CN112469829B

CN112469829B - 包含抗gpc3单链抗体的car

Info

Publication number: CN112469829B
Application number: CN201980045634.XA
Authority: CN
Inventors: 玉田耕治; 佐古田幸美; 安达圭志
Original assignee: Neuer Immune Biotechnology Co ltd
Current assignee: Neuer Immune Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: EP3825404A4; EP3825404A1; WO2020017479A1; JP2024069500A; JP7737740B2; CN112469829A; US20230071098A1; JPWO2020017479A1

Abstract

本发明的课题在于，提供包含能够与局部存在于细胞膜的GPC3特异性结合且在使用CAR‑T细胞的癌症免疫疗法中有用的单链抗体的CAR以及表达所述CAR的免疫活性细胞等。制作编码下述CAR的基因并导入免疫活性细胞中，可以制作具有优良的癌细胞杀伤活性和干扰素γ(IFN‑γ)产生能力的CAR表达免疫活性细胞，所述CAR包含：含有本发明中定义的特定的重链CDR1～3和特定的轻链CDR1～3、并且与来源于人的GPC3多肽特异性结合的单链抗体；融合于该单链抗体的羧基末端的跨膜区；和融合于该跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区。

Description

包含抗GPC3单链抗体的CAR

技术领域

本发明涉及：包含与由序列号11所示的氨基酸序列构成的来源于人GPC3(Glypican-3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的多肽特异性结合的单链抗体、融合于该单链抗体的羧基(C)末端的跨膜区和融合于该跨膜区的C末端的免疫活性细胞活化信号转导区的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor；以下也称为“CAR”)；表达上述CAR的免疫活性细胞；包含上述免疫活性细胞的抗癌剂；编码上述CAR的CAR基因；以及包含上述CAR基因的载体。

背景技术

CAR是使识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体与诱导T细胞的活化的信号转导区融合而成的人工嵌合蛋白。通过将编码CAR的基因导入到不显示肿瘤反应性的外周血T细胞(外周血T淋巴细胞)中，能够大量制作显示肿瘤反应性的CAR表达T细胞(以下也称为“CAR-T细胞”)。显示肿瘤反应性的CAR-T细胞不依赖于与主要组织相容性复合体(MHC)的相互作用地具有癌细胞杀伤活性。

通过给药CAR-T细胞来进行的癌症免疫疗法、更具体而言从患者采集T细胞、向所述T细胞中导入编码CAR的基因并进行扩增、并再次移入至患者的疗法(非专利文献1)目前正在世界范围内进行临床试验，已得到在白血病和淋巴瘤等造血器官恶性肿瘤等方面显示有效性的结果。

近年来，进行了各种各样的CAR-T细胞的研究。例如，提出了：一种药物组合物，其包含含有编码CAR的核酸的经修饰的自体人T细胞，所述CAR由CD19抗原结合区、跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3ζ信号区构成(专利文献1)；一种或多种治疗上有效的抗标签嵌合抗原受体(AT-CAR)表达T细胞团，其与同癌细胞结合的一种或多种带标签的蛋白质的配合物同时或分开地被给药于受试体，所述T细胞团与上述带标签的蛋白质结合而诱导癌细胞死亡(专利文献2)；一种细胞，其包含编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含人抗体139的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号转导结构域(专利文献3)；一种细胞，其是包含编码嵌合抗原受体的核酸序列的细胞，其中，上述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号转导区和含有特定的氨基酸序列的CD3ζ信号转导结构域(专利文献4)；一种通过基因工程方法制作的CD19特异性T细胞，其在细胞表面膜上表达和保有CD19特异性嵌合受体，上述嵌合受体由用于免疫细胞的效应功能的细胞内信号传递结构域、至少1个跨膜结构域和至少1个胞外域构成，胞外域包含CD19特异性受体(专利文献5)；以及一种嵌合抗原受体表达细胞，其导入有编码嵌合抗原受体的核酸，所述嵌合抗原受体包含糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR)的胞内域作为胞内域(专利文献6)。另外，最近本发明人报道了：若使CAR-T细胞中表达白细胞介素7(IL-7)、趋化因子配体19(CCL19)，则可发挥比以往的CAR-T细胞更优良的免疫诱导效果和抗肿瘤活性(专利文献7)。

另一方面，GPC3在胎生期的组织、特别是肝脏和肾脏中表达，是与器官形成相关的胞外基质蛋白。在成人组织中，在胎盘以外观察不到GPC3的表达，但是在肝细胞癌、黑素瘤、卵巢透明细胞癌、肺鳞状细胞癌等各种癌组织中观察到表达。可见，GPC3与甲胎蛋白(α-fetoprotein；AFP)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen；CEA)等蛋白质同样地是在胎生期的组织中表达的蛋白质，因此被分类为胚胎性癌抗原。即，GPC3显示出在正常组织细胞中不表达、但在癌细胞中特异性表达的特征，因此作为癌症治疗的靶分子、肿瘤标志物和诊断标志物有用。

作为现有的抗GPC3抗体的代表，有BioMosaics公司所销售的单克隆抗体1G12。该抗体为如下得到的抗体：将避开GPC3的复杂结构、局部存在而设计的抗原(GPC3的C末端侧70个残基的多肽)免疫于Balb/c小鼠，制作杂交瘤，通过使用该抗原的筛选而得到。另外，日本制药厂家所开发的抗体GC33和GC199也是基于同样的构思而建立的单克隆抗体，是以GPC3的C末端侧部分片段作为抗原而得到的抗体(专利文献8)。

最近，本发明人发现了一种抗GPC3抗体，其与现有抗体(例如，GC33、GC199)相比识别不同的表位、并且在单链抗体的状态下也能够与局部存在于细胞膜的GPC3特异性结合(PCT/JP2018/257)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2014/0106449号说明书

专利文献2：日本特表2014-504294号公报

专利文献3：日本特表2014-516510号公报

专利文献4：日本特表2014-507118号公报

专利文献5：日本特开2011-004749号公报

专利文献6：国际公开第2013/051718号小册子

专利文献7：国际公开第2016/056228号小册子

专利文献8：日本专利第4011100号公报

非专利文献

非专利文献1：中泽洋三信州医志61(4):197～203(2013)

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于，提供包含能够与局部存在于细胞膜的GPC3特异性结合且在使用CAR-T细胞的癌症免疫疗法中有用的单链抗体的CAR、以及表达所述CAR的免疫活性细胞等。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述课题持续进行了深入研究。在该过程中发现，若以日本制药厂家所开发的抗GPC3抗体(GC33抗体)为基础制作抗GPC3单链抗体、将表达融合有所述抗GPC3单链抗体的CAR的载体导入T细胞中，则能够制作具有优良的癌细胞杀伤活性和干扰素γ(IFN-γ)产生能力的CAR-T细胞，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种嵌合抗原受体(CAR)(以下有时称为“本发明CAR”)，其包含与由序列号11所示的氨基酸序列构成的来源于人GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的多肽特异性结合的单链抗体、融合于该单链抗体的羧基末端的跨膜区和融合于该跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区，所述CAR中，

所述单链抗体包含：

由序列号1所示的氨基酸序列构成的重链互补决定区(CDR)1、由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链CDR2和由序列号3所示的氨基酸序列构成的重链CDR3；以及

由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链CDR1、由序列号5所示的氨基酸序列构成的轻链CDR2和由序列号6所示的氨基酸序列构成的轻链CDR3。

[2]根据上述[1]所述的CAR，其中，单链抗体包含：

由与序列号7所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的重链可变区、以及由与序列号8所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的轻链可变区。

[3]根据上述[1]或[2]所述的CAR，其中，

单链抗体包含与序列号12所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列；或者

单链抗体包含与序列号13所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列。

[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的CAR，其中，跨膜区和融合于该跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区包含与序列号14～16中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列。

[5]一种免疫活性细胞(以下有时称为“本发明免疫活性细胞”)，其表达上述[1]～[4]中任一项所述的CAR。

[6]根据上述[5]所述的免疫活性细胞，其还表达白细胞介素7(IL-7)和趋化因子配体19(CCL19)。

[7]一种抗癌剂(以下有时称为“本发明抗癌剂”)，其含有上述[5]或[6]所述的免疫活性细胞以及药学上可接受的添加剂。

[8]一种CAR基因(以下有时称为“本发明CAR基因”)，其编码上述[1]～[4]中任一项所述的CAR。

[9]一种载体(以下有时称为“本发明CAR表达载体”)，其包含启动子和以能够工作的方式连接于该启动子的下游的权利要求8所述的编码CAR的CAR基因。

另外，作为本发明的其它实施方式，可列举：表达本发明CAR的免疫活性细胞的制作方法，其包括将本发明CAR表达载体导入免疫活性细胞中的步骤；表达本发明CAR的免疫活性细胞，其是通过将本发明CAR表达载体导入免疫活性细胞中而制作的；表达本发明CAR的免疫活性细胞，其包含本发明CAR基因(优选还包含IL-7基因和CCL19基因的、表达本发明CAR以及IL-7和CCL19的免疫活性细胞)。

发明效果

根据本发明，若在T细胞等免疫活性细胞的细胞膜上表达本发明CAR，则该免疫活性细胞发挥优良的癌细胞杀伤活性和IFN-γ产生能力。因此，本发明CAR在使用免疫活性细胞的癌症免疫疗法中有用。

附图说明

图1为示出用流式细胞仪对T细胞(图1A)和CAR-T细胞(图1B)中的CAR(横轴)以及CD8(纵轴)的表达进行分析而得到的结果的图。图中的矩形所包围的“Q1”、“Q2”、“Q3”和“Q4”的区域分别表示“CAR阴性CD8阳性T细胞群”、“CAR阳性CD8阳性T细胞群”、“CAR阳性CD8阴性T细胞群”和“CAR阴性CD8阴性T细胞群”，将这4种细胞群的、各细胞群的细胞数相对于总细胞数的比例(％)示于各自区域。

图2示出对在T细胞群(图中的“T细胞”)或包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群(图中的“CAR-T细胞”)存在下培养Sk-HEP-1细胞(图中的“mock(空白对照)”)和Sk-HEP-1GPC3细胞(图中的“GPC3”)时的、CD45阴性细胞(相当于残存的Sk-HEP-1GPC3细胞)数(图2A)以及该CD45阴性细胞相对于全部细胞的比例(图2B)进行分析而得到的结果。

图3为示出对在T细胞群(图中的“T细胞”)或包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群(图中的“CAR-T细胞”)存在下培养Sk-HEP-1细胞(图中的“mock”)和Sk-HEP-1GPC3细胞(图中的“GPC3”)时的、培养液中产生的IFN-γ的浓度进行分析而得到的结果的图。

图4为示出对在T细胞群(图中的“T细胞”)或包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群(图中的“CAR-T细胞”)存在下培养Sk-HEP-1细胞(图中的“mock”)和Sk-HEP-1GPC3细胞(图中的“GPC3”)时的、培养液中产生的IL-7(图4A)和CCL19(图4B)的浓度进行分析而得到的结果的图。

具体实施方式

本发明CAR为至少包含下述i)～iii)的多肽：i)包含由序列号1所示的氨基酸序列构成的重(H)链互补决定区(CDR)1、由序列号2所示的氨基酸序列构成的H链CDR2和由序列号3所示的氨基酸序列构成的H链CDR3以及由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻(L)链CDR1、由序列号5所示的氨基酸序列构成的L链CDR2和由序列号6所示的氨基酸序列构成的L链CDR3，并且与由序列号11所示的氨基酸序列构成的来源于人GPC3的多肽(相当于由人GPC3的第537位的甘氨酸～第563位的赖氨酸构成的多肽)特异性结合的单链抗体(singlechain Fv；scFv)(以下有时称为“本发明单链抗体”)；ii)融合于本发明单链抗体的C末端的跨膜区；和iii)融合于所述跨膜区的C末端的免疫活性细胞活化信号转导区，其中，本发明单链抗体与跨膜区之间、跨膜区与免疫活性细胞活化信号转导区之间可以通过肽接头或IgG4铰链区而融合。另外，本发明单链抗体通常包含含有上述H链CDR1～3的H链可变(V)区以及含有上述L链CDR1～3的L链V区，其中，H链V区与L链V区之间通常通过肽接头而结合。

作为上述肽接头的长度，可列举例如1～100个氨基酸残基、优选10～50个氨基酸残基。另外，作为本发明抗体中的肽接头，具体可列举3个由1～4个甘氨酸(G)和1个丝氨酸(S)构成的氨基酸序列连续相连而成的接头。

本发明单链抗体的V区中，作为CDR1～3以外的区域，包含骨架区(FR)。作为所述FR中的H链FR，可列举连接于H链CDR1的N末端的H链FR1、连接于H链CDR1的C末端(H链CDR2的N末端)的H链FR2、连接于H链CDR2的C末端(H链CDR3的N末端)的H链FR3、连接于H链CDR3的C末端的H链FR4。另外，作为上述FR中的L链FR，可列举连接于L链CDR1的N末端的L链FR1、连接于L链CDR1的C末端(L链CDR2的N末端)的L链FR2、连接于L链CDR2的C末端(L链CDR3的N末端)的L链FR3、连接于L链CDR3的C末端的L链FR4。

作为上述H链FR1，具体而言，可列举由序列号7所示的氨基酸序列的第1～30位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。

作为上述H链FR2，具体而言，可列举由序列号7所示的氨基酸序列的第36～49位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。

作为上述H链FR3，具体而言，可列举由序列号7所示的氨基酸序列的第67～98位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。

作为上述H链FR4，具体而言，可列举由序列号7所示的氨基酸序列的第105～114位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。

作为上述L链FR1，具体而言，可列举由序列号8所示的氨基酸序列的第1～23位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。

作为上述L链FR2，具体而言，可列举由序列号8所示的氨基酸序列的第40～54位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。

作为上述L链FR3，具体而言，可列举由序列号8所示的氨基酸序列的第62～93位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。

作为上述L链FR4，具体而言，可列举由序列号8所示的氨基酸序列的第103～113位的氨基酸残基构成的多肽、或由与该多肽的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的多肽。

作为本发明单链抗体的FR，优选已知的人抗体的FR。作为所述“已知的人抗体的FR”，可列举例如GenBank等公知的序列数据库中所登录的人抗体的FR、选自来源于人抗体的各亚群的共有序列(Human Most Homologous Consensus Sequence；Kabat,E.A.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and HumanServices,1991)的FR等。

本发明单链抗体中的H链CDR1通常在基于kabat的编号(参照文献“kabat,E.A.etal.,(1991)NIH Publication No.91-3242,sequences of proteins of immunologicalinterest”)中存在于H31～35的位置。另外，本发明单链抗体中的H链CDR2通常在基于kabat的编号中存在于H50～52、H52A和H53～65的位置。另外，本发明单链抗体中的H链CDR3通常在基于kabat的编号中存在于H95～100、H100A、H100B、H101和H102的位置。另外，本发明单链抗体中的L链CDR1通常在基于kabat的编号中存在于L24～34的位置。另外，本发明单链抗体中的L链CDR2通常在基于kabat的编号中存在于L50～56的位置。另外，本发明单链抗体中的L链CDR3通常在基于kabat的编号中存在于L89～97的位置。

作为本发明单链抗体中的H链V区，具体而言，可列举由与序列号7所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链V区，另外，作为本发明单链抗体中的L链V区，具体而言，可列举由与序列号8所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链V区。

作为本发明单链抗体，具体而言，可列举通过后述本实施例证实了其效果的单链抗体、即包含与序列号12所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列的单链抗体、包含与序列号13所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列的单链抗体。

作为上述跨膜区，只要是能够贯穿细胞膜的肽即可，可列举例如来源于CD8、T细胞受体的α、β链、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、EGFR(表皮生长因子受体，Epidermal GrowthFactor Receptor)或GITR的跨膜区的全部或部分区域，具体而言，可列举由序列号14所示的氨基酸序列的第1～83位的氨基酸残基构成的人CD8跨膜区。另外，作为上述跨膜区，也可以是能够贯穿细胞膜的肽的C末端侧的1～10个氨基酸残基、优选6～7个氨基酸残基被去除后的肽，可列举例如：由序列号14所示的氨基酸序列的第1～77位的氨基酸残基构成的上述人CD8跨膜区的改造体1、由序列号14所示的氨基酸序列的第1～76位的氨基酸残基构成的上述人CD8跨膜区的改造体2。

作为上述免疫活性细胞活化信号转导区，只要是本发明单链抗体结合到人GPC3上时能够向免疫活性细胞内进行信号转导的区域即可，优选含有选自CD28、4-1BB(CD137)、GITR、CD27、OX40、HVEM、CD3ζ、Fc受体相关γ链(Fc Receptor-associatedγchain)的胞内区的多肽中的至少一种或两种以上，更优选含有CD28、4-1BB和CD3ζ的胞内区的多肽这三种。作为所述CD28的胞内区的多肽，具体而言，可列举由序列号14所示的氨基酸序列的第85～124位的氨基酸残基构成的人CD28的胞内区的多肽。另外，作为上述“4-1BB的胞内区的多肽”，具体而言，可列举由序列号14所示的氨基酸序列的第125～170位的氨基酸残基构成的人4-1BB的胞内区的多肽。另外，作为上述CD3ζ的胞内区的多肽，具体而言，可列举由序列号14所示的氨基酸序列的第172～283位的氨基酸残基构成的人CD3ζ的胞内区的多肽。

需要说明的是，序列号14所示的氨基酸序列的第84位的精氨酸(Arg)、序列号15所示的氨基酸序列的第78位的精氨酸、序列号16所示的氨基酸序列的第77位的精氨酸为上述来源于人CD8的跨膜区的多肽与上述人CD28的胞内区的多肽的共有序列。另外，序列号14所示的氨基酸序列的第171位的亮氨酸(Leu)、序列号15所示的氨基酸序列的第165位的亮氨酸、序列号16所示的氨基酸序列的第164位的亮氨酸为上述人4-1BB的胞内区的多肽与上述人CD3ζ的胞内区的多肽的共有序列。

本说明书中，“免疫活性细胞”是指在生物体内担负免疫功能的细胞(优选从生物体中分离出的细胞)。作为免疫活性细胞，可列举例如：T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞等淋巴细胞系细胞；单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等抗原提呈细胞；中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等粒细胞，具体而言，可优选例示来源于人、狗、猫、猪、小鼠等哺乳动物的T细胞、尤其是来源于人的T细胞。另外，T细胞可以从例如血液、骨髓液等体液以及脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或者原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌组织中分离包含免疫活性细胞的细胞团而得到。另外，为了提高上述细胞团中所含的T细胞的比例，还可以根据需要利用常规方法对分离出的上述细胞团进一步进行分离或纯化，从而得到。另外，T细胞还可以利用由ES细胞(胚胎干细胞)、iPS细胞(induced pluripotent stem cells，诱导多能干细胞)制作的T细胞。作为所述T细胞，可列举α-βT细胞、γ-δT细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、初始T细胞、NKT细胞。需要说明的是，免疫活性细胞的来源和给药对象可以相同也可以不同。进而，当给药对象为人的情况下，作为免疫活性细胞，可以使用采自作为给药对象的患者本人的自体细胞，也可以使用采自他人的异体细胞。即，供者与受者可以一致也可以不一致，优选一致。

作为上述给药对象，可优选列举哺乳动物或哺乳动物细胞，所述哺乳动物中，可更优选列举人、小鼠、狗、大鼠、豚鼠、兔、绵羊、猪、牛、马、猫、猴、猩猩，可特别优选列举人。

本发明CAR优选用于在癌症治疗中在采自癌症患者的免疫活性细胞的细胞表面上进行间接体内(ex vivo)表达。在使用T细胞作为免疫活性细胞的情况下，作为由本发明CAR中的跨膜区和融合于所述跨膜区的C末端的免疫活性细胞活化信号转导区构成的肽，具体而言，可列举包含与序列号14～16中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列的肽。另外，作为本发明CAR，具体而言，可列举：包含本发明单链抗体和连接于所述单链抗体的C末端侧的包含与序列号14的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列的肽的CAR；包含本发明单链抗体和连接于所述单链抗体的C末端侧的包含与序列号15的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列的肽的CAR；以及包含本发明单链抗体和连接于所述单链抗体的C末端侧的包含与序列号16的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列的肽的CAR。

作为本发明免疫活性细胞，只要是表达本发明CAR的免疫活性细胞即可，由于本发明CAR通常在天然条件下不存在，因此是表达外源性、而非内源性的CAR的免疫活性细胞。作为本发明免疫活性细胞，优选还表达IL-7和/或CCL19。在免疫活性细胞为未确认到IL-7和/或CCL19的表达的细胞(例如，T细胞)的情况或者免疫活性细胞为T细胞以外的IL-7和/或CCL19的表达低的细胞的情况下，作为本发明免疫活性细胞，优选为表达外源性的IL-7和/或CCL19的免疫活性细胞。在此，表达外源性的IL-7和/或CCL19的免疫活性细胞可以通过向免疫活性细胞中导入外源性的IL-7基因和/或CCL19基因(优选以能够工作的方式连接于启动子的下游的外源性的IL-7基因和/或CCL19基因)而得到。导入外源性的IL-7基因和/或CCL19基因而得到的免疫活性细胞在该免疫活性细胞内可以以整合于基因组的状态、或未整合于基因组的状态(例如，游离状态)含有外源性的IL-7基因和/或CCL19基因。需要说明的是，本发明免疫活性细胞还包括对本发明免疫活性细胞进行培养而得到的表达本发明CAR的细胞培养物。

本发明免疫活性细胞可以通过将本发明CAR表达载体导入到免疫活性细胞中来制作。作为导入方法，只要是向免疫活性细胞中导入DNA的方法即可，可列举例如电穿孔法(Cytotechnology,3,133(1990))、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)、脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,7413(1987))、病毒感染法等方法。作为所述病毒感染法，可列举下述方法：将CAR表达载体(国际公开2016/056228号小册子)和包装质粒转染于GP2-293细胞(宝生物公司制)、Plat-GP细胞(Cosmo Bio公司制)、PG13细胞(ATCC CRL-10686)、PA317细胞(ATCC CRL-9078)等包装细胞而制作重组病毒，使所述重组病毒感染T细胞。导入本发明CAR表达载体而得到的免疫活性细胞(本发明免疫活性细胞)以整合于基因组的状态、或未整合于基因组的状态在该免疫活性细胞内含有本发明CAR基因。

另外，本发明免疫活性细胞可以通过下述方式来制造：使用公知的基因编辑技术，以能够在合适的启动子的调控下表达的方式将编码本发明CAR的核苷酸整合于细胞的基因组。作为公知的基因编辑技术，可例示使用锌指核酸酶、TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，成簇的规律间隔的短回文重复序列)-Cas系统等内切核酸酶的技术。

本发明抗癌剂只要是规定了“用于抗癌(即，用于抑制肿瘤增殖)”这一用途的、含有本发明免疫活性细胞和药学上可接受的添加剂的组合物即可，其中，作为药学上可接受的添加剂，可列举例如生理盐水、缓冲生理盐水、细胞培养用培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、缓冲剂、防腐剂、等渗剂、填充剂、润滑剂。另外，上述添加剂可以为由一种添加剂构成的单一成分，也可以为包含多种(至少两种)添加剂的混合物。

本发明抗癌剂可以使用本领域技术人员已知的方法给药于需要抑制肿瘤增殖(换言之，治疗癌症)的受试者(癌症患者)，作为给药方法，可列举例如：注射于静脉内、肿瘤内、皮内、皮下、肌肉内、腹腔内、动脉内、脊髓内、心脏内、关节内、滑膜腔内、颅内、髓腔内、蛛网膜下(脑脊液)等的方法；利用导管给药于肿瘤部位的方法。

作为本发明抗癌剂中所含的本发明免疫活性细胞的数量，可基于癌症的种类、位置、严重度、接受治疗的受试体的年龄、体重、状态等条件适宜选择，例如，一次给药中为1×10⁴～1×10¹⁰个、优选1×10⁵～1×10⁹个、更优选5×10⁶～5×10⁸个。

本发明抗癌剂的给药次数例如为每天4次、3次、2次、1次。另外，本发明抗癌剂的给药间隔为例如每隔1天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、每隔6天、每隔7天、每隔8天、每隔9天、每隔1个月。

作为本发明抗癌剂的给药对象的癌症，可列举例如：大肠癌(结肠癌或直肠癌)；胃癌；肝癌；脑瘤；肺癌(腺癌、鳞癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌)；食道癌；十二指肠癌；小肠癌；皮肤癌；乳腺癌；前列腺癌；膀胱癌；阴道癌；宫颈癌；宫体癌；肾癌；胰腺癌；脾癌；气管癌；支气管癌；头颈癌；胆囊癌；胆管癌；睾丸癌；卵巢癌；骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、神经组织、血管组织或造血组织的癌症(具体而言，软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等肉瘤；肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤；胚细胞瘤；淋巴瘤；白血病)；等。

本发明抗癌剂也可以与其它抗癌剂组合使用。作为其它抗癌剂，可列举：环磷酰胺、苯达莫司汀、异环磷酰胺、达卡巴嗪等烷基化药；喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、依诺他滨等代谢拮抗药；利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗等分子靶向药；伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等激酶抑制剂；硼替佐米等蛋白酶体抑制剂；环孢菌素、他克莫司等钙调神经磷酸酶抑制药；伊达比星、多柔比星、丝裂霉素C等抗癌性抗生素；依立替康、依托泊苷等植物生物碱；顺铂、奥沙利铂、卡铂等铂制剂；他莫昔芬、比卡鲁胺等激素疗法药；干扰素、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗等免疫调节药。

作为上述“将本发明抗癌剂与其它抗癌剂组合使用”的方法，可列举：使用其它抗癌剂进行处理，然后使用本发明抗癌剂的方法；同时使用本发明抗癌剂和其它抗癌剂的方法；使用本发明抗癌剂进行处理，然后使用其它抗癌剂的方法。另外，在将本发明抗癌剂与其它抗癌剂组合使用的情况下，癌的治疗效果进一步提高并且减少各自的给药次数或给药量，由此，能够进一步降低单独使用所带来的副作用。

作为本发明CAR基因，只要为编码至少包含i)本发明单链抗体、ii)融合于本发明单链抗体的C末端的跨膜区和iii)融合于所述跨膜区的C末端的免疫活性细胞活化信号转导区的i)～iii)的多肽的抗体基因(核苷酸)就没有特别限制，在此，作为编码本发明单链抗体的抗体基因，具体而言，可列举：包含由与序列号9所示的核苷酸序列具有至少80％以上的序列一致性的核苷酸序列构成的H链V区基因(编码由与序列号7所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的H链V区的基因)、以及由与序列号10所示的核苷酸序列具有至少80％以上的序列一致性的核苷酸序列构成的L链V区基因(编码由与序列号8所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成的L链V区的基因)的抗体基因。

在本说明书中，术语“一致性”是指多肽或多核苷酸序列近似性的程度(其由查询序列与其它的优选相同的类型的序列(核酸或者蛋白质序列)的匹配来确定)。作为计算和确定“一致性”的优选的计算机程序法，可列举例如GCG BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool，基本局部比对搜索工具)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.1990,215:403-410；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.1997,25:3389-3402；Devereux et al.,Nucleic Acid Res.1984,12:387)、以及BLASTN 2.0(Gish W.,http://blast.Wustl.edu,1996-2002)、以及FASTA(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85:2444-2448)、以及确定并比对最长重复的一对重叠群的GCG GelMerge(Wibur和Lipman,SIAMJ.Appl.Math.1984,44:557-567；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.1970,48:443-453)。

本说明书中，“至少80％以上的一致性”是指一致性为80％以上，是指优选为85％以上、更优选为88％以上、进一步优选为90％以上、进一步更优选为93％以上、特别优选为95％以上、特别更优选为98％以上、最优选为100％的一致性。

本说明书中，“与序列号X所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列”换句话说是“在序列号X所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加0个、1个或者数个氨基酸残基而成的氨基酸序列”且与序列号X所示的氨基酸序列具有同等功能。在此，“缺失、置换、插入和/或添加1个或者数个氨基酸残基而成的氨基酸序列”是指：缺失、置换、插入和/或添加例如1～30个的范围内、优选为1～20个的范围内、更优选为1～15个的范围内、进一步优选为1～10个的范围内、进一步优选为1～5个的范围内、进一步优选为1～3个的范围内、进一步优选为1～2个的范围内的数量的氨基酸残基而成的氨基酸序列。这些氨基酸残基的突变处理可以通过化学合成、基因工程方法、诱变等本领域技术人员已知的任意方法来进行。

在本说明书中，“以能够工作的方式连接于启动子的下游的……基因”是指：按照启动子能够使基因开始转录的方式，将启动子DNA与基因DNA以能发挥功能的方式连接。

作为本发明CAR表达载体中的启动子，只要是使位于启动子的下游的本发明CAR基因所编码的mRNA的转录开始的区域即可，启动子中通常包含转录起始点(TSS)。

本发明CAR表达载体中的启动子和载体的种类可根据要导入的宿主细胞(免疫活性细胞)的种类来适宜选择，在此，作为启动子，可列举例如巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early，即刻早期)基因的启动子、SV40的初始启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子、NFAT启动子、HIF启动子等。另外，作为载体，可列举例如pMSGV载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res18:6436-6445(2002))和pMSCV载体(宝生物公司制)等逆转录病毒载体或来源于所述载体的载体。

作为本发明CAR表达载体，可以是为了进一步提高基因表达效率而进一步包含增强子区域或核糖体结合区(RBS；ribosome binding site)的核苷酸序列的载体、以及为了筛选本发明免疫活性细胞而进一步包含与本发明免疫活性细胞的种类相应的药剂抗性基因(例如，壮观霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、遗传霉素抗性基因等)的载体。所述增强子区域通常配置在启动子的上游，RBS通常配置在启动子与本发明CAR基因之间。本发明CAR表达载体中的本发明CAR基因的核苷酸序列可根据进行表达的本发明免疫活性细胞而进行密码子序列的优化。本发明CAR、本发明CAR表达载体和本发明CAR基因可以使用基因重组技术利用公知方法来制作。

作为本发明CAR表达载体，可以为还包含本发明CAR基因以外的基因、例如IL-7基因、CCL19基因、编码具有细胞凋亡作用的多肽的基因(自杀基因)的载体(优选以能够工作的方式连接于启动子的下游的IL-7基因、CCL19基因、自杀基因)。作为所述自杀基因，可列举例如单纯疱疹病毒的编码胸苷激酶[HSV-TK]的基因、编码诱导性胱天蛋白酶9[inducible caspase 9]的基因。通过使本发明CAR表达载体包含自杀基因，能够与癌症的治疗经过相应地、例如在癌细胞消失时给药可活化自杀基因所编码的多肽的功能的药剂(例如，在HSV-TK的情况下是更昔洛韦，在诱导性胱天蛋白酶9的情况下是作为二聚体衍生化合物[chemical induction of dimerization：CID]的AP1903)，从而能够使多余的生物内的本发明免疫活性细胞死亡(Cooper LJ.,et.al.Cytotherapy.2006；8(2):105-17.,Jensen M.C.et.al.Biol Blood Marrow Transplant.2010Sep；16(9):1245-56.,JonesBS.Front Pharmacol.2014Nov 27；5:254.,Minagawa K.,Pharmaceuticals(Basel).2015May 8；8(2):230-49.,Bole-Richard E.,Front Pharmacol.2015Aug 25；6:174)。

本说明书中引用的学术文献、专利、专利申请等参考文献以参考形式与分别具体记载其整体时同等程度地援引于本说明书。

以下通过实施例更具体地说明本发明，但是本发明的技术范围不受这些例示限定。需要说明的是，在以下的实施例中，在包含10％胎牛血清(FBS)和青霉素G、硫酸链霉素的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培养液存在下，在CO₂培养箱(37℃条件下)中进行GP2-293包装细胞株(宝生物公司制)的培养。另外，在包含青霉素G(100单位/mL)等的GT-T551(宝生物公司制)培养液存在下，在CO₂培养箱(37℃条件下)中进行人T细胞的培养。

实施例

1.材料的制备

[CAR、hIL-7、hCCL19和HSV-TK表达逆转录病毒载体的制作]

基于日本制药厂家开发的抗GPC3抗体(GC33抗体)的H链V区(V_H)和L链V区(V_L)的氨基酸序列，设计出两种抗GPC3人型scFv(V_H-接头-V_L[由序列号12的氨基酸序列构成的多肽]和V_L-接头-V_H[由序列号13的氨基酸序列构成的多肽])(参照表1)。所述接头使用使多肽“GGGGS”重复3次而成的由15个氨基酸残基构成的接头。

[表1]

表中，双线矩形表示接头，单下划线表示V_H，双下划线表示V_L。

选择所设计的两种抗GPC3人型scFv中的V_H-接头-V_L(由序列号12的氨基酸序列构成的多肽)作为例子，在其下游连接由来源于人CD8的跨膜区和来源于人CD28/4-1BB/CD3zeta的免疫活性细胞活化信号转导区构成的融合肽(序列号17的氨基酸序列中的第243～525位的氨基酸残基)，设计出由序列号17的氨基酸序列构成的抗GPC3 scFv CAR(参照表2)。

[表2]

表中，单下划线表示抗GPC3人型scFv，双下划线表示由来源于人CD8的跨膜区和来源于人CD28/4-1BB/CD3zeta的免疫活性细胞活化信号转导区构成的融合肽。

进而在所设计的抗GPC3 scFv CAR的上游连接来源于人免疫球蛋白H链的信号序列(序列号18的第1～19位的氨基酸残基)，另外在其下游依次连接2A自切断型肽(序列号18的氨基酸序列的第551～575位的氨基酸残基)、人(h)IL-7(序列号18的氨基酸序列的第577～753位的氨基酸残基)、2A自切断型肽(序列号18的氨基酸序列的第754～778位的氨基酸残基)、hCCL19(序列号18的氨基酸序列的第779～876位的氨基酸残基)、2A自切断型肽(序列号18的氨基酸序列的第877～901位的氨基酸残基)和单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)(序列号18的氨基酸序列的第902～1277位的氨基酸残基)，设计出由序列号18的氨基酸序列构成的融合多肽(抗GPC3 scFv CAR+hIL-7+hCCL19+HSV-TK)(参照表3)。

[表3]

表中，单线矩形表示来源于人免疫球蛋白H链的信号序列，双线矩形表示2A自切断型肽，单下划线表示CAR，双下划线表示hIL-7，虚线下划线表示hCCL19，波浪下划线表示HSV-TK。

然后，将编码上述融合多肽(CAR+hIL-7+hCCL19+HSV-TK)且由优化为人型的密码子的核苷酸序列构成的基因DNA(由序列号19的核苷酸序列构成的多核苷酸，参照表4)整合到pMSGV逆转录病毒载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))中，制作CAR、hIL-7、hCCL19和HSV-TK表达用逆转录病毒载体(以下称为“抗GPC3scFv CAR等表达用逆转录病毒载体”)(参照国际公开2016/056228号小册子)。

[表4]

表中，单线矩形表示编码来源于人免疫球蛋白H链的信号序列的基因，双线矩形表示编码2A自切断型肽的基因，单下划线表示编码CAR的基因，双下划线表示编码hIL-7的基因，虚线下划线表示编码hCCL19的基因，波浪下划线表示编码HSV-TK的基因。

[重组逆转录病毒的制作]

使用Lipofectamine 3000(Life Technology公司制)，将所制作的抗GPC3 scFvCAR等表达用逆转录病毒载体转染到GP2-293包装细胞株(宝生物公司制)中。在转染48小时后，回收包含所产生的重组逆转录病毒(抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒)的培养上清。

[重组逆转录病毒向T细胞的感染]

为了制作抗GPC3 scFv CAR表达T细胞，使重组逆转录病毒(抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒)感染T细胞，由此向上述T细胞中导入上述抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒载体。具体而言，按照常规方法从健康人外周血分离出外周血单核细胞后，在固相化的抗CD3单克隆抗体克隆(OKT3)(5μg/mL)和RetroNectin(注册商标；宝生物公司制、25μg/mL)、以及IL-2存在下活化培养48小时。病毒吸附板如下制作：向用RetroNectin包被的板上添加包含抗GPC3 scFv CAR等表达用重组逆转录病毒的培养上清后，在4℃下以2000g离心2小时，由此制作。向制作的病毒吸附板上，以达到1×10⁵个细胞/mL的方式接种活化培养的人T细胞，在IL-2存在下培养一晩。次日回收T细胞，接种到新的病毒吸附板上，进行第2次病毒感染。培养4小时后回收细胞，添加3倍量的培养液并接种到细胞培养用板，之后培养3天。

2.方法

[流式细胞术分析]

为了确认感染抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒后的人T细胞表达抗GPC3scFv CAR这一点，进行了流式细胞术分析。具体而言，在生物素化的重组GPC3蛋白(R&D公司制)存在下，将感染抗GPC3scFv CAR等表达用逆转录病毒后的人T细胞群(包含抗GPC3 scFvCAR-T细胞的T细胞群)在冰上孵育30分钟。加入FACS缓冲液(1％BSA/PBS溶液)，进行离心处理并除去上清后，添加APC标记抗CD8抗体(Biolegend公司制)和BV421标记链霉亲和素(Biolegend公司制)，在冰上孵育30分钟。使用流式细胞仪(BD LSR Fortessa)(BDBiosciences公司制)进行APC和BV421的检测、以及这些的荧光水平的测定。需要说明的是，作为阴性对照，对于未感染抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒的人T细胞群(T细胞群)，也同样地进行流式细胞术分析。

[对GPC3表达癌细胞的杀伤活性]

为了确认抗GPC3 scFv CAR-T细胞的癌细胞杀伤活性，在包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群存在下培养GPC3表达癌细胞。具体而言，将包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群与来源于肝细胞癌的细胞株(Sk-HEP-1细胞)(购自ECACC)或表达GPC3的Sk-HEP-1细胞(Sk-HEP-1GPC3细胞)以1：1(1×10⁵个/孔)混合，在24孔板中培养。48小时后回收细胞，在藻红蛋白标记抗CD45抗体(Biolegend公司制)存在下，在冰上孵育30分钟。加入FACS缓冲液(1％BSA/PBS溶液)，进行离心处理并除去上清，之后使用流式细胞仪(BD LSR Fortessa)(BD Biosciences公司制)进行藻红蛋白的检测和荧光水平的分析，测定CD45阳性细胞(相当于T细胞)和CD45阴性细胞(相当于残存的Sk-HEP-1GPC3细胞)的数量和比例。

[抗GPC3 scFv CAR-T细胞的IFN-γ产生能力]

对抗GPC3 scFv CAR-T细胞是否具有干扰素γ(IFN-γ)产生能力这一点进行分析。具体而言，将包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群(图3中的“CAR-T细胞”)或基因非导入T细胞群(图3中的“T细胞”)与Sk-HEP-1细胞或Sk-HEP-1GPC3细胞以1：1(各为1×10⁵/孔)混合，在24孔板中培养48小时，通过ELISA(Biolegend公司制)测定培养上清中产生的IFN-γ的浓度。

[抗GPC3 scFv CAR-T细胞的IL-7和CCL19产生能力]

对于抗GPC3 scFv CAR-T细胞是否具有IL-7和CCL19产生能力这一点进行分析。具体而言，将包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群(图4中的“CAR-T细胞”)或基因非导入T细胞群(图4中的“T细胞”)与Sk-HEP-1细胞或Sk-HEP-1GPC3细胞以1：1(各为1×10⁵/孔)混合，在24孔板中培养48小时，通过ELISA(R&D公司制)测定培养上清中产生的IL-7和CCL19的浓度。作为阴性对照，在相同条件下对CAR基因非导入T细胞群(T细胞)与Sk-HEP-1细胞或Sk-HEP-1GPC3细胞进行培养。

3.结果

[流式细胞术分析]

结果显示，感染了抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒的人T细胞群中，48.1％的细胞为检测到BV421的CAR阳性(参照图1B)。另一方面，未感染该逆转录病毒的人T细胞群中，几乎未见CAR阳性细胞(参照图1A)。该结果表明，感染了抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒的人T细胞群中，约50％的细胞为表达抗GPC3 scFv CAR的T细胞(抗GPC3 scFv CAR-T细胞)。

[对GPC3表达癌细胞的杀伤活性]

包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群与使用未感染抗GPC3scFv CAR等表达用逆转录病毒的T细胞群时相比，对Sk-HEP-1GPC3细胞(图2的“GPC3”)的杀伤活性非常高，使Sk-HEP-1GPC3细胞几乎都死亡(参照图2)。另一方面，包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群与T细胞群同样地对于Sk-HEP-1细胞(图2的“mock”)几乎不显示杀伤活性(参照图2)。该结果表明，抗GPC3 scFv CAR-T细胞对表达GPC3的癌细胞发挥了特异性细胞杀死活性。

[抗GPC3 scFv CAR-T细胞的IFN-γ产生能力]

包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群在Sk-HEP-1GPC3细胞存在下与使用未感染抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒的T细胞群时相比，IFN-γ产生能力非常高(参照图3)。另一方面，包含抗GPC3scFv CAR-T细胞的T细胞群在Sk-HEP-1细胞存在下与T细胞群同样地几乎未见IFN-γ产生能力(参照图3)。该结果表明，抗GPC3 scFv CAR-T细胞中的抗GPC3 scFv与癌细胞中的GPC3表面抗原结合并活化，结果产生了IFN-γ。

[抗GPC3 scFv CAR-T细胞的IL-7和CCL19产生能力]

包含抗GPC3 scFv CAR-T细胞的T细胞群在Sk-HEP-1细胞存在下产生了较少的IL-7和CCL19，但在Sk-HEP-1GPC3细胞存在下产生了更多的IL-7和CCL19(参照图4)。在Sk-HEP-1细胞存在下以及在Sk-HEP-1GPC3细胞存在下，未感染抗GPC3 scFv CAR等表达用逆转录病毒的T细胞群均几乎未见IL-7产生和CCL19产生。该结果表明，抗GPC3 scFv CAR-T细胞产生IL-7和CCL19。

产业上的可利用性

本发明有益于使用免疫活性细胞的癌症免疫疗法的领域。

序列表

<110> 诺伊尔免疫生物科技株式会社

<120> 包含抗GPC3单链抗体的CAR

<130> KT-08P

<150> 2018-133970

<151> 2018-07-17

<160> 19

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33抗体的重链CDR1

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 发明人: 玉田耕治; 佐古田幸美; 安达圭志

<400> 1

Asp Tyr Glu Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33抗体的重链CDR2

<400> 2

Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33抗体的重链CDR3

<400> 3

Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33抗体的轻链CDR1

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33抗体的轻链CDR2

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33抗体的轻链CDR3

<400> 6

Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33抗体的重链V区

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33 抗体的重链L区

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> GC33 抗体的重链V区基因

<400> 9

caggtgcagc tgcagcagag cggagctgag ctggtgagac ctggcgccag cgtgaaactg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgaga tgcactgggt gaagcagaca 120

cccgtgcacg gcctgaagtg gatcggagcc ctggacccca agaccggaga caccgcctac 180

agccagaagt ttaagggcaa ggccaccctc accgccgata agagctccag caccgcctac 240

atggagctga ggagcctgac ctccgaggac agcgccgtgt actattgcac caggttctac 300

agctacacct actggggcca gggaacactg gtgaccgtct cc 342

<210> 10

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> GC33 抗体的重链L区基因

<400> 10

gatgtggtga tgacacagac ccctctgagc ctgcctgtga gcctgggaga ccaggccagc 60

atcagctgca ggagcagcca gagcctggtg cacagcaacg gcaacacata cctccactgg 120

tacctgcaga agcctggcca gagccccaag ctgctgatct acaaggtgag caacaggttc 180

tccggcgtgc ccgatagatt cagcggctcc ggcagcggca ccgactttac cctgaagatc 240

tccagagtgg aggccgagga cctgggcgtg tacttttgca gccagaacac ccacgtgcct 300

cctaccttcg gctccggcac caagctcgaa atcaagagg 339

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 人GPC3的第537位的甘氨酸～第563位

<400> 11

Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe

1 5 10 15

His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys

20 25

<210> 12

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> GC33抗体的人源化scFv

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu

130 135 140

Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His

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Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

180 185 190

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

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Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln

210 215 220

Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

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Lys Arg

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<213> 人工

<220>

<223> GC33 抗体的人源化scFv Ver.2

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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn

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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile

165 170 175

Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

180 185 190

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

195 200 205

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210 215 220

Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

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1 5 10 15

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Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

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Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

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<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hCD8-hCD28-h4-1BB-hCD3肽2

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130 135 140

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

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Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

165 170 175

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180 185 190

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

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Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

210 215 220

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225 230 235 240

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

245 250 255

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

260 265 270

Ala Leu Pro Pro Arg

275

<210> 16

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> hCD8-hCD28-h4-1BB-hCD3肽3

<400> 16

Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

35 40 45

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

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Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Arg Ser Lys Arg

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Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

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Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

100 105 110

Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys

115 120 125

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Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

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Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

165 170 175

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

180 185 190

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

195 200 205

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

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Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

245 250 255

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

260 265 270

Leu Pro Pro Arg

275

<210> 17

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 包含GC33 抗体的人源化scFv的CAR

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

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Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu

130 135 140

Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His

145 150 155 160

Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

165 170 175

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

180 185 190

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

195 200 205

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln

210 215 220

Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Lys Arg Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro

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Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

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<210> 18

<211> 1277

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗GPC3 scFv CAR+hIL-7+hCCL19+HSV-TK

<400> 18

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val

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Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

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Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser

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Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu

145 150 155 160

Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln

165 170 175

Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr

225 230 235 240

Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro

260 265 270

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

275 280 285

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

290 295 300

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

305 310 315 320

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

325 330 335

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg

340 345 350

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

355 360 365

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

370 375 380

Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys

385 390 395 400

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

405 410 415

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

420 425 430

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

435 440 445

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

450 455 460

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

465 470 475 480

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

485 490 495

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

500 505 510

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

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Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

530 535 540

Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe

545 550 555 560

Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys

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580 585 590

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

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Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

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Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

645 650 655

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

660 665 670

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

675 680 685

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

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Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

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Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

725 730 735

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

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His Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu

755 760 765

Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala

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Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly

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Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile

805 810 815

Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly

820 825 830

Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu

835 840 845

Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu

850 855 860

Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ser Gly Val

865 870 875 880

Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu

885 890 895

Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser

900 905 910

Ala Phe Asp Gln Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr

915 920 925

Ala Leu Arg Pro Arg Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu

930 935 940

Gln Lys Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly

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Met Gly Lys Thr Thr Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg

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Asp Asp Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu

980 985 990

Gly Ala Ser Glu Thr Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu

995 1000 1005

Asp Gln Gly Glu Ile Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr

1010 1015 1020

Ser Ala Gln Ile Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala

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Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala

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Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr Leu Met Gly Ser Met

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Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu Asp Arg

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His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Leu

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Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg Glu

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Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala

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Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr

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Leu Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly

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Asp Leu Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys

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Arg Leu Arg Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser

1220 1225 1230

Pro Ala Gly Cys Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met

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Val Gln Thr His Val Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys

1250 1255 1260

Asp Leu Ala Arg Thr Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn

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<210> 19

<211> 3834

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> (抗GPC3 scFv CAR+hIL-7+hCCL19+HSV-TK)基因

<400> 19

atggactgga cctggaggat cctgttcctg gtggctgctg ccaccggagc tcacagcagc 60

caggtgcagc tgcagcagag cggagctgag ctggtgagac ctggcgccag cgtgaaactg 120

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgaga tgcactgggt gaagcagaca 180

cccgtgcacg gcctgaagtg gatcggagcc ctggacccca agaccggaga caccgcctac 240

agccagaagt ttaagggcaa ggccaccctc accgccgata agagctccag caccgcctac 300

atggagctga ggagcctgac ctccgaggac agcgccgtgt actattgcac caggttctac 360

agctacacct actggggcca gggaacactg gtgaccgtct ccggcggcgg cggcagcggc 420

ggcggaggca gcggcggcgg cggcagcgat gtggtgatga cacagacccc tctgagcctg 480

cctgtgagcc tgggagacca ggccagcatc agctgcagga gcagccagag cctggtgcac 540

agcaacggca acacatacct ccactggtac ctgcagaagc ctggccagag ccccaagctg 600

ctgatctaca aggtgagcaa caggttctcc ggcgtgcccg atagattcag cggctccggc 660

agcggcaccg actttaccct gaagatctcc agagtggagg ccgaggacct gggcgtgtac 720

ttttgcagcc agaacaccca cgtgcctcct accttcggct ccggcaccaa gctcgaaatc 780

aagagggcgg ccgcattcgt gccggtcttc ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg 840

ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 900

gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 960

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 1020

accctttact gcaaccacag gaacaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 1080

atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1140

ccacgcgact tcgcagccta tcgctcccgt ttctctgttg ttaaacgggg cagaaagaag 1200

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1260

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1320

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1380

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1440

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1500

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1560

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1620

cacatgcagg ccctgccccc tcgcgaattc ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt 1680

gaccttctca agttggcggg agacgtggag tccaaccctg gaccatgcat gttccatgtg 1740

agcttcaggt acatcttcgg actgcctcct ctcatcctgg tcctcctccc cgtggccagc 1800

tccgactgtg acatcgaagg aaaggatggc aagcagtacg aaagcgtgct gatggtgagc 1860

atcgatcagc tcctggattc catgaaggaa atcggctcca actgcctcaa caatgagttc 1920

aactttttta agaggcatat ctgcgacgcc aacaaggagg gcatgtttct gttcagggcc 1980

gccaggaagc tgagacagtt cctcaagatg aatagcaccg gcgacttcga cctccatctg 2040

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accaatgacg ctgaagactg ctgcctgtcc gtgacccaga agcctatccc cggatatatc 2460

gtgaggaatt ttcattacct cctgatcaag gacggctgta gagtgcccgc cgtcgtgttc 2520

acaacactca gaggcaggca gctgtgtgct ccccccgacc agccttgggt ggagagaatc 2580

attcagagac tgcaaaggac ctccgctaag atgaagagga ggtccagcgg cagcggagtg 2640

aagcagacac tgaatttcga cctgctcaag ctggccggcg atgtggagag caaccctgga 2700

cctatggctt cctaccccgg acatcagcac gcttccgcct tcgaccaggc cgctagaagc 2760

agaggacact ccaatagaag gacagccctg aggcctagga gacagcagga ggccaccgag 2820

gtgaggcccg agcagaaaat gcccaccctg ctgagagtgt atattgatgg accccacggc 2880

atgggaaaaa ccaccacaac ccagctgctg gtggctctgg gaagcaggga tgatattgtg 2940

tacgtccccg aacctatgac atattggagg gtcctcggcg cctccgagac catcgccaac 3000

atttacacca cccagcacag gctggatcag ggagagatct ccgccggcga tgctgccgtg 3060

gtgatgacca gcgcccagat cactatgggt atgccttatg ccgtgaccga cgctgtgctg 3120

gctcctcaca ttggcggcga agccggatcc tcccatgctc cccctcctgc cctcacactg 3180

atctttgaca gacatcctat cgccgctctg ctgtgctacc ccgccgctag gtacctgatg 3240

ggcagcatga cccctcaggc cgtgctggct tttgtggccc tcattccccc cacactgcct 3300

ggcacaaata tcgtgctcgg cgccctgcct gaggacaggc acatcgatag gctggctaag 3360

agacagagac ccggagagag gctggatctc gctatgctgg ccgccatcag gagggtgtac 3420

ggcctgctgg ccaacaccgt gagatatctc cagtgtggcg gatcctggag ggaagactgg 3480

ggccaactga gcggcacagc tgtgcctcct caaggcgctg agccccagag caacgctgga 3540

cccagacctc acatcggcga taccctgttc accctgttta gagcccctga gctcctggcc 3600

cctaacggcg acctgtacaa tgtgttcgct tgggccctgg atgtgctcgc caagagactc 3660

aggagcatgc acgtcttcat tctggactac gaccagtccc ccgctggctg cagagatgcc 3720

ctgctccagc tgacctccgg catggtgcag acccacgtga ccacccctgg aagcatcccc 3780

acaatctgcg acctggccag gacctttgcc agagaaatgg gagaagccaa ctga 3834

Claims

1.一种免疫活性细胞，其表达嵌合抗原受体(CAR)、白细胞介素7(IL-7)和趋化因子配体19(CCL19)，所述CAR包含与由序列号11所示的氨基酸序列构成的来源于人GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的多肽特异性结合的单链抗体、融合于该单链抗体的羧基末端的跨膜区和融合于该跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区，所述CAR中，

所述单链抗体包含：

2.根据权利要求1所述的免疫活性细胞，其中，所述CAR中，单链抗体包含：

3.根据权利要求1或2所述的免疫活性细胞，其中，所述CAR中，

4.根据权利要求1或2所述的免疫活性细胞，其中，所述CAR中，跨膜区和融合于该跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区包含与序列号14～16中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列。

5.根据权利要求3所述的免疫活性细胞，其中，所述CAR中，跨膜区和融合于该跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区包含与序列号14～16中的任一者所示的氨基酸序列具有至少80％以上的序列一致性的氨基酸序列。

6.一种抗癌剂，其含有权利要求1～5中任一项所述的免疫活性细胞和药学上可接受的添加剂。

7.编码嵌合抗原受体(CAR)的基因、编码白细胞介素7(IL-7)的基因和编码趋化因子配体19(CCL19)的基因，所述CAR包含与由序列号11所示的氨基酸序列构成的来源于人GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的多肽特异性结合的单链抗体、融合于该单链抗体的羧基末端的跨膜区和融合于该跨膜区的羧基末端的免疫活性细胞活化信号转导区，

所述单链抗体包含：

8.一种载体，其包含启动子和以能够工作的方式连接于该启动子的下游的权利要求7所述的基因。