CN112575010B - 山药不同组织荧光定量的内参基因及其引物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种山药不同组织荧光定量的内参基因及其引物与应用，属于薯蓣山药分子生物学技术领域。所述内参基因CKI‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。内参基因CKI‑2的PCR扩增引物核苷酸序列：上游引物如SEQ ID NO.2所示；下游引物如SEQ ID NO.3所示。本发明选取蛋白激酶I、myb、F‑box、肌动蛋白基因、EFl、bHLH13、eIF1、网格重链蛋白等基因作为不同组织的候选基因。通过qRT‑PCR结合RefFind对候选基因的稳定性进行评估，筛选出了在山药不同组织中表达较为稳定的内参基因，为后期开展山药生长发育和代谢机理的基因功能验证等研究工作提供参考依据。

Description

山药不同组织荧光定量的内参基因及其引物与应用

技术领域

本发明属于薯蓣山药分子生物学技术领域，具体涉及一种山药不同组织荧光定量的内参基因及其引物与应用。

背景技术

基因表达研究最常规有效的手段之一，实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)技术，通过在PCR反应体系中添加特定的荧光基团，即可对整个PCR反应过程中产物变化进行实时监测，达到对目标基因的定性定量表达分析。但qRT-PCR受到RNA的质量、模板cDNA的质量、引物的特异性和PCR扩增率等因素的影响，qRT-PCR反应过程中需要选用合适的内参基因进行校正和标准化。目前，常用的看家基因有很多，包括肌动蛋白(actin)、核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)、转录延伸因子(elongation factor 1，EF1)和微管蛋白(tubulin beta，TUB)等的编码基因。国内外已开展不同物种、品种和组织内参基因筛选工作，研究表明，内参基因的表达是特异性的，适用于所有不同试验条件的内参基因并不存在。

关于山药内参基因的报道甚少，仅见花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)基因、花青素相关基因DaF3H和黄酮醇合成酶DaFLS1基因的克隆与表达，其中使用了Actin2、Actin1作为内参基因表达分析，但尚未分析内参基因的稳定性。筛选适合山药不同组织中的内参基因，对研究山药重要基因和蛋白表达具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种山药不同组织荧光定量的内参基因及其引物与应用。本发明筛选出在山药不同组织中表达较为稳定的内参基因，为后期开展山药生长发育和代谢机理的基因功能验证等研究工作提供参考依据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种山药不同组织荧光定量的内参基因，其特征在于，所述内参基因CKI-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，优选的是，所述内参基因CKI-2的PCR扩增引物核苷酸序列：上游引物如SEQ ID NO.2所示；下游引物如SEQ ID NO.3所示。

本发明同时提供所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法包括以下步骤：

S1、从候选内参基因中，选择E值接近零(E value=0.0)或者为零的12个基因序列；

S2、对步骤S2筛选的12个基因进行引物设计，并利用引物进行PCR扩增，验证引物的特异性；

S3、提取山药的茎尖、叶片、根和花束的总RNA，反转录合成第一链cDNA，采用S2设计的引物进行实时荧光定量PCR分析，计算Ct值，对步骤S1筛选的12个基因的表达稳定性进行分析；

S4、综合确定最稳定表达的山药不同组织荧光定量的内参基因。

进一步，优选的是，步骤S1中，12个基因为ACT-1、ACT-2、bHLH13、CKI-1、CKI-2、CHC-1、CHC-2、EFI、eIF1、F-box-1、F-box-2、myb。

进一步，优选的是，在步骤S2中，PCR反应体系为20μL：包括17.0μL Green Mix，1.0μL cDNA，1.0μL 10μmol/L上游引物，1.0μL 10μmol/L下游引物；

反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，退火温度60℃ 30s 及延伸温度72℃ 10s，循环30次。

进一步，优选的是，在步骤S3中，实时荧光定量PCR反应体系为20μL：包括10.0μLqPCR Master Mix (SYBR Green Ⅰ)，1.0μL cDNA，0.8μL 10 μmol/L上游引物，0.8μL 10 μmol/L下游引物，ROX 0.4μL，ddH₂O 7.0μL；

反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，循环40次。

进一步，优选的是，在步骤S4中，利用Delta CT、geNorm、Normfinder、BestKeeper、Comparative △Ct方法对各候选内参基因的表达稳定性进行分析。

本发明还提供所述的山药不同组织荧光定量的内参基因在山药基因表达分析中的应用。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明选取蛋白激酶I(casein kinaseI，CKI)、myb(myb family transcriptionfacto)、F-box(tubby-like F-box protein)、肌动蛋白基因(Actin， ACT)、EFl(Elongation Factor l)、bHLH13(Basic helix-loop-helix 13)、eIF1(eukaryotictranslation initiation factor)、网格重链蛋白(clathrin heavy chain，CHC)等12个基因作为不同组织的候选基因。通过qRT-PCR结合RefFind(http://www.ciidirsinaloa.com.mx/RefFinder-master/)在线对候选基因的稳定性进行评估，筛选出在山药不同组织中表达较为稳定的内参基因，为后期开展山药生长发育和代谢机理的基因功能验证等研究工作提供参考依据。

附图说明

图1为12个候选基因PCR扩增凝胶电泳图；

图2为CKI-2基因在山药不同组织中Plot峰；

图3为山药不同组织Ipt 1和Ipt 5b基因的相对表达量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

1 实施材料

以牛尾山药为实施材料，选择1.5-3g/个的隔年完整零余子种植于云南农业大学蔬菜大棚或植物实施台上，先催芽再种植管理。采集蔬菜大棚内山药的茎尖、叶片、根和花束共4个不同组织；植物实施台上萌芽后的珠皮，生长时期的地下块茎，6个组织称重分装后液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用。

2 内参基因引物设计

基于山药转录组CDS数据，选择12个基因其中包括肌动蛋白基因ACT、bHLH13、CKI、EFl、eIF1、F-box、myb和网格重链蛋白CHC1作为候选内参基因，获取的转录组序列通过NCBI中Blast-N进行核对，选择E值接近零或者为零的序列用于引物设计。按照qRT-PCR引物设计原则，Primer Blast在线设计引物序列（表1），并委托昆明擎科生物技术有限公司合成相应引物。

表1 山药候选内参基因qRT-PCR引物序列

3 总RNA的提取与cDNA第1链的合成

参照Eastep^TM Super总RNA提取试剂盒(上海产)使用说明书提取山药不同时不同组织(珠皮、茎尖、叶片、花束、块茎和根)的总RNA。通过质量浓度为1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性和纯度，使用 DeNOVIX DS-11仪检测RNA浓度。cDNA第1链的合成参照TSINGKE公司逆转录试剂盒Goldenstar ^TM RT6 cDNA Synthesis Kit说明书进行，获得cDNA保存于-20℃冰箱。

4 引物特异性PCR验证

以山药叶片cDNA为模板，PCR反应体系为20μL：包括17.0μL Green Mix，1.0μLcDNA，1.0μL上游引物(10μmol/L)，1.0μL下游引物(10μmol/L)。反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，循环30次。

5 实时荧光定量PCR扩增

试验利用ABI Quantstudio实时荧光定量PCR系统进行。qRT-PCR反应体系为20μL：包括10.0μL qPCR Master Mix (SYBR Green Ⅰ)，1.0μL cDNA，0.8μL上游引物(10 μmol/L)，0.8μL下游引物(10 μmol/L)，ROX 0.4μL，ddH₂O 7.0μL。反应条件： 95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，循环40次。

6 数据处理

通过Excel 2010软件对山药不同组织的RT-qPCR 数据整理和汇总；利用内参基因稳定性分析网址(http://www.ciidirsinaloa.com.mx/RefFinder-master/)，其中包括Delta CT、geNorm、Normfinder、BestKeeper and the comparative △Ct method 5个评估方法，评估不同内参基因的表达稳定性，具体分析步骤和参数设置参照陈敏敏等((陈敏敏，张茹佳，查倩等. 百合体胚诱导、发育及不同组织实时定量 PCR 内参基因筛选[J]. 分子植物育种, 2018, 16(15): 4982-4990.))数据处理分析方法。

7结果

7.1 RNA纯度及浓度分析

山药组织总RNA提取后，各样品总RNA无降解完整性好，总RNA浓度为476.759±22.937ng/uL，测A₂₆₀/A₂₃₀=1.830～2.327，A₂₆₀/A₂₈₀=1.908～2.086均符合要求，说明样本RNA完整性好、浓度高，可用于后续实施。

7.2 内参基因PCR特异性分析

以叶片的cDNA为模板，12个候选基因引物经PCR后获得清晰且单一的条带（如图1），说明引物特异性好可用于qRT-PCR实施。山药不同组织的内参基因引物上机检验仅有单一信号峰，无杂峰和非特异性扩增现象，表明引物用于qRT-PCR准确性高。

7.3 内参基因的表达丰度分析

基于已验证过的引物进行RT-qPCR扩增，通过分析候选内参基因的Ct值来评估基因在山药不同组织中的表达丰度。山药不同组织候选内参基因的Ct值在22.48～39.39间，Ct的最大值和最小值的差值从低到高排序：CKI-2＜EFI＜bHLH13＜eIF1＜MYB＜F-box-2＜ACT-2＜F-box-1＜ACT-1＜CKI-1＜CHC1-2＜CHC1-1，说明CKI-2、EFI、bHLH13、eIF1和MYB的表达丰度高，CKI-2的表达丰度最高。

由于Ct值与表达丰度呈负相关，即Ct差值越小则表达丰度越大，在山药不同组织中，CKI-2的Ct最值相对稳定，差值最小有较高的表达丰度。

7.4 内参基因表达的稳定性分析

基于RefFind在线评估基因的稳定，各软件的稳定值与排序结果如表2。山药不同组织中内参基因CKI-2在Delta CT、geNorm、Normfinder和BestKeeper 4个评估值中均排第一，最终Comparative△Ct也是第一，表明在山药不同组织中内参基因CKI-2是最稳定的管家基因。

表2 RefFind对不同组织中内参基因Ct值的评估结果

7.5 内参基因表达的稳定性验证

把CKI-2基因单独跑荧光定量，通过峰高验证内参基因的稳定性。CKI-2基因的溶解曲线温度是78～84℃， Plot峰高在不同组织中表达高度差异较小(如图2)，说明CKI-2基因的稳定性可靠。

7.6 内参基因的应用

以云南农业大学同源克隆所获得的山药Ipt 1基因（SEQ ID NO.4）和 Ipt 5b基因（SEQ ID NO.5）做目的基因，CKI-2基因为荧光定量的管家基因，进行qPCR反应，发现目标基因的相对表达量有显著变化趋势(如图3)，山药Ipt 1基因在珠皮中表达最高，Ipt 5b基因在叶中表达最好。说明本实例的结果可靠，所筛选获得的CKI-2内参基因适用于山药不同组织条件下功能基因的实时荧光定量分析。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南农业大学

云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 山药不同组织荧光定量的内参基因及其引物与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1162

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ccctaatatt attaggttca aagaggtcat attaactcct acccacctgg caattgttat 60

ggagtatgct tctgggggtg aactttttga gcgcatttgc aatgctggcc gcttcagtga 120

ggatgaggca cgtttctttt tccaacaact tatatcgggt gttagctact gtcattcaat 180

gcaagtatgc catcgtgact taaagctgga gaacacctta ctggatggaa gcgcggcccc 240

tcgtctgaag atatgtgatt ttggctattc taagtcatct gttctgcatt ctcaaccaaa 300

gtcaactgtt ggaactcctg catacattgc gcctgaagtg ttactcaaga aggagtatga 360

tggcaagatt gctgatgtat ggtcatgtgg agtgacattg tatgtcatgc tagtcggtgc 420

ataccctttc gaggatccgg aagagcccaa aaatttccgg aagactatac agcgaatcct 480

gggtgttcaa tattcaattc cagactatgt acacatatct cctgagtgcc aacacctaat 540

ctcaaggatt ttcgttgcca atccttccat gaggataaca attcctgaga tccgcaacca 600

tgaatggttt ttgaagaatc taccggcagg cttaattgat gagaacatga tgagtaacca 660

gtatgaggag cctgatcaac cgatgcaaag tatcgatgag ataatgcaga tcattgcaga 720

ggccaccata cctgcagctg gtactcgtgc tctgaaccca tatttgaccg ataacctcga 780

ccttgatgac gacatggagg atctggattc tgagcctgat ctcgacgtgg atagcagcgg 840

agaaatagta tatgcaatgt aactattgtg gttttctgct ggtgtatgaa aaacaatcag 900

gaaaggtggt tgtcaacgga cgctattcca aaccgaagat aaattgcgaa gattgaagat 960

tcagctgtct ggatgttaag gtatactccg agcatcaact ggaagaatca aaccctaagt 1020

ttacatcctt ctgttgattg tctgtgtaat gtatgtaggc acaacaactt gtttgcattg 1080

tcatgcctct gtatcttgaa actggtgact gtactatctt ggtttgttgt tgtttgttgt 1140

tgttgttgtt cttgttaatt at 1162

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ctgaacccat atttgaccga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

accacctttc ctgattgttt 20

<210> 4

<211> 1415

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

acgactcact atagggcctt tttttttttt ttttttcttt ttataagaaa gagggcaatg 60

ctgaaacgct gcaatgctca gctgacggaa ctgagaggtt gacgtcggtg ccggagaagg 120

aactgttggt ggtgggctcc gtcatcatcg tcaccggcgc cggcgccggc ggagatgcca 180

tctaggaagt ggcgcactgc ttcgatgctg ggccccacca cgtccctttc ccaggcttcg 240

acctgcttgt ctttgccggc gccgcatagc ctggcggcga tcactgcgct tgcgtccagc 300

cgtcggagcg cccacccgcg ctccaccaat cgcttgatct tcctcacctg cgcttcggcg 360

agccgccgcg tgttctcctt gatctccgcc acagccgtct cgaaccccgc cgcgctcttc 420

cccttttcaa agtacttctt gaattcaggg accccaatag ccttccccaa cccagcgtga 480

tcccggtctc cgccggctgc gaagtacgcc tccagctcgt ccaccatacc gtccccaatc 540

atctcatcca cccgccgatc aaggtactcg ccaagcaccg ccgcatcgac atcaacccat 600

aaaaagcagc accgatacct gaaccgctct cgccggacgg acccaaacgg gtcggaccgt 660

ggatcatagt gctccgcaag caacgcgtga atgtacgagt tcgacccgcc ggccagcact 720

gctcgatgac cacgggcagc aatccccgcg atgcacgaac tcgccaggga tcggaaccca 780

cccggcggga gttccccgcc gcaagggtca agctcaccga ggagatgatg cggcacgcca 840

catcgatcag caataggcat cttattcgtg gtgatgtcaa gccctctata aacctggatc 900

ttatcactgt taacaacctc accggaaaac ctagaagcga tgtcgatgga aagcttagac 960

ttgccggtac cggtagcgcc catgatgacg agtacatctt cattccttct cggatgatga 1020

tgatgttgat gttgatgatg atgatgatga aggtagtacc tccgactctg agcacaacag 1080

cgatggtgat ggttatccac agagtcggcg gcgatggtgg atacggaggt ggcggcagcc 1140

tccgcttgga gcgatggacg gaggagtctt gtcgcgttgc agttgatgat acttctagaa 1200

aataaatttt tcatatagtc caatgaatca ccacgactcg ctaaagaaga agatgatgat 1260

gaatggaatg gcaaagagaa gtaatgattg aatggaatgg gttgggtttc gcatgccaag 1320

cgtttgtcag tattcacaga agggaaccaa cagtgaatgc cgttgcgctc gagaccgaga 1380

ccgagaccga gaccgagagc atgagcaggg ctatc 1415

<210> 5

<211> 1289

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cttcactatc tactaccctt ttcaatccat tacttagatt ttgtcctcct tcttgttgtt 60

gttgttgttg ttgttgttgt tgttattgaa gaagaagaag atgatgacta tgtggccaaa 120

cccgcagggc tgcctgccgg aaagacaact acaaacaaca cccttaggat gccggcaagg 180

cctccaacct cccttccaac tctcacccat cacccctttc cacttgaatc ccaccacctt 240

ctccaagaac aacaaggtta tcttcgtcat gggcgcttcc ggcaccggaa aatctaacct 300

cgccatcgac ttagccaagc acttctccgg cgaggtcgtc aactccgaca aaatgcaagt 360

ataccaaggc cttgacatcc tcaccaacaa agtcaccgac gaggaacgtg caactgttcc 420

tcaccatctc atcggcgacg ttgaccctga cactgacttc accgccactg acttccgccg 480

tgctgccatg aaagccatag acgagattct ctctcgtgac catgtcccca tcgtcgctgg 540

tggttccaac tccttcattg aagaactcgt cgacggtgaa aacaaggagt ttagagccaa 600

gtacgaatgt tacttccttt gggtcgacgt cgacagtgac ctgctgcacg agttcgtgag 660

cccggaatct gattgcacgc gcgggatacg taggtccatc ggtgtgcccg agatgcaaga 720

ctacttctgt gccgaagcgt ccggcgccga ctcagacacg ctggctttgc ttctcggtaa 780

ggctatcgat gacatgaagg ctcatacgtg caggctaacg tgcggacagc tcttgaaaat 840

caataggttg aggttggagt gtggttggga gcttaacagg gtggatgcaa gcaaggtgtt 900

cgacggaagt tctagctggg aggagatagt cttgaagccg agctttgcgc tcgtgcagcg 960

cttcatggac ggtgaactgc cggaaaaaat ccgtgccggt gctgatgtcg atgtggttgt 1020

ggacttcgcg gcgttggggg cctcagcgta gcgtgtgcgt gtgcgcgtgt gtgaggagtt 1080

agtgcgtgga gccattgccg cacgcacgtg tgtcttagag ctaacccgtg ctgaatgatg 1140

atatatatta tattgttata taaatataaa ttataaatga tatatataat gtgtggtgtt 1200

ttaatgattt gtactaagag agtacatttt gggaggtttc tttaaaaaaa aaaaaaaagc 1260

cctatagtga gtcgaatctc acgctcttc 1289

Claims (7)

1.一种山药不同组织荧光定量的内参基因，其特征在于，所述内参基因CKI-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种山药不同组织荧光定量的内参基因，其特征在于，上游引物如SEQ ID NO.2所示；下游引物如SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求1所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、从候选内参基因中，选择E值接近零或者为零的12个基因序列；

S2、对步骤S1筛选的12个基因进行引物设计，并利用引物进行PCR扩增，验证引物的特异性；

S3、提取山药的茎尖、叶片、根和花束的总RNA，反转录合成第一链cDNA，采用S2设计的引物进行实时荧光定量PCR分析，计算Ct值，对步骤S1筛选的12个基因的表达稳定性进行分析；

S4、综合确定最稳定表达的山药不同组织荧光定量的内参基因。

4.根据权利要求3所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤S2中，PCR反应体系为20μL：包括17.0μL Green Mix，1.0μL cDNA，1.0μL 10μmol/L上游引物，1.0μL 10μmol/L下游引物；

反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，退火温度60℃ 30s 及延伸温度72℃10s，循环30次。

5.根据权利要求3所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤S3中，实时荧光定量PCR反应体系为20μL：包括10.0μL qPCR Master Mix SYBRGreen Ⅰ，1.0μL cDNA，0.8μL 10 μmol/L上游引物，0.8μL 10 μmol/L下游引物，ROX 0.4μL，ddH₂O 7.0μL；

反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，循环40次。

6.根据权利要求3所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤S4中，利用Delta CT、geNorm、Normfinder、BestKeeper和Comparative △Ct方法对各候选内参基因的表达稳定性进行分析。

7.权利要求1所述的山药不同组织荧光定量的内参基因在山药基因表达分析中的应用。

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