CN112415188B - 一种磁细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁细胞及其制备方法和应用，包括磁珠和细胞，所述磁珠为被活性功能基团修饰的生物磁珠，所述细胞为过表达抗原膜蛋白的细胞，磁珠和细胞通过磁珠的活性功能基团与细胞的膜蛋白偶联在一起形成所述的磁细胞。本发明首次将磁珠直接锚定细胞，不借助任何抗原、抗体反应，实现了磁珠与细胞的结合，利用磁力架吸附磁细胞，即可实现对细胞的控制，操作简单，使用方便，和化学发光微孔板检测系统结合可实现自动化；应用于免疫检测可兼具活体细胞检测的高灵敏度、特异性和磁珠法的操作简易性，具有十分重要的研究意义和实用价值。

Description

一种磁细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种磁细胞及其制备方法和应用。

背景技术

磁珠技术是20世纪80年代出现的技术方法。磁珠由核心金属颗粒(Fe₂O₃，Fe₃O₄)，核心外层包裹的高分子材料(如聚苯乙烯、聚氯乙烯)和最外层的功能配基(如-NH₂、COOH、-OH、-CHO)组成，是一种纳米级超顺磁性粒子，当位于磁场中时，会表现出磁性，能够被磁力架捕捉吸附。磁珠技术以免疫学为基础，渗透到生理、药理、微生物、生化及分子生物学等各个领域，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面有着越来越广泛的使用。

目前，磁珠技术被广泛应用于蛋白、核酸、细胞和其它生物分子的纯化、分析中。例如：1)分离核酸，通过DNA/RNA与磁珠的相互作用形成“核酸-磁珠复合物”，在外加磁场的作用下分离复合物。2)蛋白质/抗体分离与纯化，应用抗体/抗原包被的磁珠纯化相应的抗原/抗体。3)利用磁珠包被抗原/抗体，可以和相应抗体/抗原发生免疫反应的特点，磁珠被广泛用于体外免疫检测中，并实现了自动化检测，磁珠法检测正逐步取代酶联免疫法(ELISA)和免疫印迹法成为体外检测的重要技术。4)磁珠应用于细胞分选，比如从血液、组织等细胞混合物中分离出某一类特殊细胞亚群。

磁珠作为球体，具有较高的比表面积，应用于蛋白质/抗体分离与纯化、免疫检测中时，有助于抗原和抗体最大限度的结合；磁珠的聚合物外壳可保护目标物免受铁元素毒性效应的影响，表面化学性质稳定可以最大限度减少化学凝集和非特异性结合，具备操作简单、能够自动化及高灵敏度的特点。成熟工艺下，磁珠粒径可以在几十纳米至几微米之间，可满足不同实验的需求，被广泛应用于抗原或抗体的分离、纯化或检测中。

然而，利用磁珠技术进行细胞表面蛋白的免疫检测时，通常只能偶联纯化后的蛋白，很多膜蛋白难以纯化或容易在纯化过程中发生蛋白变性失活，无法直接使用磁珠法检测。

因此，抗细胞表面蛋白检测多采用间接免疫荧光实验，如CBA(Cell based assay)法，CBA法是一种以表达单一神经抗原的转染细胞为底物的检测，细胞表面蛋白在转染细胞中表达，加工，获得具有天然三维结构的抗原表位，被待测样品中的抗细胞表面蛋白抗体识别与结合后，实现检测。与免疫印迹法和磁珠法相比，CBA法具有较高的特异性和敏感性，但操作较为复杂，特别是在检测过程中需要对细胞进行固定或离心等操作，对细胞具有一定的损伤，并容易破坏细胞表面蛋白的抗原性。

可见，操作简单、局限性小的蛋白质分离、纯化或检测方法还有待进一步探究。

使用磁珠与细胞结合通常是应用于细胞分选，利用磁珠技术分离细胞，需要找到某类细胞特有的表面分子标记物，然后获取针对它特异性的抗体，再将抗体和磁珠偶联，才能进行后续的细胞分选，实现磁珠与细胞的连接，步骤较为繁琐。若能将磁珠与细胞直接连接并实现有效应用，必然是更理想的选择和方法，而在本领域内，尚无磁珠与细胞直接结合的产品及应用。

发明内容

针对上述技术问题，经过长期不断地探索，本发明发明人首次将带有活性功能基团的磁珠与细胞直接结合，无需在磁珠和细胞表面再连接对应的抗原、抗体，得到了磁细胞，结构简单，制作方便，将其应用于免疫检测，具有优异的效果，拓宽了免疫检测的途径和方法。可突破传统磁珠法的局限性，实现磁珠法对抗膜蛋白自身免疫抗体的检测。基于此，本发明请求保护以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种磁细胞，包括磁珠和细胞，所述磁珠为被活性功能基团修饰的生物磁珠，所述细胞为过表达抗原膜蛋白的细胞，磁珠和细胞通过磁珠的活性功能基团与细胞的膜蛋白偶联在一起形成所述的磁细胞。

优选地，所述磁珠为氨基磁珠或羧基磁珠。所述磁珠的尺寸为微米级。

优选地，所述磁珠的直径为0.2～5μm。进一步优选地，所述磁珠的直径为0.2～1μm。

在本发明的具体实施方式中，所述磁珠的直径为0.5～1μm。

在上述技术方案中，所述细胞是通过质粒转染使其过表达抗原膜蛋白的细胞。所述质粒为所述细胞表面抗原的表达质粒。优选地，所述抗原选自NF155抗原、AQP4抗原、MOG抗原、Caspr1抗原或NF186抗原。

优选地，所述细胞为贴壁细胞。

优选地，所述细胞为HEK293T细胞。

本发明的第二方面提供一种前述的磁细胞的制备方法，包括如下步骤：将活化后的磁珠与过表达抗原膜蛋白的细胞混合孵育0.5～2h。

优选地，是将活化后的磁珠与过表达抗原膜蛋白的细胞在完全培养基中混合孵育。

进一步优选地，细胞的浓度为1×10⁶cells/ml～3×10⁶cells/ml。

进一步优选地，细胞的浓度为2×10⁶cells/ml。

进一步优选地，所述完全培养基为DMEM完全培养基。

优选地，细胞和磁珠的用量比为1×10⁶cells/45ug beads～1×10⁶cells/60ugbeads。进一步优选为1×10⁶cells/50ug beads。

优选地，混合孵育是将活化后的羧基磁珠的MES溶液与细胞的完全培养基悬浮液混合孵育，或者，将活化后的氨基磁珠的PBS溶液与细胞的完全培养基悬浮液混合孵育。

优选地，MES溶液的pH为4.5～6.7，PBS溶液的pH为7.2～8.0。

优选地，磁珠浓度为1～10mg/ml，更优选为10mg/ml。

所述磁珠浓度是指混合前磁珠溶液的浓度。

进一步地，所述制备方法还包括细胞过表达抗原膜蛋白步骤：将细胞通过质粒转染使其过表达抗原膜蛋白，所述质粒为所述细胞表面抗原的表达质粒。

进一步地，所述制备方法还包括活化磁珠步骤。

只要是可将生物磁珠的功能基团活化的方法均可适用于本发明。

第三方面，本发明提供了前述的磁细胞在检测抗细胞表面蛋白抗体中的应用。

本发明的第四发明提供了一种抗细胞表面蛋白抗体的磁细胞法检测方法：是将前述的磁细胞与待测样品混合孵育后，再加入二抗孵育，通过二抗上标记的信号进行检测。

优选地，所述二抗为山羊抗人IgG。

优选地，采用化学发光微孔板检测系统或荧光显微镜检测血清进行检测。

本发明的磁细胞，磁珠通过活性功能基团与细胞的膜蛋白发生共价结合和/或物理吸附实现连接。羧基磁珠和氨基磁珠分别通过羧基和氨基与细胞的膜蛋白发生共价结合和/或物理吸附实现连接。羧基磁珠经过活化后，可以提高与带有伯氨基的生物配体进行共价偶联的反应活性；氨基磁珠经过戊二醛活化后，可以提高与带有羧基的生物配体进行共价偶联的反应活性。将细胞通过质粒转染，可使与转染的质粒对应的膜蛋白在表面过表达，可应用于特定抗体的免疫检测。

在本发明的磁细胞中，由于磁珠是直接与细胞中的膜蛋白连接，而要将磁细胞继续应用也依赖于膜蛋白的性质，磁珠的直接连接可能会对膜蛋白的抗原表位产生封闭作用或空间位阻效应，使其无法被抗体识别。

为了验证磁珠和细胞的结合是否会影响转染质粒表达的膜蛋白的抗原表位，发明人将膜蛋白对应的抗体稀释到完全培养基中，与细胞-磁珠复合体孵育反应，反应结束后，通过磁力架吸附细胞进行漂洗，再与二抗继续反应。最后通过荧光显微镜观察，发现磁细胞的膜蛋白与对应的抗体能够良好地结合，证明磁珠吸附并没有影响膜表面蛋白的免疫反应，说明本发明制备得到的磁细胞，可根据细胞表面过表达的表面抗原的不同，应用于不同抗体的检测、分离纯化等。

本发明将磁细胞用于抗细胞表面蛋白抗体的检测，检测结果与样品实际情况一致，说明本发明磁细胞可应用于抗细胞表面蛋白抗体的检测，结果准确。

本发明磁细胞保留了活细胞状态进行免疫反应，特异性好，使得免疫反应在液相、活细胞状态下进行，大大提高了检测的灵敏度；同时突破了磁珠法免疫学检测只能跟表达纯化蛋白反应结合去进行检测的局限性，具有磁珠法的操作简易性，兼具了CBA法和磁珠法的优点，本发明将本发明的这种方法简称磁细胞法。

本发明的磁细胞法，磁珠对细胞的有效吸附效率能够达到90％以上。将病人的血清稀释到完全培养基中和细胞进行孵育反应，过表达的细胞表面蛋白抗原与病人血清中的抗体进行反应，静置沉淀加上磁力架吸附细胞，洗去未结合的细胞和血清杂蛋白，和抗人二抗继续反应，静置沉淀加上磁力架吸附细胞，洗涤之后即可通过化学发光微孔板检测系统或荧光显微镜检测血清中是否存在抗细胞表面蛋白抗体。

本发明的有益效果是：

(1)本发明首次用磁珠直接锚定细胞，不借助任何抗原、抗体反应，实现了磁珠与细胞的连接，利用磁力架吸附磁细胞，即可实现对细胞的控制，操作简单，使用方便；和化学发光微孔板检测系统结合后，可实现自动化检测，高效快捷。

(2)本发明磁细胞可用于细胞表面膜蛋白抗体的检测，突破了原有免疫磁珠法检测细胞表面膜蛋白的种种限制，扩展到利用磁珠来操控活体细胞进行体外免疫反应，细胞在活体状态下进行免疫反应，有助于提高检测的灵敏度和特异性；检测过程中通过磁力架控制细胞，可避免常规免疫检测中需要对细胞进行的固定或离心等操作，减少了免疫检测过程中的细胞的损伤和膜蛋白变性；还避免了对待测血清的复杂预处理，直接将血清稀释后与磁细胞混合进行检测即可。则本发明的磁细胞法兼具了CBA法的高灵敏度、特异性和磁珠法的操作简易性。

(3)本发明磁细胞还可用于分选细胞的培养环节，可促进细胞贴壁生长，方便操作。可见，本发明磁细胞适用范围广，使多个领域的技术都可得到改进和提升，为多个领域提供了新的策略和研究方向。

(4)本发明磁细胞使用方便，能够提高工作效率，降低劳动强度，且制备方法简单，用途广泛，具有十分重要的研究和实用价值。

附图说明

图1是磁细胞的模式图。

图2是羧基磁细胞和氨基磁细胞显微镜下照片。

图3是NF155阳性血清磁细胞法免疫荧光检测实验图。

图4是AQP4阳性血清磁细胞法免疫荧光检测实验图。

图5是MOG阳性血清磁细胞法免疫荧光检测实验图。

图6是Caspr1阳性血清磁细胞法免疫荧光检测实验图。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

主要试剂和来源：

PBS：磷酸缓冲盐溶液，pH 7.2～8.0；

MES：2-(N-吗啉)乙磺酸溶液；

PEI：聚乙烯亚胺，品牌为Polysciences；

EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

NF155阳性血清，NF186阴性血清、AQP4阳性血清、MOG阳性血清、Caspr1阳性血清：来源于首都医科大学宣武医院的临床患者样本。

膜蛋白NF155真核表达质粒：质粒由安徽通用生物公司基因合成及亚克隆获得，合同号为：G0165409-1；

NF155抗原质粒：质粒由安徽通用生物公司基因合成及亚克隆获得，合同号为：G0165409-1；

AQP4抗原质粒：质粒由自己构建所得，构建策略：将AQP4基因从cDNA文库中扩增，然后亚克隆到pEGFP-C1载体中，克隆位点为：BglII--BamHI；

MOG抗原质粒：质粒由安徽通用生物公司基因合成及亚克隆获得，合同号为：G0157776-1；

Caspr1抗原质粒：质粒由安徽通用生物公司基因合成及亚克隆获得，合同号为：G0159931-3；

pEGFP-N1：Addgene，6085-1；

羊抗人IgG(H+L)交叉吸附二抗(Alexa Fluor 555标记)：Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Thermo fisher，A-21433；

羧基磁珠(直径1μm)、氨基磁珠(直径500nm)：BEAVER，70104-5、BEAVER，70201-5；

磁力架：IMAG手持式磁珠分离装置-96P和DYNAMAG-2；

细胞系：HEK293T细胞；

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。

实施例1羧基磁细胞的检测

材料、试剂、仪器准备：

(1)磁珠：羧基磁珠，直径1μm，10mg/mL；

(2)细胞系：HEK293T细胞；

(3)磁力架：Axygen的IMAG手持式磁珠分离装置-96P和DYNAMAG-2磁力架；

(4)混匀仪：HULAMIXER SAMPLE MIXER

(5)质粒：NF155抗原质粒和对照质粒(空载体：pEGFP-N1)；

(6)转染试剂：PEI Polysciences，用蒸馏水配成1mg/ml备用；

(7)一抗：NF155阳性血清，NF155阴性血清；

(8)缓冲液：PBS pH 7.4，MES pH 5.0；

(9)二抗：羊抗人IgG(H+L)交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555标记；

用上述试剂、耗材按以下方法可以获得细胞-磁珠复合体，并进行抗体的筛查。本实施例的待检样品已鉴定为NF155阳性、阴性血清。

1、NF155抗原质粒和对照质粒的转染：

1)先对HEK293T细胞培养、传代，待24孔板中HEK293T细胞密度达到50～60％时可以转染；

2)在100μl DMEM完全培养基中加入0.5ug NF155抗原质粒或对照质粒，然后按PEI(μl)：NF155抗原质粒(μg)为3:1的比例加入1.5μl PEI(1mg/ml)混匀，室温静置30min，得到质粒混合液；

3)将100μl的质粒混合液加入到步骤1)的24孔板中的每孔中，转染后6h更换新鲜的DMEM完全培养基500μl；

4)转染12h之后，可以通过荧光显微镜观察NF155自带的GFP荧光表达情况，如果表达良好，转染24h后即可用于下一步的实验。

2、磁细胞制备：

磁珠的活化：

1)混匀磁珠后，取100μl羧基磁珠(10mg/ml)到1.5ml离心管中，使用DYNAMAG-2磁力架磁性分离去除上清液，用1ml MES溶液(100mM MES，pH 5.0)进行磁性分离，洗涤2次，移除上清液；

2)加入新鲜配制的100μl EDC溶液(5mg/ml，以上述MES溶液作分散剂)到步骤1)得到的装有磁珠的离心管中，使用HULAMIXER SAMPLE MIXER漩涡混匀使磁珠充分悬浮，室温活化30min，该期间保持磁珠的悬浮状态；经过上述步骤之后，磁珠表面的羧基已经活化(活化状态不宜长时间保存，建议立即进行偶联)；

3)使用DYNAMAG-2磁性分离去除上清液，加入200μl MES(pH5.0)溶液重悬。

磁珠和细胞结合：

1)在24孔细胞培养板中，加入1ml PBS pH7.4漂洗前面转染表达膜表面蛋白NF155的HEK293T细胞2次，最后用0.5ml DMEM完全培养基将贴壁细胞轻柔吹打重悬、混匀，溶液中细胞的浓度约为2×10⁶cells/ml；

2)加入5μl前面活化后的羧基磁珠(10mg/ml)，轻柔混匀，培养箱静置孵育1h；

3)从培养箱中取出细胞培养板，静置5min，磁力架(IMAG手持式磁珠分离装置-96P)吸附细胞培养板2min，磁性分离去除上清液，加入1ml PBS pH7.4重悬细胞，漂洗2次，将洗涤液分别转到一个干净的孔中，待观察；

4)将细胞培养板从磁力架上取下，可以在显微镜下观察漂洗后细胞和羧基磁珠的结合情况及漂洗液中的未结合的细胞数目；

结果如图2所示，两种活化磁珠与细胞共孵育结合之后，绝大部分细胞能够和磁珠结合而被磁力架吸附，并且细胞会向磁力中心聚集(图2中箭头方向)；只有少数的细胞由于没有结合磁珠或者结合力弱，留存在漂洗液中。

5)加入1ml PBS pH7.4重悬细胞，取出100μl细胞悬浮液(即转染NF155质粒的磁细胞)分装到96孔板每孔中，进行下一步的免疫检测。

3、免疫检测：

1)取前面装有细胞悬浮液的96孔板，静置5min，利用磁力架将细胞吸附到底部，去除上清液，加入用DMEM完全培养基稀释(1:10)的NF155阳性血清100μl，培养箱孵育1h；同时以NF155阴性血清的作为对照；

2)利用磁力架将细胞吸附到底部，去除培养基，加入200μl PBS pH7.4漂洗细胞2次；

3)加入DMEM完全培养基稀释的荧光二抗(1:2000,150μl)，培养箱孵育1h；

2)利用磁力架将细胞吸附到底部，去除培养基，加入200μl PBS pH7.4漂洗细胞2次。

对于荧光二抗，可以用显微镜检测荧光信号，根据图3可以看出，阳性血清和转染NF155质粒的磁细胞反应后，会在细胞膜上带有明显的红色荧光信号，而阴性血清对照的几乎看不到红色荧光信号，与实际情况相符。在检测过程中，磁细胞可被磁力架吸附，方便进行漂洗等操作，使检测过程的操作更简单。

实施例2

用实施例1相同的方法分别对AQP4抗体和MOG抗体的阳性血清进行检测，结果分别如图4、图5所示，阳性血清和磁细胞反应后，均表现出红色荧光信号，可看见细胞膜上出现明显的红色荧光信号，而阴性血清中的几乎看不到红色荧光信号，与实际情况相符。

实施例3氨基磁细胞的检测

磁细胞检测法的准备：

氨基磁珠：直径500nm，10mg/mL；

其余试剂、材料和仪器与实施例1相同。

本实施例的待检样品为已鉴定Caspr1阳性、阴性血清。

1、Caspr1抗原质粒和对照质粒的转染：

按照实施例1中“NF155抗原质粒和对照质粒的转染”的方法进行。

2、磁细胞制备：

磁珠的活化：

1)混匀磁珠后，取100μl氨基磁珠(10mg/ml)到1.5ml离心管中，使用DYNAMAG-2磁力架磁性分离去除上清液，用1ml PBS pH 8.0溶液进行磁性分离，洗涤2次，移除上清液；

2)加入新鲜配制的100μl戊二醛溶液(15％)到步骤1)得到的装有磁珠的离心管中，使用HULAMIXER SAMPLE MIXER漩涡混匀使磁珠充分悬浮，室温活化60min，该期间保持磁珠的悬浮状态；经过上述步骤之后，磁珠表面的羧基已经活化(活化状态不宜长时间保存，建议立即进行偶联)；

3)使用DYNAMAG-2磁性分离去除上清液，加入200μl PBS pH8.0溶液重悬。

磁珠和细胞结合：按照实施例1的方法进行。

3、免疫检测：

按照实施例1的方法进行。

在显微镜下观察漂洗后细胞和氨基磁珠的结合情况及漂洗液中的未结合的细胞数目(图2下)，氨基磁珠和细胞共孵育结合之后，绝大部分细胞能够和磁珠结合而被磁力架吸附，并且细胞会向磁力中心聚集(图2中箭头方向)；只有少数的细胞由于没有结合磁珠或者结合力弱，残留在漂洗液中。

对于荧光二抗，可以用显微镜检测荧光信号，根据图6，可以看出，阳性血清和转染Caspr1质粒的磁细胞反应后，会在膜上带有明显的红色荧光信号，而阴性血清的几乎看不到红色荧光信号，与实际情况相符。

需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

本发明说明书包含多项发明构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”、“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。

Claims (11)

1.一种磁细胞，其特征在于，包括磁珠和细胞；

所述磁珠为被活性功能基团修饰的生物磁珠，所述被活性功能基团修饰的生物磁珠为氨基磁珠或羧基磁珠；

所述细胞为过表达抗原膜蛋白的细胞；

所述磁细胞中的磁珠直接锚定细胞，不借助抗原、抗体反应，通过磁珠的活性功能基团与细胞的膜蛋白共价偶联在一起形成所述的磁细胞；且所述磁细胞中的磁珠吸附不影响膜蛋白的免疫反应。

2.根据权利要求1所述的磁细胞，其特征在于，所述磁珠的尺寸为微米级。

3.根据权利要求2所述的磁细胞，其特征在于，所述磁珠的直径为0.2~5μm。

4.根据权利要求1所述的磁细胞，其特征在于，所述细胞是通过质粒转染使其过表达抗原膜蛋白的细胞；

所述质粒为所述抗原膜蛋白的表达质粒；

所述抗原选自NF155抗原、AQP4抗原、MOG抗原、Caspr1抗原或NF186抗原；

所述细胞为贴壁细胞。

5.权利要求1~4任一项所述的磁细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

混合孵育：将活化后的磁珠与过表达抗原膜蛋白的细胞混合孵育0.5～2h。

6.根据权利要求5所述的磁细胞的制备方法，其特征在于，细胞的浓度为1×10⁶cells/ml~3×10⁶ cells/ml。

7.根据权利要求5所述的磁细胞的制备方法，其特征在于，细胞和磁珠的用量比为1×10⁶ cells/45ug beads~1×10⁶ cells/60ug beads。

8.根据权利要求5所述的磁细胞的制备方法，其特征在于，混合孵育是将活化后的羧基磁珠的MES溶液与细胞的完全培养基悬浮液混合孵育，或者，将活化后的氨基磁珠的PBS溶液与细胞的完全培养基悬浮液混合孵育；

MES溶液的pH为4.5~6.7，PBS溶液的pH为7.2~8.0；

磁珠浓度为1~10 mg/ml。

9.根据权利要求5所述的磁细胞的制备方法，其特征在于，还包括细胞过表达抗原膜蛋白步骤：将细胞通过质粒转染使其过表达抗原膜蛋白，所述质粒为所述抗原膜蛋白的表达质粒。

10.权利要求1~4任一项所述的磁细胞在检测抗细胞表面蛋白抗体中的应用。

11.一种抗细胞表面蛋白抗体的磁细胞法检测方法，其特征在于：是将权利要求1~4任一项所述的磁细胞与待测样品混合孵育后，再加入二抗孵育，通过二抗上标记的信号进行检测；

所述二抗为山羊抗人IgG。

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