根据本发明的一些实施方式，LC-MS/MS分析过程中洗脱条件如下：

流动相：A相：添加有甲酸和甲酸铵的水溶液；B相：添加有甲酸的乙腈溶液；

采用梯度程序进行洗脱，洗脱梯度如下：

0～0.2min，70％A相；0.2～3.2min，10％A相；3.2～4min，70％A相。

根据本发明实施例的检测方法，至少具有如下有益效果：相比于现有技术中的检测方法，仅可单独检测多塞平，本发明方案可同时实现多塞平及其活性代谢产物N-去甲多塞平的定量检测，本发明方案的检测限低、线性区间宽、灵敏度高且检测方法准确可靠。

根据本发明的第三方面实施方式的检测试剂盒，包括以下试剂：

多塞平标准品和质控品；

N-去甲多塞平标准品和质控品；

多塞平-d3内标品；

N-去甲多塞平-d3内标品；

固相萃取柱；

淋洗液：碱性淋洗液、甲醇水淋洗液II和甲醇水淋洗液II；

洗脱液；

其中，所述甲醇水淋洗液I中甲醇的体积百分数低于20％；所述甲醇水淋洗液II中甲醇的体积百分数高于50％。

根据本发明实施例的检测试剂盒，至少具有如下有益效果：本发明试剂盒使用待测物的内标均为d3标记，而不是采用其他分子量近似的化学物质来替代，保证了定量响应的特异性，且实现了现有市场上多塞平及其活性代谢产物去甲多塞平检测试剂盒的零突破。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例3测得的多塞平的标准工作曲线；

图2为本发明实施例3测得的N-去甲多塞平的标准工作曲线。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明的实施例一为：一种多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其中，萃取过程如下：

1、固相萃取柱的预处理：

固相萃取柱种类：96位固相萃取小柱，填料为Cleanert PEP，容量2mg/孔。

活化方法：取200μL甲醇活化经正压压干，再取200μL超纯水平衡经正压压干。

2、固相萃取处理：取血浆200μL，加入10μL50％甲醇水(也可是内标工作液)，加入400μL稀释剂(4％磷酸水)，振荡60s，全部转移至经活化后的固相萃取小柱上，上正压压干，加入200μL碱性淋洗液(5％NH₄HCO₃)，上正压压干，加入200μL甲醇水淋洗液I(5％甲醇水)，上正压压干，加入200μL甲醇水淋洗液II(80％甲醇水)，上正压压干，加入100μL洗脱液(50％异丙醇-乙腈)，上正压压干，重复该操作一次，收集每次洗脱后的液相部分。

本发明的固相萃取，经过了甲醇活化→超纯水清洗→上样→梯度淋洗(变换不同pH和极性的淋洗液)→洗脱→氮吹复溶，仅需200μL样品即可满足需求，远低于现有固相萃取技术中的样本量，大大节省了样本用量，具有减少收集受试者生物样本的特色，尤其适用于脑脊液、关节腔内液等稀有生物样本的前处理，还具有批量处理的优势。

本发明实施例二为：一种多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平检测试剂盒包含了以下试剂：

多塞平对照品储备液(CSS、QCS)：0.1mg·mL^-1

N-去甲多塞平对照品储备液(CSS、QCS)：0.1mg·mL^-1

多塞平、N-去甲多塞平标准曲线工作液：多塞平浓度分别为80、160、400、1000、2500、6250、16000、20000pg·mL^-1，N-去甲多塞平浓度分别为40、80、200、500、1250、3125、8000、10000pg·mL^-1。分别取多塞平、N-去甲多塞平对照品储备液适量至聚丙烯EP管中，以50％甲醇水(甲醇水可对药物更好地溶解，即使在-20℃下冰箱保存时也不会结冰)为溶剂，经过系列稀释，得到同时含2种待测物的7个标准曲线工作液，其中多塞平浓度分别为80、160、400、1000、2500、6250、16000、20000pg·mL^-1；N-去甲多塞平浓度分别为40、80、200、500、1250、3125、8000、10000pg·mL^-1

多塞平、N-去甲多塞平质控工作液：多塞平浓度分别为80、200、1200、5000、15000pg·mL^-1，N-去甲多塞平浓度分别为40、100、600、2500、7500pg·mL^-1。分别取多塞平、N-去甲多塞平对照品储备液适量至聚丙烯EP管中，以50％甲醇水为溶剂，经过系列稀释，得到同时含2种待测物的5个质控样品工作液，其中多塞平浓度分别80、200、1200、5000、15000pg·mL^-1；N-去甲多塞平浓度分别为40、100、600、2500、7500pg·mL^-1

多塞平、N-去甲多塞平标准血浆样品：多塞平浓度分别为4、8、20、50、125、312.5、800、1000pg·mL^-1，N-去甲多塞平浓度分别为2、4、10、25、62.5、156.25、400、500pg·mL^-1。按标准曲线工作液:空白血浆＝1:20(体积比)将标准曲线工作液进一步稀释配制成含2种待测物的7个标准曲线标准血浆样品，多塞平终浓度分别为4、8、20、50、125、312.5、800、1000pg·mL^-1；N-去甲多塞平终浓度分别为2、4、10、25、62.5、156.25、400、500pg·mL^-1。

多塞平、N-去甲多塞平质控标准血浆样品：多塞平浓度分别为4、10、60、250、750pg·mL^-1，N-去甲多塞平浓度分别为2、5、30、125、375pg·mL^-1。按质控样品工作液:空白血浆＝1:20(体积比)进一步稀释配制成含2种待测物的5个质控标准血浆样品，多塞平浓度分别为4、10、60、250、750pg·mL^-1，N-去甲多塞平浓度分别为2、5、30、125、375pg·mL^-1

多塞平-d3、N-去甲多塞平-d3内标工作液：多塞平-d3浓度为3200pg·mL^-1，N-去甲多塞平-d3浓度为400pg·mL^-1。分别取多塞平-d3、N-去甲多塞平-d3对照品储备液适量至聚丙烯EP管中，以50％甲醇水为溶剂，经过系列稀释，得到同时含2种内标物的内标工作液，其中多塞平-d3浓度为3200pg·mL^-1，N-去甲多塞平-d3浓度为400pg·mL^-1；取10μL内标工作液加入到标准曲线和质控标准血浆样品中同步使用96位固相萃取柱的配套萃取溶剂(体积分数同实施例1的碳酸氢铵淋洗液、甲醇水淋洗液I、甲醇水淋洗液II及异丙醇-乙腈洗脱液)。

利用本发明实施例方案试剂盒定量结果判断标准如下：相关系数r²≥0.9801或r≥0.9900；校正标样的回算浓度应该在标示值的85％～115％范围内，定量下限应该在标示值的80％～120％范围内；至少75％的校正标样且最少6个浓度水平应符合上述标准。

多塞平、N-去甲多塞平标准曲线和质控标准血浆样品的配制，经历了储备液→标准曲线工作液→标准血浆样品的阶段稀释，溶剂分别变化为50％甲醇水→空白血浆→内标工作液，其中血浆的占比保持在90％以上，既接近了实际待测样本的真实情况，又保证了2种待测物质的基质溶解性和共同存在，该处理避免了从较高浓度的储备液直接过渡到生物基质引入的配制误差，保证标准品的回收率和准确性，还可以降低每次稀释的跨度(不超过100倍，20倍以内稀释为最佳)，有效提高人员操作重复性和准确度。该配制模式，同步检测2种标志物，不是分别配制2个待测物的标准曲线，对于2种以上代谢物的配制有显著参考价值。

本发明实施例试剂盒可实现一批次96个样本的集中处理，整个处理时间低于液液萃取时间，所用试剂不含戊烷、正丁醇、己烷、乙醚-乙酸乙酯等复杂溶剂，不会造成二次污染。更为重要的是，通过本申请的固相萃取，可以实现较高效率的待测物及其代谢产物的回收。所获得的定量下限显著低于其他已报道的定量下限，方法检测灵敏度得到显著增强。

本发明实施例三为：利用实施例二中的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

1、样品溶液的制备：

1.1标准品、质控品等的制备见实施例2。

1.2供试品溶液的制备：将经实施例1两次洗脱后得到的液相部分经氮气吹干(40℃)，加入100μL复溶液(10％乙腈水)，涡旋振荡60s，既得供试品溶液。

2、LC-MS/MS分析：将上述操作制得的样品溶液按如下条件进行分析：

液相色谱仪：Waters UPLC I-Class；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm(2.1×100mm)；在线过滤器：Waters CRITICAL CLEANTM；自动进样器温度：10℃；柱温：60℃；流速：0.4mL·min^-1；进样量：10μL；流动相A相：0.1％甲酸10mM甲酸铵水；流动相B相：0.1％甲酸乙腈。

质谱仪：Xevo TQ-S；离子源：电喷雾离子源；离子源温度(℃)：150；毛细管电压(KV)：2.00；锥孔电压(V)：18；脱溶剂气流(L/h)：1000；脱溶剂温度(℃)：500；电离模式：正离子；信号采集模式：MRM；峰宽：4s；单个峰采集点数：12。

化合物	Precursor	Product
			多塞平	279.96	107.17
多塞平-d3	282.97	87.16
			N-去甲多塞平	265.93	107.18
N-去甲多塞平-d3	268.94	107.19

3.标准曲线的绘制：

添加内标物后的标准曲线工作液经过固相萃取处理，进样到质谱系统分析，分别记录2个待测物与内标的响应，并计算2个待测药物与内标的响应比值。分别以多塞平及N-去甲多塞平与其内标的响应比值(Y)为纵坐标，以系列标准血浆样品浓度(X)为横坐标，使用权重因子(1/X²)，通过最小二乘法进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数。将系列标准血清样品中待测物与内标的响应比值，代入线性回归方程计算，标准曲线系列浓度样品测试得到的浓度值与标示浓度值比较。

血浆中多塞平、N-去甲多塞平的定量标准曲线如图1和2所示。从图中可以看出，本试剂盒测试人血浆中多塞平的线性范围可达4～1000pg·mL^-1，人血浆中N-去甲多塞平的线性范围可达2～500pg·mL^-1。满足线性接受标准，线性定量效果良好。

4.准确度和精密度验证

取加标后的多塞平、N-去甲多塞平质控标准血浆样品LLOQ、LQC、LMQC、HMQC、HQC各6份，其中多塞平的浓度依次为4、10、60、250、750pg·mL^-1，N-去甲多塞平的浓度依次为2、5、30、125、375pg·mL^-1，进样到质谱系统分析。记录待测物与内标响应的比值并代入对应所得线性回归方程，计算各样品浓度，将其与样品标示值比较，并据此计算批内精密度和准确度。

接受标准：LLOQ测得浓度均值的准确度应在标示值的80％～120％范围内，且至少2/3样品准确度偏差在标示值的±20％之内；其它质控浓度标准尿液样品测得浓度的均值的准确度应在标示值的85％～115％范围内，且每个浓度至少2/3样品准确度偏差在标示值的±15％之内；定量下限精密度不得超过20％，其它质控浓度的精密度不得超过15％。

准确度和精密度验证实验结果见表1。

表1试剂盒准确度和精密度验证结果(浓度单位pg·mL^-1)

从上表可以看出，采用本发明实施例试剂盒对5个不同浓度质控品各重复测定6次，多塞平的准确度偏差不超过标示值的-13.15％～6.15％、N-去甲多塞平的准确度偏差不超过标示值的-7.01％～10.95％、均符合±15％之内的接受标准，方法和试剂盒的准确度合格。各质控品6次测量结果中，多塞平的精密度CV％在1.45％～8.17％、N-去甲多塞平的精密度CV％在1.90％～5.72％，均符合≤15％的接受标准。本方法和试剂盒的精密度合格。

5.固相萃取回收率评价

取6份经伦理审查委员会批准的健康受试者者正常空白血浆，配制3种质控标准血浆样品(LQC、HMQC、HQC)各6份，其中多塞平的浓度依次为10、250、750pg·mL^-1，N-去甲多塞平的浓度依次为5、125、375pg·mL^-1，按本申请描述的固相萃取方法富集待测物并复溶。各质控样品进样10μL到色谱/质谱系统分析。分别记录多塞平的响应(A₁)，N-去甲多塞平的响应(A₂)，作为待测物提取后面积。

取6份不同来源的空白血浆，按本发明实施例1描述的固相萃取方法富集待测物并复溶。然后取质控工作溶液(SLQC、SHMQC、SHQC)分别用6份不同来源的基质配制1份样品，配制方法如下：加质控工作液10μL、内标工作液10μL、复溶液80μL，涡旋混匀，进样10μL到色谱/质谱系统分析。分别得到多塞平的响应(B₁)，N-去甲多塞平的响应(B₂)，作为待测物未提取面积。

标准血浆样品中多塞平的回收率为R1＝A₁/B₁×100％，N-去甲多塞平的回收率为R3＝A₂/B₂×100％。

固相萃取前后的回收率比对结果见表2。

表2试剂盒固相萃取处理2种待测物的回收率评价(pg·mL^-1)

从上表可以看出，低中高3种质控浓度的多塞平在经固相萃取提取后的回收率在80.81％～85.76％，平均回收率为83.75％；N-去甲多塞平在经固相萃取提取后的回收率在83.09％～86.68％，平均回收率为85.27％。2种待测物经本发明的固相萃取处理后的总体回收率接近或超过85％，比现有技术中报道的回收率均要明显提高。这对于pg·mL^-1级别的定量需求是非常重要的技术改进。

6.稳定性评价

采用新鲜全血(来源于某健康志愿者)作为全血稳定性考察基质，配制2种质控标准血浆样品(LQC、HQC)各6份，其中多塞平的浓度依次为10、750pg·mL^-1，N-去甲多塞平的浓度依次为5、375pg·mL^-1，分别室温放置0h、2h后，按本发明实施例1描述的固相萃取方法富集待测物并复溶。各质控样品进样10μL到色谱/质谱系统分析。分别记录多塞平、N-去甲多塞平和对应内标的响应。检测结果见表3。

表3全血中质控标准品的待测物稳定性(pg·mL^-1)

从上表可以看出，放置2h后离心和放置0h离心的样品的待测物与内标响应比值，其偏差在-0.73％～3.03％。说明完全按照临床待测样本的情况下，本申请中的待测物在全血中配制且室温放置2h后，均表现出明显的生物稳定性。本发明的方法和试剂盒产品具有显著的技术创新优势和实际应用价值。

分别取提前配制好的多塞平、去甲多塞平对照品储备液，用50％甲醇水稀释，得到含多塞平浓度范围为80～20000pg·mL^-1和含N-去甲多塞平浓度范围为40～10000pg·mL^-1的对照品标准曲线工作液。标准曲线标准血浆样品的配制，分别取上述对照品标准曲线工作液各10μL，再加入空白血浆190μL，获得的标准血浆样品，血浆基质的稀释比例不超过5％，从而保证血浆基质不被过度稀释并接近生物基质。

综上所述，本发明实施例通过更适用于超微量物质提取的“超灵敏”固相萃取法，可实现血浆中多塞平、N-去甲多塞平的定量下限可以分别达到4pg·mL^-1、2pg·mL^-1，满足多塞平3mg给药下的药代动力学检测需要满足定量限在10pg/ml以下的要求，在多塞平用药指导过程将具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (17)

1.一种多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于，包括以下步骤：

取待测样本，经过酸性稀释剂稀释后，转移至活化后的固相萃取柱上，再依次经过碱性淋洗液、甲醇水淋洗液I和甲醇水淋洗液II淋洗、压干后，加入洗脱液洗脱，收集洗脱后的液相部分；其中，所述甲醇水淋洗液I中甲醇的体积百分数低于20%；所述甲醇水淋洗液II中甲醇的体积百分数高于50%；所述洗脱液为异丙醇-乙腈混合液；所述固相萃取柱中的填料为聚苯乙烯/二乙烯苯。

2.根据权利要求1所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述碱性淋洗液的pH为8.5~11.0。

3.根据权利要求2所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述碱性淋洗液为碳酸氢铵溶液或氨水溶液。

4.根据权利要求3所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述碳酸氢铵溶液的质量百分数为1%~5%。

5.根据权利要求3所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述碱性淋洗液为质量百分数为5%的碳酸氢铵溶液，pH为10.4。

6.根据权利要求1所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述甲醇水淋洗液I中甲醇的体积百分数为1%~10%。

7.根据权利要求1所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述甲醇水淋洗液I中甲醇的体积百分数为5%。

8.根据权利要求1所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述甲醇水淋洗液II中甲醇的体积百分数为60%~90%。

9.根据权利要求8所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述甲醇水淋洗液II中甲醇的体积百分数为80%。

10.根据权利要求1所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述异丙醇-乙腈混合液中异丙醇的体积百分数为30%~60%。

11.根据权利要求10所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述异丙醇-乙腈混合液中异丙醇的体积百分数为50%且含2%甲酸。

12.根据权利要求1所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述固相萃取柱中的填料为Cleanert PEP。

13.根据权利要求1所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述酸性稀释剂为磷酸水溶液。

14.根据权利要求13所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述磷酸水溶液中磷酸的质量百分数为1%~10%。

15.根据权利要求1所述的多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平固相萃取方法，其特征在于：所述待测样本选自血浆、脑脊液或关节腔内液。

16.一种多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、采用如权利要求1至15任一项所述的固相萃取方法对样本中的多塞平及其代谢物N-去甲多塞平进行萃取；

S2、通过LC-MS/MS进行含量分析。

17.一种多塞平及其代谢产物N-去甲多塞平检测试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：

多塞平标准品和质控品；

N-去甲多塞平标准品和质控品；

多塞平-d3内标品；

N-去甲多塞平-d3内标品；

固相萃取柱；

淋洗液：碱性淋洗液、甲醇水淋洗液I和甲醇水淋洗液II；

洗脱液；

其中，所述甲醇水淋洗液I中甲醇的体积百分数低于20%；所述甲醇水淋洗液II中甲醇的体积百分数高于50%；所述洗脱液为异丙醇-乙腈混合液；所述固相萃取柱中的填料为聚苯乙烯/二乙烯苯。

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