CN112592975A

CN112592975A - 关于dna损伤制剂用于癌症治疗的方法和组合物

Info

Publication number: CN112592975A
Application number: CN202011481549.9A
Authority: CN
Inventors: 肖恩·P·皮特罗达; 拉尔夫·R·维希瑟尔鲍姆; 菲利普·P·康奈尔
Original assignee: University of Chicago
Current assignee: University of Chicago
Priority date: 2013-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2021-04-02
Also published as: EP3049536A1; AU2014321200A1; CN112522408A; US20160369353A1; EP3049536A4; EP3543353A1; CN105793437B; CA2958290A1; CN105793437A; EP3049536B1; WO2015042570A1

Abstract

提供了预测DNA损伤剂对癌症病人的疗效以及在评估疗效之后用DNA损伤剂治疗癌症病人的方法和组合物。在一些实施方案中，用算法来评估疗效和治疗。

Description

关于DNA损伤制剂用于癌症治疗的方法和组合物

相关专利申请

本申请案主张2013年9月23日提交的美国临时专利申请案第61/881,331号之优先权益，并将其以引用的方式完全并入本文中。本申请是申请号为201480063952.6的分案申请，该母案的申请日为2014年09月23日，发明名称为：关于DNA损伤制剂用于癌症治疗的方法和组合物。

发明背景

Ⅰ.发明领域

本发明隶属生物化学和医药领域，尤其是涉及肿瘤学和癌症治疗的方法和组合物。

Ⅱ.相关技术的解释

同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)是修复放疗或某些化疗药物造成的双链DNA断裂(DSBs)的两种竞争途径。HR还具有附加功能，例如促进细胞对DNA损伤药物中断复制叉的耐受性(Thompson,et al.,2001)。同源重组(HR)和非同源端联(NHEJ)都可以使DNA修复，通过募集上游传感器/受体蛋白。同源重组(HR)途径通过标识一段伸展的同源DNA与复制该同源DNA模板来催化双链DNA断裂修复，而非同源末端连接(NHEJ)通过加工重连双链DNA断裂末端(Thompson，et al.,2001；Lieber,etal.,2004)。和同源重组(HR)一样，非同源末端连接(NHEJ)的标准径被认为能高保真地修复DNA(Arlt,et al.,2012；Guirouilh-Barbat,et al.,2004)。然而，一些双链DNA断裂(DSBs)在微同源-介导末端连接或者单链退火加工重连前经历了大量地降解，这都将导致缺失突变(Guirouilh-Barbat,etal.,2004；Bennardo,et al.,2008)。类似的，在DNA复制前，如果干扰复制的损伤不能妥善地修复，突变可能会出现。在这种情况下，这些损伤可能促使同源-介导聚合酶模板转换(Malkova,etal.,2012)。

这些修复过程的机能对致癌和恶性肿瘤进展有着重要的意义。和同源重组(HR)一样，非同源末端连接(NHEJ)的标准途径被认为能高保真地修复DNA(Arlt,et al.,2012；Guirouilh-Barbat,et al.,2004)。然而，一些双链DNA断裂(DSBs)在微同源-介导末端连接或者单链退火加工重连前经历了大量地降解，这都将导致缺失突变(Guirouilh-Barbat,etal.,2004；Bennardo,et al.,2008)。类似的，在DNA复制前，如果干扰复制的损伤不能妥善地修复，突变可能会出现。在这种情况下，这些损伤可能促使同源介导聚合酶模板转换(Malkova,et al.,2012)。

在癌症患者治疗过程中，这些修复进程的细胞机能将直接影响肿瘤的响应能力。最典型的例子是HR-缺陷的肿瘤对PARP抑制剂(Bryant，et al.,2004；Farmer,et al.,2004；O’Shaughnessy,et al.,2011)或铂类化疗(Edwards,et al.,2008；Sakai,et al.,2008)超敏。但目前，能从人体肿瘤活检样本中测试同源重组(HR)能力的可行方法是有限的(Willers,et al.,2009；Birkelbach,et al.,2013)。从临床样本中检测非同源末端连接(NHEJ)的方法也是有限的。一些研究显示，肿瘤中双链DNA断裂重连率已经可以测量(例如H2AX磷酸化动力)，并且快速双链DNA断裂重连可能预测出人类肿瘤对放射治疗和一些化疗药物的耐受性(reviewed in Redon,et al.,2012)。但是，单一一种能成功预测同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)相关效能的方法仍被需要。

发明概要

在某些实施方案中,提供的组合物和方法包括预测DNA损伤剂在癌症治疗中的疗效的方法，评估DNA损伤剂在癌症患者中疗效的方法，用DNA损伤剂治疗癌症病患的方法，癌症病患者预后的方法，和/或通过公式运算来用DNA损伤剂治疗癌症患者的方法。

这类方法和组合物可能涉及一些方法,其中包括检测患者生物样本中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、或32(或其中任何可推导出的区间范围)个基因的表达程度:RPA、ATRIP、ATR、Mre11/RAD50/NBS1、ATM、MDC1、BRCA1、53BP1、CtIP、RIF1、Ku70、Ku80、artemis、DNA-pk、XRCC4/Ligase IV、RAD51、Palb2、BRCA2、RAD52、XRCC3/RAD51C、XRCC2/RAD51B/RAD51D、RAD51AP1、BLM、PAR、RAD54L、RAD54B、Fbh1、WRN、PARI、HELQ、MYC、或者STAT3。在一些实施方案中，用于检测的基因可以包括选自于PARI、RAD51、BLM、RIF1、Ku80、BRCA1、RAD51AP1、RAD54B、PLK1、BRCA2、RAD51C及PALB2的包含至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12(或其中任何可推论出的区间范围)个基因。在另外一些实施方案中，用于检测的基因可以不包括损伤反应次级调控基因，例如TP53,PTEN，和细胞周期检查点基因或者CtIP、RAD51B、DNA-PKcs、PIAS4、XRCC3、XRCC2、RAD52、XRCC4、Artemis、RAD51D、WRN、RAD54L、HELQ、MDC1、LIG、PIAS1、Fbh1、RNF8、RNF4、或TP53BP1中一个或更多的基因。在一些实施方案中，可以通过测定上调DNA修复基因的转录因子来衡量所述基因表达水平，例如MYC或者STAT3。在特定实施方案中，RIF1，PARI,RAD51及KU80表达水平被检测。在具体实施方案中，光测量RIF1、PARI、RAD51及Ku80这4个基因表达。

在进一步的实施方案中，被检测的基因可能与复制压力和/或DSB修复途径直接关联，尤其是细胞对同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)偏好所涉及的基因。这些基因可能包含一个或多个NHEJ基因，包括NHEJ基因中涉及和DNA末端的亲和力，如Ku70或者Ku80，或者和DNA末端的连接，如Artemis,DNA-pk,或XRCC4/Ligase IV。这些基因也可以包含一个或更多的HR基因，例如某些编码RAD51装置的介导，如Palb2、BRCA2、RAD52、XRCC3/RAD51C、XRCC2/RAD51B/RAD51D、或RAD51AP1，或者一种能编码解旋酶或者转位酶的基因，如PARI、RAD54L、RAD54B、Fbh1、WRN、或HELQ。在进一步的实施方案中，这些基因可能包括，或者不包含一个或多个涉及损伤传感的基因，例如RPA、ATRIP、ATR、Mre11/RAD50/NBS1或ATM中的一个或多个基因。

基因转录本或者多肽的表达量可以被检测。基因转录本的表达可用多种分析方法评估，包括但不仅限于涉及杂交和/或扩增的检测，如RT-PCR、实时PCR或qPCR、微阵列芯片杂交、RNA测序等。蛋白质类表达分析方法也可行，例如利用一个或多个特异性结合多肽的抗体。可用的方法可包括，但不局限于美国专利公开案20100216131、20100210522、20100167939、20100159445和20100143247所讨论的这些，特此将其全部以引用的方式并入。

在一些实施方案中，与对照或者参照样本比较，这里的任何一种基因都被过表达了。在一些实施方案中，该参照或对照反映了一个或更多的非应答者或低应答者的水平，或者是非应答、少应答或罕见应答病患的整体水平。在某些实施方案中，最高程度的表达对应于最高效力。在某些实施方案中，患者有一定程度的表达来使他/她成为前四分之一或者前二分之一的响应者直至成功响应。在其他实施方案中，病患表达相较于参照或对照水平位于前百分之10、20、30、40、50。在一些实施方案中，对照和参照样本为癌症治疗的响应等级。在某些实施方案中，一种特殊基因的表达水平可能被用于比较于响应者和非响应者。

在一些实施方案中，方法包括制定一个响应分值来预测患者对DNA损伤化疗的耐药性，和/或患者对DNA损伤放射治疗的敏感性。这个响应分值可以是基于检测基因表达量与对照基因表达量的比较。这个反应分值也可以是基于此文提到的任何基因中选取的基因表达量之和计算得到。这个响应分值可以是表达量对数转化的形式，并可以是乘以-1使数值小于0。这个响应分值可以作为一个重组能力评分系统(RPS)。这个响应分值可以通过计算机应用公式运算得到。

DNA损伤化疗或DNA损伤剂可以是铂类化合物、DNA交联剂、拓扑异构酶抑制剂、或者PARP抑制剂。在一些实施方案中，这些铂类化合物可以是顺铂(cisplatin)或卡铂(carboplatin)。在进一步的实施方案中，拓扑异构酶抑制剂可以是伊立替康(irinotecan)、或者拓扑替康(topotecan)。同例，一种PARP抑制剂可以是从四环素化合物、4-羟基喹啉及其衍生物和羧基氨基苯并咪唑及其衍生物组合中选用。

在某些实施方案中，该方法在体外被实施于患者的生物样本上。在某些实施方案中，这些样本包括癌细胞。

在其它实施方案中，患者在被诊断对DNA损伤制剂疗法敏感后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20月(或任何可推论出的时间范围或值)之内或之后接受DNA损伤制剂疗法。患者可以在此之前为癌症治疗已经接受过外科手术。通过公式运算，该患者可能被认为是对DNA损伤制剂敏感的，或对DNA损伤制剂化疗可能有应答的。在第一个或整个疗程后，对治疗的应答可以定义为肿瘤大小降低至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、60、70、80、90、或100％。

相关癌症可以是基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑及中枢神经系统癌症、乳腺癌、宫颈癌、绒膜癌(choriocarcinoma)、结直肠癌、结缔组织癌症、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头部及颈部癌症、胃癌(gastric cancer)、上皮内肿瘤、肾癌(kidneycancer)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌包括小细胞肺癌及非小细胞型肺癌、淋巴癌、包括霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、口腔癌症包括唇癌、舌癌、口癌(mouth cancer)、咽癌；卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、肾癌(renal cancer)、呼吸系统癌症、肉瘤、皮肤癌、胃癌(stomachcancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、肉瘤或转移性癌症。

在进一步的实施方案中，该方法可以被提供用于癌症病患治疗，包括在患者被确认预期对DNA损伤剂敏感后，应用DNA损伤剂治疗。其中所述确认方法基于检测病患的生物样本中下列基因中的两个或更多的基因的表达水平：RPA、ATRIP、ATR、Mre11/RAD50/NBS1、ATM、MDC1、BRCA1、53BP1、CtIP、RIF1、Ku70、Ku80、Artemis、DNA-PK、XRCC4/LIGASEIV、RAD51、PALB2、BRCA2、RAD52、XRCC3/RAD51C、XRCC2/RAD51B/RAD51D,RAD51AP1、BLM、PAR、RAD54L、RAD54B、Fbh1、WRN、PARI、HELQ、MYC、或者STAT3。

在进一步的实施方案中，提供应用算法来预测DNA损伤剂对癌症患者的治疗效果的方法，包括检测病人生物样本中以下至少两个基因的表达水平：PARI、BLM、RAD51、FIF1、BRCA1、Ku80、RAD51AP1、RAD54B、PLK1、BRCA2、RAD51C、PALB2、MYC、或STAT3，以及通过其表达水平计算应答分值来预测DNA损伤剂对癌症患者的治疗效果。

在一些实施方案中，提供用于评估DNA损伤剂对癌症患者治疗效果的方法，包括检测取自病人的生物样本中，至少一个参与修复双链DNA断裂的基因的表达水平；将所检测的表达水平与该基因的对照或者参照水平进行比较；并且，判定该患者是否对DNA损伤剂有应答。

在进一步实施方案中，提供了用于治疗癌症病患的方法，包括检测从患者取得的肿瘤细胞或组织中两个或更多的基因表达水平，这些基因选自于RPA、ATRIP、ATR、Mre11/RAD50/NBS1、ATM、MDC1、BRCA1、53BP1、CtIP、RIF1、KU70、KU80、artemis、DNA-PK、XRCC4/LIGASE IV、RAD51AP1、BLM、PAR、RAD54L、RAD54B、Fbh1、WRN、PARI、HELQ、MYC和STAT3。该方法还包括在该患者被确认为对DNA损伤剂敏感后，使用DNA损伤剂治疗该患者。在一些实施方案中，提供用于治疗癌症病患的方法，包括检测在患者癌细胞或者组织当中RIF1、PARI、RAD51、和Ku80的表达量。

上述方法可以进一步还包括依据测得的表达量应用算法计算重组能力评分(RPS)。还可以包含将计算的RPS分值与参照RPS分值的比较。在一些实施方案中，本发明的方法包括如果其计算的RPS分值低于参照RPS分值，则用DNA损伤剂治疗患者。

在一些实施方案中，提供一种预测治疗方案效果的方法，所述方案包括放疗、铂类化合物、DNA交联剂、拓扑异构酶抑制剂、和/或PARP抑制剂，所述方法包括：检测取自癌症患者的肿瘤细胞和组织中两个或更多基因的表达水平，这些基因选自于PARI、BLM、RAD51、RIF1、BRCA1、Ku80、RAD51AP1、RAD54B、PLK1、BRCA2、RAD51C、PALB2、MYC和STAT3；用所测得的基因表达量来计算重组能力分值(RPS)；并且比较所得之RPS值和参照RPS值，如果所得的RPS值小于参照RPS值，则显示患者对所述治疗方案应答有升高的可能性。

检测步骤可以包括qPCR、RNA测序、微阵列分析、或任何本领域内所知悉的方法。在一些实施方案中，DNA损伤剂为放射、铂类化合物、DNA交联剂、拓扑酶抑制剂、或PARP抑制剂。在进一步实施方案中，对放射疗法的预期响应与对DNA损伤化疗的预期响应相反。

在进一步实施方案中，提供试剂盒包括寡核苷酸，例如引物和探针，能分别与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35(或任何可由此推论出的区间范围)个基因或转录本结合或杂交。这些转录本选自于RPA、ATRIP、ATR、Mre11/RAD50/NBS1、ATM、MDC1、BRCA1、53BP1、CtIP、RIF1、KU70、KU80、artemis、DNA-PK、XRCC4/LIGASE IV、RAD5、PALB2、BRCA2、RAD52、XRCC3/RAD51C、XRCC2/RAD51B/RAD51D、RAD51AP1、BLM、PAR、RAD54L、RAD54B、FBH1、WRN、JPARI、HELQ、MYC、或STAT。在一些实施方案中，这些基因可以是PARI、RAD51、BLM、RIFI、Ku80、BRCA1、RAD51AP1、AD54B、Plk1、BRCA2、RAD51C、和PALB2中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个基因。

在一些实施方案中，不包括损伤反应的次级调控基因如TP53、PTEN、和细胞周期检查点基因或者一个或多个选自包括CtIP、RAD51B、DAN-PKCS、PIAS4、XRCC3、XRCC2、RAD52、XRCC4、ARTEMIS、R5AD51D、WRN、RAD54L、HELQ、MDC1、PIASI、FBH、RNF8、RNF4、或TP53BP1的基因。在特定实施方案中，试剂盒包括分别与RIF1、PARI、RAD51、Ku80、MYC、和STAT32基因中的2、3、4、5、6个基因相结合或杂交的寡核苷酸，这些基因,或者与RIF1、PARI、RAD51和Ku80中的所有四个基因相结合或杂交的寡核苷酸。在特定实施方案中，试剂盒包含一个或多个能与一个RIF1基因序列杂交的寡核苷酸，或者一个或多个能与一个PARI基因序列杂交的寡核苷酸，一个或多个能与一段RAD51基因序列杂交的寡核苷酸，以及一个或多个能与一段ku80基因序列杂交的寡核苷酸。

具体地，这些寡核苷酸长度为20-500个核苷酸长；在一些实施方案中，它们的长度为20-200个核苷酸。每个寡核苷酸可以是已标记或未标记的引物或探针，并可以与上述基因编码的mRNA和cDNA在在严格杂交条件下杂交。

在进一步实施方案中，试剂盒包括标记的寡核苷酸，例如引物和探针。这些标记的寡核苷酸在自然界不存在，并且在结构上与天然的核苷酸显著不同，至少是因为有非核苷酸部分以非天然方式连接至核苷酸上。

试剂盒可以用于检测患者细胞或组织中，尤其是癌症患者肿瘤组织中的基因表达量。例如，实时TaqMan PCR中，寡核苷酸可以用做PCR引物，和/或TaqMan探针。在测序中，该寡核苷酸可以用做PCR引物，和/或测序引物。在二代测序中，寡核苷酸可以用做捕获探针来捕获标记基因、mRNAs或cDNAs。在微阵列类基因表达分析中，寡核苷酸可以作为探针固定在支持物上形成杂交芯片。

因此，该试剂盒另外还可以包含一个或多个试剂用于PCR反应、测序反应、和/或杂交反应，例如Taq聚合酶、反应缓冲剂、dNTPs等等。

其它实施方案在权利要求和本说明书中说明。

在本申请中，术语“关于”被用于表示一些数值包括检测或定量方法的内在误差。

在与术语“包括”连接用词“一”或“一个”可能表示的“一”，但也可能表示‘一或更多’，‘至少一’，或者‘一及一以上’。

用词“包括”(任何形式的包括，例如“包含”和“涵盖”)，“有”(任何形式的有，例如“含”，“涵”)，“包含”(任何形式的包含，例如“涉及”，“包括”)或者“包涵”(和任何形式的包涵，例如“包涵”，“涵盖”)都是涵盖其中或者是无限制的，不排除另外，未详尽的因素或方式步骤。

这些组合物和方法用于“包含”，“基本上含有”，或“包括”任何在说明书中公开的处方和步骤。这些组合物和方法“基本含有”的任何一种公开的处方或步骤，限制实质上不影响发明权利的实用性和新颖性的，指定材料或者步骤的权利要求范围。

在说明书中讨论的任何实施案例，可根据本发明的任何方法和化合物进行实施，反之亦然。另外，发明的组合物能被用于获取发明方法。

现有发明的其他目标、特征和优势将从以下详细描述中变得明确。但应当明确，这里的详细描述和特殊例子显示本发明的具体实施例时只是作为示范，因为在本发明的精神和范围中的变化和修饰对本领域内的技术人员来说根据这里的详细描述将会变得显然。简单来说，仅仅因为某一特定化合物属于一种特定的通式并不意味着它不能符合其它的通式。

附图简介

图1涉及双链DNA断裂(DSBs)修复和复制压力耐受性的通路和基因。简要概述了涉及DNA修复的基因和调控步骤，重点突出其促进同源重组和非同源末端连接。所有列出的基因都被认为是重组能力评分(RPS)系统的潜在考虑因素，除了在蓝色表格中的那些。这四个基因的表达量最终将被选择用于构成RPS，其在红色表格中标明。

图2低RPS细胞系过表达大量HR相关基因。低RPS值的CCLE细胞系的mRNA中位水平被显示。这些mRNA水平是从CCLE数据中挖掘出来，其显示值相当于每个基因mRNA测量值标准化于初始的634株癌细胞系平均mRNA值后经log2转化所得。因此表达水平0表示一个平均表达水平，并且任何正值表示过表达。例如，测试值+0.25表示高于平均值19％的表达。误差线表示标准差。

图3A-3B RPS与不同类型治疗的敏感性和细胞系中HR缺失之间的相关性。A)鉴于RPS，CCLE癌细胞系被归于四分位数。敏感数据被从CCLE数据库中挖掘出来，并为不同肿瘤学治疗标绘，最高和最低的分位数差异用T检验来确定。B)HR修复效率与RPS相关。用包含HR报告基因的质粒(pDR-GFP)加上I-Sce I表达质粒(pCβASce)或者空白载体对照质粒(PCAG)共转染至六个代表性的细胞系，48小时后被用于FACS分析。HR报告效率呈现含pDR-GFP+pCβASce质粒的GFP+细胞的百分比，标准化于空白对照(pDR-GFP+pCAG)。

图4A-4B低RPS的CCLE癌细胞系提高其基因的不稳定性。以SNP阵列为基础的DNA拷贝数量变化(CNVs)从CCLE数据库被挖掘出来。DNA缺失(左)和扩增(右)被通过大小归类，其中所述组别代表在突变尺寸上的10倍增长。高和低RPS组分别被定义为分位数的顶部和底部。基于尺寸大小的CNVs分布为A)TP53WT细胞和B)TP53突变细胞。误差线表示标准差。星号表示基于T检验的显著性差异。

图5A-5D低RPS与人类肿瘤中基因不稳定性的关系。以SNP阵列为基础的DNA拷贝数量变化(CNVs)从CCLE数据库被挖掘出来。DNA缺失(左)和扩增(右)被通过大小归类，其中所述组别代表在尺寸上10倍的增长。高和低RPS组分别被定义为分位数的顶部和底部。基于尺寸的CNVs分布为A)

TP53WTNSCLC肿瘤细胞，B)TP53突变NSCLC肿瘤细胞，C)TP53WT乳腺肿瘤，D)TP53突变乳腺肿瘤。误差线表示标准差。星号表示基于T检验的显著性差异。

图6A-6B RPS预后和与临床肿瘤治疗敏感性的关联性。A)Kaplan Meier生存曲线显示NSCLC患者在JBR.10试验中只接受外科手术(S)或手术后化疗(S+C)的情况。低和高RPS组合被分别定义为底部25的百分率和顶部剩余75的百分率。B)四个临床数据库的非小细胞肺癌被分析用于存活预后影响RPS，用多变量来分析其整体阶段的控量。森林图中的点的代表RPS(最为一种持续变量)的特殊治疗的风险比。空栏提示风险比，菱形代表模型的风险比值用于概括这4个数据库的综合影响。误差线代表95％的置信区间。黑色＝单外科手术，绿色＝外科手术+化疗。

图7大部分药物敏感值从在同一些细胞系的CCLE数据库中挖掘出来。维恩图显示有治疗敏感度数据(拓扑替康，伊立替康，紫杉酚)的CCLE癌症细胞系数目。

图8一个具有代表性的组的癌症细胞系展示了预期的药物耐受性水平。细胞接种于96孔板组织培养皿中培养。之后所示药物在三天内被加入，6次重复所得平均存活被通过CellGlobal reagent(Promega)检测。误差线表示标准差。

图9用实时qRT-PCR检测6组代表性细胞系mRNA所产生的RPS值，与来自CCLE数据组报道的基于阵列的mRNA水平计算所得RPS值相当。细胞被培养至70％密度时，根据TRIzol(Life Technologies)产品说明提取获得mRNA。mRNA结果通过Qubit RNA BR试验(LifeTechnologies)来定量。每个细胞系等量RNA(1.5μg)使用DNAse-I(ThermoScientific)处理，通过Applied Biosystems高效cDNA反转录试剂盒(Life Technologies)合成cDNA。通过Applied Biosystems7900HT序列检测系统，使用Appplied Biosystems 2X TaqmanUniversal Master MixⅡ执行PCR，。这些qRT-PCR所得mRNA水平，标准化于PC3细胞水平，log2转化，并相加得到每个细胞系的一个RPS值。以下Taqman Assay组合物被用于PCR反应：ku80(也就是XRCC5)：Hs00897854_ml；RIF1:Hs00871714_ml；PARI(也就是PARPBP):Hs01550690_ml；RAD51:Hs00153418_ml。

发明详述

人类肿瘤呈现出广谱的恶性特征和对DNA损伤治疗方式的应答性。本发明人假设这种差异性可以用DNA修复通路的不同效率来解释。为了进一步阐释，本发明人自主开发出一种间接定量个体肿瘤HR修复能力的分析工具。这种评分系统通过对肿瘤细胞或组织中RIF1、PARI、RAD51、Ku80这4个DNA修复相关基因的表达量进行分析。在某些实施例中，重组能力评分(RPS)系统与特定类型化疗药物敏感性相关、与肿瘤细胞基因组不稳定程度相关，能够提供现有诊断方法无法获取的宝贵信息。

I.响应分值

在某些实施方案中，一种响应分值可以根据DNA修复途径中一个或多个基因的表达水平，例如复制压力和DSB修复途径，或者具体地一些使细胞相对于NHEJ更倾向于HR修复的基因。这种响应分值可以表示为重组能力评分(RPS)。

在特定实施方案中，RPS评分是基于RIF1、PARI、RAD51、Ku80这4个DNA修复相关基因的表达。RPS能准确预测多种类型DNA损伤治疗的敏感性，它与肿瘤细胞基因组不稳定程度相关，能够提供现有诊断方法无法获取的宝贵信息。RPS是一种新型的评分系统，通过定量4个基因的表达量来预测DSB修复途径选择。尤其是将癌症细胞系中DNA修复相关基因的mRNA表达量与拓扑替康敏感性相比较。这种经鉴定的基因表达评分系统称之为RPS，它与DNA修复基因表达水平呈负相关。低RPS分值能识别HR缺失的肿瘤，同时对特定化疗药物超敏。

当出现DSB，细胞所处的细胞周期阶段将影响细胞选择HR修复还是选择NHEJ修复。在细胞周期的G0与G1期，NHEJ是修复DSB的主要途径；而在S与G2期，HR是修复DSB的主要途径。这种DNA修复调控方式主要由DSB位点上的BRCA1与53BP1蛋白竞争结合所决定(Chapman,et al.,2013)。53BP1与RIF1结合的稳定性直接导致BRCA1蛋白从修复复合物上排除出来，随后DSB通过NHEJ途径修复。如果53BP1从修复复合物上排除出来，则DSB将通过HR途径修复(Zimmermann,et al.,2013；Chapman,etal.,2013)。在这种情况下，DSB末端被处理成HR底物(通过5’→3’核酸酶活性产生3’端DNA单链末端)。这个过程需要多种蛋白的参与，例如CtIP、BRCA1、MRN(Mre11/RAD50/NBS1)复合物。通过Mre11与细胞周期蛋白依赖性激酶2相互作用特性触发核酸酶活性，从而促使S/G2期细胞CtIP优先磷酸化(Buis,et al.,2012)。

鉴于不同类型的肿瘤存在广泛的生物多样性，本分析仅限于原发性肿瘤细胞。细胞对拓扑异构酶I抑制剂类药物拓扑替康的抗性被用来作为衡量同源重组能力的替代标志物。拓扑替康是一种喜树碱衍生物，这类药物通过打断复制叉从而对HR缺失细胞选择性的发挥毒性(Nitiss,et al.,1988；Arnaudeau,et al.,2001)。634株肿瘤细胞系中的279株有相关拓扑替康IC50数据在。

为了重点分析介导特殊表型的重要细胞特征，本分析方法涉及的基因限定在与复制压力、DSB修复途径相关的基因。本分析进一步限定在31个参与HR、NHEJ途径的核心蛋白与响应DNA损伤的共济失调毛细血管扩张突变(ATM)，共济失调毛细血管扩张症Rad3相关激酶(ATR)的激活阶段。然而，响应DNA损伤的次级调控子(例如TP53、PTEN、细胞周期检验点基因)并没有被考虑进本评分系统，因为它们对细胞的影响并不仅限于复制压力与DSB修复。皮尔逊积矩相关分析证实了最终的31个候选基因中的12基因表达水平与细胞拓扑替康敏感性显著相关(p<0.05)。在这12个基因中，基因表达水平与拓扑替康敏感性直接呈正相关。

在特定实施方案中，响应分值，例如RPS(重组能力评分)，可以通过测量基因表达量的技术包括，但不仅限于，NanoString和RT-PCR来计算。在一些实施案例中，RPS值可能通过微阵列计算。在其它实施例中，当用微阵列数据(从我们现存的数据来看)，有方法可以用于标准化原始的基因表达值。例如，这些数据可以这样被标准化：Raw Affymetrix CEL文件被转化为每个探针组的平均值，通过RobustMulti-array Average(RMA)和分位数校准的归一化处理。Original Affymetrix U133+2或重新定义定制CDF文件(Entrezg-v15)被用于归纳总结。本领域内任何已知方法都可以被用于微阵列数据标准化和预处理及RPS值的计算在多种标准化方法中可能是可行的。

也有一些微阵列以外的计算RPS的方法。大部分检测可以用RT-PCR并用一些持家基因(例如肌动蛋白，或核糖体RNA)来标准化。发明者发现RPS基因基因表达量的原始数据表现最好(例如微芯片数据)。在特定的实施方案中，一种基于NanoString的方法可以用于检测降解形式的mRNA，其常被发现于典型的患者肿瘤活检组织(福尔马林固定石蜡包埋的组织)。为此，NanoString公司可以提供引物和持家基因来作为标准化对照。

在具体的实施方案中，RPS提供的信息可能持续变化，也可能不持续变化。这基于材料来源例如肿瘤类型)。当处理基于RPS的数据时，最高和最低的四分位数值得注意，因为这将使结果更显而易见和更有统计学的意义。然而，这种影响可能连续至RPS所有范围的值。事实上，森林图使用RPS作为连续型变量计算风险比。

Ⅱ.响应分值的作用

在某些方面，实施方式包括用特殊治疗制剂治疗项目或者评估治疗效用。治疗制剂(抗癌制剂)的例子包括，但不仅限于，如化疗制剂、生长抑制剂、细胞毒素的制剂、放射治疗用制剂、抗血管发生制剂、细胞凋亡制剂、抗导管素制剂、和抗癌其他制剂，例如抗HER2抗体、抗CD20抗体、表皮生长素因子接受剂(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(如埃罗替尼(Tarceva^TM)、生长因素抑制剂衍生物(如格列卫(伊马替尼))、COX-2抑制剂(如赛来考西)、干扰素类、细胞因子、拮抗剂(如中和抗体)。

在特定实施案例中，患者对化疗制剂敏感性与在此提及的基因表达量呈正相关。化疗制剂可能是铂类化合物，如顺氯氨铂(cisplatin)、顺羧酸铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、沙铂(satraplatin)、吡铂(picoplatin)、奈达铂(nedaplatin)、Triplatin、Lipoplatin、或者顺氯氨铂脂质体。

在具体实施方案中，化疗制剂可能是一种DNA交联剂。被用于化疗的烷化物制剂如1,3-二(2-氯仿)-1-亚硝基脲(BCNU，洋红))和氮芥，能交叉连接DNA互补链的鸟嘌呤的N7位，形成链间交联。顺铂(顺二氨二氯铂II)和其衍生形式DNA交联作为一种单加成链间交联，间交联或DNA蛋白交联。大部分这作用在鸟嘌呤邻N7位形成1,2链间交联。

在进一步实施方案中，化疗制剂可能是拓扑异构酶抑制剂。拓朴异构酶抑制剂是影响两种酶活性的药物：拓扑异构酶I和拓扑异构酶II。当DNA双螺旋被展开，在DNA复制和转录过程中，例如，相邻未展开的DNA缠绕紧密(超螺旋)，像打开中部的扭曲链。这种效力引起的压力一部分是拓扑异构酶协助完成的。它们使DNA上产生单链或双链损伤，减少DNA链的张力。这使DNA在复制和转录过程中正常地发生解旋。拓扑异构酶I或II的抑制剂干扰了这两个进程。两种拓扑异构酶I抑制剂，伊立替康和托泊替康，是从喜树碱中半合成地衍生来的，从中国观赏树喜树得来的。拓扑异构酶II靶向药品可分为两类。拓扑异构酶II毒性导致结合DNA的酶水平增加。它能妨碍DNA翻译和转录，引起DNA链断裂，导致细胞程序性死亡(细胞凋亡)。这些制剂包括依托泊苷，多柔比星，米托蒽醌，替尼泊苷。第二类，催化抑制剂，是使拓扑异构酶II失活的药物，因此阻碍DNA合成和转录因为DNA不能正常解旋。这类药物包括新生霉素，硫巴比妥苯胺和阿柔比星，另有别的显著作用机制。

在进一步实施方案中，化疗制剂可能是PARP抑制剂。在此被用于“PARP抑制剂”(例如聚ADP多糖聚合酶)应为一种抑制PARP多于其他聚合酶的制剂。在一个实施案例中，PARP抑制剂抑制PARP至少两倍于其他任何聚合酶。在另一些实施方案中，PARP抑制剂抑制PARP至少十倍于抑制其他任何聚合酶。在第三种实施方案中，PARP抑制剂抑制PARP多于抑制任何其他酶。在一个特殊实施案例中，PARP抑制剂是奥拉伯尼、rucaparib、veliparib、CEP9722、MK 4827、BMN-673、3-氨基苯甲酰胺、四环素化合物、4-氢氧喹唑啉及其衍生物、和羧基氨基-苯并咪唑及其衍生物。

在一些实施方案中，化疗制剂是任何一种(和选自某些实施方案中包含的制剂)烷基化物制剂例如硫替派和

环磷酰胺、烷基磺酸盐例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苯佐替派、卡巴、美妥替哌和乌瑞替派；氮丙啶和甲基蜜胺类包括六甲蜜胺、三乙撑密胺、三乙撑硫化磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚,

)；β-帕拉酮；拉伯醇；白桦脂酸；喜树碱(合成类似物托泊替康

,cpt-11(抑制剂，

),乙酰喜树碱，东莨菪素，和9-氨基喜树碱)；

总草苔；海绵他汀；CC-1065(包括他的阿多来新，卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼青素；鬼曰毒酸；替尼泊苷；卡着来新(尤其是卡着来新1和卡着来新8)；多拉斯他汀；多卡米星(包括合成类似物：KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥例如苯丁酸氮芥，

萘氮芥，癌德星錠，雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥，盐酸氧氮芥，美法仑，新氮芥，苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，氯乙环磷酰胺，芥菜；亚硝基脲类例如卡莫司汀，氯脲霉素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，和雷莫司汀；抗体例如二抗(如卡奇霉素，特别是卡奇霉素gammall，omegal(详见，例如，Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素包括达内霉素A；埃斯培拉霉素；还有新制癌菌素发色团，和相关色素蛋白，二，生色团)，阿克拉霉素，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博莱霉素，放线菌素C，卡柔比星，洋红霉素，嗜癌素，色霉素，更生霉素，柔红霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸,

多柔比星(包括阿霉素吗啉，氰基吗啉阿霉素，吡咯啉阿霉素，脱氧多柔比星)，表柔比星，依索比星，伊达比星，蒽环类药物例如丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，平阳霉素，泊非霄素，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司，新制癌菌素，佐柔比星；抗代谢物例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧(5-FU)；枸橼酸类似物例如二甲叶酸，氨甲喋呤，蝶罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤胺，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷，阿扎胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，脫氧尿苷，去氧氟尿苷，散瘤星，氟尿苷；雄激素例如卡鲁睾酮，屈他雄酮丙酸，腹腔注射，美雄烷，睾内酯；抗肾上腺例如氨鲁米特，米托坦，曲罗斯坦；枸橼酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基果糖酸；恩尿嘧啶；安吖啶；阿莫司汀；比生群；依达曲沙；地磷酉先胺；秋水仙碱；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素例如美登素和安丝菌素；丙脒腙；米托蒽醌；莫喊达酉享；尼曲口丫唆；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,Oreg.)；雷佐生；根瘤菌素；西佐糖；螺锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；三(2-氯乙基)胺盐酸盐；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素，varracuinA,杆苞菌素A和蛇形菌素)；氨基甲酸乙酯；长春地辛(ELDISINE,FILDESIN)；氮烯咪胺；甘露醇；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烧；加西托新(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉烷类化合物如

紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.),ABRAXANE^TMCremophor-free，紫杉醇白蛋白纳米粒制剂(美国制药合作伙伴，Schaumberg,I11.),和

多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；chloranbucil；吉西他滨(GEMZAR)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春花碱

；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱

；奥沙利铂；亚叶酸钙；长春瑞滨

；盐酸米托蒽醌；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸钠；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸例如维甲酸；卡培他滨

；药学上适用的盐，酸或者以上任何一种的衍生物；还有以上两者或更多的结合物例如CHOP，一种环磷酰胺，阿霉素，长春新碱，强的松结合治疗的缩写，和FOLFOX，一种使用奥沙利铂(ELOXATIN^TM)结合5-FU和亚叶酸钙的治疗方案的缩写。此外化疗制剂包括细胞毒素制剂与抗体药物轭合物一样有用，例如美登素(DM1,例如)和auristatins MMAE和MMAF。

化疗制剂可能被阶段性给药(在数分钟，小时或另外几天内)或作平行；他们也可能给药于患者在一种预混合的单一化合物。它在此被认为作为一种开放性治疗可能被用于体内和体外。这些步骤可能包含在同时或一段时间内给予若干制剂，其中，分别给药达到预期治疗效果。这可能通过细胞，组织或内脏与一种化合物应答达到效果，例如药学上可接受的化合物，包括两种或更多制剂，或者细胞与两种或更多不同化合物的反应，其中所述一种组合物包括一种制剂和另外包含其他的制剂。

“预后”是指对病人病程发展情况，和它是否有一个恢复机会的预测。“癌症预后”一般是指预测治疗或者不治疗两种情况下，可能的病程或癌症后果。在此引用，癌症预后可能包括任何一种或多种：病人怀疑或被诊断为癌症的存活率期间，无复发存活的期间，被怀疑或确诊为癌症病人无存活的期间，被怀疑或确诊癌症的病人组的缓解率，反应或被确诊癌症病人或病人组的反应阶段，和/或怀疑或被确诊病人的转移可能性。预后也显示对癌症治疗不可预测的反应，例如常规癌症治疗。反应可能即是治疗反应(在一个治疗后，敏感或无复发存活)或缺乏治疗反应(疾病后遗症，可能显示在一个治疗中或治疗后的持续或复发)。

“受试者”或“病人”意思是任何单个希望治疗的对象，包括人类，小牛，狗，豚鼠，兔子，小鸡等。也用于表达一个或任何实验对象，包括临床研究试验，不显示任何疾病的临床特征，或流行病研究的对象，或者用于对照的实验对象。

在此研究表明，“增长表达”或“过表达”或“减少表达”涉及该受试者样本的基因表达量，与代表相同或不同基因的参照水平的比较结果。在具体方面，该参照水平可能是源于相同受试者非癌组织中的表达量的参照水平。另外，该参照水平可能是从不同实验对象或实验对象组来的参照水平表达量。例如，表达水平的参照量可能是从非癌症的实验对象或者实验对象组的样本(组织，体液或者细胞样本)得来的。或者是从非癌症组织，癌症的实验对象或者实验对象组得来的表达水平。该对照水平可能是一个单一的值，或者可能是一系列的值。表达的参照水平可以依据本发明通过那些已知的普通技术方法测定。在某些实施方案中，参照水平是一群癌症或者非癌症的受试者或包括两者的平均表达量。在具体实施方案中，对照水平是标准化水平，中间值，平均值，而在另一些实施案例中，关于被测试的组织或生物样本，它可能是一个不稳定的水平。

“关于”和“大约”一般指对于测量方法的特性和准确度在一个可接受的数量错误范围。一般来说，误差率在20％以内，最好在10％以内，最佳在给出数值或数值区间的5％以内。另外，特别是在生物学系统中，术语“关于”和“大约”可能指等级的顺序，最佳在给出值的5倍被或者更佳在2倍以内。除非是形容数量值的大约，否则当不是陈述性表达时，意味着术语“关于”或者“大约”可能被干扰。

Ⅲ.核酸芯片方法论，包括测试核酸来确定表达量。阵列能被用于检测两种样品之间的区别。一个阵列包括核酸探针粘附在的固体支持物上。典型来说，阵列包含多数不同的核酸探针配对已知区域的不同底物。在本案中，这些阵列，也被叫做微阵列，或俗话说的芯片。举例来说，美国专利号

5,143,854,5,445,934,5,744,305,5,677,195,6,040,193,5,424,186和Fodor etal.,1991),并将其以引用的方式为所有目的完全并入本文中。这些阵列芯片的合成技术使用在美国专利号5,384,261中描述的机械合成方法，并将其以引用的方式为所有目的完全并入本案中。虽然二维阵列表面被用于某一方面，该阵列可能被制作在任何形状的表面，或者是一个不平的表面。阵列可能是小颗粒，明胶，聚合材料表面，纤维如光学纤维，玻璃或任何合适的作用物上的核酸，详见美国专利号5,770,358,5,789,162,5,708,153,6,040,193,和5,800,992，并将其以引用的方式完全并入本文中为所有目的。

另外除了阵列和微阵列，一系列不同测定方法可以用于分析基因、他们的表达和他们的活性、以及他们的效能。例如这些测试方法包括，但不仅限于核酸扩增、聚合酶链反应、PCR、RT-PCR、RNA测序(例如二代测序技术)、原位杂交、Northern杂交、杂交保护分析法(HPA)(GenProbe)、支链DNA(bDNA)测定法(Chiron)、滚动循环扩增(RCA)(美国基因组学公司)、单分子杂交检测试剂(US Genomics)、Invader assay(ThirdWave Technologies)、和/或Bridege Litigation assay(Genaco)。

术语“引物”，在此文中，意为结合任何核酸用于初期核酸合成和模板处理。在特定实施方案中，引物是长度为10到20或30个碱基对的寡核苷酸。引物可能为用于双链或单链的形式，虽然单链形式最佳。

Ⅳ.试剂盒

在许多方面，提供了试剂盒包含一个或更多寡核苷酸或者此文所述的其它试剂。该试剂盒包括一个或更多密封容器，例如一个管形瓶，包含在此文中描述的任何一种试剂和/或在本文中描述的任何一种试剂的预试剂。在某些实施方案中，该试剂盒可以包括一整套容器装置，这个容器是不会与试剂盒的化合物产生反应的，例如Eppendorf离心管、检测板、注射器、试剂瓶或者试剂管。该容器可以由灭菌材料构成，如塑料或者玻璃。

该试剂盒可以进一步包括说明书来概括说明进行诊断、治疗或者预防疾病操作步骤，并将此文中描述的相同步骤，或那些已知的普通技术附上。该说明书可以是一份计算机可读媒体，包括可机读说明书，当使用计算机执行时，能展示一个真实的或虚拟的使用该文描述的试剂盒的操作步骤。

该试剂盒可进一步包括用于标记要想检测的基因mRNA的试剂。该试剂盒可以也包括标记试剂，包含至少一个氨基修饰的核苷酸、poly(A)聚合酶、和poly(A)聚合酶缓冲剂。标记试剂可以包括一种与氨基反应的染料。

在进一步实施方案中，试剂盒包括能够分别与二、三、四、五或六个选自于PARI、BLM、RAD51、RIF1、BRCA1、Ku80、RAD51AP1、RAD54B、Plk1、BRCA2、RAD51C、PALB2、MYC和STAT3的基因结合或杂交的寡核苷酸。在某些实施方案中，该试剂盒包括能够分别与二、三、四、五、六、七或八个选自于PARI、RIF1、Ku80、RAD51、BLM、BRCA1、RAD51AP1和RAD54B的基因结合或杂交的寡核苷酸。在具体实施方案中，该试剂盒包括能够分别与二、三、四、五、六、七或八个选自于RIF1，PARI,RAD51，Ku80，MYC和STAT3的基因结合或杂交的寡核苷酸。在特定实施方案中，该试剂盒包含一个或多个能与RIF1基因序列杂交的寡核苷酸，一个或多个与PARI基因基因序列杂交的寡核苷酸，一个或多个与RAD51基因序列杂交的寡核苷酸，和一个或多个与ku80基因序列杂交的寡核苷酸。

在具体的实施方案中，上述寡核苷酸长度为最少或者最多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个核苷酸，或者其中任意可推论出的序列长度范围区间。每个寡核苷酸可以是被标记或未标记的引物或者探针，并能在严格的杂交条件下与被任意一个上述基因所编码的mRNA或者cDNA杂交，或可能是上述任一基因所编码的部分或全长cDNA。

该试剂盒可以被用于检测在患者细胞或组织中、尤其是癌症患者的肿瘤组织中的基因表达。例如，在实时TaqMan PCR中，寡核苷酸可以用做PCR引物和/或TaqMan探针。在测序中，寡核苷酸可以是PCR引物和/或测序探针。在二代测序中，寡核苷酸可以用做捕捉探针，来捕获目标基因，mRNA,或cDNAs。在微阵列基础的基因表达谱中，该寡核苷酸可能被粘附在固体支持物的探针形成杂交芯片。

因此，该试剂盒可能另外包括一个或更多试剂用于PCR反应、测序反应、和/或杂交反应，如Taq聚合酶、反应缓冲液、dNTPs等。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例1通过癌细胞系数据开发RPS系统

发明人力图建立一种能在任何癌症中预测HR修复功效的方法。为达成这个目的，发明人发明了一种评分系统将癌细胞系中基因表达模型与HR能力相关联。基因表达水平和相关药物敏感数据，从Broad-Novartis癌症细胞系百科(CCLE)(BarRetina，et al.,2012)中被收集出来。在不同的人类恶性肿瘤之中有着已知存在的广泛的生物多样性，发明者将这种分析限定在癌症衍生细胞系。拓朴异构酶I抑制剂类药物拓扑替康的细胞耐受性被选择出来作为HR能力替代标志物。拓扑替康是喜树碱类衍生物，这类药被选择是因为它们打断复制叉并优先在HR缺陷细胞中产生细胞毒性(Nitiss,etal.,1988；Arnaudeau,et al.,2001)。在634株癌症细胞系中有279株有拓扑替康敏感性数据。

为了集中精力于介导特定表型的主要细胞学特征的分析上，发明人将他们的研究局限于与复制压力、DSB修复路径直接相关的基因(图1)。发明人进一步将此分析局限于33种在DNA损伤反应的共济失调毛细血管扩张症突变(ATM)和/或共济失调毛细血管扩张症以及Rad3相关蛋白(ATR)激活步骤之后参与细胞由NHEJ向HR偏好基因。所有这些基因除了Ku70外都有mRNA的水平数据。损伤反应次级调控基因(例如TP53、PTEN、和细胞周期检查点基因)不被考虑作为评分系统的基因候选者，因为它们对细胞影响不仅限于复制压力和DSB修复。皮尔森相关分析显示了在最后32个候选基因名单中的12个基因的表达水平与细胞拓扑替康敏感性显著相关(定义为p＜0.05)(表1)。在所有12个基因中，基因表达水平的增加与拓扑替康的敏感性提升直接相关。

表格1-与拓扑替康敏感性的显著相关的DNA修复基因

A)有统计学意义的基因

B)无统计学意义的基因

实例2 HR相关基因在低HR效率的癌症细胞中高表达

在与拓扑替康敏感性最密切相关的基因中有RIFI、Ku80和PARI。RIF1和Ku80是已知促进NHEJ和拮抗HR的(Zimmermann,et al.,2013；Chapman,et al.,2013；Bennardo,etal.,2008)。PARI是打断RAD51核线的解旋酶，有报道称它是拮抗HR修复的(Moldovan etal.,2012)。

拓扑替康敏感性也与HR相关基因家族过表达有关，包括RAD51、BLM、BRCA1、RAD51-AP1、RAD54B、PLK1、BRCA2、RAD51C、和PALB2。这种观测显示了表面上违反直觉的表征，因为RAD51和许多RAD51相关蛋白都与促进HR有关。然而，RAD51过表达先前显示发生在BRCA突变引起的HR缺陷(Martin,etal.,2007；Honrado,et al.,2005)。为调查BRCA突变模型与发明者观察的表达模型的可能的联系，发明者分析了CCLE细胞系包括BRCA1(HCC1937和MDA-MB436)或者BRCA2(CAPAN1)突变的基因表达水平。与发表的人类肿瘤BRCA1突变观察一致(Martin，et al.,2007)，这三个细胞系显著地过表达RAD51和RAD51AP1。另外，发明者发现BRCA-缺陷细胞显著地过表达另外的基因，用于促进HR所需要的多种机制，包括促进5’到3’ssDNA的末端切除的CtIP(Sartori,et al.,2007)，促进磷酰化53BP1和RAD51的Plk1(Yata,et al.,2012；van Vugt,et al.,2010)，包括促进RAD51纤维组装的数个基因(Thompson,etal.,2012)。这些数据意味着BRCA-缺失细胞对HR缺失的响应，通过增加大量HR相关基因的表达。HR基因的过表达作为补偿机制是先前特别被提及的，因为RAD51过表达是已知的能部分增加HR缺失发生的几率，尤其是关键HR基因是突变的时候(Martin,et al.,2007；Takata,et al.,2001)。

这些发现被用于完善用于RPS的基因列表。发明者假设，当HR缺陷发生在野生型BRCA背景中，细胞通过补偿过表达HR相关基因来响应，其反映出的表型就是观察到BRCA突变细胞。例如，发明者推断许多HR相关基因能报告响应低HR能力的预测性的冗余信息。基因表达水平被结合，从而产生一个单一模型来预测拓扑替康敏感性，从已知HR-拮抗活性的基因(RIF1，Ku80,和PARI)开始，按照它们的独立预测能力的次序排列(表2)。接着HR相关基因家族被有序地加入模型。RAD51的加入能提高的上述模型与拓扑替康的敏感性(与初始3个基因有关)的关联性，然而额外的HR相关基因并没有进一步提高关联性。因此，RIF1，PARI,Ku80，和RAD51这最终的四个基因被选择引入RPS。

表2-相关系数

表1A中的有意义的DNA修复基因被组合以确定最佳基因数目，其中它们表达水平的总和与托泊替康敏感性相关

提高任何一个基因的mRNA水平与拓扑替康更高敏感性相关。RPS被定义这四个基因的表达水平乘以-1的总和，用log2转化每个用634株癌细胞系的平均mRNA值标准化的每个基因的mRNA值。在癌细胞系中，该RPS中间值趋近于0，底25位百分数的RPS值小于-1.08，前25位的RPS值大于1.2.

有趣的是，低RPS值的CCLE细胞系确实过表达大量HR相关基因(图2)。这些数据支持响应低HR效应的补偿机制的存在。另外，这些结果暗示该补偿机制不仅限于像BRCA突变那样最极端HR缺失。MEN1蛋白被认为是一种可能的补偿过程调节，因为MEN1能刺激一些HR基因的转录，包括BRCA1、RAD51、和RAD51ap1(Fang,et al.,2013)。然而，该解释未必确切，因为MEN1 mRNA水平与RPS在CCLE细胞系中没有显著相关。

实施例3-RPS预测在个别癌细胞系中的HR能力

RPS预测价值被进一步测试基于对不同种类化疗制剂的敏感性。与拓扑替康的结果相似，低RPS值与伊立替康以及另外一种拓扑异构酶I抑制剂的敏感性有关(图3A)。这正如所料，因为拓扑异构酶I抑制剂能产生复制叉干扰，而这种干扰需要HR来修复(Nitiss,etal.,1988；Arnaudeau,et al.,2001)。作为对照，该分析使用非DNA损伤药物紫杉醇重复实验，结果显示RPS与该试剂敏感性的没有相关性。这些结果支持RPS对于DNA相关损失和修复的特异性。值得注意的是完整的药物敏感性数据不适用于所有三种化疗制剂，在所有被评估的细胞系中(详见图7分类)。然而，从参照结果中可以看到：该分析重复137株被所有三种试剂所检测的细胞系子集。

通过在具有低RPS(RKO，DU145，COLO205)或中/高RPS(PC3，HCC44，NCI-H650)的代表性细胞系中检测HR修复效力，RPS对于预测修复路径偏好性的能力被进一步测试。当在发明者的实验室里独立地重复测试，这些细胞系展示了对拓扑替康和紫杉醇敏感性的预期水平(图8)，与从CCLE数据库中挖掘的敏感性数据有可比性。这6个细胞系被测试，用先前描述DR-GFP报告方法(Pierce，et al.,1999)的修改版本。该方法用一个可报告的，携带2个非功能性拷贝的绿色荧光标记蛋白(GFP)的DNA结构，其中一个是通过I-SceI核酸内切酶位置被打断的。在I-SceI位置引入的DSB能被同源基因转化修复，从而产生一个GFP的功能性拷贝。如图3B中显示，RPS与HR效应相关的线性回归分析(R²＝0.833，two-sided p＝0.003)。对于其他结果的一致性，这些细胞的RPS分值，通过CCLE数据库中的阵列基础mRNA水平得到计算。发明者验证了发明者的六个细胞系的特征，通过短串联重复序列分析(GeneticResources Core Facility at Johns Hopkins School of Medicine)，和通过实时qRT-PCR独立定量法产生的mRNA测量，可与CCLE数据库报道的mRNA水平具有可比性(图9)。

实施例4-高RPS细胞系基因组不稳定性升高

HR作为一个在细胞中保持基因稳定性的关键因素。发明者假设，低RPS细胞比高RPS的细胞表现更多的基因组不稳定性。为验证这个假设，通过SNP阵列分析CCLE癌细胞系DNA拷贝数量变化(CNVs)(图4)。低RPS数值与更频繁的DNA扩增相联系。该发现也与报道的HR缺失细胞系的分析相一致，表明RAD51D或XRCC3的突变促进了DNA扩增(Hinz,et al.,2006)。这些扩增被认为是来源于复制压力诱导的复制叉干扰和继发同源介导聚合酶模板转化(Arlt,et al.,2012；Malkova,et al.,2012)。一份关于RAD51缺失的啤酒酵母细胞研究表明下调HR的细胞将频繁通过非等位损伤诱导复制引导DSBs修复，由此促进部分双链的形成(Payen,et al.,2008)。另外，发明者发现低RPS细胞含有相当频率的DNA缺失。缺失是差错倾向修复途径的特征，例如微同源-介导末端连接和单链退火(Guirouilh-Barbat,etal.,2004；Bennardo,et al.,2008)。值得一提的是，CNV大小的分布不被RPS强烈影响。总而言之，这些结果表明低RPS细胞减少HR能力并更多的依赖差错倾向修复，从而重连DSBs和/或容忍复制压力。

TP53突变是已知的在细胞对DNA损伤制剂的耐受和基因不稳定性上发挥主要影响。另外，TP53突变状态被认为影响HR效应(Linked，et al.,2003；Sirbu,et al.,2011)。因此，发明者再次检测在TP53突变状态背景下的RPS相关CNV。RPS平均值在238TP53 WT细胞系和386TP 53突变细胞系是无显著性差异的(0.25vs0.41，p＝0.41)。另外，增长的CNVs和低RPS之间的关联在TP53野生和突变细胞系中被观测到。在TP53突变细胞中，RPS依赖性的重要程度更少被公开发表，由于是高缺失背景的TP53突变细胞。一个高缺失频率在TP53突变细胞中并不罕见，因为在TP53未激活的状态下缺失的发生比已知的要高40-300倍(Gebow,et al.,2000)。因此，这些数据表明TP53突变和RPS提供了关于基因不稳定性的独立预测信息。

通过测试DNA损伤的耐受性，RPS和TP53状态之间的可能性关系进一步得到了研究。在逻辑回归上，RPS能力与拓扑替康敏感性相关性在TP53野生和突变细胞系亚种中类似(p＜0.003对于两者)。这个相关性支持RPS作为HR能力的预测作用，不同于TP53依赖的活动如细胞凋亡阈值调控和细胞周期规律。

实施例5-低RPS的人类肿瘤显示了无偏好性的临床特征和升高的基因组不稳定性。

使用癌症基因组图谱(CGA)的肿瘤数据集对RPS系统作临床验证。乳腺癌和非小细胞癌症(NSCLC)肿瘤类型被选择用于这些分析，因为这些数据包括巨大的样本数量、临床特征注释、SNP阵列基础的DNACNV数据、和病人预后的充足细节。虽然在不同的癌症类型中存在某些不同之处，更低RPS的肿瘤通常呈现不利的临床特征(表3)。低RPS肿瘤趋向于成为更局部性地加重和隐匿更高频率的TP53突变。例如，更低四分位数RPS肿瘤有着在非小细胞肺癌中更高的淋巴结浸润的可能性(p＝0.008)。相似的，低RPS的乳腺癌普遍显示雌激素感受器损伤(p＝0.0001)和HER2扩增(p＝0.007)。

表3-低RPS与人类肿瘤中的不利临床特征的相关性RPS四等分

P值表示基于似然比检验的各组间频率差异

这些不利特征与低RPS的联系可能与低精确修复进程有关，这些修复进程反过来促进基因组不稳定和恶性进展。为探究这个假设，发明者通过使用这两个相同的CGA肿瘤数据集分析了RPS与CNV之间的关系。两组癌类型展示了至少一种在低RPS中提高CNV(图5)。这种与基因组不稳定性与RPS相关性在TP53野生和突变肿瘤中被观测到。这些结果意味着突变DNA修复进程主要在低RPS肿瘤中，因此促进了恶性临床特征的发展。

实施例6-RPS在临床肿瘤中治疗敏感性的预测和预后的应用

接下来发明者评估RPS是否能在人类肿瘤中预测临床预后。对于该分析，NSCLC被认为是理想的肿瘤类型，因为针对NSCLC的化疗方案普遍是铂类，同时肺癌是癌症死亡的主因。发明者也试图用RPS区别预后和预测。严格来说，发明者假设了低RPS能给一个差强人意的预后，因为提高诱变与不利肿瘤特征有关联。然而，发明者也假设对于基于铂类的化疗的敏感性也能同时使低RPS肿瘤对治疗敏感，因为HR缺失细胞对DNA交联剂超敏感。这些不利影响被预测可以在低RPS肿瘤化疗中相互抵消。

RPS预测NSCLC患者预后的能力通过使用JBR.10临床试验数据来研究，这一研究之前证明早期NSCLC使用辅助化疗能够获益(Zhu，et al.,2010)。具体地，JBR.10在Ⅰ-Ⅱ期NSCLCs术后，随机分配患者接受顺氯氨铂+长春瑞滨的化疗和不接受任何治疗。该数据集对于发明者的分析是理想的，因为它是前瞻性的随机试验设计，并且有统一的治疗细节。这样，它没有那种回顾性的收集数据集所导致的偏向。在只接受外科手术的患者中，低RPS可以预测相对于高RPS更差的未来5年总体存活率(15％vs60％,p＝0.004,log rank test)。这些临床验证了RPS的预后能力(表6A)。化疗显著地提高了低RPS肿瘤5年内的总体存活率(15％vs77％,p＝0.01),但是高RPS肿瘤中则不同(60％vs72％,p＝0.55)。该临床验证了RPS预测铂类化疗敏感性的能力。

这些数据意味着差强人意的预后与低RPS关联性可能通过化疗被抵消，因为低RPS肿瘤对铂类化疗尤其敏感。例如，在JBR.10试验中，，不论低和高RPS(77％vs72％，p＝0.70)，化疗患者有类似的5年总体存活率。为进一步研究，发明者选取3个附加数据集，包括再回顾收集NSCLC患者数据(Okayama,etal.,2012；Tang,et al.,2013；Shedden,et al.,2008)。在多变量分析阶段的调控后，低RPS被再次与只接受外科治疗的患者的较差生存相关(图6B)。尤其是，发明者结合所有4个数据集中的数据，通过先前描述的方法学(Neyeloff,et al.,2012)和发现低RPS带来一个可持续1.24的风险比(95％CI＝1.12-1.36)。当此分析被重复在外科治疗加相应化疗的患者身上，差强人意的预后与低RPS的相关性减弱。总而言之，这些证据支持这种假设：低RPS肿瘤患者有不利的潜在预后，但HR抑制和铂类药物敏感性抵消了这些不利预后特征。因此，RPS可能帮助肿瘤学家筛选对个体患者有效的治疗方案，因此有更好的个性化治疗。

实施例7-材料和方法

研究设计：发明者力图建立一种方法来预测HR修复效率的方法，通过使用人类癌症细胞系公开有效的数据。尤其是，发明者建立了一种评分系统来联系基因表达模型与HR能力。mRNA表达数据，拷贝数变化，来源于癌症细胞系(Broda-Novartis CCLE)数据库的人类癌细胞系(n＝634)药物敏感性数据。稳健多芯片平均标准化分析MRNA表达量是标准化的平均值，分布于所有癌样本和连续性log2转化。SNP阵列DNA拷贝数被用于评估个人SNPs。对于CNV分析，最小缺失大小被定义为拷贝数片段平均≤-0.6，而最小插入大小被定义为拷贝数片段平均≥+1.4(log2[拷贝数/2])。缺失和插入按大小丢失，凭借这种丢失在大小上呈现10倍的增量。对于拓扑替康(n＝279),伊立替康(n＝180),和紫杉醇(n＝257)的药物敏感性是取决于IC50值。IC50值≥8μM被作为异常，因此，此分析通过审查。TP53突变状态通过杂交捕获序列数据确定，适用于所有癌细胞系。用于HR报告试验中的6个细胞系(RKO,DU145，COLO205，PC3，HCC44，NCI-H650)对拓扑替康和紫杉醇的敏感性被证实，通过在发明者实验室中使用急性持续3天药物曝光细胞；这方法被定义为一种用于产生CCLE药品敏感性数据的方法。

细胞中HR效应的定量：一个包含HR报告的质粒(pDR-GFP)，一个I-SceI表达质粒(pCβASce)，和由Maria Jasin提供一个空白对照质粒(pCAG)。细胞与pDR-GFP+pCβASce或者pDR-GFP+pCAG短暂地共转染。为了完成这些，0.5×10⁶ 80％密度的细胞与15μg各质粒在4mm比色皿中电融合，使用以下设置：325-375V，975μF。为了减少6个细胞系转化效率的不同，电融合电压被优化。细胞接种至合适的完全生长培养基中，培养48小时，再通过Becton-Dickinson FACScan分析。活细胞被收集，基于大小/复杂性和7-氨基放线菌素D(7-AAD)除外。活细胞部分呈现GFP阳性是可量化的。为了说明在细胞系中存在的转化效能的任何剩余差异，源于pDR-GFP+pCAG转化的GFP阳性被标准归一化于pDR-GFP+pCAG转化的GFP阳性。试验被重复三次，误差线为标准差。

在人类肿瘤数据库中RPS评估和临床特征的相关性:乳腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤数据集从癌症基因组Atlas(CGA)中挑选出来。阶段Ⅳ的转移疾病患者或者那些没有特定阶段的病人被排除在分析中。TP53突变状态通过SNP阵列基础DNA拷贝数决定。标准化mRNA表达，拷贝数变化，和TP53突变状态适用于295种乳腺癌和153种NSCLCs。CNV分析被用来作为描述CCLE癌细胞系。临床特征和预后因素适用于280种乳腺癌和145种NSCLCS，这些癌症有着可靠地mRNA表达数据。

用临床数据验证RPS系统的有效性:四项公共可靠地NSCLC数据库来源于基因表达合集(GEO；accession numbers GSE14814[JBR.10trial],GSE31210[Japanese NationalCancer Center Institute],和GSE42127[MD Anderson Cancer Center])和国家癌症机构caArray网站https://array.nci.nih.gov/caarray/project/Jacob-00182[Director’sChallenge Consortium]。mRNA表达值通过标准化至在所有病人样本的中间值，在各个数据集内或随后通过log2转化。患者样本根据治疗方式分类。总计，581名病患只接受外科手术治疗，164名病患接受了外科手术加化疗。对总体生存率进行Cox等比例危险分析来决定RPS作为一种持续变化值的风险比。所有NSCLC数据集分析仅限于阶段I和阶段II患者。

数据分析:所有分析通过JMP9.0(SAS Institute Inc.；Cary,NC)完成。当P-value≤0.05被认为是具有显著性差异。

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在此公开和声明的所有方法和仪器，都可以根据本说明书制备和执行，并且无需过度的试验。虽然本发明的组合物和方法是通过优选实施案例被描述的，本领域内的技术人员应该会明白各种变异可以用于这些方法和仪器以及步骤或者在此描述的方法的步骤顺序，并且不会违背本发明的概念、精神和范围。更具体地说，显然，一些化学上和生理学上相关联的一些试剂可以用于替代在此描述的一些试剂，并达到相同或者相似的结果。所有这些相似的替代或者修改在本领域内技术人员看来将会是落入附件的权利要求所定义的发明的精神、范围和概念之内。

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Claims

1.一种针对人类癌症病患的治疗方法，该方法通过预测患者对某种DNA损伤制剂敏感后，从而采用这种DNA损伤制剂治疗，其中所述的这种诊断是基于一种重组能力评分(RPS)，该评分源于患者生物学样本中检测到的RIF1，PAR I，RAD51或Ku80的表达水平。

2.一种针对人类癌症病患的治疗方法，该方法通过预测患者对某种DNA损伤制剂敏感后，从而采用这种DNA损伤制剂治疗，，其中这种诊断是基于患者生物学样本中检测到的一个或多个的涉及双链DNA断裂修复基因的表达水平。

3.一种针对人类癌症病患的治疗方法，该方法通过预测患者对某种DNA损伤制剂敏感后，从而采用这种DNA损伤制剂治疗，其中所述诊断是基于患者生物学样本中测得的以下两个或多个的人类基因的表达水平：RPA，ATRIP，ATR，Mre11/Rad50/NBS1，

ATM,MDC1,BRCA1,53BP1,CtIP,RIF1,Ku70,Ku80,artemis,DNA-pk,XRCC4/Ligase IV，

RAD51,Palb2,BRCA2,RAD52,XRCC3/RAD51C,XRCC2/RAD51B/RAD51D,RAD51AP1,BLM,PAR,RAD54L,RAD54B,Fbh1,WRN,PARI,HELQ，MYC或STAT3。

4.一种通过公式计算来预测DNA损伤制剂在癌症病患上治疗效果的方法，包括检测患者生物学样本中以下至少两个基因的表达水平：PAR1，BLM，RAD51，Rif1，BRCA1，Ku80，RAD51AP1，RAD54B，Plk1，BRCA2，RAD51C，PALB2，MYC或STAT3，同时依据此表达水平来计算响应评分，从而预测DNA损伤制剂在癌症患者上的疗效。

5.一种评估人类癌症患者采用DNA损伤制剂为癌症治疗的方法，包括检测患者生物学样本中至少一个涉及双链DNA损伤修复的人类基因表达水平；将测得的该基因的表达水平数值与参照或对照的表达水平进行比较；并且，确认患者是否对DNA损伤剂有积极响应。

6.一种针对人类癌症病患的治疗方法，包括：

检测患者肿瘤细胞或组织中两个或更多基因的表达水平，基因选自于RPA，ATRIP，ATR，Mre11/Rad50/NBS1，ATM，MDC1，BRCA1，53BP1，CtIP，RIF1，Ku70，Ku80，artemis，DNA-pk，XRCC4/Ligase IV，RAD51，Palb2，BRCA2，RAD52，XRCC3/RAD51C，XRCC2/RAD51B/RAD51D，RAD51AP1，BLM，PAR，RAD54L，RAD54B，Fbh1，WRN，PARI，HELQ，MYC，STAT3；同时，

在确认患者对DNA损伤制剂疗法具有预期敏感性后，采用一种DNA损伤制剂进行治疗。

7.一种治疗癌症病患的方法包括:

检测患者肿瘤细胞或组织中RIF1，PARI，RAD51和Ku80的表达水平；

通过测得的表达水平计算重组能力(RPS)分值；

比较RPS计算数值与RPS参考数值；

如果RPS计算数值低于其参考值，对患者采用DNA损伤剂治疗。

8.一种预测治疗方案疗效的方法，治疗方案包括放射性物质，铂类化合物，DNA交联剂，拓扑异构酶抑制剂或PARP抑制剂，以上所述方法包括：

检测患者肿瘤细胞或组织两个或更多基因的表达水平，基因选自于PARI,BLM,RAD51，Rif1,BRCA1,Ku80，RAD51AP1，RAD54B,Plk1,BRCA2，RAD51C,PALB2，MYC及STAT3；

通过测得的基因表达水平计算重组能力(RPS)分值；

比较RPS计算数值与RPS参考数值，其中所述RPS计算数值低于RPS参考值，则表明患者与上述治疗方案呈增长的响应可能性。

9.一种提供患者细胞或组织中重组能力评分(RPS)的方法，包括：

检测细胞或组织中RIF1,PARI,RAD51，和Ku80基因的表达水平；

将这四个基因的表达水平(mRNA数值)分别通过log2标准化转化后相加，再乘以-1，即得RPS评分。

10.一个试剂盒包括寡核苷酸分别对至少两个基因的杂交能力，基因选自于PARI,BLM,RAD51，Rif1,BRCA1，Ku80,RAD51AP1，RAD54B,Plk1,BRCA2,RAD51C,PALB2，MYC，STAT3，或选自PARI,Rif1,Ku80,RAD51，BLM,BRCA1，RAD51AP1，RAD54B，或选自PARI,Rif1,Ku80,RAD51中的基因。