CN112538519A - 一种酶促低场核磁共振dna传感器检测食源性致病菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，主要内容是将Mn(VII)/Mn(II)作为信号读出系统，结合DNA杂交技术，构建以DNA杂交为基础的磁传感器，该方法首先根据致病菌的基因序列设计并合成与该基因互补的正向探针和反向探针，将正向探针偶联在纳米磁颗粒表面，用于特异性地富集待测致病菌DNA片段，然后加入生物素标记的反向探针，形成DNA互补链，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(ALP)，形成“磁纳米颗粒‑DNA杂交双链‑ALP”的夹心结构，该夹心结构的含量与待测致病菌中的DNA含量成正相关。该方法不需要DNA扩增，提高了DNA分子检测的效率，拓宽了基于超顺纳米磁颗粒的低场核磁共振传感器的应用范围，进而为食源性致病菌的检测提供一种有力的工具。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和食品安全领域，具体而言，本发明涉及一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法。
背景技术
食源性致病菌是导致食品安全问题的一个重要的因素，快速、高灵敏检测食源性致病菌对保障食品安全具有重要的意义。目前主要的检测方法有微生物培养法、免疫检测方法和PCR分子诊断方法。微生物培养法需要较长的培养时间，操作步骤繁琐，不适合现场、快速检测。免疫检测方法，主要包括酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析试纸条法。酶联免疫吸附法需要多步操作，检测时间较长，同时灵敏度也不能满足样品中痕量的食源性致病菌检测的需要，而胶体金免疫层析试纸条的方法，具有检测速度快，一步操作即可完成的优势，但其灵敏度比酶联免疫吸附法还低，无法实现低浓度的食源性致病菌的检测。PCR分子诊断方法是检测致病菌的金标准，但其需要昂贵的设备和洁净的环境，并且需要多轮的扩增，不适合现场分析。
因为一般生物或者食品样品中磁信号背景极低，因此基于弛豫时间信号改变的低场核磁共振生物传感器具有样品前处理简单的优点，其在食品安全、临床诊断和环境监测等领域得到越来越广泛的应用。目前，磁弛豫时间传感器主要包括：(1)基于磁颗粒状态改变的横向弛豫时间(T2)生物传感器：磁颗粒表面偶联有抗体或适配体之类的特异性生物识别分子，在均匀磁场中，通过特异性结合，目标物会诱导磁颗粒状态的变化(分散或聚集)，同时会改变磁场的均匀度进而引起周围水分子质子T2的改变；(2)将磁分离和磁弛豫时间相结合的磁弛豫时间免疫传感器：基于粒径大小不同的磁颗粒在同一磁场中分离速度的显著差异，从而将免疫磁富集和磁弛豫时间免疫分析方法结合起来，实现磁分离和磁信号检测一步完成。这些磁弛豫时间传感器都是基于超顺纳米磁颗粒产生信号，而当检测复杂样品时会造成磁颗粒自身的聚集或非特异性吸附，产生假阳性结果；另外，制备稳定性好的超顺纳米小磁颗粒的工艺比较复杂，成本也比较高，重复和稳定性都有待进一步提高，因此需要开发稳定性更好、成本更低、可操作性更强的磁信号探针。
相比于超顺纳米磁颗粒，将顺磁离子作为磁信号探针有着独特的优势：(a)稳定性好、成本低，相比传统的纳米磁颗粒，顺磁离子水溶液稳定性更好，成本更低；(b)纳米磁颗粒在复杂基质中容易发生聚集，造成分析结果不稳定，但顺磁离子则可以很好地避免这个问题，因此抗干扰能力更强；(c)很多类型的氧化还原反应可以实现顺磁离子价态的转换，实现磁信号(T2)的变化，进而可以检测一系列的目标物，并且能够同时实现生化分析和免疫分析。可见，此类传感器将在众多领域发挥越来越重要的作用。Fe(III)/Fe(II)，Cu(II)/Cu(I)都是常见的顺磁离子，其不同价态的转变都可以导致横向弛豫时间(T2)或者纵向弛豫时间(T1)的改变，但Fe(III)/Fe(II)，Cu(II)/Cu(I)这两组顺磁离子价态的改变导致的T2信号变化有限，因为这两组不同价态的顺磁离子本身都有磁信号，只是磁信号由弱变强，因此该磁信号的改变不显著，很难用于复杂食品样品中痕量食源性致病菌的分析。
因此，寻找一组稳定性好、磁信号零背景的顺磁离子对作为磁信号转化探针，构建一种灵敏度高的低场核磁共振生物传感器检测食源性致病菌显得尤为重要。在实验中，我们发现Mn(VII)的T2或者T1信号几乎为零，而Mn(II)的T2或者T1信号很强，因此通过将Mn(VII)还原成Mn(II)离子，即可以实现磁信号从无到有，是一种信号打开的模式，有利于提高方法的灵敏度。因此，本发明的主要内容是将Mn(VII)/Mn(II)作为信号读出系统，结合DNA杂交技术，构建了以DNA杂交为基础的分子诊断磁生物传感器，应用于食源性致病菌的检测(图1)。在该方法中，我们首先通过NCBI寻找食源性致病菌的基因序列，再利用数据库设计与该基因互补的正向探针和反向探针并修饰上氨基，其中正向探针偶联在羧基磁纳米颗粒表面，反向探针进行生物素化，用于特异性地杂交从待测致病菌中提取的DNA片段，形成DNA互补链。通过磁分离得到“磁纳米颗粒-正向探针-DNA分子-反向探针”复合物，再加入链霉亲和素标记的ALP，通过生物素-链霉亲和素系统可以最终形成“磁颗粒-DNA杂交双链-ALP”的夹心结构。该夹心结构的含量和待测致病菌中的DNA含量成正相关，这也是本方法的定量基础。由于ALP催化的Mn(VII)/Mn(II)磁信号转换系统的效率高，方法灵敏度高，因此相比传统的PCR方法，本方法不需要对待测致病菌的DNA进行扩增，进而可以大大提高检测效率，缩短检测时间。而且没有DNA扩增步骤，可以减少假阳性率的产生以及降低对周围环境的要求。因此，该ALP催化的Mn离子诱导的低场核磁共振生物传感器将为食源性致病菌的检测提供全新有力的工具。另外，相比于基于纳米磁颗粒的传统低场核磁共振生物传感器，该基于顺磁离子的传感器具有两个独特的优势：(1)稳定性好：相比于纳米磁颗粒探针，Mn离子探针的稳定性更好；(2)灵敏度更高：在该系统里面，有ALP对底物的酶促信号放大的作用，并且其产生的酶促产物(抗坏血酸)可以进一步使Mn(VII)转变为Mn(II)，实现信号的放大和读出，整个反应是一个信号级联放大的过程。
发明内容
为了弥补传统低场核磁共振传感器的不足，提高低场核磁共振传感器的稳定性和灵敏度，拓宽其应用的普适性。本发明旨在提供一种稳定性更好、灵敏度更高，能够实现食源性致病菌高效快速检测的基于DNA杂交的低场核磁共振传感器方法，为食品安全检测提供一种高效、准确、可行的解决方案。
具体地，为达到此目的，本发明提供以下技术方案：
一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：
1)根据食源性致病菌的基因组DNA序列设计并合成正向探针与反向探针；
2)将正向探针与磁纳米颗粒偶联，将反向探针进行生物素标记；
3)提取食源性致病菌的基因组DNA，与磁纳米颗粒-正向探针偶联物以及生物素标记的反向探针进行杂交，磁分离后得到磁纳米颗粒-正向探针-DNA分子-反向探针复合物；
4)向步骤3)获得的复合物中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，利用生物素与链霉亲和素的特异结合能力，形成磁纳米颗粒-DNA杂交双链-碱性磷酸酶的夹心复合物；
5)将抗坏血酸磷酸酯溶液加入到步骤4)得到的夹心复合物中，使碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，磁分离后向反应液中加入KMnO4溶液，抗坏血酸将Mn(VII)还原成Mn(II)，低场核磁共振仪(LF-NMR)测定T2值并计算待测样品中的致病菌含量。
优选地，所述磁纳米颗粒是粒径为1000nm的COOH-MNPs。
优选地，所述生物素为EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin。
优选地，步骤3)中所述基因组DNA的A260/A280比值为1.7～1.9。
优选地，所述抗坏血酸磷酸酯溶液的浓度为15mM。
优选地，所述反应液中抗坏血酸的浓度为100-400μM，所述KMnO4溶液的浓度为0.25mM，所述反应液与KMnO4溶液的体积比为1：1。
优选地，所述碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸是在pH 7.0的纯水体系进行。
现结合本发明的构思，对本发明具体技术方案进一步阐述如下：
本发明将顺磁离子Mn离子作为T2信号探针，引入到传统的磁弛豫时间传感器中，通过特定的氧化还原反应，实现MnO4 -向Mn2+的转变。由于MnO4 -对水分子氢质子T2的影响极其微弱，而Mn2+对水分子氢质子T2有超强的改变能力，基于这一显著差异，从而实现目标物和T2之间的转换。由于氧化还原反应的多样性，并且很多生化分析指标本身具有氧化/还原的性质，因此本发明可以直接通过氧化还原反应，实现对生化指标的高灵敏度响应。同时，可以通过DNA杂交技术和生物素-链霉亲和素信号放大系统构建磁传感器，催化碱性磷酸酶的底物产生具有还原性的物质，进而可以诱导MnO4 -向Mn2+转化实现对食源性致病菌的高灵敏检测。
本发明的技术方案具有但不限于以下有益效果：
本发明将Mn(Ⅱ)T2信号作为信号读出方式引入到DNA分子诊断系统中，摆脱了纵向弛豫时间(T1)作为磁信号导致磁传感器分析时间长的问题，极大地提升了分析速度和方法稳定性。同时，通过氧化还原反应，可以调节水溶液中MnO4 -和Mn2+浓度，由于MnO4 -和Mn2+引起水分子氢质子T2改变的能力存在显著的差异，因此可以通过DNA杂交反应构建磁传感器，并通过碱性磷酸酶催化实现对食源性致病菌的高灵敏、定量地分析，大大拓宽了基于超顺纳米磁颗粒磁弛豫时间传感器检测范围的限制，极大地提高了分析效率，进而为食品安全的前期防控和临床诊断的预判提供一种有力的工具。
更为重要的是，该磁传感器是采用锰离子的信号，克服了传统磁传感器都需要纳米磁颗粒的这个缺点，而且本方法只需要配制一定浓度的高锰酸钾溶液，比合成粒径均匀、悬浮稳定性好的纳米磁颗粒更加简单，成本更低，稳定性更好。因此，本发明方法可以克服传统磁传感器大部分依赖于纳米磁颗粒的这个缺点，进而大大简化了整个磁信号分析过程，提高了整个方法的稳定性。而且该方法只需要设计致病菌相应的探针即可实现对不同致病菌的检测，在食品安全快速检测、环境病原菌监测等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明工艺路线和检测原理示意图。
图2是T2值的改变量与抗坏血酸浓度之间的响应关系曲线图。
图3是不同KMnO4溶液与抗坏血酸溶液之间的响应关系曲线图。
图4是加入抗坏血酸前后溶液中锰元素的XPS谱图。
图5是T2值的改变量与碱性磷酸酶浓度之间响应关系的曲线图。
图6是不同缓冲体系下T2值的改变量与碱性磷酸酶浓度之间响应关系的曲线图。
图7是不同浓度抗坏血酸磷酸酯作为底物时T2值的改变量与碱性磷酸酶浓度之间响应关系的曲线图。
图8是三种T2磁传感器分别对抗坏血酸和碱性磷酸酶的响应灵敏度，图中，A为锰离子、铜离子、铁离子三种顺次离子介导的T2磁传感器分别对抗坏血酸的响应灵敏度，B为锰离子、铜离子、铁离子三种顺次离子介导的T2磁传感器分别对碱性磷酸酶的响应灵敏度。
图9是DNA磁传感方法检测沙门氏菌的标准曲线。
图10是该DNA磁传感器检测沙门氏菌的特异性。
图11是该传感器与荧光定量PCR方法检测沙门氏菌的灵敏度比较；图中，A为T2值的改变量及吸光值的改变量随着沙门氏菌浓度变化曲线，B为T2值的改变量及吸光值的改变量和沙门氏菌浓度变化之间的线性关系。
图12是DNA磁传感方法检测大肠杆菌的标准曲线。
图13是DNA磁传感方法检测李斯特菌的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本实施例中使用的主要试剂和仪器如下：
试剂和材料：
碱性磷酸酶(ALP)和抗坏血酸磷酸酯(AAP)来自Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白(Amresco,USA)，1000nm COOH-MNPs(Ocean NanoTech,USA)，Sulfo-NHS-LC-LC-生物素和细菌基因组DNA提取试剂盒来自赛默飞公司；链霉亲和素标记的碱性磷酸酶来自碧云天生物技术有限公司；沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌均来自美国菌种保藏中心(ATCC)；沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌的正向探针及反相探针由武汉擎科生物设计合成并在5’末端修饰氨基，其中沙门氏菌设计探针用于实时荧光PCR，探针5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。TE缓冲液和DNA杂交缓冲液来自上海双螺旋生物科技有限公司。
磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.00g NaCl,0.20g KCl,0.20g KH2PO4和2.90g Na2HPO4·12H2O溶于1000mL水中，摇匀；
封闭液：称取0.4g BSA于40mL PBS中，摇匀，配成1％BSA封闭液；
洗涤液：在配制好的1000mL磷酸盐缓冲液中加入0.5mL吐温-20，摇匀，配成PBST洗涤液。
Tris-HCl缓冲液：50mL 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与29.2mL0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100mL得到pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。
MES缓冲液：取21.325g MES溶解于1000mL去离子水中配制成0.1M(A)溶液，取4.0gNaOH溶解于1000mL去离子水中配成0.1M(B)溶液，将(A)/(B)溶液以体积比5:2混合即得pH6.0的MES缓冲液。
仪器：0.5T小型核磁共振仪购自上海纽迈电子科技有限公司；超微量分光光度计NanoPhotometer N60购自德国IMPLEN公司。
实施例1
碱性磷酸酶(ALP)是免疫分析中应用极为广泛的一种标记酶，同时ALP可以催化其底物(抗坏血酸磷酸酯)产生具有还原性的抗坏血酸(AA)，该AA介导的氧化还原反应可以实现MnO4 -向Mn2+的转化，从而导致T2信号的改变。鉴于MnO4 -的强氧化性和AA的强还原性，ALP催化的氧化还原反应可以实现对AA的超灵敏响应。基于这一原理，可以构建磁DNA传感器实现对不同目标物的检测。
1)T2磁传感器对抗坏血酸(AA)的响应
将100μL不同浓度(1,2,5,10,20,50,100,200,300,400,500和1000μM)的抗坏血酸溶液分别加入到100μL的0.25mM KMnO4溶液中，反应5分钟，将200μL混合液用低场核磁共振仪(LF-NMR)测T2信号，其结果如图2所示，T2值的改变量随着抗坏血酸浓度的升高而变大，说明两者之间具有极好的响应关系。其中，当抗坏血酸浓度为100-400μM时，响应关系最佳。
将100μL不同浓度(10,50,100,200,300,400和500μM)的抗坏血酸溶液分别加入到100μL的不同浓度的KMnO4溶液中，反应5分钟，将200μL混合液用LF-NMR测T2信号，其结果如图3所示，各浓度KMnO4溶液均对抗坏血酸有一定响应，其中，当KMnO4溶液浓度为0.25mM时，响应关系最佳。
将加入抗坏血酸前后的KMnO4溶液固定干燥后进行XPS测试，其结果如图4所示，说明抗坏血酸与KMnO4溶液反应后生成了Mn2+，从而产生了磁信号的变化。
2)T2磁传感器对碱性磷酸酶(ALP)的响应
将碱性磷酸酶(ALP)用纯水分别稀释至0.01,0.05,0.5,1,5,10,100,500,1000,2000,4000U/L，加入60μL纯水和20μL抗坏血酸磷酸酯(15mM)于37℃孵化0.5小时。然后将100μL上述混合液加入到100μL的0.25mM KMnO4中，混合液于37℃孵化5分钟。最后将200μL反应液用LF-NMR测定T2值。实验结果如图5所示，表明T2值的变化量与ALP浓度之间存在良好的响应关系。其中，当碱性磷酸酶≥500U/L，具有最佳的响应关系。
将碱性磷酸酶(ALP)用MES缓冲液(pH＝6.0)、纯水(pH＝7.0)和Tris-HCl缓冲液分别稀释至100,500,1000,2000,3000,4000,5000U/L，加入60μL对应的缓冲液和20μL抗坏血酸磷酸酯(15mM)于37℃孵化0.5小时。然后将100μL上述混合液加入到100μL的0.25mMKMnO4中，混合液于37℃孵化5分钟。最后将200μL反应液用LF-NMR测定T2值。实验结果如图6所示，表明在纯水(pH＝7.0)体系中T2值的变化量与ALP浓度之间存在更好的响应关系。
将碱性磷酸酶(ALP)用纯水分别稀释至100,500,1000,2000,3000,4000,5000U/L，加入60μL纯水和20μL不同浓度抗坏血酸磷酸酯(10,15,20mM)于37℃孵化0.5小时。然后将100μL上述混合液加入到100μL的0.25mM KMnO4中，混合液于37℃孵化5分钟。最后将200μL反应液用LF-NMR测定T2值。实验结果如图7所示，表明使用15mM抗坏血酸磷酸酯作为ALP底物时，ALP浓度与T2值的变化量之间具有更好的响应关系。
3)三种T2磁传感器对AA和ALP响应灵敏度比较
将100μL不同浓度(1,2,5,10,20,50,100,200,300,400,500和1000μM)的抗坏血酸溶液分别加入到100μL的2.5mM CuCl2或4mM FeCl3溶液中，反应5分钟；
将碱性磷酸酶(ALP)用纯水分别稀释至0.01,0.05,0.5,1,5,10,100,500,1000,2000,4000U/L，加入60μL纯水和20μL抗坏血酸磷酸酯(25mM)于37℃孵化0.5小时，然后将100μL上述混合液加入到100μL的2.5mM CuCl2或4mM FeCl3溶液中，混合液于37℃孵化5分钟。
最后将200μL反应液分别用LF-NMR测定T2值。实验结果如图8所示，表明锰离子与铜离子和铁离子相比，对AA和ALP具有更灵敏的响应信号，因此Mn(VII)/Mn(II)是一个更加有效的T2信号读出系统。
实施例2 DNA磁传感器检测沙门氏菌
(1)磁纳米颗粒-正向探针偶联：取200μL 1000nm COOH-MNPs，用MEST洗涤两次；加入MES(pH 6.0)溶解的200μL EDC(5mg/mL)和200μL NHS(5mg/mL)在37℃下活化30分钟；磁分离后用MEST洗涤两次；再加入0.1mg沙门氏菌正向探针，并加入PBST(pH 7.4)至总体积为500μL，温和振荡反应3小时，磁分离，加入1.0mL PBST反应30分钟，封闭未结合的位点；用PBST洗涤4～5次，最后用2mL PBS重悬保存于4℃备用。
正向探针序列：5’-TTTTTTTTTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’。
(2)反向探针生物素化：首先将EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-生物素用二甲基甲酰胺稀释至1mg/mL，将沙门氏菌反向探针用PBS稀释至1mg/mL；再将两者以摩尔比20:1(生物素/反向探针)的比例混匀，在室温下震荡反应4小时实现反向探针的生物素化；反应结束后将混合液转移至干净的透析袋中，置于4℃冰箱中透析4小时除去剩余的生物素和离子；最后经生物素标记的反向探针保存在﹣20℃备用。
反向探针序列：5’-TTTTTTTTTTCATCGCACCGTCAAAGGAAC-3’。
(3)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取经培养后浓度为108CFU/mL的沙门氏菌基因组DNA，并用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度，保证A260/A280比值在1.7～1.9之间方可用于下一步实验。
(4)将所提取的DNA模板梯度稀释10,102,103,104,105,106,2×106,5×106,107倍，各取100μL于1.5mL离心管中，并分别加入100μL磁纳米颗粒-沙门氏菌正向探针和100μL生物素化的沙门氏菌反向探针，混匀后在95℃水浴中裂解10分钟，冰浴冷却5分钟后置于50℃恒温杂交炉中反应1小时，生成磁纳米颗粒-正向探针-DNA分子-反向探针复合物。
(5)反应结束后，磁分离，用去离子水洗涤3次，再加入一定量的链霉亲和素标记的ALP，使生物素化的反向探针与链霉亲和素标记的ALP的质量比例为4:1，在37℃下反应30分钟，磁分离，将得到的磁纳米颗粒-DNA杂交双链-碱性磷酸酶的夹心复合物用去离子水洗涤3次，并用100μL去离子水重悬。
(6)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(15mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入60μL纯水和20μL(5)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(7)磁分离，取所得反应液80μL，加入80μL浓度为0.25mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(8)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如图9示出了T2值的改变量随着沙门氏菌浓度变化的示意图，表明该方法对沙门氏菌的检测具有很好的灵敏度和线性范围。
实施例3 DNA磁传感器检测沙门氏菌特异性实验
(1)用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取经培养后浓度为105CFU/mL的沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌基因组DNA，并用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度，保证A260/A280比值在1.7～1.9之间方可用于下一步实验。
(2)取各致病菌DNA模板100μL于1.5mL离心管中，并加入200μL磁颗粒-沙门氏菌正向探针和200μL生物素化的沙门氏菌反向探针，混匀后在95℃水浴中裂解10分钟，冰浴冷却5分钟后置于50℃恒温杂交炉中反应1小时。
(3)反应结束后，磁分离，用去离子水洗涤3次，再加入一定量的链霉亲和素标记的ALP，在37℃下反应30分钟，磁分离，复合物用去离子水洗涤3次，并用100μL去离子水重悬复合物。
(4)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(15mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入60μL纯水和20μL(3)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(5)磁分离，取所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.25mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(6)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如图10示出了T2值的改变量与不同致病菌之间的对应关系，表明该方法对沙门氏菌的检测具有很好的特异性。
实施例4 DNA磁传感器与荧光定量PCR方法灵敏度比较
(1)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取经培养后浓度为108CFU/mL的沙门氏菌基因组DNA，并用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度，保证A260/A280比值在1.7～1.9之间方可用于下一步实验。
(2)将所提取的DNA模板梯度稀释10,102,103,104,105,106,2×106,5×106,107倍用于实时荧光PCR扩增。
(3)实时荧光PCR反应体系为10×PCR缓冲液2.5μL、沙门氏菌引物对(10μmol/L)各1μL、探针(10μmol/L)1μL、dNTP(10μmol/L)1μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL、模板DNA(1μg)2μL，去离子水补至25μL。
(4)实时荧光PCR反应参数为95℃预变性3min，94℃变性5s，60℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光，进行40个循环，4℃保存反应产物。根据Ct值判断扩增的有效性，并以沙门氏菌浓度为横坐标，Ct值为纵坐标建立检测沙门氏菌的标准曲线。
(5)相同的DNA模板按照上述DNA杂交方法，用DNA磁传感器对沙门氏菌进行检测，其结果与实时荧光定量PCR进行比较，两者实验结果如图11所示，表明DNA磁传感器方法与实时荧光定量PCR法有着相同的灵敏度和更宽的线性范围。
实施例5 DNA磁传感器检测沙门氏菌加标回收测定
(1)在牛奶样品中加入一定浓度的沙门氏菌菌液至其浓度分别为107，105，103CFU/mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取牛奶中沙门氏菌基因组DNA，并用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度，保证A260/A280比值在1.7～1.9之间方可用于下一步实验。
(2)取各基因组DNA模板100μL于1.5mL离心管中，并加入100μL磁颗粒-沙门氏菌正向探针和200μL生物素化的沙门氏菌反向探针，混匀后在95℃水浴中裂解10分钟，冰浴冷却5分钟后置于50℃恒温杂交炉中反应1小时。
(3)反应结束后，磁分离，用去离子水洗涤3次，再加入一定量的链霉亲和素标记的ALP，在37℃下反应30分钟，磁分离，复合物用去离子水洗涤3次，并用100μL去离子水重悬复合物。
(4)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(15mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入60μL纯水和20μL(3)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(5)磁分离，取所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.25mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(6)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如表1示出牛奶中不同沙门氏菌加标水平的加标回收率及变异系数，表明该方法对沙门氏菌的检测具有良好的准确性和精密度。
表1牛奶中不同沙门氏菌加标水平的加标回收率
实施例6 DNA传感器检测大肠杆菌
(1)磁颗粒-正向探针偶联：取200μL 1000nm COOH-MNPs，用MEST洗涤两次；加入MES(pH 6.0)溶解的200μL EDC(5mg/mL)和200μL NHS(5mg/mL)在37℃下活化30分钟；磁分离后用MEST洗涤两次；再加入0.1mg大肠杆菌正向探针，并加入PBST(pH 7.4)至总体积为500μL，温和振荡反应3小时，磁分离，加入1.0mL PBST(含1％BSA)反应30分钟，封闭未结合的位点；用PBST洗涤4～5次，最后用2mL PBS重悬保存于4℃备用。
大肠杆菌正向探针：5’-TTTTTTTTTTTTATTGCGCTGAAGCCTTTG-3’。
(2)反向探针生物素化：首先将Sulfo-NHS-LC-LC-生物素用二甲基甲酰胺稀释至1mg/mL，同样将大肠杆菌反向探针用PBS稀释至1mg/mL；再将两者以摩尔比20:1(生物素/反向探针)的比例混匀，在室温下震荡反应4小时实现反向探针的生物素化；反应结束后将混合液转移至干净的透析袋中，置于4℃冰箱中透析4小时除去剩余的生物素和离子；最后经生物素标记的反向探针保存在﹣20℃备用。
大肠杆菌反向探针：5’-TTTTTTTTTTTTCGAGTACATTGGCATCGTG-3’。
(3)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取经培养后浓度为108CFU/mL的大肠杆菌基因组DNA，并用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度，保证A260/A280比值在1.7～1.9之间方可用于下一步实验。
(4)将所提取的DNA模板梯度稀释10,102,103,104,105,106,107,2×107,5×107,108倍，各取100μL于1.5mL离心管中，并分别加入100μL磁颗粒-大肠杆菌正向探针和100μL生物素化的大肠杆菌反向探针，混匀后在95℃水浴中裂解10分钟，冰浴冷却5分钟后置于50℃恒温杂交炉中反应1小时。
(5)反应结束后，磁分离，用去离子水洗涤3次，再加入一定量的链霉亲和素标记的ALP，在37℃下反应30分钟，磁分离，复合物用去离子水洗涤3次，并用100μL去离子水重悬复合物。
(6)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(15mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入60μL纯水和20μL(5)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(7)磁分离，取所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.25mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(8)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如图12示出了T2值的改变量随着大肠杆菌浓度变化的示意图，表明该方法可以实现对大肠杆菌的高灵敏度检测并且具有很好的线性范围。
实施例7 DNA传感器检测李斯特菌
(1)磁颗粒-正向探针偶联：取200μL 1000nm COOH-MNPs，用MEST洗涤两次；加入MES(pH 6.0)溶解的200μL EDC(5mg/mL)和200μL NHS(5mg/mL)在37℃下活化30分钟；磁分离后用MEST洗涤两次；再加入0.1mg李斯特菌正向探针，并加入PBST(pH 7.4)至总体积为500μL，温和振荡反应3小时，磁分离，加入1.0mL PBST(含1％BSA)反应30分钟，封闭未结合的位点；用PBST洗涤4～5次，最后用2mL PBS重悬保存于4℃备用。
李斯特菌正向探针：5’-TTTTTTTTTTTTTCACGAGAGCACCTGGAT-3’。
(2)反向探针生物素化：首先将Sulfo-NHS-LC-LC-生物素用二甲基甲酰胺稀释至1mg/mL，同样将李斯特菌反向探针用PBS稀释至1mg/mL；再将两者以摩尔比20:1(生物素/反向探针)的比例混匀，在室温下震荡反应4小时实现反向探针的生物素化；反应结束后将混合液转移至干净的透析袋中，置于4℃冰箱中透析4小时除去剩余的生物素和离子；最后经生物素标记的反向探针保存在﹣20℃备用。
李斯特菌反向探针：5’-TTTTTTTTTTTGACAGGAAGAACATCGGGT-3’。
(3)用细菌基因组DNA提取试剂盒提取经培养后浓度为108CFU/mL的李斯特菌基因组DNA，并用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度，保证A260/A280比值在1.7～1.9之间方可用于下一步实验。
(4)将所提取的DNA模板梯度稀释10,102,103,104,105,106,2×106,5×106,107倍，各取100μL于1.5mL离心管中，并分别加入100μL磁颗粒-李斯特菌正向探针和100μL生物素化的李斯特菌反向探针，混匀后在95℃水浴中裂解10分钟，冰浴冷却5分钟后置于50℃恒温杂交炉中反应1小时。
(5)反应结束后，磁分离，用去离子水洗涤3次，再加入一定量的链霉亲和素标记的ALP，在37℃下反应30分钟，磁分离，复合物用去离子水洗涤3次，并用100μL去离子水重悬复合物。
(6)配制抗坏血酸磷酸酯溶液(15mM)，取20μL加入到1.5mL离心管中，再加入60μL纯水和20μL(5)中所得重悬液，在37℃下反应30分钟。
(7)磁分离，取所得混合液80μL，加入80μL浓度为0.25mM的KMnO4，置于37℃孵化5分钟。
(8)最后，将160μL反应液用LF-NMR测定T2值，实验结果如图13示出了T2值的改变量随着李斯特菌浓度变化的示意图，表明DNA传感器对李斯特菌的检测具有很好的灵敏度和线性范围。
Claims (7)
1.一种酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)根据食源性致病菌的基因组DNA序列设计并合成正向探针与反向探针；
2)将正向探针与磁纳米颗粒偶联，将反向探针用生物素进行标记；
3)提取食源性致病菌的基因组DNA，与磁纳米颗粒-正向探针偶联物以及生物素标记的反向探针进行杂交，磁分离后得到磁纳米颗粒-正向探针-DNA分子-反向探针复合物；
4)向步骤3)获得的复合物中加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，利用生物素与链霉亲和素的特异亲和能力，形成磁纳米颗粒-DNA杂交双链-碱性磷酸酶的夹心复合物；
5)将抗坏血酸磷酸酯溶液加入到步骤4)得到的夹心复合物中，碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，磁分离后向反应液中加入KMnO4溶液，抗坏血酸将Mn(VII)还原成Mn(II)，低场核磁共振仪测定T2值并计算待测样品中的致病菌含量。
2.如权利要求1所述酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述磁纳米颗粒是粒径为1000nm的COOH-MNPs。
3.如权利要求1所述酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述生物素为EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-LC-Biotin。
4.如权利要求1所述酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：步骤3)中所述基因组DNA的A260/A280比值为1.7～1.9。
5.如权利要求1所述酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述抗坏血酸磷酸酯溶液的浓度为15mM。
6.如权利要求1所述酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述反应液中抗坏血酸的浓度为100-400μM，所述KMnO4溶液的浓度为0.25mM，所述反应液与KMnO4溶液的体积比为1：1。
7.如权利要求1所述酶促低场核磁共振DNA传感器检测食源性致病菌的方法，其特征在于：所述碱性磷酸酶催化抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸是在pH 7.0的纯水体系进行。
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